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Zika virus is an arthropod-borne virus that has recently emerged as a significant public health emergency due to its association with congenital malformations. Serological and molecular tests are typically used to confirm Zika virus infection. These methods, however, have limitations when the interest is in localizing the virus within the tissue and identifying the specific cell types involved in viral dissemination. Chromogenic in situ hybridization (CISH) and immunohistochemistry (IHC) are common histological techniques used for intracellular localization of RNA and protein expression, respectively. The combined use of CISH and IHC is important to obtain information about RNA replication and the location of infected target cells involved in Zika virus neuropathogenesis. There are no reports, however, of detailed procedures for the simultaneous detection of Zika virus RNA and proteins in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples. Furthermore, the chromogenic detection methods for Zika virus RNA published thus far use expensive commercial kits, limiting their widespread use. As an alternative, we describe here a detailed and cost-effective step-by-step procedure for the simultaneous detection of Zika virus RNA and proteins in FFPE samples. First, we describe how to synthesize and purify homemade RNA probes conjugated with digoxygenin. Then, we outline the steps to perform the chromogenic detection of Zika virus RNA using these probes, and how to combine this technique with the immunodetection of viral antigens. To illustrate the entire workflow, we use FFPE samples derived from infected Vero cells as well as from human and mouse brain tissues. These methods are highly adaptable and can be used to study Zika virus or even other viruses of public health relevance, providing an optimal and economical alternative for laboratories with limited resources. © 2021 Wiley Periodicals LLC. Basic Protocol 1: Synthesis of RNA probes conjugated with digoxigenin (DIG) Basic Protocol 2: Simultaneous detection of ZIKV RNA and proteins in FFPE cell blocks and tissues.

A Zika virus (ZIKV) strain was isolated from an acute febrile patient during the Zika epidemics in Colombia. The strain was intraperitoneally inoculated into BALB/c mice, and 7 days postinoculation, neurological manifestations and ZIKV infection in the brain were demonstrated. The reported genome sequence is highly related to strains circulating in the Americas.

The real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (real-time RT-qPCR) has become a leading technique for the detection and quantification of arboviruses, including Chikungunya, Dengue, and Zika viruses. In this study, an updated real-time RT-qPCR assay was designed and evaluated together with a synthetic positive-control chimeric RNA for the simultaneous detection and quantification of Chikungunya, Dengue, and Zika viruses. Amplification assays were performed to verify the construct integrity and optimal reaction/thermal cycling conditions. The analytical sensitivity of the assay was determined for each virus in single and multiplex reactions, as well as the performance in the detection and viral load quantification of experimental samples. The real-time RT-qPCR assay presented here allowed for the simultaneous detection and quantification of Chikungunya, Dengue, and Zika viruses and could be applied in several studies where the accurate quantification of viral genomes is required.

La rabia es una enfermedad mortal causada por un virus neurotropico que produce discretos cambios morfologicos dificilmente observables con la histopatologia convencional. El desenlace fatal causado por la rabia puede atribuirse a cambios bioquimicos especificos que afectan gravemente la funcion neuronal. La proteina nuclear neuronal (NeuN) es un marcador ampliamente utilizado para la investigacion y el diagnostico histopatologico de enfermedades del sistema nervioso. Este trabajo se realizo con el proposito de evaluar la distribucion de la proteina NeuN en la corteza motora de ratones normales y ratones infectados con virus de la rabia. Ratones ICR adultos fueron inoculados con virus de la rabia por via intramuscular o por via intracerebral. Los animales infectados con rabia fueron sacrificados en la etapa terminal de la enfermedad. Ratones de la misma edad no inoculados con el virus (controles) fueron sacrificados simultaneamente. Se extrajeron los cerebros y se obtuvieron cortes coronales en un vibratomo. Mediante inmunohistoquimica se estudio la expresion de NeuN en el area motora de la corteza cerebral. Se realizaron conteos neuronales, densitometria optica celular y mediciones del diametro de los perfiles neuronales para analizar la inmunorreactividad de la proteina. En los ratones inoculados por via intracerebral hubo disminucion significativa de la inmunorreactividad de NeuN manifestada en los diferentes parametros evaluados. En contraste, estos cambios no fueron estadisticamente significativos en los cerebros de ratones inoculados por la ruta intramuscular. La inmunorreactividad de NeuN o su expresion es afectada por la presencia del virus de la rabia en la corteza cerebral pero dependiendo de la via de inoculacion. Estos resultados contribuyen al conocimiento de las dinamicas de infeccion celular en la patogenesis de la rabia.

La proteina asociada a microtubulos MAP-2 es una parte integral del citoesqueleto y juega un papel importante en la morfogenesis neuronal. Esta proteina es un componente esencial del citoesqueleto de las dendritas, especialmente en el cerebro adulto, y su expresion puede ser alterada en condiciones experimentales o patologicas. El proposito de este estudio fue evaluar el efecto de la infeccion con el virus de la rabia sobre la inmunorreactividad de MAP-2 en la corteza cerebral de ratones. Ratones inoculados con el virus de la rabia fueron sacrificados cuando la enfermedad alcanzo su fase avanzada, junto con animales no infectados de la misma edad. Los cerebros se extrajeron despues de que los animales fueron tratados con paraformaldehido mediante perfusion intracardiaca. En un vibratomo se obtuvieron cortes coronales y estos se procesaron mediante inmunohistoquimica para revelar la presencia de la proteina MAP-2 en las neuronas de la zona motora de la corteza cerebral. Los ratones infectados con rabia mostraron un aumento en la inmunorreactividad de los somas y dendritas apicales en las neuronas piramidales de la corteza motora. Este es un resultado inesperado, ya que previamente se ha demostrado patologia dendritica en rabia, y algunos estudios sobre los trastornos neurologicos asocian las alteraciones dendriticas con perdida de expresion de la proteina MAP-2. Por lo tanto, cualquiera que sea la alteracion en la expresion de esta proteina, disminucion o aumento, podria ser la causa de un desequilibrio bioquimico en la integridad y estabilidad del citoesqueleto neuronal.

Dear editors, cordial greetings As a group of researchers and professionals signing this letter to the editors, respectfully, we want to make a series of observations and reflections regarding the article “Afro-Colombian ethnicity, a paradoxical protective factor against dengue”1 , published in your prestigious journal. We considered that the article in question lightly concludes that the Afro-Colombian population present a lower risk of complications compared to the non-Afro-Colombian population. This situation, besides of not being completely based on data and facts that it describes and analyzes, is an assertion that can be a source of deeply disorientation for the Colombian health services, upon a time these conclusions get disseminated, and it can also mistakenly indicate to Afro-Colombian people that the risk of complications is lower in the presence of a virus causing a dengue disease.

Introducción. La replicación del virus del dengue se ha considerado principalmente citoplásmica; sin embargo, en diversos estudios se ha informado que algunos flavivirus pueden utilizar factores intranucleares como parte de la maquinaria que utilizan para aumentar la capacidad de infección en la célula huésped. En este trabajo se describen las alteraciones a nivel nuclear en células infectadas con dengue, probablemente involucradas en procesos de replicación viral. Objetivo. Presentar las observaciones ultraestructurales de células C6/36 de Aedes albopictus infectadas con el virus del dengue de tipo 2. Materiales y métodos. Se infectaron células C6/36 con suero de un paciente con diagnóstico de dengue 2; posteriormente, se mantuvieron en medio de cultivo durante 10 días y se evaluó el efecto citopático. Las células se procesaron para los ensayos de inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión, con el fin de hacer el estudio ultraestructural. Resultados. Los ensayos de inmunofluorescencia confirmaron la presencia de la proteína E viral asociada con sincitios celulares en el cultivo. En el estudio ultraestructural, las células infectadas tenían estructuras vesiculares y tubulares, y cisternas dilatadas del retículo endoplásmico en el citoplasma. Las partículas virales se encontraron exclusivamente en vacuolas localizadas en el citoplasma. Los núcleos de los sincitios celulares contenían estructuras de membrana dispuestas en forma circular y, en algunos casos, dichos sincitios presentaban lisis. En ningún caso se observaron partículas virales en el núcleo. Conclusiones. No se habían reportado alteraciones ultraestructurales en los núcleos de células infectadas con el virus del dengue detectadas mediante técnicas de microscopia electrónica. Es probable que tales modificaciones estén asociadas con procesos intranucleares de replicación como un mecanismo alternativo. Introduction: Dengue virus replication has been considered mainly cytoplasmic, however, studies indicate that some flaviviruses may use the intranuclear pathway as part of the machinery that the virus uses to increase infection capacity in the host cell. This paper describes alterations at nuclear level in the cell infected with dengue, which are likely involved in the virus replication processes. Objective: This paper addresses the ultrastructural observations of C6/36 cells of the Aedes albopictus mosquito infected with dengue virus type 2. Materials and methods: C6/36 cells were infected in culture medium with the serum of a patient positively diagnosed for dengue 2. Subsequently, the cells were incubated for 10 days and the cytopathic effect was assessed. The cells were processed for immunofluorescence assays and transmission electron microscopy. Results: The immunofluorescence assays confirmed the presence of viral protein E associated with cellular syncytia in the culture. In the ultrastructural study, the infected cells showed vesicular-tubular structures and dilated cisterns of the endoplasmic reticulum at the cytoplasmic level. Viral particles were found exclusively in cytoplasm localized within the vacuoles. Nuclei of cellular syncytia showed membrane structures arranged in a circular shape and, in some cases, these syncytia displayed lysis; in no case viral particles were observed at the nuclear level. Conclusions: The ultrastructural alterations of nuclei in cells infected with the dengue virus using electron microscopy techniques had not been reported before, as far as we know. It is likely that such modifications are associated with replicative processes at an intranuclear level as an alternate replication mechanism.

ResumenAntecedentesEl virus del dengue afecta distintos órganos, pero se ha determinado que el hígado es el principal blanco de acción y en donde ocurre la mayor severidad del daño. Existen pocos estudios sobre los cambios histológicos durante la infección por dengue.ObjetivosAnalizar las alteraciones histopatológicas post-mortem en hígados de pacientes que presentaron la forma grave del dengue.MétodosSe revisaron los cortes de hígado de 20 pacientes con dengue severo y se realizaron coloraciones y pruebas para glucógeno.ResultadosEncontramos pérdida de glucógeno citoplasmático en todos los casos analizados y la presencia de glucógeno intranuclear en dos de ellos.ConclusionesEn este estudio se reporta por primera vez la presencia de masas de glucógeno intranuclear en hepatocitos de dos niños fallecidos con dengue grave.AbstractBackgroundDengue virus affects various organs, but the liver is the main target of damage and where the most severe damage can occur. There are few studies on the histological changes in the liver during dengue infection.AimsTo analyze the histopathological post-mortem alterations in livers from patients with severe dengue.MethodsWe revised serial liver sections, which were stained and tested for glycogen, from 20 patients with severe dengue.ResultsWe found loss of cytoplasmic glycogen in all cases analyzed and the presence of intranuclear glycogen in two of them.ConclusionsThis is the first report of the presence of intranuclear glycogen masses during severe dengue.

Introduccion. Algunos signos clinicos de la rabia y estudios experimentales previos sugieren que esta infeccion viral podria afectar al sistema GABAergico. Objetivo. Evaluar el efecto de la infeccion con el virus de la rabia sobre la expresion de GABA en neuronas de la corteza cerebral de raton. Materiales y metodos. Se inocularon ratones adultos con virus CVS de la rabia por via intramuscular. Los animales se sacrificaron en la etapa terminal de la enfermedad y se fijaron por perfusion con paraformaldehido al 4% y glutaraldehido al 1%. Se procesaron cortes coronales de cerebro obtenidos en un Vibratome®, mediante inmunohistoquimica para identificar neuronas GABAergicas en la corteza cerebral. Se realizaron conteos y analisis cuantitativo de las neuronas positivas para GABA en muestras de ratones normales e infectados. Resultados. En los animales infectados con rabia no se altero el patron de distribucion de las neuronas GABAergicas corticales pero su numero disminuyo significativamente. El promedio de celulas positivas para GABA en 1 mm2 de corteza fue de 293±32 en los controles y de 209±13 en los infectados. Por otra parte, el valor promedio del area de los perfiles neuronales positivos para GABA aumento significativamente de 104±8 μm2 en los controles a 122±10 μm2 en las muestras infectadas, debido a que la perdida de celulas positivas para GABA fue mas evidente en las neuronas de menor tamano. No obstante, el rango de tamanos de las celulas inmunopositivas para GABA fue similar en muestras de animales normales e infectados. Conclusiones. Este trabajo aporta nueva evidencia en favor de la hipotesis que propone la participacion del GABA en la fisiopatologia de la rabia.

GABAergic neurons synthesize and release gamma-aminobutyric acid, the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. Certain clinical signs of rabies and previous experimental studies have suggested that rabies viral infections affect the host GABAergic system.The effect of rabies virus infection on the expression of GABA was evaluated in neurons of the mouse cerebral cortex.Adult mice were inoculated by intramuscular injection with the standard strain of rabies (CVS virus). The animals were sacrificed in the terminal stage of the illness and perfused with 4% paraformaldehyde and 1% glutaraldehyde. Frontal sections were obtained in a Vibratome(R) and treated with appropriate immunohistochemical reactions for identifying the GABAergic neurons in the cerebral cortex. Counts and comparative quantitative analysis of the GABA+ neurons were compared in samples of infected and normal mice.In the animals infected with rabies virus, the distribution pattern of cortical GABAergic neurons was not changed, but their number diminished significantly. The mean value of GABA+ cells number in 1 microm2 of cerebral cortex was 293+/-32 in normal samples and 209+/-13 in infected samples. Despite the loss in GABA+ cell number, the average size of GABA+ cells per unit increased from 104+/-8 microm2 in normal mice to 122+/-10 microm2 in infected mice because the cell loss consisted more frequently of smaller neurons. Nevertheless, the rank of GABA+ cell sizes in infected samples was similar to normal samples.This evidence supported the hypothesis that GABA is involved in rabies pathology.