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A enzima ascorbato peroxidase (APX) desempenha um papel essencial no controle dos níveis intracelulares de peróxido de hidrogênio (H2O2). O H2O2 é uma molécula continuamente produzida pelo metabolismo aeróbio, sendo citotóxica quando presente em níveis elevados, mas em níveis adequados pode atuar como uma molécula de sinalização. Para entender a função de um gene que codifica uma APX peroxisomal (OsAPX4) do arroz (Oryza sativa L), foram estudadas linhagens transgênicas silenciadas no referido gene (RNAiOsAPX4), através de uma caracterização fenotípica detalhada ao longo dos diferentes estádios de desenvolvimento. Após 40 dias de crescimento, as plantas RNAiOsAPX4 apresentaram maior número de folhas senescentes quando comparadas com as plantas não transformadas (NT). No entanto, as plantas não apresentaram diferenças significativas em altura, no conteúdo de espécies reativas de oxigênio (ERO) e nos parâmetros de eficiência do fotosistema II das folhas bandeira. Curiosamente, as plantas RNAiOsAPX4 apresentaram floração antecipada, de aproximadamente uma semana em relação às plantas NT. A viabilidade do pólen e o número de grãos de pólen por antera não diferiram entre os genótipos. Além disso, os fragmentos de folhas RNAiOsAPX4 foram mais suscetíveis à senescência induzida por escuro. Foi realizada uma análise de transcriptoma para identificar os genes diferencialmente expressos em plantas RNAiOsAPX4 e NT, comparando bibliotecas de mRNA preparadas de folhas de diferentes idades de uma mesma planta (análise ainda está sendo concluída). As comparações realizadas nesta análise demonstraram que as folhas 1 (folha mais antiga) das plantas RNAiOsAPX4 e NT, possui 11 genes diferencialmente expressos com “fold-change” maior ou igual a 2, enquanto que as comparações realizadas entre as bibliotecas preparadas com o material das folhas 2 (folha mais jovem) mostraram 71 genes diferencialmente expressos e cinco genes sobrepostos nas plantas transformadas e não-transformadas. A comparação entre as bibliotecas das folhas 1 e 2 da mesma planta mostrou apenas 2 genes diferencialmente expressos em plantas RNAiOsAPX4 e nenhum gene em plantas NT. Em conclusão, o silenciamento do gene OsAPX4, por conseguinte, a menor expressão de seu produto não afeta o crescimento da planta, mas influencia o tempo de floração e a senescência foliar, sugerindo um papel importante para o gene OsAPX4 na sinalização de ERO. Ascorbate peroxidase (APX) enzyme plays an essential role in the control of intracellular H2O2 levels. H2O2, which is continually produced by aerobic metabolism, is a cytotoxic molecule when in high levels, but in low levels it can act as a signalling molecule. To understand the function of a gene encoding a peroxisomal APX (OsAPX4) from rice (Oryza sativa L), silenced transgenic lines (RNAiOsAPX4) were studied. A careful phenotypic characterization was carried out, following all growth stages of RNAiOsAPX4 and non transformed plants (NT). Under growth chamber conditions, 40 days old RNAiOsAPX4 plants clearly displayed more senescent leaves than NT plants. However, the plants did not present significant differences in height, in the ROS content on flag leaves and in efficiency parameters of photosystem II of flag leaves. Interestingly, RNAiOsAPX4 plants started to flower a week earlier than NT plants. Assessments of pollen viability and the number of pollen grains per anther did not differ between genotypes. In addition, RNAiOsAPX4 leaf fragments were more susceptible to dark induced senescence. A transcriptome analysis to identify differentially expressed genes in RNAiOsAPX4 and NT plants was performed comparing leaves of different ages within a plant and the results are under evaluation. The comparisons between leaf 1 (older leaf) of RNAiOsAPX4 and NT plants showed 11 genes differentially expressed with ≥ 2 fold-change, while the comparisons of leaf 2 (younger leaf) showed 71 genes differentially expressed, with five overlapping genes. The comparison between leaves 1 and 2 within the same plant showed only 2 genes differentially expressed in RNAiOsAPX4 plants and no genes in NT plants. In conclusion, silencing of OsAPX4 gene does not affect plant growth, but it does influence flowering time and leaf senescence, suggesting a role for OsAPX4 gene in ROS signaling.

Peroxidases atuam catalisando a redução do peróxido de hidrogênio à água a fim de minimizar o dano celular e modular, direta ou indiretamente, respostas celulares dependentes da sinalização operada por esta espécie reativa de oxigênio. Análises prévias, feitas em bancos de dados de sequências genômicas, permitiram a identificação de uma nova heme peroxidase não-animal (ascorbato peroxidase-relacionada ou APx-R), a qual foi descrita pela primeira vez em 2011 em um estudo publicado pelo nosso grupo de pesquisa. O trabalho detalhado nos próximos capítulos desta tese teve como objetivo caracterizar a participação de APx-R no metabolismo antioxidante vegetal através de abordagens filogenéticas e funcionais. Os resultados apresentados nos capítulos dois e três mostram que APx-R é uma peroxidase de classe I, filogeneticamente relacionada à ascorbato peroxidase, citocromo-c peroxidase e catalase peroxidase. Em Arabidopsis thaliana, APx-R codifica uma proteína cloroplastídica que atua regulando os processos de germinação e maturação da semente. A superexpressão de APx-R in planta afetou drasticamente a viabilidade das sementes, sugerindo que os níveis de expressão deste gene devem ser rigorosamente controlados para permitir o desenvolvimento da planta. Além disso, as análises filogenéticas aqui apresentadas levaram à identificação de uma nova família de peroxidases (intitulada ascorbato peroxidase-like ou APx-L), adicionando um novo componente ao complexo sistema antioxidante vegetal. Peroxidases act reducing hydrogen peroxide into water, minimizing cell injury and modulating cell responses through hydrogen peroxide signaling. From analysis in public genome databases, we identified a non-animal heme-peroxidase (ascorbate peroxidase-related or APx-R) present from basal to vascular plants, which was initially described in a study published by our group in 2011. The work described hereafter aimed to characterize APx-R participation in the antioxidant metabolism through phylogenetic and functional approaches. The results presented on chapters two and three showed that APx-R is a class I peroxidase, phylogenetically related to ascorbate peroxidase, cytochrome-c peroxidase and catalase peroxidase. In Arabidopsis thaliana, APx-R gene encodes a chloroplast protein which acts regulating germination and seed maturation processes. The overexpression of APx-R in planta impaired seed viability, showing that APx-R expression level must be tightly controlled in order to enable plants to develop properly. In addition, the phylogenetic analysis here presented allowed the identification of a new peroxidase family, called ascorbate peroxidase-like (APx-L), which adds a new component into plant antioxidant metabolism.