Search

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2019. Nos últimos anos, o surgimento, ou ressurgimento, de diferentes arboviroses gerou um alerta global. Diferente da infecção causada por outros flavivírus, a infecção pelo ZIKV pode ocasionar alterações neurológicas, tais como malformações cerebrais em crianças de mães infectadas durante a gravidez, conhecidas como síndrome congênita do Zika (SCZ). Também foram relatadas outras alterações neurológicas, como a síndrome de Guillain- Barré. A microcefalia é uma desordem de células progenitoras neurais (CPN) desencadeada pelo isolado brasileiro (ZIKVPE243), a qual pode atravessar a placenta e induzir neuroinflamação e ativação microglial. O isolado africano (ZIKVMR766) também mostrou ser capaz de infectar células-tronco humanas pluripotentes in vitro e induzir a morte celular por apoptose, entretanto, não foram relatados casos de CSZ associados a esta linhagem. Estes dados, junto com as poucas informações disponíveis a respeito dos mecanismos neuroinflamatórios desencadeados por infecções virais, nos levaram a avaliar a possível relevância fisiológica dos receptores ativados por proliferadores peroxissomais (PPARs) na resposta inflamatória após infecção de células da microglia-BV2 com as linhagens africana e asiática do vírus Zika. Em um primeiro momento foi possível observar que os isolados ZIKVMR766 e ZIKVPE243 são capazes de infectar células da micróglia da linhagem BV2 e produzir partículas virais infecciosas, embora em níveis menores que os descritos para outros tipos celulares e não induzir efeitos citopatogênicos. Por outro lado, ambas os isolados induziram a expressão dos marcadores de ativação Iba1, CD68, enquanto a expressão do MHC-II foi induzida apenas pelo ZIKVMR766. A infecção pelo ZIKV mostrou induzir a expressão de PPARγ nas células BV2, sendo claramente superiores em células infectas pelo isolado brasileiro, no entanto as células não apresentaram expressão de PPARα. De modo geral, as células infectadas pelo isolado africano apresentaram maiores níveis de expressão das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α. O tratamento com Rosiglitazona evidenciou a participação do PPARγ na modulação destas citocinas. Os níveis de expressão dos miRNAs 146a e 124 se correlacionam de foram geral com os níveis de expressão de PPARγ, e com os das citocinas inflamatórias e anti-inflamatórias, além de se correlacionar com seu alvo, a proteína TRAF6, um importante mediador inflamatório. Esperamos que as diferenças observadas entre as duas linhagens do ZIKV nos auxiliem, numa etapa posterior, a esclarecer os mecanismos moleculares envolvidas na doença ou proteção, virulência, tropismo tecidual, patologia, e evasão imune. Recently, the emergence or resurgence of different arboviruses has generated a global alert. Unlike infection caused by other flaviviruses, ZIKV infection can cause neurological alterations, such as brain malformations in children of mothers infected during pregnancy, related to as Congenital Zika Syndrome (SCZ). Other neurological changes, such as Guillain-Barré syndrome, have also been reported. Microcephaly is a neural progenitor (NSC) disorder triggered by the Brazilian isolate (ZIKVPE243), which can cross the placenta and induce neuroinfection and microglial injury. The African isolate (ZIKVMR766) was also shown to be capable of infecting pluripotent human stem cells in vitro, inducing apoptotic cell death, however, this strain is not related to the associated CSZ cases. These data, together with limited information available regarding the neuroinflammatory mechanisms triggered by viral infections, lead us to assess a possible physiological relevance of peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs), in the inflammatory response following microglia- BV2 cell infection by both isolates, African and Brazilian. At first glance, it was possible to observe that ZIKVMR766 and ZIKVPE243 are capable of infect BV2 lineage cells and produce infectious viral particles, besides the fact that they do not induce cytopathic effects, and that the viral production occurs at lower levels compared to other cell lineages described. On the other hand, both isolates triggered the expression of the activation markers Iba1, CD68, while MHC-II expression were induced only by ZIKVMR766. ZIKV infection induced PPARγ expression in BV2 cells, being clearly higher in cells infected by the Brazilian isolate, however PPARα was not expressed. Overall, cells infected by the African isolate showed higher levels of proinflammatory cytokines IL-6 and TNF-α. Furthermore, Rosiglitazone treatment evidenced PPARγ participation in the modulation of these cytokines. The expression levels of miRNAs 146a and 124 correlates broadly with the expression levels of PPARγ, and with those of inflammatory and anti-inflammatory cytokines. Those miRNAs levels are also correlated with their target protein, TRAF6, an important inflammatory mediator. We hope that the differences observed between the two ZIKV isolates help us, at a later stage, to clarify the molecular mechanisms involved in disease or protection, virulence, tissue tropism, pathology, and immune evasion.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2019. Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq). Nos últimos anos, o surgimento, ou ressurgimento, de diferentes arboviroses gerou um alerta global. À diferença da infecção por outros flavivírus, a infecção pelo vírus zika (ZIKV) pode ocasionar alterações neurológicas, tais como malformações cerebrais em neonatos de mães infectadas durante a gravidez, incluindo encefalite, mielite e microcefalia, conhecidas como síndrome congênita do Zika (SCZ). Também foram relatadas outras alterações neurológicas, como a síndrome de Guillain-Barré em adultos. A microcefalia é uma desordem de células progenitoras neurais desencadeada por ZIKV da estirpe brasileira, a qual pode atravessar a placenta e induzir neuroinflamação e ativação microglial. Vírus da cepa africana também mostrou ser capaz de infectar células-tronco humanas pluripotentes in vitro e induzir a morte celular por apoptose, entretanto, não foram relatados casos de SCZ associados a esta cepa. Estes dados juntos com as poucas informações disponíveis a respeito dos mecanismos de neurodegeneração envolvidos nos distúrbios neurológicos e o envolvimento de miRNAs em processos neuroinflamatórios desencadeados por infecções virais, nos levaram a realizar uma análise comparativa por PCR da expressão de miRNAs envolvidos na resposta inflamatória, assim como seus alvos celulares, após infecção de células imortalizadas da micróglia com ZIKV das cepas africana e asiática. Neste trabalho foi possível observar que os isolados da cepa africana (ZIKVMR766) e asiática (ZIKVPE243) são capazes de infectar células da micróglia de camundongos da linhagem BV2 e produzir vírus infecciosos, embora em níveis menores que os descritos para outros tipos celulares e não induzir efeitos citopatogênicos. Ambas os isolados induziram a expressão dos marcadores de ativação Iba1, CD68, enquanto a expressão do MHC-II foi induzida apenas pelo ZIKVMR766. A infecção pelo ZIKV mostrou induzir a expressão diferencial dos miRNAs 155, 146a, 132 e 125b, assim como dos respectivos alvos celulares envolvidos na regulação da resposta imune inata. A infecção pelo ZIKVMR766 mostrou induzir níveis maiores dos miRNAs que os induzidos pelo ZIKVPE243, especialmente do miR-146a em 24h (>7 folds). Também, ambos os isolados mostraram induzir um padrão diferencial na expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias, IFN-β, IFN-γ e IL-10. Esperamos que as diferenças observadas entre os isolados das duas cepas do ZIKV nos auxiliem, numa etapa posterior, a esclarecer os mecanismos moleculares envolvidas na doença ou proteção, virulência, tropismo tecidual, patologia, e evasão imune. In recent years, the emergence, or resurgence, of different arboviruses has generated a global alert. In contrast to infection with other flaviviruses, Zika virus (ZIKV) infection may cause neurological changes such as brain malformations in children of infected mothers during pregnancy, including encephalitis, myelitis, and microcephaly, known as Zika congenital syndrome (SCZ). Other neurological changes, such as Guillain-Barré syndrome, have also been reported. Microcephaly is a disorder of neural progenitor cells triggered by the Brazilian lineage (ZIKVPE243), which can cross the placenta and induce neuroinflammation and microglial activation. The African strain (ZIKVMR766) has also been shown to be able to infect pluripotent human stem cells in vitro and trigger cell death by apoptosis; however, no cases of SCZ associated to this lineage have been reported. These data, paired to the limited information available on mechanisms of neurodegeneration involved in neurological disorders, and the involvement of miRNAs in neuroinflammatory processes triggered by viral infections, led us to perform a qPCR to compare the miRNAs expression involved in the inflammatory response, as well as their cell targets, after infection of microglia-BV2 cells with the African and Asian strains of the Zika virus. In this work it was possible to observe that the ZIKVMR766 and ZIKVPE243 strains are capable of infecting BV2 lineage microglial cells and producing infectious viral particles, although at levels lower than those described in other cell types besides not inducing cytopathogenic effects. Both strains induced the expression of Iba1, CD68 activation markers, whereas MHC-II expression was induced only by ZIKVMR766. ZIKV infection has been shown to produce differential expression of miRNAs 155, 146a, 132 and 125b, as well as their respective cellular targets involved in the regulation of the innate immune response. ZIKVMR766 infection showed higher levels of miRNAs than that caused by ZIKVPE243, especially miR-146a in 24h (> 7 folds). Also, both strains have been shown to prompt a differential pattern in the expression of pro and anti-inflammatory cytokines, IFN-β, IFN-γ and IL-10. We expect that the observed differences between the two ZIKV strains will help us, at a later stage, to clarify the molecular mechanisms involved in the disease or protection, virulence, tissue tropism, pathology, and immune evasion.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2019. Há uma grande variação na suscetibilidade à infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) durante a progressão da doença. A progressão da AIDS depende de complexas interações entre hospedeiro e vírus. As características mais importantes da progressão da doença são a ativação imunológica e a apoptose. Neste estudo abordamos a prevalência de polimorfismos relacionados a genes pró-inflamatórios e apoptóticos, como IFN-γ (+874 T / A), TNF-α (308G / A), IL-6 (-174 G / C), IL-8 (-251 A / T), NLRP3 (C/G), FAS (-670 A / G) e FASL (-124 A / G) em uma coorte multicêntrica altamente miscigenada composta por 84 pacientes infectados com diferentes desfechos clínico, sendo 12 controladores de elite [EC], 29 progressores lentos [LTNPs], e 43 progressores [P]. A genotipagem foi realizada por TaqMan-qPCR. Indivíduos com o genótipo AG presente no polimorfismo FAS (-670 A / G), mostraram uma carga viral significativamente maior (p= 0,006). Foi possível observar uma maior associação dos genótipos AG/GG com uma maior carga viral (p= 0,012) que a apresentada pelos genótipos AG/AA (p=0,047). Por outro lado, para o polimorfismo IL-8 (-251 A / T) foi possível observar um resultado próximo da significância estatística entre o genótipo AT e o grupo de pacientes progressores lentos (P = 0,054). Em conclusão, encontramos a variante alélica genética do polimorfismo FAS (-670 A / G) associado à alta carga viral e o polimorfismo IL-8 (-251 A / T) com baixa progressão à doença em uma coorte de pacientes HIV positivos altamente miscigenada. There is great variation in susceptibility to human immunodeficiency virus (HIV-1) infection during disease progression. The progression of AIDS depends on complex interactions between host and virus. The most important characteristics of disease progression are immunological activation and apoptosis. In this study, the prevalence of polymorphisms related to pro-inflammatory and apoptotic genes, such as IFN-γ (+ 874 T / A), TNF-α (308G / A), IL- 8 (-251 A / T), NLRP3 (C / G), FAS (-670 A / G) and FASL (-124 A / G) in a highly miscegenated multicentre cohort composed of 84 patients infected with different clinical outcomes 12 elite controllers [EC], 29 slow progressors [LTNPs], and 43 progressors [P]. Genotyping was performed by TaqMan-qPCR. Individuals with the AG genotype present in the FAS polymorphism (-670 A / G), showed a significantly higher viral load (p = 0.006). On the other hand, it was possible to observe a greater association of AG / GG genotypes with a higher viral load (p = 0.012) than that presented by AG / AA genotypes (p = 0.047). On the other hand, for the IL-8 polymorphism (-251 A / T) it was possible to observe a result near for significant association between the AT genotype and the slow progressor group (P = 0.054). In conclusion, we found the genetic allelic variant of FAS polymorphism (-670 A / G) associated with high viral load and IL-8 (-251 A / T) polymorphism with low disease progression in a cohort of highly miscegenated HIV positive patients.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2011. A diminuição da expressão do receptor CD4 na superfície das células infectadas é um dos mais importantes eventos durante a infecção pelo HIV-1. Foi observada uma clara relação entre a degradação do receptor viral, o aumento da infectuosidade e a replicação viral, sugerindo a participação deste fenômeno na patogênese e progressão da infecção. Para vencer os efeitos negativos exercidos pela expressão da molécula CD4, o HIV possui três proteínas: Nef, Vpu e Env, sendo Nef a proteína mais relevante neste fenômeno. Nef agiria na superfície celular como um conector da cauda citoplasmática da molécula CD4, com membros do complexo adaptador heterotetramérico de clatrina, redirecionando a molécula CD4 para vesículas endocíticas. Uma bomba de prótons vacuolar (V-ATPase) e a proteína Epsn15 foram envolvidas no aumento da força de ligação entre Nef e a subunidade μ2 de AP-2. Com a finalidade de evitar a reciclagem de CD4 para a superfície celular, uma segunda conexão entre CD4 e a proteína β-COP é estabelecida por Nef, o que permite direcionar o receptor para degradação lisossômica. Adicionalmente, duas proteínas foram também envolvidas no mecanismo a tioesterase humana II (hTE-II) e a dinamina 2 (Dyn2). Experimentos para validar o papel dessas proteínas celulares e sua relevância fisiológica não foram conclusivos. Por esse motivo nos propomos neste trabalho a caracterizar as interações entre algumas das proteínas celulares e diferentes alelos da proteína Nef. Os níveis de interação entre as proteínas celulares hTEII, CD4, V1H, β-COP, AP1σ, AP2μ e AP2σ e diferentes alelos da proteína Nef do HIV-1 e de SIV (Nef.NA7, NL4.3 e Mac239, respectivamente), assim como mudança de localização intracelular foram avaliados pelas técnicas de transferência relativa de energia de fluorescência (FRET) e microscopia confocal. As proteínas hTEII, AP2μ e β-COP, embora tenham mostrado elevados níveis de interação com os alelos de Nef NL4.3, NA7 e Mac239, demonstraram importantes diferençaspor FRET e confirmados por microscopia confocal, sendo que algumas proteínas tiveram também sua localização intracelular alterada. Resultados similares foram observados quando analisadas as interações entre as proteínas celulares e o alelo Mac239 de SIV, detectando-se elevados níveis de interação entre este alelo e a proteína celular AP2μ, assim como uma mudança na localização da proteína celular. Já as proteínas V1H, AP1σ e AP2σ AP1 não evidenciaram níveis significativos de interação com os alelos de Nef por ambas as técnicas. As proteínas AP2μ e β-COP e o receptor CD4 mostraram uma significativa interação, mas não foi observado mudanças na localização das mesmas. Adicionalmente, foram construídos vetores lentivirais codificando RNAs de interferência (RNAis) contra as diferentes proteínas celulares e virais, com o intuito de avaliar o impacto fisiológico das mesmas na degradação de CD4 no contexto da infecção viral. A eficiência dos diferentes vetores no silenciamento gênico foi confirmada, entretanto, experimentos exploratórios para avaliar o impacto da inibição da expressão das proteínas celulares na degradação de CD4 mediada por Nef não foram conclusivos, precisando–se realizar experimentos adicionais com mudança nas condições experimentais. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT The reduction of the receiver’s expression CD4 in the infected cells surfasse is one of the most importante events during the infectious process by HIV-1. It was observed a clear relationship among the viruses’ receiver degradation, the increase of infectious and virus’ replication, suggesting the participation of this phenomenon in infection pathogenesis and progress. To overcome the negative effects carried on by the molecular expression. CD4, HIV has three proteins: Nef, Vpu and Env, being Nef the most relevant protein in this phenomenon. Nef could act in cell surfasse as a link of the molecular cytoplasmic tail CD4 with the members of the complex adapter hetero tatrameter of clathrin, redirecting the CD4 molecule to the endocytic vesicles. A bomb of vacuole prótons (V- ATPase) and the protein Espn 15 were involved in the increase of bond strength between Nef and the subunit μ2 of AP-2. In order to avoid CD4 recycling to cell surfasse, another connection between CD4 and β-COP proteins is stabilished by Nef, which allows direct the receiver to the lysosomal degradation. Additionally, two proteins were also involved in this mechanism, human tioesterase II (hTEII) and the dynamin 2 (Dyn2). Experiments to validate the role of these cell proteins and its physiological relevance were not conclusive. For this reason we propose in this work characterize the interactions between some cell proteins and Nef’s protein diferente alleles. In both, the interactions and the location levels among some cell proteins as: hTEII, CD4, V1H,β- COP, AP1α, AP2μ and AP2α and diferente alleles of Nef protein of HIV-1 and SIV (Nef. NA7, NL4.3 and Mac 234, respectively), were evaluated by the techniques Relative transference of fluorescence energy (FRET) and Confocal microscopy. The proteins hTEII, Ap2μ and β- COP, although have shown high levels of interaction with Nef NL 4.3, NA7 and mac 239 alleles, demonstrated importante diferences among them. These levels of interaction were detected by FRET and confirmed by Confocal microscopy, of which some proteins also had their intracelular locations changed. Similar results were observed when interactions have happened between cell proteins and similar alleles Mac 239 of SIV, detecting high levels between this allele and the cell protein AP2μ, observing a change in the location of the protein, too. On the other hand, the proteins V1H, AP1α and AP2α, AP1 did not evidence significant levels of interaction with Ned alleles for both techniques. The analysis of interactions between cell proteins and CD4 receiver showed a significant interaction with AP2μ and β- COP proteins, but they did not induce changes in their location. Furthermore, there were lentiviral vectors encoding Interference RNAs (RNAis) against different cell proteins and viral. For the purposes of evaluate the physiological impact of CD4 degradation in viral infection context. The efficiency of different vectors in gene sileencing was confirmed, however, exploratory experiments to rate the impact of inibition in cell protein expression. in CD4 degradation, mediated by Nef, were not conclusive. It is necessary carry out additional experiments with change of experimental conditons.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2011. A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV - Human immunodeficiencyVirus) caracteriza-se por uma imunossupressão progressiva e aumento da infectividade e replicação viral. Apesar dos exatos mecanismos moleculares envolvidos na patogênesedo HIV não terem sido completamente elucidados, diversos fatores genéticos do hospedeiro e do vírus foram descritos. Dentre os fatores virais, encontram-se alterações em domínios protéicos de regiões biologicamente ativas de várias proteínas virais. As proteínas acessórias Vif e Vpr participam de diversos mecanismos patogênicos. Dentro deste contexto este projeto teve como principal objetivo caracterizar o pool de seqüências dos genes vif e vpr presentes em amostras de DNA genômico de células de sangue periférico de oito pacientes, sendo três deles em dois estágios da infecção (inicial etardio). Foram obtidas 115 sequências, sendo 57 do gene vif e 58 do gene vpr. A salterações presentes nos diferentes domínios foram correlacionadas com as principais funções biológicas, com a progressão à doença (modelo de regressão linear simples) e com as estruturas terciárias das proteínas. Finalmente foram realizadas análises filognéticas de ambos os genes . Dentre as principais mudanças detectadas para os alelos de vif e vpr, podemos destacar : Em Vpr, L5P, S10P, R73G, R85P, R87K, V57A, G75K ,G75R, nos alelos presentes no estágio inicial e S94G, F72L, W54 por stop codon, presentes nos dois estágios de infecção. No caso de Vif as principais mudanças detectadas foram: W38L, W21 por stop codon, W38 por stop codon, nos alelos do estágio inicial e D101G e D101N em ambos os momentos. A análise da correlação entre as alterações presentes nos alelos de vpr e vif e os diferentes estágios clínicos da infecção pelo HIV-1, revelou que o score influencia a contagem de células CD4+. É possivel notar uma tendência no gráfico de regressão, onde quanto maior é o score, menor é o número de células CD4+. Há portanto uma forte correlação (r = -0,826 [Vpr] e r = -0,840 [Vif])entre as mudanças nas proteínas acessórias Vpr (score 1) e Vif (score 2) e a diminuição das células CD4+. As arvóres filogenéticas geradas com base nas sequências dos alelos de vif e vpr indicam uma tendência de agrupamento entre os alelos dos mesmos pacientes nos estágios iniciais de finais. Não houve significativa mudança estrutural nas sequências analisadas, quando comparadas com a estrutura terciária do consenso do subtipo B. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT Human immunodeficiency virus (HIV) is caracterized by a progressive immunossupression and infectivity and viral replication increase. Although the exact molecular mechanisms involved in HIV pathogenesis have not been totally elucidated, several genetic factors of both host and vírus have been described. Among some viralf actors, there are alterations in protein domains of biologically active regions of several viral proteins. The accessory proteins Vif and Vpr participate of many pathogenic mechanisms. Taking this these ideas into consideration, this Project aimed at caracterizing the pool of sequences of vif and vpr genes present in genomic DNA samples of peripheral blood from eight patients, three of them from two different infection stages (early and late). Total of 115 sequences, 57 from vif gene and 58 from vpr gene were obtained. The alterations present at the different domains were correlated to the main biological functions, within the desease progression context (simple linear regression model), and with the protein’s terciary structure. Finally, filogenetic analysis were made for both genes. Among all detected mutations in vif and vpr aleles, we may highlight: in Vpr: L5P, S10P, R73G, R85P, R87K, V57A, G75K , G75R, ate the alleles present in the initiasl state and S94G, F72L, W54 for a stop cod on, present at both infection stages. In the Vif paradigm, the main detected changes were: W38L, W21 for a stop codon, in the early stage aleles and D101G e D101N in both moments. The correlation analysis of changes in vif and vpr aleles and the different clinical stages of HIV-1 infection showed that the influence score affect the CD4+ cells count. It is clearly possible to note a tendency in the regression graphic, being noticeable that when the score increases, CD4+ cells number decreases. Furthermore, there is a strong correlation between the changes in the accessory proteins Vpr (score 1) and Vif (score 2) and the diminish in the CD4+ cells count (r = -0,826 [Vpr] and r = -0,840 [Vif]). The filogenetic trees generated with regard to the sequence of the vif and vpr aleles indicate that there isa tendency in the gathering of the aleles of the same patients in the early and late stages. There hás not been noticed significant changes in the structure of the analysed sequences, when compared to the 3D consensus structure of the subtype B.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. A proteína acessória do HIV-1 Vpr ativa ATR induzindo um estresse replicativo do DNA. A ativação de ATR resulta num prolongamento da fase G2 do ciclo celular e termina induzindo a célula entrar em apoptose. No presente estudo investigou-se a função do sistema ubiquitina/proteassoma no contexto da atividade de Vpr. Reporta-se que esse sistema essencial para Vpr disparar o ponto de checagem de dano ao DNA na fase G2. Também investigou-se em detalhes as E3 ligases manipuladas por Vpr nesse processo. Foi encontrado que Vpr se liga a DCAF1, uma subunidade de Cul4-A/DDB1 E3 ligase. Mutações no domínio C-terminal da Vpr(R80A) mutante, a qual é capaz de se ligar à DCAF1, é incapaz de realizar a ativação do ponto de checagem do ciclo celular e possui um caráter dominante negativo. Em contraste, a mutação Q65R, na cadeia rica em leucina de Vpr inibe a interação com DCAF1, resultando numa forma inativa de Vpr; portanto, considerar-se-ia, então, que essa interação é requerida porém não suficiente para Vpr induzir o prolongamento de G2. Foi, então, proposto um modelo no qual Vpr recruta, através do seu domínio C-terminal, uma proteína celular desconhecida para ser degradada pelo sistema de ubiquitina- proteassoma e isto causaria o bloqueio do ciclo celular. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT HIV-1 Vpr is a viral accessory protein that activates ATR through the induction of DNA replication stress. ATR activation results in cell cycle arrest in G2 and induction of apoptosis. In the present study, we investigate the role of the ubiquitin/proteasome system (UPS) in the above activity of Vpr. We report that the general function of the UPS is required for Vpr to induce G2 checkpoint activation. We further investigated in detail the specific E3 ubiquitin ligase subunits that Vpr manipulates. We found that Vpr binds to the DCAF1 subunit of a cullin 4a/DDB1 E3 ubiquitin ligase. The carboxyterminal domain Vpr(R80A) mutant, which is able to bind DCAF1, is inactive in checkpoint activation and has dominant-negative character. In contrast, the mutation Q65R, in the leucine-rich domain of Vpr that mediates DCAF1 binding, results in an inactive Vpr devoid of dominant negative behavior. Thus, the interaction of Vpr with DCAF1 is required, but not sufficient, for Vpr to cause G2 arrest. We propose that Vpr recruits, through its carboxy terminal domain, an unknown cellular factor that is required for G2- to-M transition. Recruitment of this factor leads to its ubiquitination and degradation, resulting in failure to enter mitosis.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. A diminuição da expressão do receptor CD4 da superfície celular é um dos eventos mais importantes durante a infecção pelo vírus da Imunodeficiência Adquirida (HIV-1). Dentre as três proteínas virais que participam neste processo, Nef, Vpu e Env, a primeira se apresenta como a mais relevante. Estudos realizados por outros grupos e o nosso, evidenciaram claramente a relação entre a capacidade em diminuir a expressão da molécula CD4, a capacidade replicativa e a infectividade viral, sugerindo a participação deste evento na patogênese e progressão à doença. Resultados encorajadores obtidos por nosso grupo demonstraram que o bloqueio da modulação de CD4 mediada por Nef em células infectadas pode ser uma boa abordagem terapêutica. Baseados nestes resultados e com o intuito de identificar novos alvos e abordagens terapêuticas, traçamos como principal objetivo neste estudo determinar o real papel fisiológico da tioesterase humana II (hTE) na modulação do receptor CD4 mediada por Nef. Esta proteína foi descrita como um dos principais parceiros celulares de Nef neste processo fisiopatológico. Utilizando a ferramenta molecular do RNA de interferência (RNAi) para bloquear a expressão de proteínas celulares e virais envolvidas neste fenômeno, foi possível observar que hTE não desempenharia um papel relevante na modulação de CD4, contrariamente ao assinalado em trabalhos prévios. Porém, esta proteína mostrou participar na regulação dos níveis de CD4, possivelmente através da despalmitoilação do receptor viral na superfície celular, levando a internalização da molécula independentemente da presença de Nef. Outros resultados obtidos neste estudo também indicam que ao menos em variantes de Nef que se ligam a esta proteína, como a presente na cepa NL43, a ação da enzima celular poderia ser potencializada pela proteína viral. No entanto a confirmação desta como outras hipóteses relacionadas às possíveis conseqüências biológicas da interação entre hTE e Nef requerem estudos adicionais. _________________________________________________________________________________________ Abstract The down-modulation of CD4 receptor expression is one of the most important events during the HIV-1 infection. Among the three viral proteins involved in this process Nef, Env and Vpu, the first one is the most relevant. Results obtained by our group and others showed a clear relationship between the virus mediated receptor down-modulation, the increasing of infectivity and viral replication of HIV-1, suggesting a pathogenic role in this phenomenon and disease progression. More recently, we provided proof-of-concept that specific inhibition of Nef mediated CD4 down-modulation could be a good therapeutical strategy. Based on these results and aiming to identify new targets and therapeutical strategies, we investigated the physiological role of the human tioesterase II (hTE) in the down-modulation of CD4 receptor mediated by Nef. The hTE was described as one of the main cellular partners of Nef in this process. Using the interference RNA (RNAi) mechanism, as a molecular tool to block cellular and viral proteins expression involved in this phenomenon, we observed that hTE does not play a relevant role on Nef-CD4 modulation, as assigned by previous works. We showed here that the participation in the regulation of cellular surface CD4 levels possibly by a depalmitolation process, making the internalization independent of Nef. The hTE enzymatic action on Nef-NL43 transfected cells showed a probably synergism between Nef and hTE. The confirmation of these preliminary findings as well as, a more thoroughly understanding of the general biological consequences arising from the interaction between hTE and Nef, requires additional studies.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. A diminuição da expressão do receptor CD4 da superfície da célula infectada é um dos mais importantes eventos durante a infecção pelo vírus da Imunodeficiência Adquirida (HIV-1). Três proteínas virais, Nef, Env e Vpu, participam neste processo, sugerindo que a remoção do receptor viral possui um papel crítico no ciclo de vida destes retrovírus. Dentro deste contexto, estudos descritos por outros grupos e o nosso, mostraram claramente a relação entre a capacidade de diminuir a expressão do receptor viral e o aumento de infectividade e capacidade replicativa do HIV-1, o que sugere a participação deste fenômeno na patogênese e progressão à doença. Baseado nestes dados, este estudo propõe investigar a presença de possíveis mutações nas seqüências de alelos de vpu, presente em diferentes estágios clínicos da infecção. Por outro lado, aproveitando a abordagem de PCR utilizada, foram também analisadas as seqüências dos alelos do exon 1 do gene rev e do peptídeo sinal do gene env. Na análise dos alelos de vpu em amostras de DNA genômico de células de sangue periférico de 12 pacientes, nos estágios inicial e tardio da infecção, foram detectadas 37 mutações (P3S, -L, I4Q, V6L, I8P, I26F, L41I, L45I, I46R, E59D, - QEE, A74P, W75G, V6I, A7T, V60L, I4E, V6F, I15A, V20I, I26L, R36K, M66T, E50D, -V, I4V, V6S, A14V, S23T, I24L, I26G, R29S, M69L, I78V, D79V, I27G e D79A) nos alelos presentes no estágio inicial, sendo que oito mutações (P3S, -L, L45I, I46R, E59D, -QEE, I15A, M66T) apresentaram diferenças estatisticamente significativas (p0,05. Finalmente, no peptídeo sinal da proteína Env, foi detectado seis mutações (IRKN, IRRNC, GIKKNC, IRMSC, IRKNC e TLL) no estágio inicial e uma (K16E) no estágio tardio, porém essas mutações, não apresentaram diferenças estatisticamente significativas (p>0,05). A localização das mutações detectadas, assim como, sua possível correlação com os estágios clínicos da infecção, sugerem que estas possam vir a desempenhar importante papel na função das proteínas analisadas e conseqüentemente no curso da infecção. Dessa forma, espera-se que as informações obtidas neste estudo nos permitam posteriormente junto com testes funcionais "in vitro", determinar a relevância fisiológica da proteína Vpu, como das outras regiões analisadas, na patogênese da AIDS. _________________________________________________________________________________________ Abstract Down-modulation of CD4 receptor expression is one of the most important events during the HIV-1 infection. Three viral proteins, Nef, Env and Vpu participate in this process, suggesting that viral receptor removal from the cell surface exerts a critical role in the retroviral life cycle. In this context, results achieved by for our group and others clearly showed a relationship between the infected cells viral receptor down-modulation and the increased infectivity and viral replication of HIV-1. These data suggest participation of this phenomenon in the pathogenesis and progression to the syndrome. Based on these data, it was investigated the presence of possible mutations in the alleles sequences of vpu, present in different clinical stages of HIV-1 infection. On the other hand, and taking advantage of the PCR approach utilized it was also analysed the allelic sequences of exon 1 rev gene and of env gene signal peptide. The analysis of genomic DNA obtained from peripheral blood samples of 12 patients, in the early and late stage of infection, detected 37 mutations (P3S, -L, I4Q, V6L, I8P, I26F, L41I, L45I, I46R, E59D, - QEE, A74P, W75G, V6I, A7T, V60L, I4E, V6F, I15A, V20I, I26L, R36K, M66T, E50D, -V, I4V, V6S, A14V, S23T, I24L, I26G, R29S, M69L, I78V, D79V, I27G e D79A) in the vpu alleles present in the early stage of infection, of these, eight mutations (P3S, -L, L45I, I46R, E59D, -QEE, I15A, M66T) showed statistically differences significant (p0.05 value. Finally, in the env peptide signal, six mutations were detected (IRKN, IRRNC, GIKKNC, IRMSC, IRKNC e TLL) in the initial stage and one (K16E) in the late stage of infection. Nevertheless, these mutations did not show statistical differences (p>0.05). Mapping of detected mutations, as well as, the possible correlation with different clinical infection stages of AIDS, suggests that Vpu and Env peptide signal could play an important function in the disease evolution. Therefore, we hope these informations, related to mutations in different alleles, would allow us in the near future; allied with in vitro experiments, contribute to the elucidatation the physiological relevance of Vpu protein as also, the other analyzed regions, in the pathogenic mechanisms of AIDS.