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Recientemente, se han descubierto experimentalmente numerosas mini-proteínas (< 50 aminoácidos) implicadas en procesos esenciales para las bacterias. Sin embargo, la existencia de estas miniproteínas se encuentra sesgada por la deficiente anotación de los genomas, que normalmente se basa en algoritmos arbitrarios que las excluyen. Mediante la combinación de diversas tecnologías de última generación, nuestro grupo está estudiando las mini-proteínas que constituyen el proteoma oculto de Staphylococcus aureus, una de las bacterias patógenas de mayor relevancia clínica. En este estudio presentamos la caracterización funcional de una mini-proteína de 21 aminoácidos (5’Lip), altamente conservada en el género Staphylococcus, que no se encuentra anotada en las bases de datos públicas. 5’Lip está codificada en la región 5’ del mRNA que produce SAL1, una de las dos lipasas extracelulares importantes para la virulencia de este patógeno. Descubrimos que la expresión constitutiva de 5’Lip disminuía la actividad lipasa de los sobrenadantes de cultivo debido a una reducción en la cantidad de lipasas extracelulares, mayoritariamente de SAL2. Mutaciones puntuales en 5’Lip demostraron que la fenilalanina 20 es esencial para su función. Los análisis de expresión y localización subcelular revelaron que la disminución de la actividad lipasa es debida a la inducción por parte de 5 ́Lip de la formación de agregados proteicos asociados a la superficie celular que capturan e insolubilizan a las lipasas. Interesantemente, los estudios proteómicos indicaron que las PSMs (phenol-soluble modulins), otras mini-proteínas de S. aureus que pueden formar amiloides estructurados, posiblemente también estén involucradas en este proceso. Además, demostramos que SAL2, marcada con la proteína fluorescente MARS, co-localiza con el colorante Tioflavina-T, indicando el posible carácter amiloide de estos complejos proteicos. Los próximos estudios están dirigidos a demostrar la relación entre 5’Lip, las PSMs

La microbiota del tracto gastrointestinal constituye el biofilm más abundante del cuerpo humano (1). La composición de la matriz extracelular del biofilm varía entre las diferentes especies bacterianas y es susceptible a cambios ambientales. Estudios recientes han reconocido que los amiloides son elementos funcionales y estructurales de la matriz extracelular del biofilm de muy diversas bacterias. La presencia de amiloides funcionales proporciona integridad a la estructura del biofilm, favorece su estabilidad, media la interacción con otros componentes de la matriz y evita la degradación de proteínas del biofilm por proteasas y estreses externos. Por tanto, estas estructuras podrían considerarse como uno de los componentes mayoritarios del biofilm de la microbiota intestinal. Además, se postula que la presencia/ausencia, o cambios en la abundancia de los amiloides de la microbiota intestinal, podrían actuar como punto de inflexión en el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas, gastrointestinales, autoinmunes o cáncer. Sin embargo, nuestros conocimientos actuales sobre amiloides bacterianos en el tracto gastrointestinal y ,especialmente, durante una disbiosis intestinal, son limitados. En este trabajo, hemos puesto a punto un protocolo para purificar amiloides provenientes de muestras de microbiota fecal humana. Las muestras fecales fueron sometidas a un fraccionamiento por gradiente de densidad, centrifugación diferencial y lavados con detergentes. Además, haciendo uso de un ensayo de retención en filtro, hemos sido capaces de detectar estructuras amiloides formadas por la proteína Esp de Enterococcus faecalis en varias muestras fecales. Los aislados de E. faecalis productores de amiloides presentaban una elevada capacidad para formar biofilm (2). Asimismo, hemos determinado que la presencia de amiloides bacterianos provocaba cambios en la permeabilidad intestinal así como en la composición de la microbiota. Estos resultados sugieren que los amiloides bacteria

Aedes albopictus is a species of mosquito, originally from Southeast Asia, that belongs to the Culicidae family and the Dipteran insect order. The distribution of this vector has rapidly changed over the past decade, making most of the temperate territories in the world vulnerable to important human vector-borne diseases such as dengue, yellow fever, zika or chikungunya. Bacillus thuringiensis var. israeliensis (Bti)-based insecticides represent a realistic alternative to the most common synthetic insecticides for the control of mosquito larvae. However, several studies have revealed emerging resistances to the major Bti Crystal proteins such as Cry4Aa, Cry4Ba and Cry11Aa, making the finding of new toxins necessary to diminish the exposure to the same toxicity factors overtime. Here, we characterized the individual activity of Cyt1Aa, Cry4Aa, Cry4Ba and Cry11Aa against A. albopictus and found a new protein, Cyt1A-like, that increases the activity of Cry11Aa more than 20-fold. Additionally, we demonstrated that Cyt1A-like facilitates the activity three new Bti toxins: Cry53-like, Cry56A-like and Tpp36-like. All in all, these results provide alternatives to the currently available Bti products for the control of mosquito populations and position Cyt proteins as enablers of activity for otherwise non-active crystal proteins.

La microbiota del tracto gastrointestinal constituye el bioflm más abundante del cuerpo humano (1). La composición de la matriz extracelular del bioflm varía entre las diferentes especies bacterianas y es susceptible a cambios ambientales. Estudios recientes han reconocido que los amiloides son elementos funcionales y estructurales de la matriz extracelular del bioflm de muy diversas bacterias. La presencia de amiloides funcionales proporciona integridad a la estructura del bioflm, favorece su estabilidad, media la interacción con otros componentes de la matriz y evita la degradación de proteínas del bioflm por proteasas y estreses externos. Por tanto, estas estructuras podrían considerarse como uno de los componentes mayoritarios del bioflm de la microbiota intestinal. Además, se postula que la presencia/ausencia, o cambios en la abundancia de los amiloides de la microbiota intestinal, podrían actuar como punto de infexión en el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas, gastrointestinales, autoinmunes o cáncer. Sin embargo, nuestros conocimientos actuales sobre amiloides bacterianos en el tracto gastrointestinal y ,especialmente, durante una disbiosis intestinal, son limitados. En este trabajo, hemos puesto a punto un protocolo para purifcar amiloides provenientes de muestras de microbiota fecal humana. Las muestras fecales fueron sometidas a un fraccionamiento por gradiente de densidad, centrifugación diferencial y lavados con detergentes. Además, haciendo uso de un ensayo de retención en fltro, hemos sido capaces de detectar estructuras amiloides formadas por la proteína Esp de Enterococcus faecalis en varias muestras fecales. Los aislados de E. faecalis productores de amiloides presentaban una elevada capacidad para formar bioflm (2). Asimismo, hemos determinado que la presencia de amiloides bacterianos provocaba cambios en la permeabilidad intestinal así como en la composición de la microbiota. Estos resultados sugieren que los amiloides bacterianos del bi

Nontypeable Haemophilus infuenzae (NTHi) is a human-adapted bacterial pathogen causing airway infections. NTHi is an intracellular facultative pathogen, capable of both forming bioflms and invading airway epithelial cells, a combination of traits likely contributing to persistence. Standardised clinical procedures for antibiotic administration rely on pathogen identifcation and antibiotic susceptibility testing, often performed on single-colony bacterial isolates. For respiratory pathogens, this could be questionable as chronic patients may be persistently colonised by multiple clones. Moreover, diferences in the susceptibility of the diferent strains present within the same isolate have been reported for a variety of antibiotics. In vitro polyclonal infections can be assessed at the single cell level using bacterial strains engineered for diferential labelling. However, appropriate genetic tools amenable for H. infuenzae are currently limited. Here, we designed a novel plasmid toolkit named pTBH (toolbox for Haemophilus) for engineering H. infuenzae, with functional components (cargo module, two selectable markers, and a replication origin) assembled in modular combinations to create standardised and versatile plasmids. Using this structure, six reporter genes for fuorescent or bioluminescent labelling, expressed from a constitutive promoter, were independently assembled. This plasmid set was introduced into two phenotypically divergent H. infuenzae strains, and the engineered strains were used to analyse mixed bioflm growth architecture, antibiotic efcacy, and to visualise the dynamics of alveolar epithelial co-infection. The mixed bioflms showed a bilayer architecture and selective antibiotic efcacy associated to the respective susceptibility profles of their members. Furthermore, diferential kinetics of bacterial intracellular location within subcellular acidic compartments was quantifed upon co-infection of cultured airway epithelial cells by quantitative image

Genomic diversity of nontypeable H. influenzae strains confers phenotypic heterogeneity. Multiple strains of H. influenzae can be simultaneously isolated from clinical specimens, but we lack detailed information about polyclonal infection dynamics by this pathogen. A long-term barrier to our understanding of this host-pathogen interplay is the lack of genetic tools for strain engineering and differential labeling. Here, we present a novel plasmid toolkit named pTBH (toolbox for Haemophilus), with standardized modules for fluorescent or bioluminescent labeling, adapted to H. influenzae requirements but designed to be versatile so it can be utilized in other bacterial species. We present detailed experimental and quantitative image analysis methods, together with proof-of-principle examples, and show the ample possibilities of 3D microscopy, combined with quantitative image analysis, to model H. influenzae polyclonal infection lifestyles and unravel the co-habitation and co-infection dynamics of this respiratory pathogen.