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Dissertação (Mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. Baculovírus são vírus de DNA dupla-fita circular que infectam insetos principalmente da ordem Lepidoptera. O problema de seu uso como inseticida é o tempo que este leva para matar o inseto hospedeiro. A fim de resolver este problema, inserção de genes inseticidas no genoma viral pode ser requerida. Uma importante fonte de proteínas inseticidas é o veneno de aracnídeos, cujo alvo e ação permanecem pouco elucidados. Assim, promopos o uso de baculovírus como ferramenta para entender mecanismo de ação de peptídeos tóxicos em células de inseto. Diante disso, diferentes versões da toxina putativa BaTx derivada de biblioteca de cDNA da glândula de veneno da aranha caranguejeira Brachypelma albiceps foram obtidas por PCR e usadas para construção de baculovírus recombinantes. Os recombinantes foram usados para infecção de duas linhagens de lepidópteros, IPLB-Sf1-AE e BTI-Tn5B1-4 e a viabilidade celular foi avaliada durante a infecção. As diferentes versões da toxina causaram morte celular precoce por necrose em níveis diferenciados. Análise estrutural e ultraestrutural mostraram clara mudança citomorfológica em células, corroborando perda de integridade da membrana plasmática e do conteúdo citoplasmático, permanência do núcleo com carioteca intacta e associada a restos de membranas circundantes. Esta característica criou um aspecto rugoso quando observado em microscopia de luz. Além disso, o gene da toxina BaTx foi expresso em sistema procariótico para obtenção de antisoro policlonal murino. Entretanto, quando testado contra extratos de células infectadas com recombinantes, não houve marcação. Fato este esperado, uma vez que a toxina não foi observada em gel SDS-PAGE. Não há relatos de genes de toxinas de aranha com ação citotóxica clonadas em baculovírus, provavelmente esta característica não permitiu que houvesse acúmulo da toxina em níveis diagnosticáveis por imunomarcação ou pode ter promovido instabilidade peptídica. Peptídeos formadores de canais apresentam alto conteúdo de resíduos básicos (arginina e lisina), de cisteínas e conformação em folha-beta. BaTx apresenta todas estas características, porém alvo e ação permanecem obscuros. Canais tipo-TRP são encontrados em insetos e há indícios da presença desses transportadores na membrana plasmática e em membranas intracelulares. Talvez estes canais possam ser o alvo de ação da toxina BaTx. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT Baculoviruses are dsDNA circular virus infectives to insects mainly from the Order Lepidoptera. Its biopesticide use problem is the time of death during insect infection. To solve this problem, insecticide genes can be inserted into the viral genome. An important insectice protein source is the venom of arachinids. However, the target and action of many peptides remain unclear. Baculoviruses can be used as a tool to udersatand the toxic peptides playing in insect cells. Thus, different vesions of a putative toxin were obtained from cDNA library of the tarantula Brachypelma albiceps venom gland by PCR and used to construct recombinant baculoviruses. The recombinants were used to infect two lepidopteran cell lines, IPLB-Sf1-AE and BTITn5B1- 4, and cell viability was evaluated during infection. The toxin versions caused wide and early cell death by necrosis in different levels. Structural and ultrastructural analyses showed clear cytomorphological changes, corroborating loss of the plasma membrane integrity and cytoplasmic contents, and nucleus with intact karyotheca linked with surrounding plasma membrane remains. The features created a rough aspect when those infected cells were observed by light microscopy. Furthermore, the BaTx toxin gene was expressed by a prokaryotic system to obtain murine polyclonal antiserum. However, when the antiserum was tested against infected cells extract with recombinant virus carrying the BaTx toxin no reaction was detected. This observation was expected since the toxin was not observed by SDS-PAGE. There are no reports of spider toxin genes with necrotic action cloned into baculovirus, probably this feature did not allowed toxin accumulation in detectable levels by immunoblot or it could have promoted protein instability. Channel former peptides show high content of basic amino acid residues (lysine and arginine), cystein residues, and beta-sheet conformation. BaTx presents all those features, but its target and mode of action remain unknown. TRP-like channels are found in insects and there is evidence of the presence of these iontransporters in intracellular membranes as well as in plasma membrane. Perhaps TRPlike channels can be the BaTx toxin target of action.

Baculoviruses are bioinsecticides widely used in Brazil and in the world and can replace, assist or reduce the consumption of agrochemicals in agricultural crops. They are part of the Baculoviridae family, a family of viruses that contain a double-stranded, supercoiled, circular DNA genome. The genome size varies between 80-180 kb and encodes 90-180 genes, of which only 38 are present in all baculoviruses sequenced to date. They are insect-specific pathogens and are divided into four genera, Alphabaculovirus and Betabaculovirus contain members that are infective for lepidopteran larvae, Gammabaculovirus contain members that are infective for Hymenopteran larvae, and Deltabaculovirus which contain members that are infective for dipteran larvae. In addition, as a distinct characteristic, they present two viral phenotypes during a complete cycle of infection, one responsible for the primary oral infection and which is protected within the body from occlusion, active principle of baculovirus-based bioinsecticides and another phenotype responsible for the spread of secondary infection along the body of the insect. In the present work, the genome of a new baculovirus isolated from the rice and wheat pest of the Mythimna sequax species that causes an economic impact on these crops was characterized. Scanning electron microscopy confirmed the characteristic polyhedral occlusion body of Alphabaculoviruses, hence the virus was named Mythimna sequax nucleopolyhedrovirus (MyseNPV). The virus genome showed 148,403 bp, G + C content of 40.3% and 169 genes were noted, 13 of which are exclusive to this baculovirus. It is a member of the genus Alphabaculovirus and is closely related to seven other baculoviruses that infect insects of the family Noctuidae, including the viruses that infect insects of the genus Mamestra and the species Helicoverpa armigera. Although there are five recognized species among those closely related, only three were true species, MyseNPV being potentially one of them. The other viruses were just viral isolates. This was reinforced by the similarity of the chitinase and cathepsin gene locus between the true species. A selection analysis was performed for each gene shared by all MyseNPV-related genomes using an individual dN/dS analysis. A total of 221 different genes were found with only 152 shared by the eight genomes. Only three genes underwent positive selection in this group, hoar, bro-d and MyseNPV-127. The fp25k, p28, cathepsin, vlf-1 are those that undergo the greatest purification selection of those 152 genes. That said, the increase in the number of fully sequenced baculoviruses is beneficial for a better understanding of baculoviruses and their evolution, potentially helping the use of baculoviruses both as a biopesticide and expression vectors. Os baculovírus são bioinseticidas amplamente utilizados no Brasil e no mundo e podem substituir, auxiliar ou reduzir o consumo os agroquímicos comuns em lavouras agrícolas. Fazem parte da família Baculoviridae, uma família de vírus que contém genoma de DNA circular, superenovelado de fita dupla. O tamanho do genoma varia entre 80-180 kb e codifica para 90-180 genes, destes apenas 38 estão presentes em todos os baculovírus sequenciados até a data. Eles são patógenos específicos para insetos e são divididos em quatro gêneros, Alphabaculovirus e Betabaculovirus contém membros que são infectivos para larvas de lepidópteros, Gammabaculovirus contém membros que são infectivos para larvas de himenópteros e Deltabaculovirus que contém membros infectivos para larvas de dípteros. Além disso, como característica distinta, apresentam dois fenótipos virais durante um ciclo completo de infecção, um responsável pela infecção oral primária e que está protegido dentro do corpo de oclusão, princípio ativo de bioinseticidas a base de baculovírus e outro fenótipo responsável pelo espalhamento da infecção secundária ao longo do corpo do inseto. No presente trabalho, foi caracterizado o genoma de um novo baculovírus isolado da praga de arroz e trigo da espécie Mythimna sequax que causa impacto econômico nessas culturas agrícolas. Microscopia eletrônica de varredura confirmou o corpo de oclusão poliédrico característico dos Alphabaculovirus, por isso o vírus foi denominado Mythimna sequax nucleopolyhedrovirus (MyseNPV). O genoma do vírus apresentou 148.403 pb, conteúdo G + C de 40,3% e foram anotados 169 genes, sendo 13 exclusivos deste baculovírus. Trata-se de um membro do gênero Alphabaculovirus e está proximamente relacionado a outros sete baculovírus que infectam insetos da família Noctuidae, incluindo os vírus que infectam insetos do gênero Mamestra e da espécie Helicoverpa armigera. Apesar de haver cinco espécies reconhecidas dentre os proximamente relacionados, apenas três eram espécies verdadeiras, sendo MyseNPV potencialmente uma delas. Os outros vírus eram apenas isolados virais. Isso foi reforçado pela similaridade do lócus dos genes da chitinase e cathepsin entre as espécies verdadeiras. Realizou-se uma análise de seleção para cada gene compartilhado por todos os genomas relacionados ao MyseNPV por meio de uma análise de dN/dS individual. Um total de 221 genes diferentes foram encontrados com apenas 152 compartilhados pelos oito genomas. Apenas três genes sofriam seleção positiva neste grupo, hoar, bro-d e MyseNPV-127. O fp25k, p28, catepsina, vlf-1 são aqueles que sofrem maior seleção de purificação daqueles 152 genes. Dito isso, o aumento no número de baculovírus completamente sequenciados é benéfico para o melhor entendimento dos baculovírus e a sua evolução, podendo ajudar potencialmente o uso de baculovírus tanto como biopesticida, como vetores de expressão.

Selenium (Se) plays a biological role for many organisms that may include reproduction, immune defense, and disease resistance. A selenoprotein has an amino acid residue containing the element selenium (Se), called selenocysteine (Sec) or 21st amino acid. Selenoproteins are a broad group of proteins identified as misidentified and poorly annotated in databases. These genes are complex due to the ambiguity of the identification codon "UGA", considered a stop codon and selenocysteine signal. SECIS elements are RNA structures essential for selenocysteine incorporation, being used as gene indicators of selenoproteins in bioinformatics. The objective of this research was to evaluate the pre-verbal candidate genes of selenoproteins from Aedes aegypti and Aedes albopictus, in silico, evaluating their modulation during infection by the arboviruses Dengue virus 1 (DENV1) and 2 (DENV2). Search for possible selenoprotein genes in Ae.aegypti and Ae.albopictus, in the NCBI database “National Center for Biotechnology Information” and analysis of the sequences in the Seblastian platform, predictor of SECIS, resulted in the identification in Ae. aegypti from 11 candidate genes for selenoproteins in the mRNA set and 2 in ncRNAs and in Ae. albopictus of 3 possible genes among the set of mRNAs and 3 in ncRNAs. In addition, genes for selenoproteins and genes associated with their biosynthesis machinery were evaluated for their expression at the transcriptional level in two species-derived mosquito strains. All the putative selenoprotein genes already described, as well as the genes associated with the synthesis machinery, were transcribed at different levels. During DENV1 invasion of Ae.aegypti Aag2 cells, there was a transcriptional increase in the Gawky gene, a candidate gene for selenoprotein, and a transcriptional increase in the Sergef gene, a gene for the selenoprotein synthesis machinery. DENV1 infection in Ae. albopictus did not consider the transcriptional modulation of genes. Aag2 cells, during DENV2 infection, significantly decreased transcription of the SelenoK gene commonly found in arthropods, Eif1ax, Kcnt2 and Tigd6, candidate genes, Pstk, Sars1 and Sbp2 genes, machinery genes, and increased transcription of SelenoH, also found in most arthropods. In C6/36 cells there was a transcriptional decrease of SelenoH induced by DENV2 infection and a transcriptional increase of Sars1 and decrease in the transcription of Secp43, another gene in the machinery. Wolbachia co-infection induced a transcriptional increase of SelenoK in Aag2 cells and decreased transcription of the putative selenoproteins Gawky, Girdin, Ikzf1, Kcnt2, Rip3 and Tigd6 and of the machinery genes Efsec, Sbp2 and Sepsecs. In C6/36 cells, Wolbachia co-infection increased SelenoH transcription and increased transcription of Xpr1, a gene predicted in Ae.albopictus, and Efsec. These data corroborate the importance of Se in the nutrition of mosquitoes and may have an implication in the modulation of the immune system during persistent infection by arboviruses of human interest. In fact, the results of the present work reinforce the need for further studies to refine the selenoprotein search tools. O selênio (Se) exerce um papel biológico para muitos organismos que podem incluir reprodução, defesa imunológica e resistência a doenças. Uma selenoproteína apresenta um resíduo de aminoácido contendo o elemento selênio (Se), chamado selenocisteína (Sec) o 21º aminoácido. As selenoproteínas são um grupo amplo de proteínas normalmente mal identificadas e mal anotadas em bancos de dados de sequências. A identificação desses genes é complexa devido à ambiguidade do códon "UGA", considerado um códon de terminação e sinalizador de selenocisteína. Elementos SECIS são estruturas de RNA essenciais para a incorporação de selenocisteína, sendo usados como marcadores gênicos de selenoproteínas em diversos estudos de bioinformática. O objetivo desta pesquisa foi prever genes candidatos de selenoproteínas de Aedes aegypti e Aedes.albopictus, in silico, avaliando sua modulação durante a infecção pelos arbovírus Dengue vírus 1 (DENV1) e 2 (DENV2). A busca por possíveis genes de selenoproteínas em Ae.aegypti e Ae.albopictus, no banco de dados NCBI “National Center for Biotechnology Information” e análise das sequências na plataforma Seblastian, preditor de SECIS, resultou na identificação em Ae. aegypti de 11 genes candidatos para selenoproteínas no conjunto de mRNAs e 2 em ncRNAs e em Ae. albopictus de 3 genes possíveis entre o conjunto de mRNAs e 3 em ncRNAs. Além disso, os genes para selenoproteínas e genes associados à sua maquinaria de biossíntese foram avaliados quanto a sua expressão em nível transcricional em duas linhagens de mosquito derivadas das duas espécies. Todos os genes de selenoproteínas putativos já descritos, bem como os genes associados a maquinaria de síntese foram transcritos em diferentes níveis. Durante a infecção por DENV1 em células Aag2 de Ae.aegypti, houve diminuição transcricional do gene Gawky, gene candidato para selenoproteína, e um aumento transcricional do gene Sergef, gene da maquinaria de síntese das selenoproteínas. A infecção por DENV1 em células C6/36 de Ae. albopictus não causou modulação transcricional nos genes avaliados. Células Aag2, durante a infecção por DENV2, diminuiu significativamente a transcrição do gene de SelenoK comumente encontrado em artrópodes, o Eif1ax, o Kcnt2 e o Tigd6, genes candidatos, os genes Pstk, Sars1 e Sbp2, genes da maquinaria, e aumentou a transcrição de SelenoH, também encontrado na maioria dos artrópodes. Em células C6/36 houve uma diminuição transcricional de SelenoH induzida pela infecção por DENV2 e um aumento transcricional de Sars1 e diminuição na transcrição de Secp43, outro gene da maquinaria. A co-infecção de Wolbachia induziu um aumento transcricional de SelenoK, em células Aag2, e diminuiu a transcrição das selenoproteínas putativas Gawky, Girdin, Ikzf1, Kcnt2, Rip3 e Tigd6 e dos genes Efsec, Sbp2 e Sepsecs da maquinaria. Nas células C6/36 a co-infecção por Wolbachia aumentou a transcrição de SelenoH e aumentou a transcrição de Xpr1, um gene predito em Ae.albopictus, e do Efsec. Esses dados corroboram a importância do Se na nutrição dos mosquitos, e pode ter implicação na modulação do sistema imune durante infecção persistente por arbovírus de interesse humano. De fato, os resultados do presente trabalho reforçam a necessidade de maiores estudos para refinar as ferramentas de busca de selenoproteínas.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Foodborne zoonotic disease, listeriosis contains numerous gaps in knowledge regarding its pathogenic mechanisms. In addition, the problem of bacterial resistance requires potential alternatives to treatment. The aim of this study was to verify changes in the cholinergic, purinergic, redox status and energy metabolism systems in listeriosis; as well as verifying the effects of free and nanoencapsulated curcumin in experimentally infected animals. In Experiment I, 10 cattle were used, 5 of which were infected with L. monocytogenes. Blood samples were collected on days 7 and 14 post-infection (PI) to assess acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE) activity. AChE activity was measured in central nervous system (CNS) on day 14 PI, time of euthanasia. Cerebral cortex, brainstem, cerebellum and spinal cord were used to measure AChE, NTPDases, ADA, PK, AK, CK, Na+/K+ATPase activities and redox status. In experiment II, gerbils were usedː with adult gerbils, an experimental study of the mechanisms of infection was carried out, similar to that carried out with cattle, with an infected group and a control group, euthanized at 6 and 12 days PI. After 12 days PI, the antibacterial action of PCR treatments on the spleen, oxidative stress, inflammatory and energy metabolism markers were evaluated. With young gerbils, a control group (group T0), infected without treatment (group T1), infected treated with free curcumin (group T2) and infected treated with nanocapsules curcumin (group T3) were formed. In experiment I, there was a positive PCR for the bacteria in the liver and CNS. In none of the experiments the animals showed clinical signs. AChE activity in blood, spleen, cerebral cortex and cerebellum was lower in those infected, as was BChE in serum 14 days PI. NTPDase, 5'-nucleotidase and ADA activity had lower activity on the same day in most brain structures, not changing in the spinal cord. Mitochondrial CK activity was higher and cytosolic lower in all brain structures; as well as PK and Na+/K+ATPase activity. In experiment II with adult gerbils, the liver and heart showed lower PK and Na+/K+ATPase activity, and in the heart, mitochondrial and cytosolic CK had lower activity in those infected. The ADA activity was lower in the infected brain as well as the AChE activity, while there were higher levels of ROS and lower levels of CAT and SOD in this group. In the experiment with young gerbils, PCR for Listeria in the spleen was positive at T1 (6 of 6), T2 (2 of 6) and T3 (5 of 6). In liver, PK activity was lower in T1 and T2, as well as Na+/K+ATPase activity. The group treated with nanoencapsulated curcumin had lower lipoperoxidation than the other groups, while all infected groups had higher ACAP. We conclude that subclinical L. monocytogenes infection causes alterations in the cholinergic, purinergic, redox and energy metabolic state in target and non-target organs, which contribute to the pathogenesis of the disease. There is a protective immunomodulatory response through the enzymatic activity of these systems, which seek to reestablish homeostasis in inflammation. Free curcumin showed an antibacterial effect, but the nanoencapsulated form was able to minimize changes in energy metabolism and lipoperoxidation. Doença zoonótica de origem alimentar, a listeriose contém inúmeras lacunas no conhecimento referentes aos seus mecanismos patogênicos. Além disso, a problemática de resistência bacteriana exige alternativas potenciais ao tratamento. O objetivo deste estudo foi verificar alterações no sistema colinérgico, purinérgico, status redox e metabolismo energético na listeriose; bem como, verificar os efeitos da curcumina livre e nanoencapsulada em animais experimentalmente infectados. No experimento I foram utilizados 10 bovinos, sendo 5 infectados com L. monocytogenes. Amostras de sangue foram coletadas nos dias 7 e 14 pós-infecção (PI) para avaliar a atividade da acetilcolinesterase (AChE) e da atividade da butirilcolinesterase (BChE). A atividade da AChE foram medidos no sistema nervoso central (SNC) no dia 14 PI, momento da eutanásia. Córtex cerebral, tronco cerebral, cerebelo e medula espinhal foram usadas para mensurar a atividades enzimáticas de AChE; NTPDases, ADA, PK, AK, CK, Na+/K+ATPase e status redox. No experimento II foram utilizados gerbilosː com gerbilos adultos foi realizado um estudo experimental dos mecanismos de infecção, similar ao realizado com os bovinos, sendo um grupo infectado e outro controle, eutanasiados 6 e 12 dias PI. Após 12 dias PI foi avaliada a ação antibacteriana dos tratamentos por PCR no baço, os marcadores de estresse oxidativo, inflamatórios e metabolismo energético. Com gerbilos jovens, formou-se o grupo controle (grupo T0), infectados sem tratamento (grupo T1), infectados tratados com curcumina livre (grupo T2) e infectados tratados com nanocápsulas contendo curcumina (grupo T3). No experimento I, houve PCR positivo para a bactéria no fígado e SNC. Em nenhum dos experimentos os animais apresentaram sinais clínicos. A atividade da AChE no sangue, no baço, no córtex cerebral e cerebelo foi menor nos infectados, assim como BChE no soro 14 dias PI. Atividade NTPDase, 5′-nucleotidase e ADA tiveram atividade menor no mesmo dia na maioria das estruturas encefálicas, não alterando na medula espinhal. A atividade da CK mitocondrial foi maior e citossólica menor em todas as estruturas encefálicas; assim como a atividade PK e Na+/K+ATPase. No experimento II, com gerbilos adultos o fígado e coração apresentaram menor atividade de PK e Na+/K+ATPase, e no coração a CK mitocondrial e citossólica tiveram menor atividade nos infectados. A atividade de ADA foi menor no encéfalo dos infectados assim como a atividade da AChE, enquanto houve maiores níveis de ERO e menor de CAT e SOD nesse grupo. No experimento com gerbilos jovens, o PCR para Listeria no baço foi positivo em T1 (6 de 6), T2 (2 de 6) e T3 (5 de 6). No fígado, a atividade da PK foi menor em T1 e T2, assim como a atividade Na+/K+ATPase. O grupo tratado com curcumina nanoencapsulada apresentou menor lipoperoxidação que os demais grupos, enquanto todos os grupos infectados tiveram maior ACAP. Concluímos que a infecção subclínica por L. monocytogenes causa alterações nos sistemas colinérgico, purinérgico, estado redox e metabólico energético em órgão alvo (SNC) e não alvos, que contribuem para a patogênese da doença. Há uma resposta imunomodulatória protetora através da atividade enzimática desses sistemas, os quais buscam reestabelecer a homeostase na inflamação. A curcumina livre demonstrou efeito antibacteriano, mas a forma nanoencapsulada foi capaz de minimizar alterações do metabolismo energético e lipoperoxidação.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES The Spodoptera genus, Guenée (1852) contains important polyphagous pests of agriculture. In Brazil, the occurrence of S. cosmioides used to be sporadic, although in recent years it has emerged as a primary pest in monocultures such as soybean, corn, and cotton. Here a new baculovirus isolated from S. cosmioides was characterized. The virus was found in extracts of dead black armyworm with signals of viral infection caused by baculovirus and named Spodoptera cosmioides nucleopolyhedrovirus isolated CNPSo-72 (SpcoNPV-CNPSo-72). SpcoNPV-CNPSo-72 occlusion bodies (OB) had a polyhedral shape with several occluded virions and multiple nucleocapsids per envelope. The new virus was lethal to healthy third-instar S. cosmioides larvae with an LC50 of 2.9 x 103 OB/ml, but not to larvae of S. frugiperda at the tested concentrations. The genome of the new virus was sequenced using Roche 454 technology, and the sequencing produce 14,499 reads that were assembled into a single circular contig of 147,763 bp with a G+C content of 44.8%. We annotated 161 ORFs and found only 20 genes as unique in baculovirus and five homologous regions. About 86% of the genome was composed of protein coding sequences, while 13% represent intergenic spaces and homolog regions. We found the 38 currently defined baculoviral core genes in the genome of SpcoNPV-CNPSo-72 and also a set of 26 genes shared between infectious baculoviruses in lepidopterans (members of genera Alphabaculovirus and Betabaculovirus). Interestingly, we found homologs of cathepsin and chitinase, which were much likely to the observed host tegument liquefaction when healthy larvae were exposed to virus OBs, as a post mortem phenotype similar to other viruses that infect members of Spodoptera. The virus also presented a tRNA-coding gene that corresponded to the amino acid arginine (Arg). We carried out a phylogenetic analysis of the new species based on the core genes and found that the new virus is closely related to members of Alphabaculovirus, especially those infectious to Spodoptera. We also performed a gene content comparison SpcoNPV-CNPso-72 and those most closely related and found 241 different genes, with only 119 genes shared among all analyzed species. Moreover, we applied the evolutive model of kimura-2-parameter adjusted to conserved regions of lef-8, lef-9, and polyhedrin and the number of substitutions per site suggested that SpcoNPV could constitute a new species within gens Alphabaculovirus. Baculoviruses are pathogens that lethally infect insect larvae and their study allows for a better understanding of the evolution of large DNA viruses, providing bases for the improvement of viruses as a tool in biological control like the discovery of genes associated with both specificity and host range. O gênero Spodoptera, Guenée (1852) contém importantes pragas agrícolas polífagas. No Brasil, a ocorrência de S. cosmioides costumava ser esporádica, embora nos últimos anos tenha emergido como praga primária em monocultivos tais como soja, milho e algodão. No presente trabalho, um novo baculovírus isolado de S. cosmioides foi caracterizado. O vírus foi encontrado em extratos de lagartas-preta-da-soja mortas com sinais de infecção por vírus e, após análises preliminares denominado Spodoptera cosmioides nucleopolyhedrovirus isolado CNPSo-72 (SpcoNPV-CNPSo-72). Os corpos de oclusão (OBs) do vírus apresentavam formato poliédrico com diversos vírions oclusos e com múltiplos nucleocapsídeos por envelope. O novo vírus é letal para larvas de S. cosmioides sadias no terceiro instar com uma LC50 de 2,9x103 OB/ml, mas não para S. frugiperda nas concentrações testadas. O genoma do novo vírus foi sequenciado usando a tecnologia 454 da Roche e o sequenciamento produziu 14.499 leituras que foram montadas em uma única sequência circular de 147.763 bp com conteúdo de G+C de 44,8%. Foram anotadas 161 ORFs hipotéticas com apenas 20 genes não encontrados em outros genomas de vírus da família Baculoviridae e cinco regiões homólogas. Cerca de 86% do genoma era composto por sequências codificadoras de proteínas, enquanto 13% representam espaços intergênicos e regiões repetitivas. Os 38 ‘genes core’ de baculovírus foram encontrados no genoma do SpcoNPV-CNPSo-72 e também o conjunto dos 25 genes compartilhados entre baculovírus infecciosos em lepidópteros (membros dos gêneros Alphabaculovirus e Betabaculovirus). Além disso, foram encontrados genes homólogos de catepsina e quitinase envolvidos na liquefação do tegumento do hospedeiro, como o observado no fenótipo post mortem de lagartas infectadas, semelhante a outros vírus que infectam indivíduos do gênero Spodoptera. Ainda o vírus possuía um gene de tRNA correspondente ao amino ácido arginina (Arg). A análise filogenética da nova espécie foi realizada com o alinhamento dos core genes e mostrou que o novo vírus está intimamente relacionado a membros de Alphabaculovirus, especialmente os infecciosos para lagartas do gênero Spodoptera. Foi realizada a comparação de conteúdo gênico entre o genoma de SpcoNPV-CNPso-72 e dos vírus mais proximamente relacionados em um Diagrama de Venn. Um total de 241 genes foram encontrados considerando os cinco genomas estudados e incluem Sper-NPV-251, SeMNPV-US1, SperNPV-CNPSo-165, SfMNPV-19. Somente 119 genes foram compartilhados no genoma de todas as espécies analisadas. O modelo de Kimura-2 parâmetros ajustado foi aplicado em regiões conservadas dos genes lef-8, lef-9 e poliedrina, e o valor obtido para o número de sustitítuições por sítio sugeriu que SpcoNPV constitui uma nova espécie dentro da família Baculoviridae. Baculovírus são patógenos que infectam lentamente larvas de insetos e seu estudo permite um melhor entendimento da evolução dos grandes vírus de DNA, fornecendo bases para o aprimoramento dos vírus como ferramenta no controle biológico, como a descoberta de genes associados à especificidade e ao espectro de hospedeiro.

Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq The brain is highly dependent on adequate glucose catabolism, but changes in brain glucose transport are well documented in hyperglycemic conditions. Recent evidence of “hyperglycemic memory" further suggests that chronic exposure to hyperglycemia may predispose to deleterious alteration even after normal glycemic levels are restored. Therefore, it is important not only to try to maintain circulating glucose levels within the normal range, but also to avoid the lasting complications caused by chronic hyperglycemia. At the end of the 20th century, insect models (such as Drosophila melanogaster) began to be considered as important tools in the study of insulin-related human pathologies. Cockroaches have already been shown to be effective experimental organisms for neurobiology research, therefore, we herein explore brain energy metabolism using a known alkylating agent – streptozotocin – in Nauphoeta cinerea. First, we elucidate the biochemical and molecular changes resulting from acute exposure of cockroaches to streptozotocin (1 dose of 74 nmol or 740 nmol per g of bodymass). Streptozotocin caused an increase in glucose, mRNA levels of glucose transporter 1, thiobarbituric acid reactive substances, total glutathione S-transferase activity, and glutathione levels in head homogenates. Fat body glycogen, head triglyceride content and the reduction of MTT in head homogenates were diminished. Our results showed streptozotocin-induced alterations in the metabolism of glucose in N. cinerea, and we also highlight the evolutionary conservation of GLUT1 between N. cinerea and other insects. Secondly, we examined how streptozotocin-induced hyperglycemia in the CNS of N. Cinerea affects redox homeostasis and the expression of genes related to inflammatory response. We found an increase in mRNA levels of early growth response factor (EGR) and reaper (target genes of the c-Jun N terminal kinase pathway); TOLL1 (target gene of the Toll/NF-κB pathway); unpaired 3 (UPD 3) and suppressor of cytokine signaling at 36E Socs36E (activator and target gene of the UPD3/JAK/STAT pathway); superoxide dismutase and catalase (primary antioxidants) and GST sigma. There was no significant difference in the expression of PDGF -and VEGF -related factor 1 (PVF1), peroxiredoxin (PRX), thioredoxin (TRX) and GST delta. These changes in inflammation-related signaling and antioxidant enzyme activity are similar to changes observed in rodents and humans with hyperglycemia. Third, we showed transcriptional modifications that are similar to results of genome wide association studies in mammals and flies, especially the up regulation of the 40S ribosomal protein S6 and its signaling molecules. Low dose STZ treatment deregulated more genes than the high dose treatment, and there was a higher rate of up regulation than down regulation. We also identified the putative insulin signaling pathway of N. cinerea and observed a decrease in the transcription of components of the PI3K/AKT pathway, but target genes of the RAS, P38 and JNK MAPK cascade were up regulated. Structure-function elements were also similar between the MAPK genes of N. cinerea and other insects. Together, these data demonstrate that the cockroach N. cinerea can be used in the study of metabolic alterations caused by increased brain glucose levels. O cérebro é altamente dependente do catabolismo de glicose adequado, mas as mudanças no transporte de glicose no cérebro são bem documentadas em condições hiperglicêmicas. Evidências recentes de "memória hiperglicêmica" sugerem ainda que a exposição crônica à hiperglicemia pode predispor a alterações deletérias, mesmo depois que os níveis glicêmicos normais são restaurados. Portanto, é importante não apenas tentar manter os níveis de glicose circulante dentro da faixa normal, mas também evitar as complicações duradouras causadas pela hiperglicemia crônica. No final do século 20, modelos de insetos (como Drosophila melanogaster) começaram a ser considerados ferramentas importantes no estudo de patologias humanas relacionadas à insulina. Baratas já se mostraram eficazes experimentais organismos para a pesquisa neurobiológica, portanto, aqui exploramos o metabolismo da energia do cérebro usando um conhecido agente alquilante - estreptozotocina - em Nauphoeta cinerea. Primeiro, elucidamos as alterações bioquímicas e moleculares resultantes da exposição aguda de baratas à estreptozotocina (1 dose de 74 nmol ou 740 nmol por g de massa corporal). A estreptozotocina causou um aumento na glicose, níveis de mRNA do transportador de glicose 1, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, atividade da glutationa S-transferase total e níveis de glutationa em homogêneos de cabeça. O glicogênio do corpo adiposo, o conteúdo de triglicerídeos na cabeça e a redução de MTT na cabeça foram diminuídos. Nossos resultados mostraram alterações induzidas por estreptozotocina no metabolismo da glicose em N. cinerea, e destacamos a conservação evolutiva de GLUT1 entre N. cinerea e outros insetos. Em segundo lugar, examinamos como a hiperglicemia induzida por estreptozotocina no CNS de N. Cinerea afeta a homeostase redox e a expressão de genes relacionados à resposta inflamatória. Encontramos um aumento nos níveis de mRNA do fator de resposta de crescimento precoce (EGR) e reaper (genes alvo da via da quinase c-Jun N terminal); TOLL1 (gene alvo da via Toll / NF-κB); unpaired 3 (UPD 3) e supressor de sinalização de citocina em 36E Socs36E (ativador e gene alvo da via UPD3 / JAK / STAT); superóxido dismutase e catalase (antioxidantes primários) e GST sigma. Não houve diferença significativa na expressão de fator 1 relacionado a PDGF e VEGF (PVF1), peroxirredoxina (PRX), tioredoxina (TRX) e GST delta. Essas mudanças na sinalização relacionada à inflamação e na atividade das enzimas antioxidantes são semelhantes às mudanças observadas em roedores e humanos com hiperglicemia. Terceiro, mostramos modificações transcricionais que são semelhantes aos resultados de estudos de associação do genoma em mamíferos e moscas, especialmente a regulação positiva da 40S proteína ribossômica S6 e suas moléculas de sinalização. O tratamento de STZ com dose baixa desregulou mais genes do que o tratamento com dose alta, e houve uma taxa maior de regulação positiva do que regulação negativa. Também identificamos a via de sinalização de insulina putativa de N. cinerea e observamos uma diminuição na transcrição de componentes do Via PI3K / AKT, mas os genes alvo da cascata RAS, P38 e JNK MAPK foram regulados para cima. Os elementos estrutura-função também foram semelhantes entre os genes MAPK de N. cinerea e outros insetos. Juntos, esses dados demonstram que a barata N. cinerea pode ser utilizada no estudo das alterações metabólicas causadas pelo aumento dos níveis de glicose no cérebro.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Studies using model organisms, such as insects, are growing and have sought to investigate, in a preliminary way, the mechanisms involved in the progression of infectious diseases, examine potential pharmacological targets and access bacterial virulence factors. Insects have organs and systems analogous to mammals, conserved metabolic pathways, short lifetimes and, in general, are easy to create and manipulate. However, few insect species have been used in studies to understand immune reactions. Thus, this work aimed to investigate the bases of the immune defense of the cockroach Nauphoeta cinerea and evaluate its potential as an alternative animal for the study of bacterial infection. Different amounts of colony-forming units (CFU) of Staphylococcus aureus were injected into the nymphs' thorax in the last juvenile stage. Survival, number of nymphs that reached the adult stage, changes in biochemical parameters in the hemolymph and fat body were verified and CFU was counted in the hemolymph, after inoculation of the microorganism. The potential immunological memory (priming) was evaluated in the face of repeated bacterial challenges, as well as behavioral changes associated with infection and the phenoloxidase (FO) enzyme activity in the hemolymph. The available transcriptome of N. cinerea, of the head and fat body, was used to investigate the relative basal expression of genes involved in the FO cascade and to analyze phylogenetic comparison of amino acids from other insects. The infection caused a decrease in metabolites in the hemolymph (glucose, amino acids, proteins and cholesterol) and inhibition of FO activity after 24 h post injection. Nymphs infected with the highest concentrations of S. aureus (2 x 108 and 2 x 1010 CFU/cockroach), when compared to control nymphs, showed an increase in mortality, permanent morphological changes in adults, an increase in CFU in hemolymph over time, decreased levels of protein in the fat body, decreased aggregation behavior and antenna grooming. Nymphs inoculated with 2 x 107 CFU/cockroach showed a decrease in CFU in the hemolymph over time, increased levels of protein in the fat body, increased locomotor activity and exploration. There was no change in FO activity in the acute phase of infection (up to 4 h). Priming with 2 x 107 CFU / cockroach, or saline, did not promote an increase in FO activity after the second challenge with 2 x 1010 CFU/cockroach. The survival and protection of cockroaches primed with sublethal concentration of S. aureus varied according to the bacterial metabolic condition. The FO sequence shares a high identity with insects of the Neoptera infraclass, especially for the copper B binding site. The results of the relative expression showed that the serine proteases and FO are more expressed in the head than in the fat body of N. cinerea nymphs. Based on the results, N. cinerea proved to be a promising model organism for use in studies related to bacterial infection. Estudos utilizando organismos-modelo, como os insetos, são crescentes e têm buscado investigar, de maneira preliminar, os mecanismos envolvidos na progressão das doenças infecciosas, examinar potenciais alvos farmacológicos e acessar fatores de virulência bacterianos. Os insetos possuem órgãos e sistemas análogos aos de mamíferos, vias metabólicas conservadas, tempo de vida curtos e, em geral, são de fácil criação e manipulação. No entanto, poucas espécies de insetos têm sido utilizadas em estudos para compreensão das reações imunes. Assim, este trabalho teve por objetivo investigar as bases da defesa imunológica da barata Nauphoeta cinerea e avaliar seu potencial como animal alternativo para o estudo de infecção bacteriana. Diferentes quantidades de unidades formadoras de colônia (UFC) de Staphylococcus aureus foram injetas no tórax de ninfas, em último estágio juvenil. Foi verificada a sobrevivência, número de ninfas que chegaram ao estágio adulto, alterações em parâmetros bioquímicos na hemolinfa, corpo gorduroso e foram contabilizadas UFC na hemolinfa, após inoculação do microrganismo. Foi avaliada a potencial memória imunológica (priming) frente a desafios bacterianos repetidos, alterações comportamentais associadas à infecção e a atividade da enzima fenoloxidase (FO) na hemolinfa. O transcriptoma disponível de N. cinerea, da cabeça e corpo gorduroso, foi utilizado para investigação da expressão relativa basal de genes envolvidos na cascata da FO e para análise de comparação filogenética dos aminoácidos de outros insetos. A infecção causou a diminuição de metabólitos na hemolinfa (glicose, aminoácidos, proteínas e colesterol) e inibição da atividade da FO após 24 h pós injeção. Ninfas infectadas com as maiores concentrações de S. aureus (2 x 108 e 2 x 1010 UFC/barata), quando comparadas às ninfas controle, apresentaram um aumento na mortalidade, alterações morfológicas permanentes nos adultos, aumento de UFC na hemolinfa, ao longo do tempo, diminuição dos níveis de proteína no corpo gorduroso, diminuição no comportamento de agregação e grooming de antenas. Ninfas inoculadas com 2 x 107 UFC/barata apresentaram diminuição de UFC na hemolinfa ao longo do tempo, aumento dos níveis de proteína no corpo gorduroso, aumento na atividade locomotora e exploração. Não houve mudança na atividade da FO na fase aguda da infecção (até 4 h). A pré-imunização com 2 x 107 UFC/barata, ou salina, não promoveu aumento da atividade da FO após segundo desafio com 2 x 1010 UFC/barata. A sobrevivência e a proteção de baratas que receberam imunização com concentração subletal de S. aureus variou de acordo com a condição metabólica bacteriana. A sequência da FO compartilha alta identidade com insetos da infraclasse Neoptera, especialmente para o sítio de ligação B do cobre. Os resultados da expressão relativa mostraram que as serino proteases e FO são mais expressas na cabeça do que no corpo gorduroso das ninfas de N. cinerea. Com base nos resultados, N. cinerea demonstrou ser um organismo-modelo promissor para utilização em estudos relacionados à infecção bacteriana.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Continuous exposure to small doses of toxic substances elicit changes in the transcriptional profile and function of proteins before causing physical damage to organisms. Toxic effects can appear even after exposure stops. Knowing the mechanism of action and identifying biomarkers of early substance toxicity are interests of the scientific community. As humans are continually exposed to several xenobiotics, it is necessary to study the effects of concomitant exposure to two or more toxic agents and establish experimental models for translational studies. Xenobiotics like methylmercury (MeHg+) and vinylcyclohexene (VCH) have similar electrophilic properties, albeit their combined toxicity profile has not been assessed. Thus, this work aims to study the effects of per os acute, intermediate and chronic exposure to MeHg+ and the possible reversal of the effects of this xenobiotic after the interruption of exposure in behavioral and biochemical parameters of the Lobster cockroach N. cinerea, as well as the individual and combined effect of MeHg+ and VCH on the transcriptional profile of the fly D. melanogaster since these compounds have similarities in their toxicity mechanisms (affinity for proteins containing –SH and –SeH). Cockroaches were exposed to diets containing 0 (control), 2.5, 25, and 100 μg of MeHg+/g of diet for 10, 30, and 90 days. Additional groups of cockroaches were fed the same doses of MeHg+ for 30 days and then underwent a detoxification period for 60 days. Nymphs exposed to 100 μg MeHg+/g succumbed to a high mortality rate, along with biochemical changes (increased production of reactive oxygen species and activity of glutathione S-transferase, as well as decreased acetylcholinesterase activity) and behavioral changes. We observed delayed mortality and behavioral changes in nymphs exposed to 100 μg MeHg+/g for 30 days with a subsequent 60 day detoxification period. To evaluate the transcriptional profile of D. melanogaster, RNA-sequencing of exposed flies was performed individually and concurrently at 1 mM VCH and 200 μM MeHg+ for three days. The VCH deregulated 38 genes (most of which were overexpressed), while MeHg+ altered 26 genes (14 down-regulated genes). The co-exposure of the VCH + MeHg+ altered 72 genes with a greater number of down-regulated genes. These results suggest that, although the compounds might have some similar protein targets, the transcriptional profile after individual exposures and co-exposure was different. The set of proteins that contains –SH and –SeH was explored and we identified thioredoxin, glutaredoxin, glutathione S-transferase, and glucose dehydrogenase as targets for VCH and/or MeHg+. Together, these data suggest that the use of insects in the study of compound toxicity is relevant, with D. melanogaster being widely used in research and N. cinerea being validated as a potential experimental organism for translational studies. We also indicate possible targets for MeHg+ and VCH that may be potential biomarkers of early toxicity to these xenobiotics. A exposição contínua a pequenas doses de substâncias tóxicas causam alterações no perfil transcricional e na função de proteínas antes de causarem prejuizos físicos nos organismos. Os efeitos tóxicos podem surgir até mesmo após a interrupção da exposição. Conhecer o mecanimo de ação e identificar biomarcadores de toxicidade precoce para substâncias são interesses da comunidade científica. Como o ser humano está constantemente exposto a vários xenobióticos, torna-se necessário estudar os efeitos da exposição a dois ou mais agentes tóxicos concomitantemente. Para isso, é necessário estabelecer modelos experimentais para estudos translacionais. Dentre os xenobióticos destacam-se o metilmercúrio (MeHg+) e o vinilciclohexeno (VCH), os quais ainda não possuem mecanismo de toxicidade completamente elucidados e apresentam propriedades eletrônicas semelhantes. Desta forma, este trabalho visa estudar os efeitos da exposição per os aguda, intermediária e crônica ao MeHg+ e a possível reversão dos efeitos deste xenobiótico após a interrupção da exposição em parâmetros comportamentais e bioquímicos da barata N. cinerea, assim como, o efeito isolado e da interação do MeHg+ e do VCH sobre o transcriptoma da mosca D. melanogaster, uma vez que estes compostos apresentam semelhanças nos seus mecanismos de toxicidade (afinidade por proteínas que contém –SH e –SeH). As baratas foram expostas a dietas contendo 0 (controle), 2,5, 25 e 100 μg de MeHg+/g de dieta por 10, 30 e 90 dias. Grupos adicionais de baratas foram alimentados com as mesmas doses de MeHg+ por 30 dias e depois foram submetidos a um período de desintoxicação por 60 dias. As ninfas expostas a 100 μg de MeHg+/g sucumbiram a uma alta taxa de mortalidade, juntamente com alterações bioquímicas (aumento da produção de espécies reativas de oxigênio e atividade da glutationa S-transferase, bem como diminuição da atividade da acetilcolinesterase) e alterações comportamentais. Observamos atraso na taxa de mortalidade e alterações comportamentais nas ninfas expostas a 100 μg de MeHg+/g por 30 dias e posteriormente submetidas a 60 dias de desintoxicação. Para avaliar o perfil transcricional da D. melanogaster foi realizado o sequenciamento de RNA de moscas expostas individual e concomitantemente a 1 mM de VCH e 200 μM de MeHg+ por três dias. O VCH desregulou 38 genes (dos quais a maioria estava super-expresso), enquanto o MeHg+ alterou 26 genes (14 genes sub-expressos). Já a coexposição do VCH + MeHg+ alterou 72 genes com maior número de genes sub-expressos. Estes resultados sugerem que, embora os compostos pudessem ter alguns alvos proteicos semelhantes, o perfil transcricional após exposições individuais e coexposição foi diferente. O conjunto de proteínas que contém –SH e –SeH foi prospectado e identicamos a tiorredoxina, glutarredoxina, glutationa S-transferase e glicose desidrogenase como alvos do VCH e/ou MeHg+. Em conjunto estes dados sugerem que o uso de insetos no estudo da toxicidade de compostos é relevante, sendo a D. melanogaster amplamente utilizada na pesquisa e a N. cinerea sendo validada como organismo experimental potencial para estudos translacionais. Indicamos também potenciais alvos do MeHg+ e VCH que podem ser potenciais biomarcadores de toxicidade precoce a estes xenobióticos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Mental disorders are a major challenge to global health, considered 21st century pandemics. About a third of the world's disability is caused by mental health problems. Faced with this situation, World Health Organization developed an action plan, which searches new strategies for promotion and prevention in mental health, and strengthening research in the area. Therefore, studies aimed at discovering new therapies in the area of mental health become attractive. Taurine has been studied as an adjuvant therapy in disorders of the central nervous system (CNS), due to the potential to prevent the glutamate excitotoxicity, calcium regulation, inflammatory processes and oxidative stress. Herein, we looking for to better understand the actions of taurine as a treatment for mental disorders in humans through zebrafish (Danio rerio) as a model organism. In a systematic review, we describe its main contributions and limitations as a model organism, assessing the central effects of taurine in neuropsychiatric diseases. Finally, we conclude that zebrafish is a model organism with great potential for assessing the neuroprotective effects of taurine in these diseases. Then, we investigated the effects of three concentrations of taurine (42, 150, 400 mg / L) on behavioral models of stress and anxiety in zebrafish. We found that taurine modulates the behavioral and neuroendocrine responses in this species in different contexts. In the first experiment, the fish were tested in the novel tank and light-dark test after treatment with taurine. We did not observe any behavioral difference in the novel tank, only in the light-dark test. All concentrations of taurine prevented the anxiety-like behavior (scotaxis) in fish, allowing them to spend more time in the light area, indicating anxiolytic activity. In the second experiment, the fish were challenged with an acute mechanical stressor (net chasing) or chemical stressor (coespecific alarm substance; CAS) in the same previous behavioral tests. All concentrations of taurine prevented stress-related behaviors triggered by CAS. The lower concentration of taurine also prevented the protein carbonylation caused by chasing with a net, suggesting e possible antioxidant activity. However, the higher concentration stimulated excessively both oxidative parameters and antioxidants triggered by the two stressors. The higher taurine concentration also inhibited the release of cortisol in response to CAS, indicating a possible anti-stress action. Although the phenotypes presented here represent a complex response to multifaceted interactions of various neurotransmitter systems, we believe that taurine can exert a therapeutic action on stress-related mental disorders. Os transtornos mentais são um grande desafio à saúde global, consideradas pandemias do século XXI. Cerca de um terço da incapacidade mundial é causada por problemas relacionados à saúde mental. Frente a isso, a Organização Mundial da Saúde desenvolveu um plano de ação, que busca novas estratégias de promoção e prevenção em saúde mental, e o fortalecimento das pesquisas na área. Portanto, os estudos que visam desvendar novas terapias na área de saúde mental tornam-se atraentes. A taurina tem sido estudada como terapia adjuvante em transtornos do sistema nervoso central (SNC), devido ao potencial de prevenção à excitotoxicidade do glutamato, regulação do cálcio, dos processos inflamatórios e estresse oxidativo. No presente estudo, buscamos melhor compreender as ações da taurina como tratamento dos transtornos mentais em humanos através do peixe-zebra (Danio rerio) como organismo modelo. Em uma revisão sistemática, descrevemos as suas principais contribuições e limitações como organismo modelo, avaliando os efeitos centrais da taurina em doenças neuropsiquiátricas. Ao fim, concluímos que o peixe-zebra é um organismo modelo com grande potencial para a avaliação dos efeitos neuroprotetores da taurina nessas doenças. Posteriormente, investigamos os efeitos de três concentrações de taurina (42, 150, 400 mg/L) em modelos comportamentais de estresse e ansiedade em peixe-zebra. Descobrimos que a taurina modula as respostas comportamentais e neuroendócrinas nessa espécie em diferentes contextos. No primeiro experimento, os peixes foram testados no teste do tanque novo e claro-escuro após o tratamento com taurina. Não observamos diferença comportamental no tanque novo, apenas no claro-escuro. Todas as concentrações de taurina evitaram o comportamento do tipo ansiedade (escotaxia) nos peixes, permitindo que passassem mais tempo na área clara, indicando atividade ansiolítica. No segundo experimento, os peixes foram desafiados a um estressor agudo mecânico (perseguição com rede) ou químico (exposição à substância de alarme de coespecífico; CAS) nos mesmos testes comportamentais anteriores. Todas concentrações de taurina evitaram comportamentos relacionados ao estresse desencadeados por CAS. A menor concentração de taurina também preveniu a carbonilação de proteínas ocasionada por perseguição com rede, sugerindo uma possível atividade antioxidante. No entanto, a maior concentração estimulou excessivamente tanto parâmetros oxidativos quando antioxidantes desencadeados pelos dois estressores. A maior concentração também inibiu a liberação de cortisol em resposta ao CAS, indicando ação antiestresse. Apesar dos fenótipos apresentados aqui representarem respostas complexas de interações multifacetadas de vários sistemas de neurotransmissores, acreditamos que a taurina possa exercer ação terapêutica em transtornos mentais relacionados ao estresse.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Selenoproteins are selenocysteine (Sec)-containing proteins that exhibit numerous physiological functions, including redox homeostasis maintenance, thyroid hormones metabolism, selenium transport and chaperone-like activities. Compared to other organisms, zebrafish presents the highest number of selenoprotein-coding genes identified to date, and almost all selenoproteins found in human are present in the fish. Despite this, the variety of selenoproteins in zebrafish is little explored. In order to identify potential targets for translational studies, herein we analyzed the transcriptional status of selenoprotein genes in different tissues and life stages of zebrafish. Using RNA-seq data set from Sequence Reads Archive (SRA) experiments published at the DNA Data Bank of Japan (DDBJ), we determined the transcriptional levels of the 37 selenoproteins-coding sequences in brain, heart, gills, liver and skeletal muscle, comparing them throughout aging. Zebrafish selenoprotein-coding genes were confirmed by the presence of 3'-UTR SECIS structure in selenoprotein-coding mRNAs. Out of 37 selenoprotein genes analyzed here, we were unable to found a proper SECIS sequence for Selenoprotein J gene (selenoj). Overall, our transcriptome queries suggest all selenoprotein genes are actively transcribed in the tissues, with the exception of Selenoprotein E gene (selenoe). Finally, RNA-seq search revealed brain has the highest selenoprotein diversity and the transcription of 20 genes varied accordingly to age, with a peak at 16-month-old zebrafish brain. Collectively, the data from the present study support zebrafish and specially zebrafish adult brain as potent model organism for studies towards selenium and selenoproteins, focusing particularly on dio2, gpx1a, gpx4a, gpx4b, msrb1b, selenof, selenop, selenot1a, selenot2 selenow1, and selenow2a genes as targets for future translational studies. As selenoproteínas são proteínas contendo selenocisteína (Sec) que exibem inúmeras funções fisiológicas, incluindo manutenção da homeostase redox, metabolismo dos hormônios da tireóide, transporte de selênio e atividades do tipo chaperona. Comparado a outros vertebrados, o peixe-zebra apresenta o maior número de genes codificadores de selenoproteínas identificados até o momento, e quase todas as selenoproteínas encontradas em humanos estão presentes nos peixes. Apesar disso, a variedade de selenoproteínas no peixe-zebra é pouco explorada. Para identificar alvos em potencial para estudos translacionais, foi analizado o status transcricional dos genes de selenoproteínas em diferentes tecidos e estágios da vida do peixe-zebra. Usando o conjunto de dados RNA-seq dos experimentos em Sequence Reads Archive (SRA) publicados no DNA Data Bank of Japan (DDBJ), foram determinados os níveis transcricionais das 37 sequências codificadoras de selenoproteínas em cérebro, coração, brânquias, fígado e músculo esquelético, comparando-os ao longo de diferentes idades. Os genes que codificam as selenoproteínas de peixe-zebra foram confirmados pela presença da estrutura SECIS na região não traduzida 3' dos mRNAs que codificam a selenoproteínas. Dos 37 genes das selenoproteínas analisados aqui, não foi encontrada uma sequência SECIS para o gene da selenoproteína J (selenoj). No geral, as consultas ao transcriptoma mostraram que todos os genes de selenoproteínas são ativamente transcritos nos tecidos analisados, com exceção do gene para selenoproteína E (selenoe). A pesquisa com RNA-seq revelou também que o cérebro é o tecido com maior diversidade de selenoproteínas, e que a transcrição de 20 genes varia de acordo com a idade, atingindo um pico no nível de transcrição no cérebro de peixe-zebra aos 16 meses de vida. Coletivamente, os dados do presente estudo identificam o peixe-zebra e, especialmente, o cérebro de peixes-zebra adultos como potencial tecido modelo para estudos sobre selênio e selenoproteínas, focando particularmente nos genes dio2, gpx1a, gpx4a, gpx4b, msrb1b, selenof, selenop, selenot1a, selenot2 selenow1 e selenow2a como alvos em futuros estudos translacionais.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Exposure to numerous toxic agents, including occupational exposure to volatile organic compounds has generated numerous health problems in humans, which are correlated to the emergence of numerous diseases. The volatile organic compound 4- vinylcyclohexene (VCH) is a well-known environmental contaminant whose toxicity has been investigated due to its ovotoxic effects on various organisms. However, the mechanisms underlying its toxicity, as well as its harmful effects on other organs, are uncertain. In this study, we evaluated some signs of toxicity induced by exposure to volatilized VCH using nymphs of Nauphoeta cinerea. Nymphs were exposed to VCH by inhalation for 70 day; thereafter the headspace technique associated with gas chromatography with flame ionization detector was utilized to quantify the levels of VCH in the boxes. The survival rates, total body weight, weight of some tissues (head, fat body and reproductive organs), food and water consumption, and feces production were evaluated during the experimental period. In addition, activities of glutathione-Strasnferase (GST), acetylcholinesterase (AChE), and levels of reactive oxygen and nitrogen species (RONS) of isolated tissues were evaluated after 35 and 70 days of spontaneous exposure to volatilized VCH. The levels of volatilized VCH ranged from 3.41 to 7.03 nmol/mL. Exposure to spontaneously volatilized VCH caused a 35% reduction in the survival rate of exposed animals. Nymphs exposed to volatilized VCH for 35 and 70 days had a reduction in body weight by 1.8 and 2.6 times respectively, consequently a reduction in the head, fat body and immature reproductive organs were observed. During the period of exposure, there was also a significant decrease in food intake and feces production in the nymphs. Nevertheless, the exposure did not alter water consumption, except on the twentieth day. Moreover, GST activity increased in all the tissues evaluated after 35 and 70 days of exposure. The fat body presented the most prominent increase in GST activity, specifically after 35 days of exposure, 1.6 times larger than the control group. Exposure of nymphs to volatilized VCH also caused a significant increase in the levels of reactive species in the fat body by 1.35 and 1.47 times after 35 and 70 days respectively. However, there was no significant difference in the head AChE activity after 35 and 70 days. It is not clear if the changes in GST activity and body-weight could compromise the functioning of the tissues/organism involved due to the effects observed, which reinforces the need for further research. Therefore, our results support the harmful impact of volatilized VCH inhalation and demonstrates that the cockroach of the species of N. cinerea is a valuable model for initial toxicological screening to investigate environmental toxicants. A exposição de maneira ocupacional a inúmeros agentes tóxicos, incluindo os compostos orgânicos voláteis vem gerando agravos à saúde humana, correlacionados ao surgimentos de inúmeras doenças. O composto orgânico volátil 4-vinilciclohexeno (VCH) é um contaminante ambiental bem conhecido e vem sendo investigado devido aos seus efeitos ovotóxicos em vários organismos. Entretanto, os mecanismos subjacentes a sua toxicidade, bem como os efeitos nocivos causados a outros órgãos, são incertos. Neste trabalho, foram avaliados alguns sinais de toxicidade induzidos pela exposição ao VCH espontaneamente volatilizado usando ninfas da espécie Nauphoeta cinerea. As ninfas foram expostas ao VCH por inalação durante 70 dias. Para a quantificação dos níveis de VCH nas caixas metabólicas foi empregado a técnica de Headspace associada à cromatografia de fase gasosa com detector de ionização de chama. Foram avaliados durante o período experimental as taxas de sobrevivência, o peso corporal total e de alguns tecidos (cabeça, corpo gorduroso e órgãos reprodutores imaturos), o consumo de ração e água e a produção de fezes. Além disso, foram avaliados in vitro as atividades enzimáticas das enzimas glutationa-S-trasnferase (GST), acetilcolinesterase (AChE) e dos níveis de espécies reativas dos tecidos isolados nos períodos de 35 e 70 dias de exposição ao VCH espontaneamente volatilizado. Os níveis da concentração de VCH volatilizado variou entre 3,41 e 7,03 nmol/mL. A exposição ao VCH espontaneamente volatilizado causou uma redução de 35% na taxa de sobrevivência dos animais expostos. As ninfas expostas durante 35 e 70 dias tiveram uma redução no ganho de peso corporal de 1,8 e 2,6 vezes, respectivamente, com uma redução no peso da cabeça, do corpo gorduroso e dos órgãos reprodutivos em maturação. Durante o período de exposição houve também nas ninfas uma diminuição significativa no consumo de ração e na produção de fezes. Apesar disso, a exposição não alterou o consumo de água, exceto no vigésimo dia. Em relação aos marcadores bioquímicos, verificou-se que a atividade enzimática da GST em todos os tecidos avaliados foi significativamente aumentada pelo VCH volatilizado após 35 e 70 dias de exposição. O corpo gorduroso apresentou a atividade da GST mais proeminente, especialmente após 35 dias de exposição, 1,6 vezes maior que o grupo controle. A exposição ao VCH espontaneamente volatilizado causou também um aumento significativo nos níveis das espécies reativas no corpo gorduroso de 1,35 vezes e 1,47 vezes após 35 e 70 dias, respectivamente. Em nenhum dos períodos avaliados a atividade da AChE da cabeça foi afetada. Não se sabe se essas alterações podem comprometer a funcionalidade dos tecidos/organismo envolvido versus os efeitos observados. Portanto, os resultados confirmaram o impacto prejudicial da inalação do VCH volatilizado e evidenciam a barata N. cinerea como um modelo valioso de triagem toxicológica inicial, a fim de investigar os toxicantes ambientais.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES We described a novel baculovirus isolated from the polyphagous insect pest Rachiplusia nu. The virus presented pyramidal-shaped occlusion bodies (OBs) with singly-embed nucleocapsids and a dose mortality response of 6.9 × 103OBs/ml to third-instar larvae of R. nu. The virus genome is 128,587 bp long with a G + C content of 37.9% and 134 predicted ORFs. The virus is an alphabaculovirus closely related to Trichoplusia ni single nu-cleopolyhedrovirus, Chrysodeixis chalcites nucleopolyhedrovirus, and Chrysodeixis includens single nucleopolyhedrovirus and may constitute a new species. Surprisingly, we found co-evolution among the related viruses and their hosts at species level. Besides, auxiliary genes with homologs in other baculoviruses were found, e.g. a CPD-photolyase. The gene seemed to be result of a single event of horizontal transfer from lepidopterans to alphabaculovirus, followed by a transference from alpha to betabaculovirus. The predicted protein appears to be an active enzyme that ensures likely DNA protection from sunlight. Descrevemos um novo baculovírus isolado da praga polífaga Rachiplusia nu. O vírus apresentou corpos de oclusão em forma de pirâmide (OBs) com um único nucleocapsídeos por envelope e uma dose de mortalidade de 6,9 × 103OBs / ml a larvas de terceiro instar de R. nu. O genoma do vírus possui 128.587 pb de comprimento, com um teor de G + C de 37,9% e 134 ORFs preditas. O vírus é um alphabaculovirus intimamente relacionado com Trichoplusia ni single nucleopolyhedrovirus, Chrysodeixis chalcites nucleopolyhedrovirus e Chrysodeixis includens nucleopolyhedrovirus. Surpreendentemente, encontramos co-evolução entre os vírus relacionados e seus hospedeiros em nível de espécie. Além disso, foram encontrados genes auxiliares com homólogos em outros baculovírus, por exemplo uma CPD fotoliase. O gene pareceu ser o resultado de um único evento de transferência horizontal de lepidópteros para alphabaculovírus, seguido por uma transferência de alfa para betabaculovírus. A proteína prevista parece ser uma enzima ativa que garante a proteção do DNA contra a luz solar.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Amphibians have suffered a widespread population decline across the globe. About 40% of existing amphibian species are threatened with extinction. Solar ultraviolet (UV) radiation (280-400 nm) has the capacity to form cytotoxic and mutagenic lesions in the amphibian genome, which may compromise the performance and fitness of these animals. Factors such as the decrease of stratospheric ozone, climate changes, deforestation and decrease of organic matter in water bodies have increased the incidence of solar UV radiation upon amphibian breeding sites. In contrast, in order to minimize the harmful effects of UV-induced lesions on their genome, amphibians have mechanisms capable of repairing them, such as photorepair (or photoreactivation), which involves the absorption of light (350-700 nm) by means of enzymes called photolyases and the transfer of electrons to the lesions, thus removing them. However, photorepair capacity varies among species, and the inefficiency of this mechanism is a possible determinant factor for population decline of UV-sensitive species. Taking this into account, the general objective of this work was to evaluate the importance of DNA photorepair in amphibians. First, the biological responses of amphibians to UV-induced DNA damage, which include photorepair capability, have been discussed through a broad review of existing literature on this topic. The results show that only three out the 21 studies found directly evaluated the UV-induced DNA lesions in vivo. As a consequence, DNA repair mechanisms are very few studied and understood. Thus, the importance of DNA photorepair for the maintenance of the feeding performance of forest specialist tadpoles previously exposed to a low environmental dose of UVB radiation (280-315 nm) was evaluated through a controlled experimental study with a species of treefrog threatened with extinction [Boana curupi (Garcia, Faivovich and Haddad, 2007); Anura; Hylidae]. The results demonstrate that UVB radiation negatively impacted tadpole weight due to reduced food consumption, which in turn was a consequence of the genotoxic impact of UVB. An additional treatment with visible light (post-UVB) suggested a low efficiency of DNA photorepair in this species, since body weight and food consumption activity remained affected. In addition, in silico analyzes were conducted with the objective of understanding the molecular basis of amphibian photolyases. Homology analyzes were performed with sequences of amphibian photolyases. Only annotated and accurate sequences were obtained from GenBank, BLASTp and tBLASTn (NCBI). The results demonstrate interspecific variations in the occurrence of these enzymes and the possible bad annotation of some sequences. From these results, future perspectives are discussed. The present dissertation demonstrates that there is still a lack of understanding of amphibian photolyases, and that possible new avenues on this subject must be traced in order to better elucidate the role of photorepair in amphibians. Therefore, the contribution of solar UV radiation to the decline of amphibians, and the importance of DNA photorepair to avoid the UV-induced genotoxic effects on amphibian species may become more evident in the near future. Os anfíbios têm sofrido um declínio populacional generalizado em todo o globo. Em torno de 40% das espécies de anfíbios existentes estão ameaçadas de extinção. A radiação ultravioleta (UV) solar (280-400 nm) possui a capacidade de formar lesões citotóxicas e mutagênicas no genoma de anfíbios, as quais podem comprometer o desempenho e aptidão destes animais. Fatores como o decréscimo do ozônio estratosférico, mudanças climáticas, desmatamento e diminuição de matéria orgânica em cor-pos de água, têm aumentado a incidência de radiação UV solar em sítios reprodutivos de anfíbios. Em contrapartida, a fim de minimizar os efeitos prejudiciais das lesões induzidas pela UV em seu genoma, anfíbios possuem mecanismos capazes de repará-las, tais como o fotorreparo (ou fotorreativação), o qual envolve a absorção de luz (350-700 nm) por meio de enzimas chamadas fotoliases e a transferên-cia de elétrons às lesões, assim removendo-as. No entanto, a capacidade de fotorreparo varia entre espécies, sendo a ineficiência deste mecanismo um possível fator determinante para o declínio popula-cional de espécies sensíveis à radiação solar. Levando isto em consideração, o objetivo geral deste trabalho consistiu em avaliar a importância do fotorreparo de DNA em anfíbios. Primeiramente, as respostas biológicas de anfíbios aos danos de DNA induzidos pela UV, as quais incluem a capacidade de fotorreparo, foram discutidas através de uma revisão ampla da literatura existente sobre este tópico. Os resultados demonstram que apenas três trabalhos dos 21 encontrados avaliaram diretamente as lesões de DNA induzidas pela UV in vivo. Como consequência, os mecanismos de reparo de DNA são pouquíssimos estudados e compreendidos. Desta forma, a importância do fotorreparo de DNA para a manutenção do desempenho alimentar de girinos especialistas florestais previamente expostos a uma baixa dose ambiental de radiação UVB (280-315 nm) foi avaliada através de um estudo experimental controlado com girinos de uma espécie de perereca ameaçada de extinção [Boana curupi (Garcia, Fai-vovich e Haddad, 2007); Anura; Hylidae]. Os resultados demonstram que a radiação UVB impactou negativamente no peso dos girinos devido a uma redução do consumo de alimento, que por sua vez foi consequência do impacto genotóxico da UVB. O tratamento adicional com luz visível (pós UVB) su-geriu uma baixa eficiência do fotorreparo de DNA nesta espécie, uma vez que o peso corporal e a ati-vidade de consumo de alimento permaneceram afetados. Adicionalmente, análises in silico foram con-duzidas com o objetivo de compreender as bases moleculares das fotoliases de anfíbios. Análises de homologia foram realizadas com sequências de fotoliases de anfíbios. Apenas sequências anotadas e acuradas foram obtidas a partir do GenBank, BLASTp e tBLASTn (NCBI). Os resultados demonstram variações interespecíficas na ocorrência destas enzimas e a possível má anotação de algumas sequên-cias. A partir destes resultados, perspectivas futuras são discutidas. A presente dissertação demonstra que há ainda uma falta de compreensão do fotorreparo em anfíbios, e que possíveis novas avenidas sobre este tema devem ser traçadas, a fim de melhor elucidar o papel do fotorreparo em anfíbios. Por-tanto, a contribuição da radiação UV solar para o declínio de anfíbios e a importância do fotorreparo de DNA para evitar os efeitos genotóxicos induzidos pela radiação UV em espécies de anfíbios pode se tornar mais evidente em um futuro próximo.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Larvae of the soybean looper, Chrysodeixis includens (Walker, [1858]) (Lepidoptera: Noctuidae), is the most important soybean caterpillar pest in Brazil due to high tolerance to insecticides and control failures in soybean fields. In this sense, we conducted some researches to evaluate the performance of insecticides against C. includens on soybean in field conditions over three years (2014, 2015, and 2016) and a high-throughput RNA sequencing on two Brazilian populations of C. includens, LAB and MS, differing in susceptibility to pyrethroid λ-cyhalothrin. In the first research, the number of surviving small and large larvae of C. includens was evaluated at 3, 7, and 10 days after spray. Moreover, in 2016 we compared the efficacy of one and two applications of each insecticide within a seven-day interval. In the second research, RNA was extracted from head and thorax + abdomen parts of 3° instar larvae of C. includens susceptible and resistant and paired-end Illumina libraries were generated using the TruSeq® RNA Library Prep Kit. The Illumina data was used to compare the transcriptomes evaluating mutations and a global differential gene expression between these populations. Considering the results of the field trials the majority of insecticides showed low efficacy against larvae of C. includens, over three years of experiments. The insecticides indoxacarb and chlorfenapyr had consistently the highest reduction of larvae of C. includens. The second application of methoxyfenozide, spinetoram, indoxacarb, and flubendiamide+thiodicarb increased efficacy significantly against large larvae. The mixture of chlorfluazuron+acephate reduced defoliation in 2016 but did not effect larval density. Considering the three-year period, these findings demonstrate that few insecticides are effective to cause mortality of C. includens on soybean, suggesting further investigation of insecticide resistance. Some of the insecticides needed a second application to improve efficacy or to reduce the injury on soybean leaves. Based on these results, the grower also has to take into account the cost of these insecticides, because the most effective insecticides in this case are costlier. In the other hand, based on the second research, our results revealed several potential molecular mechanisms on C. includens responsible for its low susceptibility to pyrethroid insecticides. The comparison between sodium channel transcript, which is the target of pyrethroids, resistant vs. susceptible populations, MS vs. LAB, we found five nonsynonymous mutations within the coding region of the voltage gated sodium channel in the resistant population (N1013I, L1314V, Q1433H, F1608C, and P1800S), specifically in domains II, III, and IV. These mutations might alter the protein conformation and reduce sensitivity of connection between pyrethroids and sodium channel. Also, the high abundance of transcripts related to metabolic enzymes including cytochrome p450s, glutathione s-transferases, esterases, and UDP glycosyltransferases, suggests an intense detoxification process of pyrethroid in C. includens. Some of these enzymes were upregulated in the head of the resistant population, suggesting that a detoxification process begins in the mouth parts and continues through the gut. This overexpression of detoxification genes in MS population might be enhanced via a signaling pathway of two overexpressed GPCR genes in the head. In order to compensate the spent energy in the detoxification 15 process, larvae of soybean looper showed high expression of some potential digestive and metabolic energy enzymes such as: trypsin, serine protease, lipase, and chymotrypsin. In addition, cuticle genes were found to be upregulated in the thorax + abdomen, which represents a potential barrier to insecticide penetrate in the resistant larvae. In summary, our findings represent the first insights into the molecular mechanisms underlying insecticide resistance in C. includens. Thus, the management of C. includens in soybean is challenging and the tactics have to be combined in an integrated pest management and insecticide resistance management. A lagarta falsa-medideira, Chrysodeixis includens (Walker, [1858]) (Lepidoptera: Noctuidae), é a mais importante praga da soja no Brasil devido à alta tolerância aos inseticidas e as falhas de controle em lavouras de soja. Neste sentido, foram realizadas pesquisas para avaliar o desempenho de inseticidas no controle de C. includens em soja em condições de campo durante três anos (2014, 2015 e 2016) e o sequenciamento de mRNA (RNA-seq) de duas populações brasileiras de C. includens que diferiram em suscetibilidade à λ-cialotrina piretroide. Na primeira pesquisa, o número de larvas pequenas e grandes de C. includens sobreviventes foi avaliado aos 3, 7 e 10 dias após a pulverização. Além disso, em 2016, foi comparada a eficácia de uma e duas aplicações de cada inseticida em um intervalo de sete dias. No segundo trabalho, o RNA total foi extraído das partes da cabeça e do tórax + abdômen de larvas de 3° instar de C. includens suscetíveis e resistentes e bibliotecas Illumina de extremidade dupla foram geradas usando o TruSeq® RNA Library Prep Kit. Os dados do sequenciamento foram utilizados para comparar os transcriptomas e avaliar mutações e a expressão diferencial de genes entre essas populações. Considerando os resultados dos ensaios de campo, a eficácia de controle da maioria dos inseticidas foi baixa para larvas pequenas e grandes de C. includens ao longo dos três anos de experimentos. Os inseticidas indoxacarbe e clorfenapir apresentaram consistentemente a maior redução de larvas de C. includens. A segunda aplicação de metoxifenozide, spinetoram, indoxacarb e flubendiamide + thiodicarb aumentou significativamente a eficácia de larvas grandes. A mistura de clorfluazuron + acefato reduziu a desfolha em 2016, mas não reduziu a densidade larval. Considerando o período de três anos, esses resultados demonstram que poucos inseticidas são eficazes para causar mortalidade de C. includens na soja, sugerindo uma investigação com bases moleculares da resistência a inseticidas. Alguns dos inseticidas precisaram de uma segunda aplicação para melhorar a eficácia ou reduzir a injúria nas folhas de soja. Com base nesses resultados, o produtor também deve levar em conta o custo desses inseticidas, pois os inseticidas mais eficazes, neste caso, são os mais caros. Por outro lado, com base na segunda pesquisa, nossos resultados revelaram vários mecanismos moleculares de resistência em C. includens responsáveis pela baixa suscetibilidade a piretroides. Com análise comparativa do transcrito do canal de sódio, que é alvo dos priretroides, entre as populações suscetível e resistente, MS vs. LAB, foram encontradas cinco mutações não sinônimas na região codificadora do gene na população resistente (N1013I, L1314V, Q1433H, F1608C e P1800S), especificamente nos domínios II, III e IV. Essas mutações podem alterar a conformação da proteína e insensibilizar a ligação dos piretroides no canal de sódio. Além disso, a superexpressão de transcritos relacionados a enzimas metabólicas incluindo do citocromo P450, glutationa S-transferase, esterases, e UDP-Glucosyltransferase sugere um intenso processo detoxificativo de inseticidas em C. includens. Algumas destas enzimas foram superexpressas na cabeça da população resistente, sugerindo que o processo detoxificativo inicia no aparelho bucal e continua através do aparelho digestivo das lagartas. Essa 13 superexpressão de genes detoxificantes na população MS pode estar sendo regulada por meio de uma via de sinalização de genes GPCR que foram superexpressos no tecido da cabeça. A fim de compensar a energia gasta no processo detoxificativo, larvas de C. includens apresentaram alta expressão de enzimas digestivas e de metabolismo energético como: tripsina, serina protease, lipase e quimotripsina. Além disso, verificou-se também que os genes da cutícula tiveram alta expressão nos tecidos do tórax + abdómen, o que representa uma potencial barreira aos inseticidas. Em resumo, nossas descobertas representam os primeiros insights sobre as dificuldades de controle e os mecanismos moleculares de resistência a inseticidas em C. includens. Assim, o manejo de C. includens na soja é desafiador e as táticas de controle devem ser combinadas em um manejo integrado de pragas e dentro de um manejo de resistência com o uso de inseticidas com diferences mecanismos de ação. O uso de inseticidas químicos, inseticidas biológicos e plantas geneticamente modificadas que expressam toxinas inseticidas devem ser utilizados no manejo para manter a eficiência da tática de controle e retardar ou evitar o aumento da frequência de indivíduos de C. includens resistentes.

Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq Baculoviruses are insect viruses largely used as vectors for gene expression and biopesticides. These viruses can efficiently infect larvae of several agricultural pests worldwide, causing a lethal disease. In this work, a novel baculovirus isolated from the larval stage of Urbanus proteus (L.), the bean leafhopper caterpillar was found in the 1980s and the complete genome was characterized. This was an important pest of several legumes in Brazil and belongs to the butterfly family Hesperiidae, from where no baculovirus genome sequence has been described. This new virus was shown to have the smallest genome among all alphabaculoviruses sequenced to date, with 105,555 bp and 119 putative ORFs. Ten unique genes, seven bro genes and the 38 baculovirus core genes were found. UrprNPV was found to be related to the Adoxophyes-infecting baculoviruses AdorNPV and AdhoNPV, with high genetic distance and long branch length. Interestingly, few individual core gene-based phylogenies were found to support the relationship of UrprNPV to both AdorNPV and AdhoNPV. Importantly to note that the increase in the number of completely sequenced baculoviruses points to an interesting way of understanding baculoviruses and their evolution, potentially helping the use of baculovirus, both as biopesticide and expression vectors. Os baculovírus são vírus de insetos amplamente utilizados como vetores de expressão gênica e biopesticidas. Esses vírus podem infectar eficientemente larvas de várias pragas agrícolas em todo o mundo, causando uma doença letal. Neste trabalho, foi encontrado um novo baculovírus isolado do estágio larval de Urbanus proteus (L.), a lagarta desfolhadora do feijão nos anos de 1980 e foi caracterizado o seu genoma completo. Esta foi uma importante praga de várias leguminosas no Brasil e pertence à família das borboletas Hesperiidae, de onde não foi descrita nenhuma sequência genômica de baculovírus. Este novo vírus mostrou ter o menor genoma entre todos os alphabaculovírus sequenciados até o momento, com 105.555 pb e 119 ORFs. Foram encontrados dez genes únicos, sete genes bro e os 38 genes compartilhados entre todos os baculovírus. Verificou-se que UrprNPV estava relacionado com os baculovírus que infectam o gênero Adoxophyes, AdorNPV e AdhoNPV, com alta distância genética e comprimento longo do ramo. Curiosamente, poucas filogenias baseadas nos genes compartilhados individuais apoiaram a relação de UrprNPV com ambos, AdorNPV e AdhoNPV. É importante ressaltar que o aumento no número de baculovírus completamente sequenciados aponta para uma forma interessante de entender os baculovírus e a sua evolução, podendo ajudar potencialmente o uso de baculovírus tanto como biopesticida e vetores de expressão.

Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq Transposable elements (TEs) are sequences of DNA with the ability to move inside host genomes. Some TEs are able to transpose into somatic tissues, process called Somatic Transposition (ST) that can be involved with aging, neurodegenerative diseases and cancer. The mariner element is a TE able to move in both somatic cells and germline. A nonautonomous mariner was discovered as a cause of the white-peach mutation in Drosophila eyes. The insertion of this element in the promoter region of the white gene leads to flies with peach colored eyes. In the presence of autonomous copies, the mariner in the white gene can transpose, reversing the mutation and leading to flies with mosaic phenotype (white-peach colored eyes with red spots). This model makes possible to measure the rate of ST by the number of red spots in mosaic flies, because every spot represents an excision event and as a consequence, a ST event. In this study, we used mild heat stress to induce mariner transposition through different stages of D. simulans white-peach test development in order to verify if ST events accumulate in Drosophila. The mariner ST was not constant during the development: the larval stage showed the higher ST rates; pupal stage exhibited less than larval; and transposition was not detected during the embryogenesis. The development stage and the cellular process involved in this period can affect mariner transposition: more intense cell division phases may facilitate it. ST accumulation does not occur linearly, but it may vary by the stages with highest or lowest transposition. The mariner activation under thermal stress was confirmed by qPCR that indicated twice as high rates of ST in the larval stage at 28ºC. Besides, these analyses also showed an accumulation of ST throughout the development. Elementos transponíveis (TEs) são sequências de DNA móveis nos genomas hospedeiros. Alguns TEs são capazes de se transpor em células somáticas, processo conhecido por Transposição Somática (TS), que pode estar envolvido no envelhecimento celular, doenças neurodegenerativas e câncer. O elemento mariner é um TE capaz de se transpor em células somáticas e germinativas. Uma cópia não-autônoma desse elemento na região promotora do gene white gera moscas com olhos cor de pêssego, chamadas white-peach. Na presença de cópias autônomas, o mariner no gene white é capaz de se transpor, revertendo parcialmente a mutação e originando moscas com fenótipo mosaico: olhos white-peach com manchas vermelhas. Esse modelo torna possível medir a taxa de TS através do número de manchas das moscas mosaico, pois cada mancha reflete um evento de excisão e como consequência, um evento de TS. Neste estudo utilizamos o estresse por temperatura para induzir a transposição de mariner durante diferentes estágios do desenvolvimento de D. simulans white-peach teste, buscando verificar se eventos de TS são acumulados em Drosophila. A TS de mariner sob estresse térmico não foi constante durante todo o desenvolvimento: a fase larval apresentou as maiores taxas de TS; a fase de pupa exibiu taxas menores; e na fase embrionária a transposição não foi detectada. A fase do desenvolvimento e os processos celulares envolvidos nesse período podem influenciar a transposição de mariner, que parece ser facilitada por estágios de intensa divisão celular, como a fase larval. O acúmulo de TS não ocorre de maneira linear, podendo variar de acordo com os estágios de maior e menor transposição. A ativação de mariner sob estresse foi confirmada por qPCR, que indicou uma taxa de TS duas vezes maior nos tratamentos a 28°C para a fase larval. Essa análise também mostrou um acúmulo de TS ao longo do desenvolvimento.