Search

Bu çalışmada, indikatörlü DNA dizi algılama yöntemine dayalı bir elektrokimyasal genosensör tasarımı yapılmıştır.Algılama materyali olarak biyomoleküllerden, hakkında en fazla çalışma yapılmış olan E.coli bakterisinden yararlanılmıştır. Indikatör ( sinyal) ajanı olarak kuantum parçacıkları kullanılmıştır. Deney eş zamanlı yürütülen iki prosedüre dayalı olarak yapılmıştır.Yıkama aşamasından sonra da DPV tekniğiyle kuantum parçacığına ait -0.8V` ta sinyal ölçümleri alınmıştır. Çalışmalar biyosensör tasarımı için en uygun ve seçiciliğini en iyi verimle alınabildiği koşulları belirlemeye yönelik olarak yapılmıştır.Elektrot yüzeyinde oluşturulan örnek hibrit dizimizin, çözeltiden gelen ve etiket ajanı (kuantum parçacığı) içeren işaretleyici dizimizle birleşmesiyle Hibridize sandviç tipi dizi oluşturulmuştur. Böylece tasarlanan elektrokimyasal biyosensörü başarılı bir şekilde hibridize sandviç tipi dizi örneğini algılamayı başarmıştır.Tasarlanan elektrokimyasal biyosensör sayesinde, daha kolay, hızlı ve ekonomik bir biyomolekül algılama yöntemi oluşturulmuştur. In this study, indicator based DNA detection methods are developed by using DNA biosensors.E. coli was a biomolecule which used as a sensing material and most studies have been done about it. Quantum particles are signal agent that were used as the indicator agent. The experimental procedure, that the two procedures were carried out.End-stage occurs technique of DPV measurements were performed after the washing stage.Studies for the design of biosensors, have been made to determine the conditions whereby of the best efficiency and selectivity.Series of hybrid instance that is created on the electrode surface,combines to a series of signal (quantum dots) that containing signal agent in a solution, thus sandwich assay is dedicated.Thus, electrochemical biosensor was designed successfully for detect Sandwich Assay.With electrochemical biosensor designed, easier, faster and economical measurements methods of biomolecules formed. 154

Farmasötik analizlerde etkin madde tayinleri için `altın standart yöntem` olarak da adlandırılan sıvı kromatografi (LC) yöntemlerinden yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile ilaç etkin maddelerinin miktar tayinleri standart analitik LC yöntemlerinin kullanımıyla 1970'li yıllardan beri yapılmaktadır. Sıvı kromatografide son yıllarda genel eğilim olarak analiz süresi onlarca dakika sürebilen HPLC yöntemlerinin yerini artık toplam analiz süresi 1-2 dakika civarında olan ultra performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) yöntemleri almaktadır. Tez çalışmalarımızın ana hedefi olan model bileşikler için farklı LC dedektörlerinin yanıtlarının elde edilmesi ve mukaye edilmesi hususunda HPLC'ye bağlı elektrokimyasal (ECD), UPLC'ye bağlı sıralı fotodiyot (DAD) ve kütle (MS ve MS/MS) dedektörleriyle fenilefrin hidroklorür (PE) ve parasetamol (PA) etkin maddelerine ait veriler, standart koşullar altında uygun LC yöntemleriyle elde edilmiştir. Bu sayede ECD, DAD, MS ve MS/MS dedektörlerinin iki etkin maddenin tayinlerindeki eş-zamanlı performansı kıyaslanabilecektir. ECD ve DAD dedektörler ile her iki mobil faz olan MF1 (%75-25, h/h, MeOH-50mM PBS) ve MF2 (%30-70, h/h, Ach-50mM PB) ile çalışılmıştır. MS ve MS/MS dedektörleriyle de aynı etkin maddeler için iyonlaştırma yönteminin (ESI) gereği olarak farklı bir mobil fazda kütle kromatogramları, birincil ve ikincil parçalanma ürünlerine ait iyon pikleri ve bu piklerin alanlarına dayalı kalibrasyon eğrileri elde edilmiştir. MS ve MS/MS çalışmalarında MF3 mobil fazı (%10-90, h/h, B-D. B: 4mM amonyum asetat + %0,1, ağ/h, formik asit + MeOH, D: 4mM amonyum asetat + %0,1, ağ/h, formik asit + H2O ) kullanılmıştır. Ancak her çalışılan tüm dedektörlerle aynı koşullar altında analitik geçerlilik (validasyon) çalışmalarının tamamlanması uygun olacaktır. Hali hazırda elde edilen veriler bu anlamda çok az ve kısmi veriler içermektedir. Ayrıca daha fazla sayıda deneysel parametrenin deneysel değişkenler olarak kullanılmasıyla daha fazla sayıda deney yapılarak daha kesin ve anlamlı veriler elde edilmelidir. With the use of standardized analysis methods, the determination of drug substances with high performance liquid chromatography (HPLC), one of the methods of the `golden standard method`; liquid chromatography (LC), is a on-going application area since 1970s. In liquid chromatography the trend in the latest years is the replacement of HPLC methods with UPLC methods as an effort of decreasing the total run time from 10 folds of minutes to 1-2 minutes range.Data for paracetamol (PA) and phenylephrine hydrochloride (PE) drug substances is obtained under standard conditions with appropriate LC methods with electrochemical (ECD) dedector connected to HPLC, diode array (DAD), tandem mass (MS and MS/MS) dedector connected to UPLC, to obtain and compare the results of various LC dedectors for the model drug substances, which is the main goal of our thesis studies. Thus the simultaneous performances of ECD, DAD, MS and MS/MS dedectors in the determination of both drug substances may be compared. With ECD and DAD both mobile phases (MF1 ? 72/25%, v/v, MeOH/50mM PBS, pH 6.0 and MF2 ? 30/70%, v/v, Ach/50mM PBS, pH 4.0) are employed. With MS and MS/MS dedectors for both drug substances because of the need for charge transfer in the mobile phase (for ESI ionisation) another mobile phase was used and ion peaks of the primer and seconder fragments and calibration plots out of these data were obtained. For MS and MS/MS studies MF3 mobile phase (MF3 ? 10/90%, v/v, B/D, B: 4mM amonium acetate and 0.1%, w/v, formic acid in MeOH and D: : 4mM amonium acetate and 0.1%, w/v, formic acid in H2O) is used. But to make an accurate comparison exactly the same operation conditions should be achieved during the analytical method validation studies with the all used dedectors (including the mobile phase and seperation conditions). Regarding that, the current data obtained may be accepted as partial small in run number. Also performing consecutive experiments with the use of more experimental parameters should be achieved to obtaine more acquire and precise data. 211

Ultra performanslı sıvı kromatografisi (UPLC), yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC)?ne kıyasla göreceli olarak sağladığı daha düşük tayin ve belirleme sınırları, yüksek tekrarlanabilirlik, kısa analiz süresi, sarf malzemesi tasarrufu, daha az tehlikeli atık miktarı gibi sağladığı yararlar nedeniyle son yıllarda hızla HPLC?nin yerini almaktadır. Mevcut durumda sıklıkla sorunla karşılaşılan süreç geçerli (valide) HPLC yöntemlerinin UPLC?ye adaptasyonu aşamasıdır. Tez çalışmamızda her iki cihaz arasında yöntem transferi ve adaptasyonunun, hızlı, az sorunlu ve olabildiğince az deney yapılarak gerçekleşebilmesi için, tamamıyla analitik verilere dayalı, bir transfer çalışmasının yapılması amaçlanmıştır. HPLC ile ilaç etkin maddelerinin miktar tayinleri standart analitik LC yöntemlerin kullanımıyla 1970?li yıllardan beri yapılmakta ancak çalışma sayısı UPLC?nin kullanıma girmesiyle son yıllarda hızlı bir azalma göstermektedir. Benzer analizlerin UPLC ile yapılmasının çok sayıda faydası olmakla birlikte analitik yöntemin UPLC donanımı kullanılarak çalışılacak olması nedeniyle yeniden deneysel olarak oluşturulması, sınanması ve geçerlilik (validasyon) testlerinin yapılması gibi başlıca sakıncaları da bulunmaktadır. Tez konusunun nihai ana hedefi model olarak seçilen iki adet ilaç etkin maddesi (fenilefrin hidroklorür ve parasetamol) için HPLC?de geliştirilen 2 farklı yöntemin (MF1 ve MF2 mobil fazlarını kullanan) UPLC?ye transfer edilmesidir. Bu amaçla kolon boyutları, mobil faz ve dedektör özellikleri, akış hızı, loop hacmi, analiz zamanı vb değişkenler ile çalışılarak kromatogramlara etkileri saptanmaya çalışılmıştır. MF1 olarak %75-25 (h/h) MeOH-50mM PBS (pH 6,0), MF2 olarak ise %30-70 Ach-50mM PBS (pH 4,0) ile çalışılmıştır. MF1 mobil fazıyla izokratik koşullarda C18 tabanlı dolgu maddesine sahip ve boyutları 250mmx4.6mm, 5µm partikül çapı ve 80Å por çapına sahip bir HPLC kolonu 20µL loop hacmi ve 1.0mL/dakika?lık akış hızıyla kullanılarak elde edilen optimum bir HPLC kromatogramını aynı ayırım gücüyle ve aynı mobil fazla (MF1) UPLC?ye transfer etmek için kullanılması gereken aynı dolgu maddesine sahip analitik kolonun boyutları 50mmx2.1mm, 1.7µm partikül çapı ve 100Å por çapı olmalı ve analiz 10µL loop hacmi ve 300µL/dakika?lık akış hızıyla yürütülmelidir. Tez çalışmalarımız esnasında çalışılan diğer mobil faz olan (MF2) %30-70 (h/h) Ach-50mM PBS (pH=4.0) mobil fazıyla da izokratik koşullarda aynı aynı sonuçlara ulaşılarak yöntem transferi gerçekleştirilmiştir. Ultraperformance liquid chromatography (UPLC) because of the advantages it has in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC), such as lower detection and quantification limits, higher reproducibility, shorter run time, savings in consumables, decreased amount of hazardous waste, is replacing HPLC in the recent years. In the current status the most problematic process is the adaptation stage of the valid HPLC methods to UPLC. In our thesis study, to perform a transfer work which is completely based on analytical data is aimed to perform the transfer and adaptation of method between both instruments in a fast and less problematic way which requires fewer practical experiments. Quantification of drug substances with HPLC is being perofrmed since 1970s with the use of standard LC methods but with the UPLC enterin service the number of works is rapidly decreasing in the last decade. Eventhough performing similar analysis with UPLC has various major advantages, it also has some leading disadvantages such as the need of the development, test and validation of the same HPLC method on UPLC, as the method will be used operating the UPLC hardware. The final major aim of the thesis subject is the transfer of two different methods of HPLC analysis (using MF1 and MF2 mobile phases) of two model drug substances (phenylephrine hydrochloride and paracetamol) to UPLC. For this purpose, variables such as column sizes, properties of mobile phases and detectors, flow rate, loop volume and analysis run time are studied to determine their effects on chromatograms. As MF1 75-25% (v/v) MeOH-50mM PBS (pH 6.0) and as MF2 30-70% Ach-50mM PBS (pH 4.0) were used. To transfer an optimum HPLC chromatogram obtained with MF1 mobile phase in isocratic conditions with an C18 analytical column of 250mmx4.6mm, 5µm particule size and 80Å pore size, with a 20µL loop volume at a flow rate of 1.0 mL/minute to UPLC with the same resolution in the same MF1 mobile phase, the C18 column needed has to have the sizes 50mmx2.1mm, 1.7µm particule size and 100Å pore size and the analysis should be performed at 10µL loop volume and 300µL/minute flow rate. Similar results were repeated again in isocratic conditions with 30-70% (v/v) Ach-50mM PBS (pH=4.0) which was the other mobile phase studied in the thesis (MF2). 170

Tez çalışmasının ilk kısmında, prostat kanserinin spesifik bir belirteci olan GSTP1 geninin hibridizasyon üzerinden hipermetilasyon tayini için elektrokimyasal bir biyosensör tasarlanmıştır. Bu yeni biyosensör sistemi ile DPV kullanılarak, sentetik veya denatüre PCR örneklerinin hibridizasyonundan önce ve sonra elde edilen guanin yükseltgenme sinyal değişiklikleri değerlendirilmiştir. DNA hibridizasyonu ayrıca, EIS ile karakterize edilmiştir. Hibridizasyon protokolü iki farklı teknikten oluşmaktadır:(i) GSTP1 dizileri metilasyon spesifik bölgesi için seçici olan prob ve hedef sensör yüzeyine doğrudan immobilize edilmiş ve hibridizasyon elektrot yüzeyinde gerçekleştirilmiştir.(ii) prob/hedef veya prob/rastgele dizi çiftleri çözelti fazında karıştırılmış ve elektrot basit adsorbsiyonla modifiye edilmiştir. İkinci kısımda JAK2 geninin 1849. bazında Guanin bazının Timine değişmesi sonucunda valinin fenilalanine yerdeğiştirmesine (JAK2V617F) sebep olan tek nokta mutasyonu elektrokimyasal biyosensör ile algılanmıştır. Prob ile hedef arasındaki hibridizasyon ve sağlıklı dizilerden mutasyonlu dizilerin ayırt edilmesi DPV ile sentetik ve denatüre PCR örneklerde gerçekleştirilmiştir. Prob/hedef, prob/tek bazı hedeften farklı dizi ve prob/rastgele dizi çiftleri çözelti fazında karıştırılmış ve bu çözeltiler daha sonra elektrot yüzeyine pasif adsorbsiyon ile immobilize edilmiştir. Tek nokta mutasyonu içeren dizi ve rastgele diziler hibrit yapıdan, hibridizasyon sıcaklığı ve hibridizasyon tamponundaki tuz konsantrasyonunun ayarlanması ile ayırt edilebilmiştir. In the first part of thesis, an electrochemical biosensor for the detection of hypermethylation of the GSTP1) gene, a specific marker of prostate cancer, was reported. This new sensor was used in combination with DPV, with the results of sample analysis based on the guanine oxidation signals obtained at +1.0 V before and after hybridization between probe and synthetic target or denatured PCR samples. The detected DNA hybridization was also characterized by EIS. The protocol consisted of two different modes: (i) Capture probes selective for methylation-specific and unmethylated GSTP1 sequences were immobilized onto the sensor directly, and hybridization was formed on the electrode surface. (ii) Probe/target or probe/noncomplementary target couples were mixed in solution phase, and the transducer was modified through simple adsorption. In the second part, an electrochemical biosensor for the detection of a guanine (G) to thymine (T) transversion at nucleotide position 1849 of the JAK2 gene was reported. Hybridization between probe and its complementary oligonucleotide (target) and discrimination of single point mutation was investigated by monitoring guanine oxidation signals observed at +1.0 V with Differential Pulse Voltammetry (DPV) by using synthetic oligonucleotides and PCR amplicons. Probe/complementary, probe/mismatch and probe/non-complementary target couples were mixed in solution phase, and the electrode surface was modified by simple adsorption. The sensitivity of the proposed electrochemical DNA biosensor was optimized with respect to hybridization temperature and salt concentration in the hybridization buffer. 226

Çalışmamızda, kalem grafit elektrot yüzeyine dördüncü jenerasyon poli(amidoamin) (PAMAM) dendrimerin modifikasyonuyla elektrokimyasal sensör tasarlandı (G4-PDR/PGE) ve tek kullanımlık dendrimer modifiye edilmiş elektrot, elektrokimyasal nükleik asit tayini için kullanıldı. PGE yüzeyine G4-PDR'nin immobilizasyonundan sonra, dendrimer modifiye edilmiş PGE'nin yüzeyi, dönüşümlü voltametri (CV) ve elektrokimyasal empedans spektroskopisi (EIS) gibi elektrokimyasal tekniklerle karakterize edildi. Ayrıca, G4-PDR/PGE yüzey karakterizasyonu taramalı elektron mikroskopu (SEM) kullanılarak incelendi. Optimum deneysel koşulların saptanmasının ardından Hepatit B Virüsü (HBV)'ne dayalı dizi seçimli DNA hibridizasyonunun voltametrik tayini, hedef, NC ve hedef:NC (1:1) dizilerini içeren karışım ortamı varlığında gerçekleştirildi In our study, the electrochemical sensor was designed by the modification of the fourth generation poly(amido amine) (PAMAM) dendrimer onto the surface of pencil graphite electrode (G4-PDR/PGE) and the single-use dendrimer modified electrode was then used for electrochemical detection of nucleic acid. After the immobilization of G4-PDR onto the PGE surface, the surface of dendrimer modified PGE was charecterized by using different electrochemical techniques; cyclic voltammetry (CV) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS). The surface characterization of G4-PDR/PGE was also explored by using scanning electron microscopy (SEM). After the optimum conditions were investigated, the voltammetric monitoring of a sequence-selective DNA hybridization related to Hepatitis B virus (HBV) was accordingly performed in the presence of the complementary of probe (target), NC and also the mixture medium containing target:noncomplementary (NC) sequences (1:1). 108

OPTİK VE ELEKTROKİMYASAL DNA BİYOSENSÖRLERİNİN GENETİK HASTALIK VE MİKROORGANİZMA TAYİNİNE YÖNELİK TASARIMI VE UYGULAMALARIDNA'de meydana gelen mutasyonların tayinini yapabilecek ve uzun süre boyunca kullanıma hazır bir şekilde saklanabilecek bir elektrokimyasal DNA biyosensör tasarımı, DNA hibridizasyon esasıyle patojen tayinine yönelik SPR biyosensör tasarımı gerekleştirildi.DNA'nın yapısı aydınlatıldıktan ve önemi anlaşıldığından bu yana DNA anazlizleri için yeni yöntemler geliştirilmesi, moleküler biyoloji ve nanoteknoloji alanındaki gelişmelere paralel olarak ilerlemektedir. Bu gelişmelerle birlikte analiz sistemlerinin boyutları giderek küçültülmekte, hassasiyet ve özgüllükleri giderek arttırılmaktadır.Tez çalışması kapsamında DNA'da mutasyon tayinine yönelik bir elektrokimyasal DNA biyosensör, ve patojen tayinine yönelik yüzey plazmon rezonans (SPR) DNA biyosensör tasarımı gerçekleştirildi.Tez çalışmasının ilk bölümünde şizofreni, alzehmir gibi psikolojik rahatsızlıklardan sorumlu olduğu bilinen bir enzim olan katekol-o-metil transferaz (E.C.2.1.1.6.) sentezinden sorumlu gende gerçekleşen tek nokta polimorfizm (SNP) tayini yapıldı. Kalem grafit elektroda (PGE) tutturulan inozin işaretli prob DNA'lar kullanılarak, sentetik oligonükleotidlerde ve polimer zincir reaksiyonu (PCR) ile üretilen ürünlerde hibridizasyonun tayini gerçekleştirildi. Hibridizasyon tayini guanin yükseltgenme sinyallerinin diferansiyel puls voltametri (DPV) tekniği kullanılarak ölçülmesi ile gerçekleştirildi. Biyosensör tasarımdan etanolaminin (ETA) hibridizasyona olan etkisi zamana bağlı olarak incelendi. En uygun saklama koşullarında ( -20°C, +4°C, +25°C) nekadar süre ile saklanabilecekleri inceledi. Ölçümler asetat tamponu (pH: 4,8) içersinde gerçekleştirildi. Hibridizasyondan önce elektrot yüzeyinden guanin yükseltgenme yanıtı alınmazken, hedef dizi ile hibritleşme sonrasında elde edilen yanıtın yüksek olduğu gözlendi. Probun hedef dizi ile hibridizasyonunun yanı sıra prob, hedef diziden bir baz farklı dizilime sahip ve bazları tamamen farklı olan iki ayrı hedef ile de etkileştirildi. Hibridizasyon sonrası alınan guanin sinyalleri, öngörüldüğü üzere, hedef ile hibridizasyon durumunda en yüksek iken, tek bazı farklı olan hedefle hibridizasyonda biraz daha düşük, rastgele diziyle yapılan hibridizasyonda ise en düşüktür. ETA'nın yüzeydeki boşukları kapladığını böylece sensör elektrotun uzun süre saklanabilmesine olanak verdiği buna karşın, elektron transferini zorlaştırdığı için yanıtlarda düşüşe neden olduğu gözlendi. Belirli sıcaklıklarda (-200C, +40C, +250C) saklanarak, planlanan zamanlarda hedef ile etkileştirilerek hibridizasyon analizi gerçekleştirilen elektrotların, +40C'de 150 gün süresince seçiciliğini kaybetmeden saklanabildiği görüldü. Tasarlanan sensörde kullanılan PGE'lerin tek kullanımlık ve ucuz olması, hazırlanan sensör elektrotların uzun süre bozulmadan bekleyebilir olması fabrikasyona ve seri üretime uygun olabileceği fikrini düşündürmüştür. COMT geni üzerindeki SNP'nin enzim aktivitesinde 4 kata kadar etkili olması ve enzimdeki bozuklukların psikolojik rahatsızlıklardan sorumlu olduğunun düşünülmesi, bu SNP'nin tayininin gerçekleştirilmesini gerekli kılmıştır. Tasarlanan biyosensör ile kısa sürede (21dk) yapılan mutasyon tayini klasik yöntemlere farklı güçlü bir alternatif getirmiştir. Hesaplanan tayin sınırı sentetik hedeflerde 1,184pmol/30µL, PCR ürünlerinde ise 6,09x105 moleküldür. Bu biyosensör yanlızca hızlı, ucuz ve kolay analiz sağlamakla kalmayıp aynı zamanda uzun bir kullanım süresine sahiptir.Tez çalışmasının ikinci kısmında insan, kuş ve bazı memelilerde hastalığa sebep olan İnfluenza B virüsünün tayinine yönelik SPR biyosensörü tasarımı gerçekleştirildi. İnfluenza B virüsünü tanımlayan, tiyol grubu işaretli 21mer oligonükleotit prob olarak kullanıldı. İlk önce prob DNA çip yüzeyine enjekte edildi. Oligonükleotitler tiyol gruplarından ince altım filmle kovalent olarak bağlandı. Bu etkileşim SPR sensöründe yanıta sebep oldu. Yanıt hesaplandı ve prob DNA'nın yanıtı olarak kaydedildi. Daha sonra prob DNA ve hedef PCR ürünü (influenza B PCR ürünü) ile etkileştirildi ve Prob DNA-hedef PCR (hibrit DNA) çip yüzeyine gönderilerek yüzey plazmon rezonans yanıtları hesaplandı. Hibrit DNA ile elde edilen yanıtların, prob DNA ile elde edilen yanıtlardan yaklaşık 2 kat kadar daha yüksek olduğu gözlendi. Hedef PCR ürünü yerine rastgele PCR ürünü (influenza A PCR ürünü) prob DNA ile etkileştirildikten sonra çip yüzeyine gönderilmesi ile elde edilen yanıtların prob DNA yanıtları kadar olduğu gözlendi.Geliştirilen bu biyosensör ile seçilecek özgül prop dizilerle kolayca ve gerçek zamanlı olarak tür tayini yapılmasına sağlamıştır. Klasik tayin yöntemlerine yeni bir alternatif getirmiştir. Tayin sınırı 6,88x105 molekül olarak hesaplanmıştır.Tez çalışması kapsamında geliştirilen her iki biyosensörde hazırlama kolaylığı, kullanım kolaylığı ve düşük maliyeti özellikleri sayesinde fabrikasyona geçirilebilmeye uygundur. THE DESIGN AND APPLICATIONS OF OPTICAL AND ELECTROCHEMICAL BIOSENSORS FOR GENETIC DISEASES AND MICROORGANISM DETECTIONIn this study, by the principle of DNA hybridization, a SPR biosensor that is capable of detecting patogens and an electrochemical DNA biosensor, ready to use for a long time, that will detect the mutations exist in DNA a were designed.After the enlightening the structure of DNA and understanding its importance, for DNA analysis, new metods have been developed parellel to the developments of molecular biology and nanotechnology. By these advancements, the dimensions of analysis systems have been gradually decreased while the sensitivity and specifity have been gradually increased.In this dissertation study, an electrochemical DNA biosensor for detection of DNA mutation and a surface plasmon resonance (SPR) DNA biosensor for detection of pathogens were developed.In the first part of the study, an electrochemical DNA sensor designed to detect single nucleotid polimorphism (SNP) on COMT gene. The gene is responsible for the enzyme, cathecol-o-methyl transferaz enzyme, which causes the psycological diseases like schizophrenia and alzhemier. By the usage of inosine substituted probes that were immobilized on to the surface of pencil graphite electrode (PGE), hybridization between the probe and synthetic target oligonucleotides and polimer chain reaction (PCR) amplicons was achieved. The detection of hybridization was done by evaluation of guanine oxidation signals recorded by differential pulse voltammetry. The effect of ethanolamine on hybridization was examined with respect to time. Also, the maximum duration of the electrodes at the optimum storage conditions ( -20°C, +4°C, +25°C) was specified. The measurements were done in acetate buffer solutions (pH : 4.8). Before hybridization, no guanine oxidation signal was recorded, after the hybridization of immobilized probe with target sequence, the recorded oxidation signal of guanine was relatively high. In addition to the hybridization of probe with its complementary target, probe was hybridized with a non-complementary target and a mismatch target. The purpose of doing this is, to prove the nonexistence of hybridization between probe and target that is not fully complementary to the probe. As expected, the guanine oxidation signals recorded after hybridization was seen to be highest in the case of full complementarity and decreasing from mismatch to noncomplementary. It was observed that, the usage of ETA enables the storage of electrode for a long time due to its covarage of electrode surface, although, the signals were seemed to be lowered since it makes difficult the electron transfer. Also, it was proved that, it is possible to store the electrodes for 150 days at +4 0C according to the tests repeated at different temperatures for specific duration periods. The idea of fabrication and mass production of PGEs due to their disposiblity, cheapness and long shell life was supposed as a future aspect. It makes necessary to detect the Single nucleotide polimorphism (SNP) due to the fact that, the SNP on COMT gene, affects the enzyme activity up to 4 fold and this failure of enzymes are responsible for psycological diseases. By the designed biosensor, a new powerful alternative to the classical mutation methods was brought in. This biosensor not only rapid (21dk), cheap and enables easy analysis, but also has a long shell life. Detection limit calculated 1,184pmol/30µL for synthetic target and 6,09x105 molecules for PCR products.In the second part of the dissertation study, a design of a SPR biosensor that is capable of detecting influenza B virus that causes the disease in human beings, birds and some mammals were done.Thiol attached 21mer oligonucleotid which, represents the influenza B virus was used as probe DNA. Firstly probe DNA enjected to the chip surface. The oligonucleotid attached covalently with gold thin metal film on chip surface. This interaction caused a response from SPR sensor. The response calculated and saved as probe response. After that probe DNA and target PCR product (influenza B PCR product) interacted than, probe DNA-target PCR product (hybrid DNA) was send to the chip surface and the responses of plasmon resonance were calculated. The response belonging to hybrid DNA was seen to be approximately two times higher than the responses of probe DNA. It was observed that, the signal recorded after sending the interacted probe with non-complementary PCR product (influenza A PCR product) instead of target PCR product to the chip surface, was as much as the signal of probe.This developed biosensor enabled the detection of specimen by specific probe sequences and is an alternative method to classical detection methods. Detection limit calculated as 6,88x105 molecules.Both biosensors developed throughout this study are suitable for fabrication due to their ease of use and low cost features. 117

Bu tez çalışmasında; bazı maddelerin çift sarmal DNA (dsDNA) ile Grafit Kalem Elektrot (PGE) yüzeyinde, Diferansiyel Puls Voltametrisi (DPV) ve Döngüsel Voltametri (CV) yöntemleri kullanılarak DNA'ya ait Guanin ve Adenin ile maddeye ait yükseltgenme sinyallerine dayanarak etkileşim çalışmaları yapılmıştır. Bu çalışmalar elektrot yüzeyi ve çözelti ortamında olmak üzere 2 farklı yöntemle gerçekleştirildi. Etkileşim sonrası DNA'ya ait Guanin ve Adenin bazlarının yükseltgenme sinyalindeki düşüş, bu bazların hasara uğradığını göstermektedir.Sentezi yeni yapılmış maddelerin DNA ile etkileşim mekanizmalarının tespit edilmesi, üretimi yeni yapılacak ilaçların tasarımında faydalı sonuçlar ortaya çıkaracaktır.Sonuç olarak yapılan çalışmada, DNA ile etkileşim gösteren maddelerin elektrokimyasal davranışlarının tayini, kanser tedavisinde uygulanabilir DNA'ya özgü olarak bağlanan moleküllerin dizayn edilmesi ve DNA'ya bağlı hasta başı teşhislerinde kullanılan küçültülebilir aygıtların geliştirilmesinde önemli olacaktır. In this thesis; Interaction studies about some substances with fish sperm double-stranded DNA (dsDNA) were made electrochemically rely on the oxidation signals of guanine, adenine and substances by using Differential Pulse Voltammetry (DPV) and Cyclic Voltammetry (CV) with Pencil Graphite Electrode (PGE). The electrochemical procedure for the detection of these studies was based on two methods as; interaction at electrode surface and at solution phase. Decrease in oxidation signals of guanine and adenine after interaction of substance and DNA indicated there could be damage to guanine and adenine bases.Determining the interaction mechanisms of newly synthesized substances with DNA will give beneficial results by designing newly produced drugs.To sum up; Detecting the electrochemical behaviors of several substances that interact with DNA will be important by designing of sequence-spesific DNA binding molecules in cancer therapy and improvement of miniaturized devices which are used for medical diagnosis. 173

Yapılan çalışmada sentetik bir madde olan 2-(1H-benzimidazol -2-il) fenol ve Artemisia campestris adlı bir bitkiden elde edilen ekstrenin tek sarmal ve çift sarmal DNA ile olan etkileşimleri elektrokimyasal yöntemlerle incelendi. Etkileşimlerin belirlenebilmesi için elektrokimyasal tayin tekniklerinden Diferansiyel Puls Voltametri (DPV) ve Dönüşümlü Voltametri tekniği (CV) ile tek kullanımlık kalem elektrot (PGE) çalışma elektrodu olarak kullanıldı.2-(1H-benzimidazol -2-il) fenol maddesinin DNA ile etkileşimi çalışmasında; DPV tekniği kullanılarak, etkileşim için uygun konsantrasyon ve süre koşulları belirlendi. pH değişiminin etkileşime etkisini görebilmek için 2-(1H-benzimidazol -2-il) fenol farklı tampon çözeltileri içinde hazırlandı. Prob tutturma yöntemlerinin etkileşim üzerine etkisi ve biyosensör özgüllüğünün tayini çalışmaları yapıldı. DNA modifiye edilmiş elektrot yüzeyinde etkileşim sonucu bu maddeye ait görünen bağlanma katsayısı değeri hesaplandı.Artemisia campestris ekstresi için DPV tekniği ile etkileşim için uygun konsantrasyon ve süre koşulları belirlendi. CV tekniği ile tarama hızı çalışmasıyla maddeye ait kütle aktarım mekanizması ve reaksiyonun tersinirliği parametreleri incelendi. Çözelti fazında DNA ile etkileşim çalışması sonucunda, potansiyelde meydana gelen değişimler incelendi.Her iki madde ile yapılan çalışmalarda; guanin bazına ve maddeye ait yükseltgenme sinyallerinde meydana gelen değişimler incelendi.Sonuç olarak; gelecekte antikanser ilaç olarak kullanılabilecek aday moleküllere dair ilk verileri elde etmek ve DNA hibridizasyon biyosensörlerinde kullanılabilecek yeni bir hibridizasyon indikatörü bulmak amacıyla bir biyosensör tasarlanmıştır. İncelenen bu iki maddenin DNA ile etkileşiminin ardından ssDNA ve dsDNA' ya ait guanin yanıtlarında meydana gelen belirgin farklanma, maddelerin hibridizasyon indikatörü olarak kullanabileceğini göstermiştir. In this study, a synthetic substance 2-(1H-benzimidazol-2-il) phenol and the extract obtained from a plant called Artemisia campestris that interact with a single helix and double helix of DNA has been examined with the electrochemical method.For the determination of interactions, Differential Pulse Voltametry (DPV) and Cyclic Voltametry (CV) that are the electrochemical designation techniques were used. Disposable pencil graphite electrode (PGE) was used for a working electrode.2-(1H-benzimidazol-2-il) phenol substances in studies of the interaction with DNA, by using the DPV technique, concentration and duration of conditions suitable for interaction have been identified. To see the effect of exchange interaction to pH 2-(1H-benzimidazol-2-il) phenol was prepared in different buffer solutions. The effect of the interaction prob immobilization methods and determination of specificity biyosensor work done. Apparent binding constant was calculated.The study made with Artemisia campestris, concentration and duration statements for interaction, have been identified with the DPV technique. CV technique with scan rate of work, materials for the mass transfer mechanism and the reaction reversibility parameters have been examined.Interact with DNA in solution phase as a result of the study, the potential change has been occurring in. In studies with both substances, guanine and substance oxidation signals change has been researched.As a result, a biosensor was designed for, to obtain first data for candidate molecules can be used as anticancer medicine in the future and to find a new DNA hybridization indicators. 146

Kanserli dokuların elektrokimyasal ve spektroskopik analiz verilerinin tümör sınıflandırılmasındaki (tumor grading) kullanılabilirliğinin incelenmesi konulu tez çalışmalarımızda hem elektroanalitik bulgulara dayanan kemometrik analizlerin hem de kromatografik yöntem (HPLC) bulgularının tümör tanı ve sınıflandırılmasında kullanılabilirliği incelenmiştir. Voltamogramlardaki pik yeri ve şekillerine bakılarak tümör tanı ve sınıflandırılmasının yapılabilmesi için farklı türlere ait voltamogram veri tabanının çok geliştirilmesi ve tekrarlanabildik ölçüsünün yeterli düzeyde test edilebilmesi için örnek sayısının oldukça arttırılması gerekmektedir. Bu gerçek dikkate alınarak tez çalışmalarımızda tümör tanı ve sınıflandırma işlemleri, dönüşümlü voltamogralardaki pik şekil ve sayısı yerine veri kümelerinin sayısal anlamda birbirlerinden farklılıklarının incelendiği kemometrik analizlere dayandırılmıştır. Kemometrik analizler sonucunda az sayıdaki örneğe rağmen ilk 3 ana bileşen kullanıldığında menengiomaların geri kalan tüm dokulardan başarıyla ayrılabildiği gözlenmiştir. Ancak diğer dokuların ayrılmaları mümkün olamamıştır. Buna istatistiksel anlamsızlığa neden olan örnek sayısının azlığı en olası neden olarak gösterilebilir. Çalışmalarımızın 80HdG düzeylerinin saptanması kısmında gerçekleştirilen HPLC analizleriyle ise glioblastoma dokularının diğer dokulardan daha fazla 80HdG içermekte olduğu gösterilmiştir.