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Plant virus identification and characterization can be accomplished by several methods involving their morphological, physical, biological, cytological, serological and molecular properties. The use of molecular techniques is increasing worldwide, and some have been developed for identification and characterization of plant viruses. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) has been shown to be a suitable method for research with RNA plant viruses. In this study, a new approach of RT-PCR involving previous virus immunoprecipitation (IP) was used for RNA amplification of five virus species of the genera Comovirus, Cucumovirus, Potyvirus and Sobemovirus from infected plant tissues. IP-RT-PCR was practical, sensitive and minimized problems with total RNA extractions from infected tissues. The technique provides partial virus particle purification by its specific immunoprecipitation, and it should be especially useful for RNA amplification of viruses that occur in low or variable concentrations in plant tissues or when the tissues contain various forms of RT-PCR amplification inhibitors.

Visando verificar a ocorrência de vírus em cultivos de feijoeiro-caupi (Vigna unguiculata), foram realizadas visitas de inspeção a campos de produção dos municípios de Bom Sucesso, Paulista e Pombal, no estado da Paraíba, durante os meses de agosto a dezembro de 2009 e de fevereiro a maio de 2010. Amostras foliares com sintomas típicos de mosaico e deformação foliar foram coletadas e analisadas por "enzyme linked immunosorbent assay" (ELISA) indireto contra anti-soros específicos para Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) e Cucumber mosaic virus (CMV) e por dupla difusão em ágar contra anti-soro para Cowpea severe mosaic virus (CPSMV). Cinco amostras coletadas com sintomas de mosaico dourado no município de Pombal na época chuvosa foram submetidas à detecção molecular por meio de "Polymerase Chain Reaction" (PCR) para Begomovirus. A ocorrência de CPSMV e CABMV foi observada nos campos de produção dos três municípios visitados nas duas épocas de cultivo analisadas, em infecções simples e mistas. A presença de vírus do gênero Begomovirus foi confirmada em amostras foliares com sintomas de mosaico dourado. Entretanto, estudos adicionais serão necessários para a identificação da espécie. CMV não foi detectado em nenhum dos municípios analisados.

Cowpea (Vigna unguiculata) is an important crop of the traditional agriculture system in the Northeast of Brazil. It can be infected by more than 20 virus species and Cowpea severe mosaic virus (CPSMV) is one of the most important pathogens that naturally infect cowpea in Brazil. Several CPSMV isolates were obtained and characterized in the Plant Virus Laboratory at the Federal University of Ceará: CPSMV-CE - the first characterized isolate of the virus obtained from cowpea in the State of Ceará; CPSMV-AL - isolated from cowpea in Alagoas; CPSMV-PE - isolated from cowpea in Pernambuco; CPSMV-PR - obtained from soybean (Glycine max) in Paraná and CPSMV-CROT - isolated from Crotalaria paulinea, in Maranhão. An isolate of CPSMV with the property to infect the cv. Macaibo, a cowpea cultivar immune to most of CPSMV isolates was also biologically and serologically characterized as a new strain of the virus (CPSMV-MC). The CPSMV-MC was isolated in January 1990 and has been evaluated over 20 years by host range studies and maintenance in vivo by periodical mechanical inoculations in cowpea. The results of this periodical evaluation revealed that the biological integrity and the serological properties of CPSMV-MC were preserved over 20 years, indicating that the genetic preservation of a virus strain could occur over the years. Molecular studies involving part of the coat protein (CP) gene of CPSMV-MC and five other Brazilian CPSMV isolates indicated a high degree of conservation, with 92-100% nucleotide sequence identity among the isolates. O feijão-caupi (Vigna unguiculata) é uma cultura do sistema tradicional do Nordeste do Brasil, que pode ser infetada por mais de 20 espécies de vírus, sendo o vírus do mosaico severo do caupi (Cowpea severe mosaic virus, CPSMV) um dos mais importantes patógenos que infeta naturalmente essa leguminosa no Brasil. Vários isolados do CPSMV foram obtidos e caracterizados no Laboratório de Virologia Vegetal da UFC: CPSMV-CE - o primeiro isolado do vírus obtido no Ceará; isolados obtidos de feijão-caupi: CPSMV-AL (Alagoas) and CPSMV-PE (Pernambuco); CPSMV-PR - isolado de soja (Glycine max) no Paraná e CPSMV-CROT - isolado de Crotalaria paulinea no Maranhão. Um isolado de CPSMV capaz de infetar o cv. Macaibo, cultivar de ffeijão-caupi imune a todos os demais isolados de CPSMV foi biológica e sorologicamente caracterizado e designado de CPSMV-MC. O CPSMV-MC obtido em janeiro de 1990 vem sendo avaliado através de estudos de gama de hospedeiro e mantido in vivo através de inoculações periódicas em feijão-caupi. Os resultados dessas avaliações revelaram que a integridade biológica e as propriedades sorológicas do CPSMV-MC foram preservadas ao longo dos anos, indicando que a preservação das propriedades genéticas de uma estirpe viral pode acontecer através dos anos. Estudos moleculares adicionais revelaram que a seqüência de nucleotídeos correspondente a parte do gene da capa protéica de cinco isolados de CPSMV, incluindo o CPSMV-MC, possui elevado grau de conservação, com 92-100% da seqüência de nucleotídeos idêntica entre os isolados.

The objective of this work was to identify new sources of simple and multiple resistances to Cowpea severe mosaic virus (CPSMV), Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) and Cucumber mosaic virus (CMV) isolates in cowpea (Vigna unguiculata). Thirty-three genotypes from the germplasm bank of Universidade Federal do Ceará were tested as to their resistance to four CPSMV isolates, two CABMV isolates and one CMV isolate. Twenty-five days after the first virus inoculations, all inoculated plants, including the asymptomatic ones, were tested by serology. Genotypes were classified as: immune, plants without symptoms and negative serology; resistant, plants with mild mosaic and positive serology; susceptible, plants with mosaic and positive serology; and highly susceptible, plants with severe mosaic, other systemic symptoms, including systemic necrosis, and positive serology. Simple and multiple resistances to viruses were identified among the evaluated genotypes, but none of them showed multiple immunities to all isolates. Four genotypes showed immunity to all CPSMV isolates, two were immune to CABMV and two showed immunity to CMV. Eleven genotypes showed multiple resistances to two viruses, allowing for the development of new cultivars with more stable and broader resistance. Genotypes Purple Knuckle Hull-55, MNC-03-731C-21 and CNCx284-66E show resistance to CABMV, even when inoculated with CMV.

O feijão caupi Vigna unguiculata subsp. unguiculata constitui um alimento básico das populações rurais e urbanas das regiões Norte e Nordeste, possui grande importância como gerador de emprego e renda, sendo cultivado por pequenos e médios produtores. O Brasil é o maior produtor de feijão [feijão comum (Phaseolus vulgaris) e feijão caupi] com produção de 2,5 mil toneladas, na safra de 2015/16, sendo os estados do Paraná e Minas Gerais os maiores produtores de feijão comum, ficando o estado do Ceará na nona posição. Vários fatores afetam a cultura do feijão caupi, influenciando na qualidade e na quantidade produzida, destacando as viroses como responsáveis por grandes perdas na cultura. Várias espécies de vírus podem infectar naturalmente o feijão caupi, destacando-se o Cowpea severe mosaic virus (CPSMV). O objetivo desta pesquisa foi estudar a variabilidade genética de isolados de CPSMV, de diferentes estados da Região Nordeste, por meio da caracterização biológica, sorológica e molecular. Os experimentos realizados foram conduzidos em casa de vegetação e no Laboratório de Virologia Vegetal da Universidade Federal do Ceará. O isolado de CPSMV-MC foi purificado a partir de plantas de feijão caupi cultivar Macaibo, obtendo uma preparação viral com concentração de 64,83 mg de vírus por Kg de tecido infectado e título do antissoro de 1:1.024, em teste de Dupla Difusão em Ágar (DDA). No estudo biológico, por gama parcial de plantas hospedeiras, mostrou diferença sintomatológica entre o isolado CPSMV-MC e os demais. O resultado do estudo sorológico mostrou que o isolado CPSMV- MC pode ser sorologicamente distinto, quando utilizado antissoro produzido a partir deste isolado. As análises eletroforética revelaram bandas referentes ao peso da proteína capsidial, formada por duas proteínas estruturais de aproximadamente 22,5 kDa e de 39 kDa. Estudo de comparação entre PTA-ELISA e IP-PTA-ELISA, variações da técnica de ELISA, mostrou que o IP-ELISA foi eficiente e confiável para a detecção do CPSMV, contornando alguns problemas de vírus do gênero Comovirus que não aderem adequadamente aos fundos dos orifícios das placas de ELISA. No estudo molecular, os primers desenhados para o genoma parcial de regiões dos RNA1 e RNA2 podem ser utilizados tanto para detecção quanto para sequenciamento do vírus. As análises filogenéticas das sequências dos isolados de CPSMV, utilizando primers para a região do RNA1, revelaram diferença entre o isolado CPSMV-MC e os demais, enquadrando os mesmos em dois grupos. Um grupo que causam sintomas severos, agregando sete isolados de CPSMV e o outro grupo com apenas um isolado, que causa sintoma leve (CPSMV-MC) em feijão caupi. O estudo de interação entre vírus que infecta o feijão caupi ?Setentão? mostrou forte sinergismo entre CPSMV, Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) e Cucumber mosaic virus (CMV), levando em alguns casos morte da planta, principalmente, quando da interação desses três vírus, sendo que dois desse isolados apresentaram sintomas severos nas plantas, quando em infecção simples. Estudos desta natureza, envolvendo aspectos relacionados ao patógeno e a planta produzem informações importantes aos programas que visam o desenvolvimento de cultivares resistentes a vírus. Made available in DSpace on 2018-12-28T23:37:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseAna.pdf: 1731430 bytes, checksum: 52fe9ff98614a1fa8e493ba2d12f68ef (MD5) Previous issue date: 2018-12-26 Tese (Doutorado em Agronomia/Fitotecnia) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza. Orientador: Prof. Fernando Antonio Souza de Aragão. Co-orientador: Prof. José Albersio de Araújo Lima.