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Data associated to the paper submitted to Geophysical Research Letters

La sclerosi multipla (SM) � una patologia infiammatoria autoimmune cronica, demielinizzante e invalidante, del sistema nervoso centrale (SNC). Recentemente, un crescente interesse � stato rivolto alle vescicole extracellulari (EVs), in particolare microvescicole (MVs) ed esosomi (EXOs), risultati essere importanti mediatori della comunicazione tra cellule, in condizioni sia fisiologiche che patologiche. Diverse evidenze indicano che il rilascio delle MVs aumenta nelle cellule immunitarie, in particolare quelle della linea mieloide, dopo stimolazione con APT del recettore purinergico P2X7 (un recettore di segnale dell?ATP), attraverso l'attivazione della sfingomielinasi acida (A-SMase), che media anche il rilascio della citochina infiammatoria IL-1?. Il contenuto delle MVs comprende acidi nucleici, proteine cellulari e lipidi che possono essere trasferiti alle cellule target. In particolare, le MVs sono in grado di trasferire piccole sequenze di RNA non codificanti (miRNA), che sono deregolati nel sistema immunitario e nel SNC di pazienti affetti da SM e che stanno emergendo come nuovi biomarcatori di malattia. Il principale obiettivo di questo studio � indagare l?effetto del Fingolimod, un trattamento di seconda linea per la SM, sulla produzione delle MVs e dei pathways cellulari coinvolti in monociti di pazienti affetti, utilizzando un approccio sperimentale che sfrutta la quantificazione spettrofotometrica e la valutazione dell?espressione genica mediante Real-time PCR. Trentasette pazienti con SM sono stati arruolati, diciannove dei quali in trattamento con il Fingolimod e valutati dopo 12 mesi di trattamento. Diciotto donatori sani (HDs) sono stati inoltre reclutati e analizzati nello stesso modo. Le MVs, marcate con NBD C6-Spingomielina, sono state quantificate mediante metodo spettrofotometrico. L'attivit� di A-SMase � stata determinata utilizzando il dosaggio fluorimetrico del reagente Amplex Red, mentre l'espressione del recettore P2X7, IL-1? e A-SMase nei monociti � stata quantificata mediante qRT-PCR. Abbiamo riscontrato che la produzione basale di MVs � pi� alta nei monociti di pazienti con SM non trattati rispetto ai pazienti trattati con Fingolimod o HDs. La stimolazione con il Benzoil-ATP, un analogo sintetico dell?ATP, incrementa significativamente la produzione di MVs negli HDs e nei pazienti trattati con Fingolimod, ma non nei pazienti con SM. Abbiamo osservato che il trattamento � in grado di ridurre la produzione delle MVs nei monociti rispetto ai pazienti SM non trattati, sia in condizioni di stimolo che di non stimolo. L'espressione del recettore P2X7 aumenta, invece, nei pazienti trattati con Fingolimod rispetto ai HDs in entrambe le condizioni. Tuttavia, il farmaco riduce l'espressione di IL-1? e l'attivit� di A-SMase nei monociti stimolati con BzATP in pazienti con SM. Complessivamente, i nostri risultati suggeriscono che le MVs aumentano in corso di malattia e che il trattamento con Fingolimod � in grado di ridurre la produzione delle stesse inibendo l'attivit� di A-SMase. I nostri dati suggeriscono, inoltre, che le MVs monocitarie possono essere considerate come un possibile biomarker di malattia. In secondo luogo, abbiamo valutato l?espressione di alcuni microRNA nelle EVs e la relativa espressione degli stessi miRNA nei monociti di pazienti affetti da SM e HDs. A tale scopo, sono stati arruolati 35 pazienti affetti da SM (21 RRMS e 14 PPMS) e 16 HDs, analizzati in maniera analoga. Sono stati valutati dei miRNA specifici, noti per essere importanti nella regolazione del sistema immunitario e del SNC, cos� come nel crosstalk tra monociti/macrofagi e oligodendrociti o neuroni. Risultati preliminari rivelano livelli detectabili di un set di miRNAs, per esempio il miR- 146a, miR-181a, miR-223, miR-23a, miR- 30c e il miR125a noti per essere alterati nella SM, in EVs isolate da monociti di pazienti e HDs. Successivamente abbiamo valutato l?espressione differenziale di questi miRNAs in monociti da pazienti e HDs. Complessivamente, i nostri dati suggeriscono che lo studio dei miRNAs cellulari pu� fornire informazioni sul loro ruolo nella risposta infiammatoria. Inoltre, il loro possibile coinvolgimento nelle funzioni sinaptiche, nella SM e in altre malattie neuroinfiammatorie, � sicuramente meritevole di ulteriori considerazioni per studi futuri. L?ottimizzazione e la standardizzazione dei protocolli per isolare e caratterizzare il contenuto di EVs rappresenta la sfida che la ricerca futura dovr� affrontare al fine di identificare nuovi biomarcatori.