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Wood-feeding termites effectively degrade plant biomass through enzymatic degradation. Despite their high efficiencies, however, individual glycoside hydrolases isolated from termites and their symbionts exhibit anomalously low effectiveness in lignocellulose degradation, suggesting hereto unknown enzymatic activities in their digestome. Herein, we demonstrate that an ancient redox-active enzyme encoded by the lower termite Coptotermes gestroi, a Cu/Zn superoxide dismutase (CgSOD-1), plays a previously unknown role in plant biomass degradation. We show that CgSOD-1 transcripts and peptides are up-regulated in response to an increased level of lignocellulose recalcitrance and that CgSOD-1 localizes in the lumen of the fore- and midguts of C. gestroi together with termite main cellulase, CgEG-1-GH9. CgSOD-1 boosts the saccharification of polysaccharides by CgEG-1-GH9. We show that the boosting effect of CgSOD-1 involves an oxidative mechanism of action in which CgSOD-1 generates reactive oxygen species that subsequently cleave the polysaccharide. SOD-type enzymes constitute a new addition to the growing family of oxidases, ones which are up-regulated when exposed to recalcitrant polysaccharides, and that are used by Nature for biomass degradation.

Wood-feeding termites effectively degrade plant biomass through enzymatic degradation. Despite their high efficiencies, however, individual glycoside hydrolases isolated from termites and their symbionts exhibit anomalously low effectiveness in lignocellulose degradation, suggesting hereto unknown enzymatic activities in their digestome. Herein, we demonstrate that an ancient redox-active enzyme encoded by the lower termite Coptotermes gestroi, a Cu/Zn superoxide dismutase (CgSOD-1) plays a previously unknown role in plant biomass degradation. We show that CgSOD-1 transcripts and peptides are up-regulated in response to an increased level of lignocellulose recalcitrance and that CgSOD-1 localizes in the lumen of the fore- and midguts of C. gestroi together with termite main cellulase, CgEG-1-GH9. CgSOD-1 boosts the saccharification of polysaccharides by CgEG-1-GH9. We show that the boosting effect of CgSOD-1 involves an oxidative mechanism of action in which CgSOD-1 generates reactive oxygen species that subsequently cleave the polysaccharide. SOD-type enzymes constitute a new addition to the growing family of oxidases, ones which are up-regulated when exposed to recalcitrant polysaccharides, and that are used by Nature for biomass degradation.

A celulose bacteriana possui em comparação com a celulose vegetal elevado grau de pureza, resistência mecânica, cristalinidade, biocompatibilidade e alta absorção de água apresentando potencial de aplicação em diversas áreas. Pode ser produzida por diversas fontes microbianas, como a bactéria Gluconacetobacter xylinus, com alto nível de pureza. Outra fonte de produção de celulose bacterianaé o SCOBY, symbiotic colony of bacteria and yeasts bebida Kombucha, que consiste em uma comunidade microbiana constituída por leveduras e bactérias. No entanto, o elevado custo de produção de celulose bacteriana compromete a sua produção em escala industrial. Meios de cultura que utilizem fontes alternativas de carbono apresentam potencial para produção promovendo a diminuição de custo do produto final. O objetivo do presente trabalho consistiu em avaliar a produção de celulose bacteriana em cultivo estático utilizando o SCOBY de kombucha e G. xylinus em meio contendo glicerol como fonte de carbono. A produção de CB utilizando SCOBY e o microrganismo isolado G. xylinusfoi realizada em 400 mL de meio HSG a 26 °C por 7 dias, por 5 semanas consecutivas. Após a produção, as membranas foram purificadas através de tratamento com NaOH e ácido acético e posteriormente foram secas por 24 horas a 45 °C, para determinação da massa seca. Em seguida foram realizados os métodos comumente empregados para caracterização de celulose bacteriana: rendimento, controle microbiológico por meio do teste de esterilidade, resistência à tração, absorção de água e resistência a soluções básicas e ácidas. A produção utilizando o microrganismo G. xylinus obteve rendimento semelhante ao obtido utilizando o SCOBY na quinta semana de cultivo, de 1,64 g/L e 1,48 g/L, respectivamente. O teste de esterilidade, mostrou que a etapa de purificação foi capaz de remover as células viáveis, assim como o processo de autoclavagem, uma vez que não foi observado turvação do meio em nenhuma das amostras. Dentre os parâmetros avaliados, não foi verificado diferença estatística, considerando intervalo de 95% de confiança, nas membranas produzidas por G. xylinus e SCOBY para o teste de resistência mecânica e resistência a ácidos. No entanto para o teste de resistência a soluções básicas e para o teste de absorção de água foi verificado que a membrana proveniente de G. xylinus foi capaz de absorver mais água e houve uma perda maior de massa no teste em solução básica. Os resultados deste trabalho demonstram que o SCOBY de kombucha apresenta-se como uma potencial fonte de celulose bacteriana tanto no que se refere ao rendimento de produção como características da membrana obtida. Novos estudos deverão ser realizados buscando investigar o uso de fontes de carbono alternativas para sua produção. Bacterial cellulose has compared to plant cellulose a high degree of purity, mechanical resistance, crystallinity, biocompatibility and high-water absorption, presenting potential application in several areas. It can be produced by several microbial sources, such as the Gluconacetobacter xylinus bacteria, with a high level consists of a microbial community made up of yeasts and bacteria. However, thehigh cost of producing bacterial cellulose compromises its production on an industrial scale. Culture media that use alternative carbon sources have potential for production, reducing the cost of the final product. The objective of the present work was to evaluate the production of bacterial cellulose in static culture using SCOBY from kombucha and G. xylinus in a medium containing glycerol as a carbon source. BC production using SCOBY and the isolated microorganism G. xylinus was performed in 400 mL of HSG medium at 26 °C for 7 days, for 5 consecutive weeks. After production, the membranes were purified by treatment with NaOH and acetic acid and subsequently dried for 24 hours at 45 °C, to determine the dry mass. Then, the methods commonly used for characterization of bacterial cellulose were carried out: yield, microbiological control through the sterility test, tensile strength, water absorption and resistance to basic and acidic solutions. The production using the microorganism G. xylinus obtained a yield like that obtained using SCOBY in the fifth week of cultivation, of 1,64 g/L and 1,48 g/L, respectively. The sterility test showed that the purification step was able to remove viable cells, as well as the autoclaving process, since no medium turbidity was observed in any of the samples. Among the parameters evaluated, there was no statistical difference, considering a 95% confidence interval, in the membranes produced by G. xylinus and SCOBY for the mechanical resistance and acid resistance tests. However, for the resistance test to basic solutions and for the water absorption test, it was verified that the membrane from G. xylinus was able to absorb more water and there was a greater loss of mass in the basic solution test. The results of this work demonstrate that SCOBY from kombucha presents itself as a potential source of bacterial cellulose both in terms of production yield and characteristics of the membrane obtained. New studies should be carried out seeking to investigate the use of alternative carbon sources for its production.

Alimentos que passam pelo processo de fermentação apresentam mudanças em suas características, como alterações no sabor, aroma e textura, as quais atraem a atenção de diversos consumidores, além de estarem associadas a benefícios para saúde. O kefir é uma bebida originada da fermentação do leite, a partir de uma mistura complexa de bactérias e leveduras que vivem simbioticamente e formam o grão de kefir. A identificação e caracterização da microbiota presente no grão de kefir pode viabilizar a produção em maior escala, visto que o conhecimento da mesma pode estimular a produção de culturas iniciadoras, que podem contribuir para a obtenção de uma bebida estável, padronizada e segura. Neste contexto, o objetivo deste trabalho consistiu em avaliar a microbiota pertencente aos grãos de kefir bem como identificar e isolar os microrganismos pertencentes à bebida kefir, visando à identificação de possíveis candidatos para a elaboração de cultura iniciadora. O sequenciamento da região V4 do gene 16S rRNA do DNA extraído dos grãos de kefir foi realizado para a caracterização da comunidade bacteriana. Em paralelo, foi realizado o cultivo e isolamento dos microrganismos presentes nos grãos e na bebida kefir, visando à obtenção de isolados representantes dos grupos das bactérias láticas, acéticas e leveduras, seguido pela caracterização morfológica e bioquímica e identificação molecular. A viabilidade celular e identificação dos microrganismos presentes na bebida kefir foram estimadas por plaqueamento e contagem das unidades formadoras de colônia em meios para isolamento de bactérias acéticas, láticas e fungos. Através da análise do sequenciamento dos grãos, o gênero predominantemente encontrado foi o Lactobacillus, seguido por Lactococcus, Acetobacter, Faecalibacterium, Leuconostoc, Bacteroides e Bifidobacterium. Nenhum isolado foi obtido a partir do grão de kefir, no entanto, 26 isolados foram recuperados a partir da bebida. Através da coloração de gram, do total de isolados, 6 apresentaram características de bactérias Gram positivas, 6 de bactérias Gram negativas e 14 de leveduras. Através sequenciamento dos genes 16S rRNA, um isolado foi identificado como Lactococcus lactis e outro como Bacillus thuringiensis. Através do sequenciamento da região ITS, um isolado foi identificado como Candida parapsilosis. As três espécies citadas já foram descritas na literatura como sendo encontradas na bebida kefir, mas ainda assim não representam a diversidade microbiana encontrada no grão de kefir. Neste sentido, técnicas alternativas de isolamento precisam ser avaliadas e testadas, visando ampliar o acesso aos isolados presentes no grão do kefir com o foco na formulação de uma cultura iniciadora. Foods that are present in fermentation process show changes in their characteristics, such as changes in flavor, aroma and texture, which attract the attention of several consumers, in addition to being associated with health benefits. Kefir is a drink originated from the fermentation of milk from a complex mixture of bacteria and yeasts that live symbiotically and form the kefir grain. The identification and characterization of the microbiota present in the kefir grain can enable production on a larger scale, since knowledge of it can stimulate the production of starter cultures, which can contribute to obtaining a stable, standardized and safe drink. In this context, the objective of this work was to evaluate the microbiota belonging to the kefir grains as well as to identify and isolate the microorganisms belonging to the kefir drink, aiming at the identification of possible candidates for the preparation of starter culture. The sequencing of the V4 region of the 16S rRNA gene from the DNA extracted from the kefir grains was carried out to characterize the bacterial community. In parallel, the cultivation and isolation of the microorganisms present in the grains and in the kefir drink was carried out, aiming at obtaining isolated representatives of the groups of lactic bacteria, acetic bacteria and yeasts, followed by the morphological and biochemical characterization and molecular identification. Cell viability and identification of the microorganisms present in the kefir drink were estimated by plating and counting the colony-forming units in media for isolation of acetic bacteria, lactic bacteria and fungi. Through the analysis of grain sequencing, the genus predominantly found was Lactobacillus, followed by Lactococcus, Acetobacter, Faecalibacterium, Leuconostoc, Bacteroides and Bifidobacterium. No isolates were obtained from the kefir grain, however, 26 isolates were recovered from the drink. Through gram staining, of the total isolates, 6 showed characteristics of Gram positive bacteria, 6 of Gram negative bacteria and 14 of yeast. By sequencing the 16S rRNA genes, one isolate was identified as Lactococcus lactis and the other as Bacillus thuringiensis. By sequencing the ITS region, an isolate was identified as Candida parapsilosis. The three species mentioned have already been described in the literature as being found in the kefir drink, but still do not represent the microbial diversity found in the kefir grain. In this sense, alternative isolation techniques need to be evaluated and tested, in order to expand access to the isolates present in the kefir grain with a focus on the formulation of a starter culture.

As amêndoas de cacau são fermentadas durante sua etapa de pré-processamento e a qualidade final do chocolate obtido a partir delas depende de vários fatores, como a variedade genética e modo de beneficiamento do cacau bem como das etapas de fermentação e secagem, que conferem sabores e aromas singulares às amêndoas. Com a ascensão do mercado de produtos funcionais, o chocolate com alto teor de cacau é um alimento de destaque, além de ser um potencial veículo para a inclusão de substâncias benéficas à saúde, como os probióticos. No entanto, um dos principais desafios encontrados nestes casos é a manutenção da viabilidade celular dos microrganismos probióticos, e sendo assim, técnicas de imobilização e/ou incorporação de agentes protetores, podem ser empregados com esta finalidade. Neste contexto, o objetivo desse trabalho consistiu em avaliar a viabilidade celular de probióticos incorporados em barras de chocolates artesanais com elevado teor de cacau. Inicialmente, as barras de chocolate foram confeccionadas a partir das amêndoas das variedades Parazinho e Trinitário SJ02, contendo 70% de cacau. Posteriormente, amostras liofilizadas do probiótico Lactobacillus plantarum foram incorporados ao chocolate com e sem adição de 20% manteiga (m/m). Para avaliar a viabilidade celular dos probióticos, as análises foram realizadas logo em seguida à confecção (tempo zero) das barras e após 30 dias e 60 dias de armazenamento a 25 oC e 4 oC, através da contagem de unidades formados de colônia (UFC) em meio ágar MRS. Como resultado, os testes de viabilidade celular realizados demonstraram que a presença da manteiga de cacau nas amostras não influenciou na viabilidade celular do L. plantarum durante a estocagem por 30 dias a 4 e 25 ° C, pois todas as condições testadas mantiveram taxa de sobrevivência acima de 108 células UFC/g. No caso do armazenamento durante 60 dias a 25 ºC, foi observado que as condições na presença de manteiga de cacau apresentaram redução na viabilidade celular, o que também foi observado no caso da variedade Parazinho, na presença de manteiga de cacau, por 60 dias, a 4 ºC. Como conclusão desse trabalho, observa-se que os chocolates contendo formulação de cacau 70% demonstraram ser uma potencial matriz para incorporação de probióticos, sem a indicação da necessidade de adição de manteiga de cacau para manutenção da viabilidade celular dos probióticos nas condições avaliadas. Sendo assim, o produto desenvolvido pode contribuir com a disseminação do consumo do chocolate como um alimento benéfico a saúde dos consumidores. Cocoa beans is a fermented fruit during its pre-processing stage and the final quality of the chocolate obtained from it depends on several factors, such as the genetic variety and the way of processing the cocoa as well as the fermentation and drying stages, which give flavors and unique flavors of almonds. With the rise of the functional product's market, chocolate with a high cocoa content is a featured product and it is also a potential vehicle for the inclusion of beneficial substances to health, such as probiotics. However, one of the main challenges found in these cases are the maintenance of the cellular viability of probiotic microorganisms, and therefore, techniques of immobilization and/or incorporation of protective agents can be used for this purpose. In this context, the objective of this work was to evaluate the cell viability of probiotics incorporated in artisanal chocolate bars with high cocoa content. Initially, the chocolate bars were made from almonds of Parazinho and Trinitário SJ02 varieties, containing 70% cocoa. Subsequently, lyophilized samples of the probiotic Lactobacillus Plantarum were incorporated into the chocolate with and without the addition of 20% butter (m/m). To assess probiotic’s cell viability, the analyzes were performed right after the making (zero time) of the bars with probiotics after 30 days and 60 days of storage at 25º C and 4º C, through the counting of units formed by the colony (CFU) on MRS agar. As a result, the cell viability tests demonstrated that the presence of cocoa butter in the samples did not influence the cell viability of L. Plantarum during storage for 30 days at 4°C and 25°C, as all tested conditions maintained survival rates above 108 cells UFC / g. In the case of 60 days storage at 25 ºC, it was observed that conditions in the presence of cocoa butter showed a reduction in the cell viability, which was also observed in the case of the Parazinho variety, in the presence of cocoa butter, for 60 days, at 4 ºC. As a conclusion of this study, it is observed that chocolates containing 70% cocoa formulation proved to be a potential matrix for the incorporation of probiotics, without the indication of the need to add cocoa butter to maintain the cell viability of probiotics under the evaluated conditions. Thus, the product developed can contribute to the spread of chocolate consumption as a beneficial food for consumers health.

Os avanços na área de Biotecnologia têm sido essenciais para a evolução da indústria do etanol no Brasil. A levedura Brettanomyces bruxellensis é comumente encontrada em ambientes comerciais de fermentação alcoólica. Essa levedura é capaz de fermentar uma variedade de fontes de carbono, porém em taxas variáveis. Seu perfil de aroma exclusivo a torna interessante para a produção de cervejas, além da tolerância ao baixo pH e à capacidade de produzir altas concentrações de etanol, características de interesse para a indústria cervejeira e de bioetanol. O objetivo deste trabalho consistiu em avaliar o potencial fermentativo de Brettanomyces bruxellensis, isolada de uma cervejaria em Bruxelas - Bélgica, na presença de diferentes açúcares. Inicialmente, foi realizada a análise do crescimento em meio Yeast Nitrogen Base, suplementado com xilose, glicose, sacarose, frutose e lactose. Foram preparadas placas contendo o meio carbonato de cálcio para a avaliação da produção de ácido. Em seguida, foi realizado o teste de tolerância ao teor alcoólico na presença de etanol nas concentrações de 0%, 4%, 6%, 8%, 10% e 12% (v/v). Além disso, também, foi avaliado o crescimento da levedura em meio YPD com variações de pH entre 2 - 8. Por fim, foi avaliada a fermentação alcoólica em sacarose, frutose e glicose. A levedura utilizada não foi capaz de consumir xilose e lactose, apresentando crescimento apenas nos meios suplementados com sacarose, frutose e glicose. Também foi constatada a ocorrência de fermentação alcoólica na presença destes açúcares, apresentando graduação alcoólica de 1,33% para sacarose, 1,22% para frutose e 1,21% para glicose. Foi observada a indicação da produção de ácido pela levedura nos testes em meio com carbonato de cálcio, em virtude da formação de halos transparentes em torno das colônias. Além disso, a levedura apresentou crescimento em meio contendo 12% de etanol e em pH na faixa entre 3 - 8. Conclui-se que a linhagem de Brettanomyces bruxellensis apresenta potencial para ser empregada em processos biotecnológicos, em virtude principalmente da tolerância a elevada concentração de etanol e atuação em ampla faixa de pH. Advances in the field of biotechnology have been essential for the evolution of the ethanol industry in Brazil. Brettanomyces bruxellensis yeast is commonly found in commercial fermentation environments. This yeast can ferment a variety of carbon sources, but at varying rates. Its unique aroma profile makes it interesting for beer production, in addition to its low pH tolerance and ability to produce high concentrations of ethanol, characteristics of interest to the brewing and bioethanol industry. The objective of this work was to evaluate the fermentative potential of Brettanomyces bruxellensis, isolated from a brewery in Brussels - Belgium, in the presence of different sugars. Initially, growth analysis was performed on Yeast Nitrogen Base medium supplemented with xylose, glucose, sucrose, fructose and lactose. Plates containing calcium carbonate medium were prepared for the evaluation of acid production. Then, the alcohol tolerance test was performed in the presence of ethanol at concentrations of 0%, 4%, 6%, 8%, 10% and 12% (v/v). In addition, yeast growth in YPD medium with pH ranges between 2 - 8 was also evaluated. Finally, the alcoholic fermentation in sucrose, fructose and glucose was evaluated. The yeast used was not able to consume xylose and lactose, showing growth only in media supplemented with sucrose, fructose and glucose. Alcoholic fermentation was also observed in the presence of these sugars, with an alcoholic content of 1,33% for sucrose, 1,22% for fructose and 1,21% for glucose. The indication of acid production by yeast was observed in the tests in calcium carbonate medium, due to the formation of transparent halos around the colonies. In addition, the yeast showed growth in medium containing 12% ethanol and at pH in the range 3 - 8. It is concluded that the Brettanomyces bruxellensis strain has potential to be used in biotechnological processes, mainly due to the tolerance to high ethanol concentration and performance in a wide pH range.

A busca pelo aumento da produtividade agrícola é uma necessidade para atender a demanda crescente da população mundial por alimentos. Os fertilizantes são primordiais para corrigir as deficiências nutricionais do solo e suprirem os nutrientes necessários para as plantas. A utilização de agentes quelantes sintéticos, como o EDTA, e agentes complexantes orgânicos, como os aminoácidos, visam aumentar a velocidade de absorção dos nutrientes pelas plantas. A principal vantagem da utilização dos aminoácidos como agentes complexantes orgânicos é que eles são biodegradáveis, além do complexo orgânico suprir os nutrientes mais rapidamente para as plantas quando comparado com os agentes quelantes sintéticos e com sais e óxidos inorgânicos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho consistiu em avaliar o efeito da aplicação de um fertilizante organomineral contendo extrato de levedura sobre a cultura de feijão (Phaseolus vulgaris L.). O delineamento experimental foi o de blocos casualizados em esquema fatorial 7x1, sete épocas de aplicação de fertilizante organomineral contendo extrato de levedura em um cultivar de feijão (ANFC 09) com quatro repetições. Após a colheita, foram determinados altura de planta, número de ramos por planta, diâmetro do caule, número de vagens por planta, número médio de grãos por vagem, massa de 1.000 grãos e produtividade. Em determinados tratamentos, foram identificados resultados com diferenças significativas para as variáveis vagens por planta e produtividade com aumentos de até 15,6 vagens por planta (+74,6%) e 1.033 kg ha-1 (+30,1%) comparados com a testemunha. Possivelmente, a aplicação do fertilizante organomineral contendo extrato de leveduras promoveu uma ação estimulante contribuindo para a absorção dos nutrientes e ativação do metabolismo da planta ao longo das fases de desenvolvimento da cultura de feijão. Esta ativação pode estar relacionada à presença de aminoácidos, peptídeos, precursores hormonais, vitaminas, enzimas e minerais, comumente encontrados em extrato de levedura. Como perspectivas futuras, pode-se ainda combinar o extrato de levedura com micronutrientes e outros compostos orgânicos para potencializar e diversificar os efeitos benéficos para o desenvolvimento das plantas. The search for increased agricultural productivity is a necessity to comply with the growing demand of the world’s population for food. Fertilizers are key to correcting nutrient deficiencies in the soil and supplying the nutrients needed by plants. The use of synthetic chelating agents, such as EDTA, and organic complexing agents, such as amino acids, are intended to increase the rate of absorption of nutrients by plants. The main advantage of using amino acids as organic complexing agents is that they are biodegradable in addition to the fact that the organic complex supplies nutrients faster to plants when compared to synthetic chelating agents and inorganic salts and oxides. In this context, the objective of this work was to evaluate the effect of the application of an organomineral fertilizer containing yeast extract on the bean crop (Phaseolus vulgaris L.). The experimental design was a randomized block design in 7x1 factorial scheme, seven times of application of organomineral fertilizer containing yeast extract in a bean cultivar (ANFC 09) with four replications. After harvest, plant height, number of branches per plant, stem diameter, number of pods per plant, average number of grains per pod, mass of 1,000 grains and yield were determined. In certain treatments, results were identified with significant differences for the pods per plant and yield variables with increases of up to 15.6 pods per plant (+ 74.6%) and 1,033 kg ha-1 (+ 30.1%) compared with the witness. Possibly, the application of organomineral fertilizer containing yeast extract promoted a stimulating action contributing to the absorption of nutrients and activation of plant metabolism throughout the developmental stages of bean crop. This activation may be related to the presence of amino acids, peptides, hormonal precursors, vitamins, enzymes and minerals commonly found in yeast extract. As future perspectives, yeast extract can be combined with micronutrients and other organic compounds to enhance and diversify the beneficial effects on plant development..

As micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos filamentosos que apresentam efeitos toxigênicos para os humanos e animais. Considerando a contaminação dos alimentos – especialmente grãos – por essa toxina, a necessidade de se produzir alimentos seguros, de minimizar as perdas econômicas relacionadas à contaminação dos alimentos, e a ausência de estratégias eficazes de remoção desses contaminantes, faz-se necessária a pesquisa e o desenvolvimento de processos que efetivamente atuem nessa questão. Neste trabalho o objetivo foi recuperar e identificar microrganismos com potencial de degradação de aflatoxina B1 (AFB1) a partir de amostras de solo e de grãos de milho (Zea mays) submetidas ao enriquecimento em meio com cumarina, visto que as aflatoxinas são derivadas da difuranocumarina. Foram coletadas cinco amostras de solo cultivado com soja com histórico recente de contaminação por aflatoxinas, e quatro amostras de grãos de milho fora do padrão de qualidade, as quais foram cultivadas em meio líquido contendo cumarina como única fonte de carbono. O enriquecimento foi conduzido durante seis semanas, e ao final do período foi identificado apenas um isolado (S1) com capacidade de crescimento no meio cumarina. O isolado S1 foi identificado por análises morfológica e molecular, que indicaram tratar-se de um organismo do gênero Paecilomyces sp. Além disso, foi constatado o potencial de crescimento do fungo em meio contendo cumarina como única fonte de carbono e em caldo nutriente adicionado de AFB1. Estudos posteriores deverão ser realizados com a finalidade de avaliar sua capacidade de degradação de AFB1 e investigar o potencial de aplicação de biotecnológica deste isolado Mycotoxins are secondary metabolites produced by filamentous fungi that have toxigenic effects on humans and animals. Considering the contamination of food - especially grains - by this toxin, the need to produce safe food, minimize economic losses related to food contamination, and the absence of effective removal strategies for these contaminants, it is necessary to research and develop processes that effectively act on this issue. In this work the objective was to recover and identify microorganisms with aflatoxin B1 (AFB1) degradation potential from soil and corn (Zea mays) samples submitted to enrichment in coumarin medium, since aflatoxins are derived from difuranocoumarin. Five samples of soil cultivated with soybeans with a recent aflatoxin contamination history, and four samples of corn grains out of quality standards were collected, which were cultivated in a liquid medium containing coumarin as sole carbon source. Enrichment was conducted for six weeks, and at the end of the period only one isolate (S1) with growth capacity in coumarin medium was identified. Isolate S1 was identified by morphological and molecular analysis, which indicated that it is an organism of the genus Paecilomyces sp. In addition, the growth potential of the fungus in coumarincontaining medium as sole carbon source and in nutrient broth added from AFB1 was verified. Further studies should be conducted to evaluate its degradation capacity of AFB1 and to investigate the biotechnological application potential of this isolate

Orientadores: Fabio Marcio Squina, Thabata Maria Alvarez Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As glicosil hidrolases (GHs) compõem uma classe de enzimas amplamente utilizadas nos processos enzimáticos por atuarem na hidrólise das ligações glicosídicas de polissacarídeos. Além do domínio catalítico, diversas GHs apresentam domínios acessórios que podem influenciar diversos aspectos bioquímicos e estruturais das enzimas. A celulase CelE2 de origem metagenômica, caracterizada recentemente, apresenta em sua estrutura um domínio catalítico N-terminal característico da família GH5 e um domínio C-terminal com identidade para o domínio Calx-beta, previamente identificado em outras GHs mas sem função claramente definida nestes casos. Com o intuito de investigar as características bioquímicas e estruturais dos domínios de CelE2 separadamente, foram construídas derivações truncadas referentes ao domínio catalítico e ao domínio acessório Calx-beta. Como resultados, observou-se que a excisão do domínio acessório Calx-beta (CelE2382-477) não provocou alterações nas características bioquímicas de CelE2, visto que o domínio catalítico (CelE21-381) apresentou valores semelhantes de atividade enzimática em beta-glucano, carboximetilcelulose e liquenana, valores de pH e temperatura ótimos próximos de 5,3 e 45 ºC, respectivamente, estabilidade térmica a 40 ºC e 50 ºC por 360 minutos e aumento de atividade enzimática na presença de CaCl2. O perfil de degradação e as evidências de transglicosilação também foram mantidas após a excisão do domínio acessório Calx-beta. No entanto, o domínio catalítico apresentou um aumento de cerca de 4 vezes da atividade enzimática na hidrólise de Avicel, comparado à CelE2. As análises por dicroísmo circular (CD) de CelE21-381 indicaram um perfil predominante de alfa-hélice, diminuição de 4,6 ºC da temperatura de desnaturação e um aumento destes valores na presença de CaCl2, tanto para a construção completa, quanto para CelE21-381. Assim como para CelE2, as análises por espalhamento de raio-X de baixo ângulo (SAXS) mostraram que a adição de CaCl2 resultou na diminuição da tendência de agregação proteica para CelE21-381. Os ensaios de avaliação da ligação a polissacarídeos solúveis e insolúveis indicaram que CelE2382-477 não apresentou capacidade de ligação para os substratos testados. A estrutura tridimensional do domínio catalítico CelE21-381 foi determinada a uma resolução de 2,1 Å que permitiu a identificar um enovelamento do tipo barril (alfa/beta)8. Os resultados obtidos mostraram que a presença do domínio acessório Calx-beta não é fundamental para atividade enzimática de CelE2, de modo que a alteração mais significativa diz respeito ao aumento da atividade enzimática do domínio catalítico em Avicel em comparação à construção completa. Estes resultados contribuirão para estudos futuros acerca deste domínio pouco estudado entre as celulases e informações para a família 5 das GHs Abstract: Glycoside hydrolases (GHs) comprise a class of enzymes widely used in the enzymatic processes, acting in the hydrolysis of the polysaccharides glycosidic bonds. In addition to the catalytic domain, several GHs present accessory domains, which may influence the biochemical and structural aspects of the enzymes. The CelE2, a metagenomic-derived cellulase, recently characterized, harbors in its structure an N-terminal catalytic domain characteristic of the GH5 family, and a C-terminal domain with identity for the Calx-betadomain, previously identified in other glycoside hydrolases but without clearly defined function in these cases. In order to investigate the biochemical and structural characteristics of the CelE2 domains separately, truncated derivations were constructed regarding the catalytic domain and the accessory domain Calx-beta. The results showed that the deletion of Calx-beta domain (CelE2382-477) did not cause alterations in the biochemical characteristics of CelE2, since the catalytic domain (CelE21-381) presented similar values of enzymatic activity in beta-glucan, carboxymethylcellulose and lichenan, optimal pH and temperature values near 5,3 and 45 ºC, respectively, thermal stability at 40 ºC and 50 ºC up to 360 minutes, and increase of enzymatic activity in the presence of CaCl2. The cleavage pattern and evidence of transglycosylation were also maintained after Calx-beta deletion from CelE2. However, the catalytic domain showed a 4-fold increase in the enzymatic activity of Avicel hydrolysis, compared to CelE2. Circular dichroism (CD) analysis of CelE21-381 indicated a predominant alpha-helix profile, decrease in the denaturation temperature around 4.6 ºC and an increase of these values in the presence of CaCl2, both for the complete construct and for CelE21-381. As well as CelE2, small angle X-ray scattering (SAXS) analyzes showed that the addition of CaCl2 resulted in a decrease in the protein aggregation tendency for CelE21-381. The binding assays for soluble and insoluble polysaccharides indicated that CelE2382-477 did not show the binding ability for the substrates tested. The three-dimensional structure of the catalytic domain CelE21-381 was determined at a resolution of 2.1 Å which allowed to identify an (alpha/beta)8 barrel fold. The results showed that the presence of the accessory domain Calx-beta is not fundamental for the enzymatic activity of CelE2, so that the most significant change concerns the increase of the enzymatic activity of the catalytic domain in Avicel, comparing to the whole construct. These results may contribute to future studies about this understudied domain among cellulases and information for the family 5 of glycoside hydrolases Mestrado Bioquímica Mestra em Biologia Funcional e Molecular FAPESP 132372/2016-9 CNPQ 2016/01926-2

Orientadores: Fabio Marcio Squina, Thabata Maria Alvarez Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Lignina, um dos materiais mais recalcitrantes da natureza, consiste em um polímero tridimensional composto de vários anéis aromáticos ligados por ligações do tipo éter, estando presente em combinação com celulose e hemicelulose na parede celular vegetal. A lignina se encontra fortemente associada a polissacarídeos da parede celular, o que dificulta seu aproveitamento e praticamente inviabiliza seu isolamento na forma não alterada. Vanilina é um dos produtos da oxidação de lignina, e é obtida na forma natural a partir da vagem de orquídeas tropicais do gênero Vanilla. Devido à sua baixa produtividade e à dificuldade de cultivo fora de seu habitat natural, a demanda mundial por este produto vem sendo atendida através de síntese química a partir de recursos não renováveis como guaicol e ácido glioxílico. Recentemente, rotas fermentativas naturais têm sido desenvolvidas para a produção de vanilina a partir de fontes renováveis. Dada a importância comercial da molécula de vanilina, associada à demanda pela substituição de matérias primas não renováveis por matérias primas renováveis de baixo custo, é proposto neste trabalho o estabelecimento e caracterização de um consórcio de micro-organismos degradadores de lignina como estratégia para a valorização deste subproduto. Este consórcio foi criado através do cultivo de micro-organismos oriundos de solo de canavial em meio de cultura contendo uma solução de compostos provenientes de lignina. Esta solução é obtida através do processo de delignificação do bagaço de cana-de-açúcar, e é composta majoritariamente de compostos fenólicos de baixo peso molecular. Com o sequenciamento metagenômico do consórcio, foi possível ter acesso às enzimas e vias metabólicas envolvidas em processos de bioconversão destes compostos fenólicos. Como método para validação desta estratégia para a prospecção de enzimas lignolíticas, foram selecionadas as enzimas feruloil-CoA sintetase (fcs) e enoil-CoA hidratase/aldolase (ech), seguido de ensaios enzimáticos com estas enzimas para avaliar a capacidade de conversão de ácido ferúlico em vanilina. A caracterização do consórcio revelou a capacidade dos micro-organismos presentes de degradar compostos fenólicos de baixo peso molecular do meio de cultura. Uma subsequente análise taxonômica indicou o enriquecimento do consórcio, com a diminuição da diversidade de micro-organismos em relação à amostra original de solo, e o aumento de espécies descritas na literatura como relacionadas à degradação de compostos aromáticos. Desta maneira, pode se observar a especialização do consórcio através da seleção de micro-organismos aptos a degradarem a lignina presente no meio. A análise do metagenoma do consórcio também permitiu a identificação de enzimas que participam na degradação de lignina e compostos aromáticos, tais como lacases, peroxidases e outras enzimas envolvidas no metabolismo de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs). A partir dos dados de sequenciamento metagenômico, realizou-se a seleção in silico por análise de similaridade de sequência três enzimas feruloil-CoA sintetase (fcs) e duas enoil-Coa hidratase/aldolase (ech). Através de análises de eletroforese capilar e espectrometria de massas, verificou-se a produção de vanilina a partir de ácido ferúlico em ensaios enzimáticos com as enzimas selecionadas. Em paralelo, foram isolados micro-organismos capazes de crescer de forma autônoma em meios contendo lignina e com possível atividade lignolítica. Em especial, a cepa isolada de Paenarthrobacter sp. (denominada de HW13) se mostrou capaz de crescer em meio de cultura contendo apenas lignina kraft como fonte de carbono. Esta cepa foi também testada quanto a capacidade de crescimento/tolerância a diversos compostos fenólicos de reconhecida toxidade, bem como teve seu genoma sequenciado e comparado com um genoma de Paenarthrobacter obtido a partir dos dados de sequenciamento metagenômico do consórcio, revelando um alto grau de similaridade. Desta maneira, foi mostrado neste trabalho que a estratégia de estabelecimento de um consórcio degradador de lignina, aliado ao acesso de enzimas lignolíticas dos micro-organismos pelo isolamento dos mesmos e por ferramentas de metagenômica, consistem em formas efetivas de se obter rotas de bioconversão de compostos aromáticos oriundos de lignina. A obtenção de enzimas presentes nestas rotas possui o potencial de valorização da lignina de bagaço de cana através da conversão desta em moléculas de maior valor agregado Abstract: Lignin, one of nature's most recalcitrant materials, consists of a three-dimensional polymer composed of various aromatic rings bound by ester-like bonds, being present in combination with cellulose and hemicellulose in the plant cell wall. Lignin is strongly associated with polysaccharides of the cell wall, which makes difficult its use and isolation in an unchanged form. Vanillin is one of the products of lignin oxidation, and is obtained in the natural form from the pod of tropical orchids of the genus Vanilla. Due to its low productivity and the difficulty of growing outside its natural habitat, the world demand for this product has been met through chemical synthesis from non-renewable resources such as guaicol and glyoxylic acid. Recently, natural fermentative routes have been developed for the production of vanillin from renewable sources. Given the commercial importance of the vanillin molecule, associated to the demand for the substitution of non-renewable raw materials for low cost renewable raw materials, it is proposed in this work the establishment and characterization of a consortium of lignin degrading microorganisms as a strategy for the valorization of this sub-product. This consortium was created through the cultivation of microorganisms from sugar cane fields in a culture medium containing a solution of compounds from lignin. This solution is obtained through the process of delignification of sugarcane bagasse, and is composed mainly of phenolic compounds of low molecular weight. With the metagenomic sequencing of the consortium, it was possible to have access to the enzymes and metabolic pathways involved in the bioconversion processes of these phenolic compounds. As a method to validate this strategy for the prospection of lignolytic enzymes, feruloil-CoA synthetase (fcs) and enoyl-CoA hydratase / aldolase (ech) enzymes were selected and evaluated for the conversion capacity of ferulic acid to vanillin. The characterization of the consortium revealed the ability of the present microorganisms to degrade low molecular weight phenolic compounds from the culture medium. A subsequent taxonomic analysis indicated the enrichment of the consortium, with the decrease of the diversity of microorganisms in relation to the original soil sample, and the increase of species described in the literature as related to the degradation of aromatic compounds. In this way, the specialization of the consortium can be observed through the selection of microorganisms able to degrade the lignin present in the medium. The analysis of the metagenome of the consortium also allowed the identification of enzymes involved in the degradation of lignin and aromatic compounds, such as laccases, peroxidases and other enzymes involved in polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism (PAHs). From the metagenomic sequencing data, three enzymes feruloil-CoA synthetase (fcs) and two enoyl-Coa hydratase / aldolase (ech) were performed in silico by sequence similarity analysis. Capillary electrophoresis and mass spectrometry analyzes showed the production of vanillin from ferulic acid in enzymatic assays with the selected enzymes. In parallel, microorganisms capable of growing independently in media containing lignin and with possible lignolytic activity were isolated. In particular, the isolated strain of Paenarthrobacter sp. (referred to as HW13) was shown to be capable of growing in culture medium containing only kraft lignin as the carbon source. This strain was also tested for growth / tolerability to various phenolic compounds of recognized toxicity, as well as having its genome sequenced and compared to an Paenarthrobacter genome obtained from the metagenomic sequencing data of the consortium, revealing a high degree of similarity. Therefore, it was shown in this work that the strategy of establishing a lignin degrading consortium, together with the access of lignolytic enzymes of the microorganisms by their isolation and by metagenomic tools, consists of effective ways of obtaining bioconversion routes of aromatic compounds derived from lignin. The obtaining of enzymes present in these routes has the potential of valorization of the sugarcane bagasse lignin through the conversion of this into molecules of greater added value Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular FAPESP 2014/26152-4 CNPQ 149186/2014-2 CAPES