Search

The aim of this investigation is to prove a modified algorithm for statistical approaches to develop gene expression panels for the detection of prostate tumors. According to Classification and Regression tree models and RE differences between adenocarcinoma (T) and adenoma (A) groups, we have chosen 31 transcripts for MDR analysis. Among them, there were 15 transcripts of (epithelial-mesenchymal transition (EMT) and prostate-cancer associated (PrCa-associated) genes and 16 transcripts of cancer-associated fibroblasts (CAF), tumor-associated macrophages (TAM), immune-associated genes (IAG)), which have shown some datasets with high statistical parameters. The highest diagnostic levels are manifested by expression panels developed from all 5 gene groups: PCA3, HOTAIR, ESR1, IL1R1 (Se = 0.97, Sp = 0.85, Ac = 0.93, OR = 204); CDH2, KRT18, PCA3, HOTAIR, ESR1, IL1R1 (Se = 1.0, Sp = 0.8, Ac = 0.93, OR > 500). We propose an improved algorithm for the gene expression data analysis to develop diagnostic panels with good and excellent diagnostic levels for the prostate tumor stratification in a group of patients from the Ukrainian population. Our data require a more detailed analysis and a larger cohort of patients with prostate tumor. Досліджено адаптацію модифікованого алгоритму статистичного підходу для розробки експресійних панелей для детекції раку передміхурової залози. За даними моделей класифікації та регресії й статистично значущими відмінностями відносної експресії між групами аденокарцином та аденом, серед досліджуваних генів відібрано 31 транскрипт для MDR аналізу. Серед них 15 транскриптів з груп генів епітеліальномезенхімального переходу та генів, асоційованих з раком передміхурової залози, і 16 транскриптів з груп генів пухлиноасоційованих фібробластів, пухлиноасоційованих макрофагів та імуноасоційованих генів. З цих груп отримано ряд панелей з високими статистичними показниками. Найвищі показники діагностичних рівнів мали експресійні панелі, які розроблені з усіх п’яти груп генів: PCA3, HOTAIR, ESR1, IL1R1 (Se = 0,97, Sp = 0,85, Ac = 0,93, OR = 204); CDH2, KRT18, PCA3, HOTAIR, ESR1, IL1R1 (Se = 1,0, Sp = 0,8, Ac = 0,93, OR > 500). Запропоновано модифікований алгоритм для аналізу даних експресії генів, який може бути використаний для розробки діагностичних панелей з добрим та високим діагностичними рівнями для стратифікації раку передміхурової залози на групі пацієнтів з української популяції. Одержані дані потребують подальшого аналізу на більшій вибірці пацієнтів з раком передміхурової залози. Исследована адаптация модифицированного алгоритма статистического подхода для разработки экспрессионных панелей для детекции рака простаты. Согласно данным моделей классификации и регрессии, а также статистически значимым отличиям относительной экспрессии между группами аденокарцином и аденом, среди исследуемых генов отобрано 31 транскрипт для MDR анализа. Среди них 15 транскриптов из групп генов эпителиально-мезенхимального перехода и генов, ассоциированных с раком простаты, и 16 транскриптов из групп генов опухолеассоциированных фибробластов, опухолеассоциированных макрофагов и иммуноассоциированных генов. Из этих групп было получено ряд панелей с высокими статистическими показателями. Самые высокие показатели диагностических уровней имели экспрессионные панели, полученные со всех пяти групп генов: PCA3, HOTAIR, ESR1, IL1R1 (Se = 0,97, Sp = 0,85, Ac = 0,93, OR = 204); CDH2, KRT18, PCA3, HOTAIR, ESR1, IL1R1 (Se = 1,0, Sp = 0,8, Ac = 0,93, OR > 500). Предложен модифицированный алгоритм для анализа данных экспрессии генов, который может быть использован для разработки диагностических панелей с хорошим и высоким диагностическими уровнями для стратификации рака простаты на группе пациентов из украинской популяции. Полученные данные требуют более детального анализа на большей выборке пациентов с раком простаты.

Aim. Despite the great progress in cancer treating, the breast cancer remains lethal in 15 % cases. Regardless of the many years of research and extensive experience in the treatment of this type of cancer, one of the main problems in diagnosis and therapy is its high clinical and genetic heterogeneity. Thereby the identification of markers for personalized treatment of patients is still an actual issue. Methods. Collection of clinical material, RNA isolation, and expression analysis of ITSN2 and TKS5 isoforms using quantitative real time PCR with fluorescence-labeled probes. Results. We have found that ITSN2-S expression is reliably reduced in HER2/neu-positive tumors with poor prognosis. There were no significant differences in the expression of ITSN2-L and TKS5-L in the analyzed samples. Conclusions. These studies have demonstrated the possible use of ITSN2 short isoform (ITSN2-S) as a prognostic marker for breast cancer. Keywords: breast cancer, ITSN2, TKS5, expression analysis.

Rho GTPases play a key role in various membrane trafficking processes. RhoU is an atypical small Rho GTPase related to Rac/Cdc42 which possesses unique N- and C-terminal domains that regulate its function and its subcellular localization. RhoU localized at the plasma membrane, on endosomes and in cell adhesion structures where it governs cell signalling, differentiation and migration. However, despite its endomembrane localization, RhoU function in vesicular trafficking has been unexplored. Here, we identified intersectins (ITSNs) as new binding partners for RhoU and showed that the second PxxP motif at the N-terminus of RhoU mediated interactions with SH3 domains of ITSNs. To evaluate the function of RhoU and ITSNs in vesicular trafficking, we used fluorescent transferrin as a cargo for uptake experiments. We showed that silencing of either RhoU or ITSN2, but not ITSN1 increased transferrin accumulation in early endosomes resulting from defect in fast vesicle recycling. Concomitantly, RhoU and ITSN2 colocalized to a subset of Rab4-positive vesicles suggesting that RhoU-ITSN2 interaction may occur on fast recycling endosomes to regulate the fate of vesicular cargos.

We have analyzed the putative value of the pattern of relative expression (RE) of several genes that might be involved in a response to anti-cancer therapy, namely AR, PTEN, COX2, FASN, HMGCR, LDLR, and CTLA4, in samples of prostate adenoma, adenocarcinoma, and the paired conventional normal tissues. We could propose three subtypes of adenocarcinomas that show the distinct pattern of expression of the above-mentioned genes, characteristics for (1) cancer-associated fibroblasts (CAFs), (2) tumor-associated macrophages (TAMs), and (3) markers of immune response. These groups correlate with the prostate cancer subtypes, that were determined earlier, based on the analysis of RE of the epithelial-to-mesenchymal cell transition (EMT) genes and prostate cancer-associated genes. Noteworthy, the highest correlation was found for genes characteristic of CAFs. This emphasizes the importance of the simultaneous analysis of genes, involved in various intercellular interactions between tumor cells and cells of tumor microenvironment, in prediction of efficacy of anti-cancer therapy. To confirm the presented data, the additional studies on a larger cohort of the prostate cancer patients are required. Проаналізoвано потенційні значення діапазонів відносної експресії ряду генів, які можуть бути залучені у відповідь на протиракову терапію, а саме AR, PTEN, COX2, FASN, HMGCR, LDLR і CTLA4, у зразках аденом, аденокарцином і парних умовно-нормальних тканин передміхурової залози. Визначено три підтипи аденокарцином, які показують чітку картину експресії досліджуваних генів, які характеризують: 1) пухлино-асоційовані фібробласти; 2) пухлиноасоційовані макрофаги; 3) маркери імунної відповіді. Ці групи корелюють з підтипами раку передміхурової залози, які були визначені раніше на основі аналізу відносної експресії генів, асоційованих з епітеліально-мезенхімальним переходом, і генів, пов’язаних з раком передміхурової залози. Звертає на себе увагу, що найбільша кореляція була знайдена для цих підтипів раку й групи генів пухлиноасоційованих фібробластів. Це підкреслює важливість одночасного аналізу генів, залучених до різних міжклітинних взаємодій між клітинами пухлин і клітинами пухлинного мікрооточення, в прогнозуванні ефективності протиракової терапії. Для підтвердження одержаних даних необхідні додаткові дослідження на більшій вибірці хворих на рак передміхурової залози. Проанализированы потенциальные значения диапазонов относительной экспрессии ряда генов, которые могут быть вовлечены в ответ на противораковую терапию, а именно AR, PTEN, COX2, FASN, HMGCR, LDLR и CTLA4, в образцах аденом, аденокарцином и парных условно-нормальных тканей простаты. Определены три подтипа аденокарцином, показывающие четкую картину экспрессии исследуемых генов, которые характеризуют: 1) опухолеассоциированные фибробласты; 2) опухолеассоциированные макрофаги; 3) маркеры имунного ответа. Эти группы коррелируют с подтипами рака простаты, которые были детектированы ранее на основе анализа относительной экспрессии генов, ассоциированных с эпителиально-мезенхимальным переходом, и генов, связанных с раком простаты. Важно отметить, что наибольшая корреляция была найдена для этих подтипов рака и группы генов опухолеассоциированных фибробластов. Это подчеркивает важность одновременного анализа генов, участвующих в различных межклеточных взаимодействиях между клетками опухолей и клетками опухолевого микроокружения, в прогнозировании эффективности противораковой терапии. Для подтверждения полученных данных необходимы дополнительные исследования на большей выборке больных раком простаты.

Aim. To investigate an effect of the Focal adhesion kinase 1 (FAK1) expression on the level of tyrosine phosphorylation of an adaptor protein SHB and to find functional consequences of this posttranslational modification. Methods. Recombinant DNA construction, protein expression and purification, human cell transfection, western blot. Results. The expression of FAK1 induces the massive tyrosine phosphorylation of SHB adaptor and enhances its interaction in vitro with SH2 domains of a range of the signaling proteins such as PI3K, ABL, CRK and PLCG1. Additionally we have found that Epstein-Barr virus protein LMP2A can partially mimic the FAK1-mediated effect strongly elevating the efficiency and SHB interaction with the mentioned above proteins. While the expression of individual proteins elevated SHB phosphorylation level, the co-expression of LMP2A and FAK1 did not display a synergetic effect. Conclusions. FAK1 as well as LMP2A induce the SHB tyrosine phosphorylation and enhance its interaction with a set of the signaling proteins. Мета. Дослідити ефект надексперсії кінази фокальної адгезії (FAK1) на рівнь фосфорилювання залишків тирозину адапторного білка SHB та знайти функціональне значення цієї посттрансляційної модифікації. Методи. Конструювання рекомбінантних ДНК, експресія та очистка рекомбінантних білків, трасфекція клітинних ліній, вестерн блот. Результати. Надексперсія FAK1 в клітинах лінії 293 викликає масивне фосфорилювання залишків тирозину адапторного білка SHB та значно підсилює його взаємодію in vitro з SH2-доменами низки сигнальних білків, таких як PI3K, ABL, CRK та PLCg1. Крім того, білок LMP2A вірусу Епштейна-Барр може посилювати in vitro зв’язування SHB з вищезазначеними білками, так само, як і FAK1. Тоді як надекспресія окремих білків FAK1 та LMP2A підвищувала рівні фосфорилювання SHB, їх ко-експерсія не мала синергічного ефекту. Висновки. Експресія FAK1 та LMP2A індукує фосфорилювання залишків тирозину адапторного білка SHB та підсилює його взаємодію з SH2-доменами низки сигнальних білків. Цель. Исследовать эффект суперэкспрессии киназы фокальной адгезии (FAK1) на уровень фосфорилирования остатков тирозина адаптерного белка SHB и найти функциональное значение этой посттрансляционной модификации. Методы. Конструирование рекомбинантных ДНК, экспрессия и очистка рекомбинантных белков, трансфекция клеточных линий, вестерн блот. Результаты. Суперэксперссия FAK1 в клетках линии 293 приводит к многократному повышению уровней фосфорилирования остатков тирозина адаптерного белка SHB, что в свою очередь приводит к усилению взаимодейсвия с SH2-доменами ряда сигнальных белков, таких как PI3K, ABL, CRK та PLCg1. Кроме того, белок LMP2A вируса Эпштейна-Барр может усиливать in vitro взаимодействие SHB с указанными белками, аналогично FAK1. Тогда как суперэкспрессия отдельных белков FAK1 та LMP2A приводила к интенсификации фосфорилирования SHB, их ко-экспрессия не обладала синергическим эффектом. Выводы. Экспрессия FAK1 и LMP2A индуцирует фософрилирование остатков тирозина адаптерного белка SHB и усиливает его взаимодействие с SH2-доменами ряда сигнальных белков.

WIP (WASP interacting protein) together with N-WASP (neural Wiskott-Aldrich syndrome protein) regulates actin polymerization that is crucial for invadopodia and filopodia formation. Recently, we reported the WIP interaction with ITSN1 which is highly implicated in endo-/exocytosis, apoptosis, mitogenic signaling and cytoskeleton rearrangements. Here we demonstrate that the WIP/ITSN1 complex is involved in the transferrin receptor recycling and partially co-localizes with a marker of the fast recycling endosomes, RAB4. Moreover, ITSN1 recruits WIP to RAB4-positive vesicles upon overexpression. Our data indicate that WIP enhances the interaction of N-WASP with ITSN1 and promotes ITSN1/β-actin association. Moreover, the WIP/ITSN1-L complex facilitates formation of filopodia-like protrusions in MCF-7 cells. Thus, WIP/ITSN1 complex is involved in the cellular vesicle trafficking and actin-dependent membrane processes.

At present, the role of ubiquitination of cargoes internalized from the plasma membrane is better understood than the consequences of ubiquitination of proteins comprising the endocytic machinery. Here, we show that the E3 ubiquitin ligase AIP4/ITCH contributes to the differential ubiquitination of isoforms of the endocytic scaffold protein intersectin1 (ITSN1). The major isoform ITSN1-s is monoubiquitinated, whereas the minor one, ITSN1-22a undergoes a combination of mono- and oligoubiquitination. The monoubiquitination is required for ITSN1-s stability, whereas the oligoubiquitination of ITSN1-22a causes its proteasomal degradation. This explains the observed low abundance of the minor isoform in cells. Thus, different modes of ubiquitination regulated by AIP4 have opposite effects on ITSN1 isoform stability.

ITSN1 is a scaffold protein involved in endocytosis, signal transduction and cytoskeleton regulation. It has been previously shown that ITSN1 undergoes Ca2+/calmodulin-dependent phosphorylation in vitro. Aim. We intend to identify these phosphorylation sites. Methods. In vitro kinase reaction; liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). Results. We identified five sites of Ca2+/calmodulin-dependent phosphorylation in the recombinant fragments of ITSN1. Conclusions. We have shown that the ITSN1 coiled-coil region (CCR) and the interdomain linkers between EH2 and CCR, SH3A and SH3B, SH3B and SH3C domains were phosphorylated in a Ca2+/calmodulin-dependent manner in vitro.

ITSN1 is an endocytic scaffold protein implicated in synaptic functioning. Ca2+ is known to be important for endo- cytosis in both pre- and post-synaptic terminals. ITSN1 contains two EH (Eps15 homology) domains which possess putative Ca2+-binding EF-hand motifs. Aim. To test the effect of Ca2+ on the EH domain binding properties. Methods. His-tag pulldown, Western blotting. Results. Addition of 1.5 mM Ca2+ does not affect the binding of the ITSN1 EH domains to the C-terminal fragment of the endocytic protein Epsin 1. Conclusions. The data obtained indicate that Ca2+ has no effect on the binding properties of the ITSN1 EH domains.

Aim. The work is devoted to the development of less invasive tools for the colorectal cancer (CRC) screening. Methods. Q-PCR and methylation-specific PCR techniques were used in the current work. Results. We have shown that the levels of cell-free plasma DNA are higher in the CRC patients compared with the healthy donors (p < 0.01). Hypermethylation of APC, FHIT, LRRC3B and HIC1 genes was studied in the tumor and plasma samples of CRC patients. Two-stage verification for CRC screening was proposed. Conclusions. We proposed and tested a novel approach for CRC screening based on the determination of cell-free DNA and methylated DNA fragments in the plasma. Мета. Розробка менш інвазивних методик для скринінгу злоякісних пухлин товстого кишечника (CRC). Методи. Використано кількісну ПЛР і метил-специфічну ПЛР. Результати. Показано, що середнє значення концентрацій вільно циркулюючої ДНК у плазмі крові є статистично достовірно вищим у пацієнтів з CRC порівняно зі здоровими донорами (p < 0,01). Встановлено гіперметилювання генів APC, FHIT, LRRC3B і HIC1 у пухлинах та плазмі хворих на CRC. Висновки. Нами запропоновано і перевірено новітній підхід для скринінгу CRC, який базується на визначенні позаклітинної ДНК і метильованих фрагментів ДНК у плазмі. Цель. Разработка менее инвазивных методик для скрининга злокачественных опухолей толстого кишечника (CRC). Методы. Использована количественная ПЦР и метил-специфическая ПЦР. Результаты. Показано, что среднее значение свободно циркулирующей ДНК в плазме статистически достоверно выше у пациентов с CRC по сравнению со здоровыми донорами (p < 0,01). Установлено гиперметилирование генов APC, FHIT, LRRC3B и HIC1 в опухолях и плазме пациентов с CRC. Выводы. Нами предложен и проверен новейший подход для скрининга CRC, базирующийся на определении внеклеточной ДНК и метилированных фрагментов ДНК в плазме.

Phosphorylation of endocytic adaptor ITSN2 that enabled its interaction with the SH2 domains of signaling proteins was recently reported. The aim of this study was to determine whether tissue-specific ITSN2 phosphorylation and subsequent recognition by phosphotyrosine-binding domains could occur in mouse tissues. Methods. In silico prediction of interaction motifs, expression of recombinant proteins in bacterial system, GST pull-down analysis, immunoblotting. Results. Analysis of phosphoproteomic data demonstrated tyrosine phosphorylation of mouse ITSN2 homologue, Ese2 protein. Scansite service was used to predict binding motifs for the SH2 domains of Fyn, Abl1, PLCg1 and PI3KR1 within Ese2. Comparison of ITSN2 and Ese2 sequences showed conservation of predicted interaction motifs between human and mouse. GST-fused SH2 domains of Fyn, Abl1, PLCg1 and PI3KR1 were obtained and used as phosphorylation «sensors» of tyrosine-based motifs within Ese2 molecule. Binding of Ese2 to the SH2 domains of Fyn and PLCg1 was observed in brain, lung and heart whereas SH2 domains of Abl1 and PI3KR1 interacted with Ese2 in lung and heart only. Conclusions. Differential Ese2/ SH2 interactions in tissues suggest that tissue-specific tyrosine phosphorylation might regulate specific binding of the Ese2 adaptor to the signaling molecules. Нещодавно виявлено фосфорилювання адаптора ендоцитозу ITSN2, що забезпечує впізнавання цього білка SH2-доменами білків, залучених до передачі мітогенного сигналу. Метою цієї роботи було перевірити, чи має взаємодія ITSN2 з SH2-вмісними біл- ками тканиноспецифічний характер. Методи. Передбачення мотивів взаємодії in silico, експресія білків у бактерійній системі та культурі клітин ссавців, преципітація з використанням білків, злитих з GST. Результати. Дані фосфопротеомних досліджень свідчать про фосфорилювання тирозинових залишків гомолога ITSN2 миші, білка Ese2. За допомогою сервісу Scansite у складі Ese2 передбачено мотиви взаємодії з доменами SH2 білків Fyn, Abl1, PLCg1 і PI3KR1. Порівняння послідовностей інтерсектинів людини та миші показало консервативність передбачених мотивів. Отримано злиті з GST домени SH2 білків Fyn, Abl1, PLCg1 і PI3KR1, які використано для преципітації білка Ese2 з лізатів мозку, легень і серця миші. Зв’язування Ese2 з доменами SH2 білків Fyn і PLCg1 спостерігали в усіх досліджуваних тканинах, тоді як домени SH2 білків Abl1 і PI3KR1 упізнавали Ese2 лише в легенях та серці. Висновки. Диференційне впізнавання Ese2/SH2 у тканинах дозволяє припустити, що тканиноспецифічне фосфорилювання регулює специфічне зв’язування адапторного білка Ese2 із сигнальними молекулами. Недавно показано фосфорилирование адаптора эндоцитоза ITSN2, опосредующее узнавание этого белка SH2-доменами белков, вовлеченных в передачу митогенного сигнала. Целью этой работы было проверить, имеет ли взаимодействие ITSN2 с SH2- содержащими белками тканеспецифический характер. Методы. Предсказание мотивов взаимодействия in silico, экспрессия белков в бактериальной системе и культуре клеток млекопитающих, преципитация с использованием белков, слитых с GST. Результаты. Данные фосфопротеомных исследований свидетельствуют о фосфорилировании тирозиновых остатков гомолога ITSN2 мыши, белка Ese2. При помощи сервиса Scansite в составе Ese2 предсказано мотивы взаимодействия с доменами SH2 белков Fyn, Abl1, PLCg1 и PI3KR1. Сравнение последовательностей интерсектинов человека и мыши показало консервативность предсказанных мотивов. Получены слитые с GST домены SH2 белков Fyn, Abl1, PLCg1 и PI3KR1, использованных для преципитации белка Ese2 из лизатов головного мозга, легких и сердца мыши. Связывание Ese2 с доменами SH2 белков Fyn и PLCg1 наблюдали во всех исследованных тканях, тогда как домены SH2 белков Abl1 и PI3KR1 узнавали Ese2 только в тканях легких и сердца. Выводы. Дифференциальное узнавание Ese2/SH2 в тканях позволяет предположить, что тканеспецифическое фосфорилирование опосредует специфическое связывание адаптерного белка Ese2 с сиг- нальными молекулами.

Aim. Previously Latent membrane protein 2A (LMP2A) of Epstein-Barr virus was found to be ubiquitylated by CBL ubiquitin ligase but no direct interaction of LMP2A with CBL was reported. We aimed to explore this interaction and study a possibility of adaptor protein involvement. Taking into consideration that both LMP2A and CBL were shown to interact with endocytic adaptor protein intersectin 1 (ITSN1), we assumed that the latter could serve as a scaffold for LMP2A/CBL complex. Methods. We used an immunofluorescence and coimmuno- precipitation approaches to test a mutual complex formation of ITSN1, CBL and LMP2A proteins. Results. LMP2A coimmunoprecipitated with CBL while LMP2A did not interact with CBL G306E mutant harboring inactive phosphotyrosine-binding domain. We observed a triple colocalization of ITSN1, CBL and LMP2A signals in MCF-7 cells as well as coprecipitation of all mentioned proteins. Overexpression of ITSN1 did not affect the efficiency of complex formation of LMP2A with CBL. Moreover, LMP2A mutant unable to interact with ITSN1 was readily precipitated with CBL. Conclusions. LMP2A can be engaged in the complex together with endocytic adaptor ITSN1 and ubiquitin ligase CBL. We show that PTB domain of CBL is responsible for interaction with LMP2A. ITSN1 is not required for LMP2A recruiting to CBL. Відомо, що мембранний білок латентної фази 2А вірусу Епштейна-Барр убіквітинілюється убіквітин-лігазою CBL, хоча прямої взаємодії цих двох білків не виявлено. Наша мета полягала у дослідженні взаємодії LMP2A і CBL та вивченні можливості участі в цьому комплексі білкового адаптера. Беручи до уваги, що обидва зазначених білки взаємодіють з ендоцитозним адаптерним білком ITSN1, ми припустили, що останній може слугувати платформою для утворення комплексу LMP2A/CBL. Методи. Імунофлуоресцентний аналіз та коімунопреципітацію застосовано для дослідження можливості формування комплексу між ITSN1, CBL і LMP2A. Результати. Коімунопреципітація LMP2A і CBL свідчить про утворення комплексу цими білками, причому мутантна форма CBL, яка не здатна зв’язувати фосфотирозинові залишки, не взаємодіє з LMP2A. Ми спостерігали потрійну колокалізацію ITSN1, CBL і LMP2A у клітинах лінії MCF-7, а також коімунопреципітацію всіх зазначених білків. Надекспресія ITSN1 не впливає на ефективність коімунопреципітації LMP2A з CBL. Більш того, мутантний варіант LMP2A, не здатний зв’язуватися із ITSN1, ефективно взаємодіє з CBL. Висновки. LMP2A може входити до комплексу ендоцитозного адаптерного білка ITSN1 та убіквітин-лігази CBL. Участь ITSN1 не є необхідною для формування комплексу між LMP2A і CBL. Показано, що РТВ-домен убіквітин-лігази CBL відповідає за зв’язування з LMP2A. Известно, что мембранный белок латентной фазы 2А вируса Эпштейна-Барр убиквитинилируется убиквитин-лигазой CBL, однако прямого взаимодействия этих белков ранее обнаружено не было. Наша цель состояла в исследовании взаимодействия CBL и LMP2A, а также в изучении возможности участия в этом комплексе белкового адаптера. Принимая во внимание, что оба упомянутых белка взаимодействуют с эндоцитозным адаптерным белком ITSN1, мы предположили, что последний может служить платформой для образования комплекса LMP2A/CBL. Методы. Иммунофлуоресцентный анализ и коиммунопреципитацию использовали для изучения возможности образования комплекса с участием ITSN1, CBL и LMP2A. Результаты. Коиммунопреципитация CBL и LMP2A свидетельствует об образовании комплекса этими белками, причем мутантная форма CBL, лишенная способности связывать фосфотирозиновые остатки, не взаимодействует с LMP2A. Мы детектировали тройную колокализацию ITSN1, CBL и LMP2A в клетках линии MCF-7, а также ко-иммунопреципитацию вышеупомянутых белков. Суперэкспрессия ITSN1 не влияет на эффективность копреципитации CBL и LMP2A. Более того, мутантный вариант LMP2A, дефектный по связыванию с ITSN1, эффективно взаимодействовал с CBL. Выводы. LMP2A может включаться в комплекс эндоцитозного адаптера ITSN1 и убиквитин-лигазы CBL. Участие ITSN1 не является обязательным для образования комплекса LMP2A/CBL. Показано, что РТВ-домен убиквитин-лигазы CBL отвечает за связывание с LMP2A.

The critical point for successful treatment of cancer is diagnosis at early stages of tumor development. Cancer cell-specific methylated DNA has been found in the blood of cancer patients, indicating that cell-free DNA (cfDNA) circulating in the blood is a convenient tumor-associated DNA marker. Therefore methylated cfDNA can be used as a minimally invasive diagnostic marker. We analysed the concentration of plasma cfDNA and methylation of six tumor suppressor genes in samples of 27 patients with renal cancer and 15 healthy donors as controls. The cfDNA concentrations in samples from cancer patients and healthy donors was measured using two different methods, the SYBR Green I fluorescence test and quantitative real-time PCR. Both methods revealed a statistically significant increase of cfDNA concentrations in cancer patients. Hypermethylation on cfDNA was detected for theLRRC3B(74.1%),APC(51.9%),FHIT(55.6%), andRASSF1(62.9%) genes in patients with renal cancer. Promoter methylation ofVHLandITGA9genes was not found on cfDNA. Our results confirmed that the cfDNA level and methylation of CpG islands ofRASSF1A,FHIT, andAPCgenes in blood plasma can be used as noninvasive diagnostic markers of cancer.

Endocytic pathways constitute an evolutionarily ancient system that significantly contributed to the eukaryotic cell architecture and to the diversity of cell type-specific functions and signaling cascades, in particular of metazoans. Here we used comparative proteomic studies to analyze the universal internalization route in eukaryotes, clathrin-mediated endocytosis (CME), to address the issues of how this system evolved and what are its specific features. Among 35 proteins crucially required for animal CME, we identified a subset of 22 proteins common to major eukaryotic branches and 13 gradually acquired during evolution. Based on exploration of structure-function relationship between conserved homologs in sister, distantly related and early diverged branches, we identified novel features acquired during evolution of endocytic proteins on the way to animals: Elaborated way of cargo recruitment by multiple sorting proteins, structural changes in the core endocytic complex AP2, the emergence of the Fer/Cip4 homology domain-only protein/epidermal growth factor receptor substrate 15/intersectin functional complex as an additional interaction hub and activator of AP2, as well as changes in late endocytic stages due to recruitment of dynamin/sorting nexin 9 complex and involvement of the actin polymerization machinery. The evolutionary reconstruction showed the basis of the CME process and its subsequent step-by-step development. Documented changes imply more precise regulation of the pathway, as well as CME specialization for the uptake of specific cargoes and cell type-specific functions.

ITSN1 adaptor/scaffold protein takes part in a variety of physiological and pathological cellular processes. It has a complex expression regulation and many protein partners. Aim. Characterization of the ITSN1 functioning and expression control is important for understanding its role in cell. Methods. Bioinformatic analysis, semi-quantitative expression analysis by RT-PCR, immunoprecipitation. Results. We have described and analyzed the ITSN1 promoter regions, detected ITSN1 alternatively spliced isoforms at mRNA and protein levels in different cancer specimens. By means of different bioinformatic servers, we have identified the sites for miRNA binding and analyzed the sites for serine, threonine and tyrosine phosphorylation of the ITSN1 protein. Conclusions. We have obtained new data on the ITSN1 expression in pathology. We have also shown the possibility of ITSN1 expression regulation by miRNA and phosphorylation of serine, threonine and tyrosine. ITSN1 – адаптерний/скафолдний білок який приймає участь у різноманітних фізіологічних та патологічних клітинних процесах. Він має складну регуляцію експресії та багаточисельні білки партнери. Мета. Характеристика функціонування та регуляції експресії ITSN1 має важливе значення для розуміння ролі ITSN1 в житті клітини. Методи. Біоінформатичний аналіз, напівкількісний аналіз експресії за допомогою ЗТ-ПЛР, іммунопреципітація. Результати. Описано та проаналізовано промоторні регіони ITSN1, детектовано альтернативно сплайсовані ізоформи ITSN1 на рівні мРНК та білка в різних зразках раку. За допомогою різноманітних біоінформатичних серверів виявлено сайти зв’язування з мікроРНК, проаналізовано сайти серин-, треонін- та тирозин-фосфорилювання білка ITSN1. Висновки. Отримано нові дані про експресію ITSN1 при патологіях. Показано можливість регуляції экспресії ITSN1 за допомогою мікроРНК та ролі фосфорилювання серину, треоніну и тирозину в регуляції взаємодії ITSN1 з білками партнерами. ITSN1 – адапторный/скафолдный белок который принимает участие в различных физиологических и патологических клеточных процессах. Он имеет сложное регулирование экспрессии и многочисленные белки партнеры. Цель. Характеристика функционирования и регуляция экспрессии ITSN1 имеет важное значение для понимания роли ITSN1 в жизни клетки. Методы. Биоинформатический анализ, полуколичественный анализ экспрессии с помощью ОТ-ПЦР, иммунопреципитация. Результаты. Описано и проанализировано промоторные области ITSN1, детектировано альтернативно сплайсированные изоформы ITSN1 на уровне мРНК и белка в разных образцах рака. С помощью различных биоинформатических серверов определены сайты связывания с микроРНК, также проанализированы сайты серин-, треонин- и тирозин-фосфорилирования белка ITSN1. Выводы. Получены новые данные о экспрессии ITSN1 при патологиях. Показана возможность регуляции экспрессии ITSN1 с помощью микроРНК и потенциальной роли фосфорилирования серина, треонина и тирозина в регуляции взаимодействия ITSN1 с белками партнерами.

Intersectin 1 (ITSN1) is an adaptor protein involved in membrane trafficking and cell signaling. Long and short isoforms of ITSN1 (ITSN1-L and ITSN1-S) are produced by alternative splicing. The aim of our study was to investigate whether ITSN1-L and ITSN1-S could interact in mammalian cells. Methods. During this study we employed immunoprecipitation and confocal microscopy. Results. We have shown that endogenous ITSN1-S coprecipitates with overexpressed ITSN1-L in PC12, 293 and 293T cells. Long and short isoforms of ITSN1 also colocalize in 293T cells. Conclusions. ITSN1-L and ITSN1-S form complexes in mammalian cells. Keywords: ITSN1, alternatively spliced isoforms, adaptor/scaffold proteins. Інтерсетин 1 (ITSN1) – адатоний білок, залучений до мембранного транспорту та передачі клітинних сигналів. Довга і коротка ізоформи ITSN1 (ITSN1-L і ITSN1-S) утворюються в результаті альтернативного сплайсингу. Метою роботи було встановити, чи можуть ITSN1-L і ITSN1-S взаємодіяти в клітинах ссавців. Методи. Використано методи імунопреципітації та конфокальної мікроскопії. Результати. Показано, що ендогенний ITSN1- S копреципітується з надекспресованим ITSN1-L у клітинах PC12, 293 і 293T. Довга і коротка ізоформи ITSN1 також колокалізуються у клітинах 293T. Висновки. ITSN1-L і ITSN1-S формують комплекси в клітинах ссавців. Ключові слова: ITSN1, альтернативно сплайсовані ізоформи, адапторні білки. Интерсектин 1 (ITSN1) – адапторный белок, участвующий в мембранном транспорте и передаче клеточных сигналов. Длинная и короткая изоформы ITSN1 (ITSN1-L и ITSN1-S) образуются вследствие альтернативного сплайсинга. Целью исследования было выяснить, могут ли ITSN1-L и ITSN1-S взаимодействовать в клетках млекопитающих. Методы. Использованы методы иммунопреципитации и конфокальной микроскопии. Результаты. Показано, что эндогенный ITSN1-S копреципитируется со сверхэкпрессированным ITSN1-L в клетках PC12, 293 и 293T. Длинная и короткая изоформы ITSN1 так же колокализуются в клетках 293T. Выводы. ITSN1-L и ITSN1-S формируют комплексы в клетках млекопитающих. Ключевые слова: ITSN1, альтернативно сплайсированные изоформы, адапторные белки.

Латентный мембранный белок 2А вируса Эпштейна-Барр является ключевым регулятором латентной фазы вирусной инфек- ции. Цель. Идентифицировать белки, способные связываться с пролин-обогащенными мотивами LMP2A. Методы. Анализ in silico при помощи программного обеспечения Scansite позволил предсказать взаимодействие амфифизина 1 (Amph1) и LMP2A. Использованы стандартные методы молекулярного клонирования, сайт-направленный мутагенез и тест на взаимодействие in vitro для последующего изучения структурных основ взаимодействия комплекса LMP2A/Amph1. Фракцию экзосом получали при помощи последовательных центрифугирований. Результаты. Показано, что изоформа LMP2A, но не LMP2АDNT взаимодействует с доменом SH3 Amph1. Выявленное взаимодействие опосредуется тремя разными пролин-обогащенными мотивами, расположенными в N-концевом участке LMP2A. Все три мотиваявляются взаимозаменяемыми, так как присутствия хотя бы одного из них оказывается достаточно для реализации связывания LMP2A с Amph1. Нами продемонстрировано связывание Amph1 и родственного ему Amph2 с LMP2A при помощи ко-иммунопреципитации эндогенных комплексов. Мутант LMP2A по пролиновым мотивам не взаимодействовал с Amph1, что привело к исчезновению его из фракции экзосом. Выводы. Латентный мембранный белок 2А вируса Эпштейна-Барр образует комплексы с эндоцитозными адаптерными белками Amph1 и Amph2. Идентифицированные новые партнеры LMP2A могут влиять на его внутриклеточный трафик и секрецию. Ключевые слова: вирус Эпштейна-Барр, LMP2A, амфифизин, экзосомы. Латентний мембранний білок 2А (LMP2A) вірусу Епштейна-Барр є важливим регулятором латентної фази вірусної інфекції. Мета. Ідентифікувати білки, які взаємодіють з пролін-збагаченими мотивами LMP2A. Методи. Аналіз in silico за допомогою програмного забезпечення Scansite дозволив передбачити можливість взаємодії амфіфізину 1 (Amph1) і LMP2A. Використано загально прийняті техніки молекулярного клонування, сайт-спрямований мутагенез і тест на взаємодію in vitro для подальшого дослідження структурних основ взаємодії комплексу LMP2A/Amph1. Фракцію екзосом отримано за допомогою послідовних центрифугувань. Результати. Показано, що ізоформа LMP2A, але не LMP2А DNT взаємодіє з доменом SH3 амфіфізину 1. Виявлена взаємодія опосередковується трьома різними пролін-збагаченими мотивами, розташованими в N-кінцевій ділянці LMP2A. Всі три мотиви є взаємозамінними, оскільки присутність хоча б одного з них є достатньою для реалізації зв’язування LMP2A з Amph1. Нами продемонстровано взаємодію Amph1 і високоспорідненого з ним Amph2 з LMP2A за допомогою ко-імунопреципітації ендогенних комплексів. Мутант LMP2A за проліновими мотивами не взаємодіяв з Amph1, що спричиняло зникнення його з фракції екзосом. Висновки. Латентний мембранний білок 2А вірусу Епштейна-Барр утворює комплекси з ендоцитозними адаптерними білками Amph1 і Amph2. Ідентифіковані нові партнери LMP2A можуть впливати на його внутрішньоклітинний трафік та секрецію. Ключові слова: вірус Эпштейна-Барра, LMP2A, амфіфізин, екзосоми. Latent membrane protein 2A (LMP2A) of Epstein-Barr virusisimplicated in the regulation of viral latency. The aim of the current study was to identify proteins interacting with proline-rich motifs of LMP2A. Methods. In silico prediction with Scansite allowed to recognize amphiphysin 1 (Amph1) as a binding partner of LMP2A. Molecular cloning techniques, site-directed mutagenesis, in vitro binding assay made it possible to study the interaction interface of Amph1/LMP2A complex. Sequential centrifugation steps were used to isolate an exosomal fraction. Results. LMP2A but not LMP2DNT mutant has been found to bind the SH3 domain of Amph1 via three distinct proline-rich motifs located in the N-terminal tail. All three motifs seem to be interchangeable as the presence of at least one of them was sufficient to mediate LMP2A/Amph1 interaction. Furthermore, the binding of LMP2A to Amph1 and related protein amphiphysin 2 was demonstrated by co-immunoprecipitation of endogenous complexes. We have found that inability of LMP2A mutant to bind Amph1 leads to the vanishing of the viral protein from the exosomal fraction. Conclusions. The latent membrane protein 2A of Epstein-Barr virus forms complexes with endocytic adaptor proteins Amph1 and Amph2. Described interaction might be involved in the regulation of intracellular traffic and secretion of LMP2A. Keywords: EBV, LMP2A, Amphiphysin, exosomes.

Aim. Previously we have identified a novel isoform of endocytic adaptor protein ITSN1 designated as ITSN1- 22a. Western blot revealed two immunoreactive bands of 120 and 250 kDa that corresponded to ITSN1-22a. The goal of this study was to investigate the possibility of dimer formation by the novel isoform. Methods. Dimerization ability of ITSN1-22a was tested by immunoprecipitation and subsequent Western blot analysis. To specify the region responsible for dimerization, site-directed mutagenesis and truncation analysis were carried out. Inhibition of endocytosis by potassium depletion and EGF stimulation of HEK293 were performed. Results. We have found that ITSN1-22a forms dimers in HEK293 cells. The dimerization of ITSN1-22a was mediated by C-terminal domain. We showed that cysteines C1016 and C1019 were involved in homodimerization. Inhibition of clathrin-mediated endocytosis and mitogen stimulation did not affect ITSN1-22a dimer formation. Conclusions. ITSN1-22a is the only one known ITSN1 isoform, which is capable to form homodimers via disulphide bonds. This could be important for the formation of protein complexes containing ITSN1 molecules. Keywords: intersectin 1, isoform, homodimer. Мета. Раніше нами ідентифіковано нову ізоформу адаптерного білка ITSN1, названу ITSN1-22a. Вестерн-блот аналіз виявив наявність двох імунореактивних смуг 120 і 250 кДа, що відповідають ITSN1-22a. Мета цієї роботи полягала у вивченні здатності нової ізоформи формувати димери. Методи. Імунопреципітацію і Вестерн-блот аналіз використано для дослідження здатності ізоформи до димеризації. Ідентифікацію ділянки, що відповідає за формування димерів, здійснювали за допомогою сайтспрямованого мутагенезу та делеційного аналізу. Інгібування ендоцитозу індукували дефіцитом іонів калію. Для мітогенної стимуляції клітин HEK293 застосовано епідермальний фактор росту. Результати. Нами виявлено, що надекспресована в клітинах НЕК293 ізоформа ITSN1-22a формує димери. Димеризація обумовлена специфічним для цієї ізоформи С-кінцевим доменом. Нами показано, що цистеїни С1016 і С1019 залучені до процесу гомодимеризації. Інгібування клатрин-опосередкованого ендоцитозу та стимуляція клітин мітогеном не впливають на формування димерів ізоформою ITSN1-22a. Висновки. ITSN1-22a – це єдина відома на сьогодні ізоформа ITSN1, здатна утворювати гомодимери за допомогою дисульфідних зв’язків, що може бути важливим для формування ITSN1-вмісних білкових комплексів. Ключові слова: інтерсектин 1, ізоформа, гомодимер. Цель. Ранее мы идентифицировали новую изоформу адаптерного эндоцитозного белка ITSN1, названную ITSN1-22a. Вестерн-блот анализ выявил наличие двух иммунореактивных полос 120 и 250 кДа, соответствующих ITSN1-22a. Цель этой работы состояла в изучении возможности формирования димеров изоформой ITSN1-22a. Методы. Иммунопреципитация и Вестерн-блот анализ использованы для исследования возможности димеризации изоформы. Идентификацию участка, отвечающего за димеризацию, осуществляли с помощью сайт-направленного мутагенеза и делеционного анализа. Ингибирование эндоцитоза индуцировали дефицитом ионов калия. Для митогенной стимуляции клеток применен эпидермальный фактор роста. Результаты. Нами обнаружено, что сверхэкспрессированная в клетках НЕК293 изоформа ITSN1-22a формирует димеры. Димеризация изоформы обусловлена ее специфическим С-концевым доменом. Нами показано, что цистеины С1016 и С1019 вовлечены в процесс гомодимеризации. Ингибирование клатрин-опосредованного эндоцитоза и митогенная стимуляция клеток не влияют на формирование димеров изоформой ITSN1-22a. Выводы. ITSN1-22a – это единственная на сегодня изоформа ITSN1, способная образовывать гомодимеры посредством дисульфидных связей, что может быть важно для формирования ITSN1-содержащих белковых комплексов. Ключевые слова: интерсектин 1, изоформа, гомодимер.

We have cloned a novel human mixed-lineage kinase gene, MLK4. Two alternatively spliced forms, MLK4α (580 aa) and MLKβ (1036 aa), have been identified and mapped to chromosomal band lq42. MLK4 shows high amino acid homology to the kinase catalytic domain of MLK3 (72%), MLK1 (71%) and MLK2 (69%). Strong expression of MLK4 was detected in the human pancreas and kidneys. pCMV-MLK4β c-myc-tagged protein (human) was expressed in the cytoplasm and nucleus of transiently transfected COS-1 cells, while pCMV-MLK4α c-myc-tagged protein (human) was expressed in cytoplasm only. Both MLK4 isoforms reduced the colony formation ability of MCF7 cells by 85%–95% and almost totally suppressed cell proliferation in the CyQUANT cell proliferation assay. Human pCMV-MLK4β transgenic mice expressed the MLK4β in all tissues examined but no phenotypic abnormalities were observed. Thus, in this work, we present the cloning and sequencing of MLK4α and MLK4β for the first time; the data obtained suggest that MLK4 may function as a MAP kinase.

ITSN1 is an endocytic scaffold protein with a prominent function in synaptic transmission. It is known that Ca signaling is crucial for the regulation of synaptic proteins functioning. Aim. Checking the possibility of Ca/calmodulin-dependent phosphorylation of ITSN1. Methods. Affinity chromatography, in vitro kinase reaction, Western blotting, gel staining with fluorescent stains. Results. We show that the fraction of calmodulin-binding proteins is able to phosphorylate the recombinant fragments encoding the coiled-coil region and the SH3 domain-containing region of ITSN1 in the presence of Ca ions and calmodulin. Conclusions. The coiled-coil region and the SH3 domain-containing region of ITSN1 undergo Ca/calmodulin-dependent phosphorylation in vitro, suggesting a possible regulation of ITSN1 by Ca signaling. ITSN1 – це ендоцитозний адапторний білок, що виконує значущі функції у синаптичному передаванні нервового імпульсу. Відомо, що кальцієва сигналізація є ключовим елементом регуляції функціонування синаптичних білків. Мета. Дослідити можливість кальцій/кальмодулін-залежного фосфорилювання ITSN1. Методи. Афінна хроматографія, кіназна реакція in vitro, Вестерн блот-гібридизація, фарбування гелів флуоресцентними барвниками. Результати. Показано, що фракція кальмодулін-зв’язувальних білків здатна фосфорилювати рекомбінантні надспіралізовану та SH3 домен-вмісну ділянки ITSN1 in vitro за присутності іонів кальцію і кальмодуліну. Висновки. Надспіралізована та SH3 домен-вмісна ділянки ITSN1 підлягають кальцій/кальмодулін-залежному фосфорилюванню in vitro, що дозволяє припустити існування регуляції ITSN1 кальцієвою сигнальною системою. ITSN1 –это эндоцитозный адапторный белок, выполняющий значительные функции в синаптической передаче нервного импульса. Известно, что кальциевая сигнализация является ключевым элементом регуляции функционирования синаптических белков. Цель. Исследовать возможность кальций/кальмодулин-зависимого фосфорилирования ITSN1. Методы. Аффинная хроматография, киназная реакция in vitro, Вестерн блот-гибридизация, окрашивание белков флуоресцентными красителями. Результаты. Показано, что фракция кальмодулин-связывающих белков способна фосфорилировать рекомбинантные суперспирализованный и SH3 домен-содержащий участки ITSN1 in vitro в присутствии ионов кальция и кальмодулина. Выводы. Cуперспирализованный и SH3 домен-содержащий участки ITSN1 подлежат кальций/кальмодулин-зависимому фосфорилированию in vitro, что позволяет предположить существование регуляции ITSN1 кальциевой сигнальной системой.

Intersectin 1 (ITSN1) is an evolutionarily conserved adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, cellular signaling and cytoskeleton rearrangement. ITSN1 gene is located on human chromosome 21 in Down syndrome critical region. Several studies confirmed role of ITSN1 in Down syndrome phenotype. Here we report the identification of novel interconnections in the interaction network of this endocytic adaptor. We show that the membrane-deforming protein SGIP1 (Src homology 3-domain growth factor receptor-bound 2-like (endophilin) interacting protein 1) and the signaling adaptor Reps1 (RalBP associated Eps15-homology domain protein) interact with ITSN1 in vivo. Both interactions are mediated by the SH3 domains of ITSN1 and proline-rich motifs of protein partners. Moreover complexes comprising SGIP1, Reps1 and ITSN1 have been identified. We also identified new interactions between SGIP1, Reps1 and the BAR (Bin/amphiphysin/Rvs) domain-containing protein amphiphysin 1. Immunofluorescent data have demonstrated colocalization of ITSN1 with the newly identified protein partners in clathrin-coated pits. These findings expand the role of ITSN1 as a scaffolding molecule bringing together components of endocytic complexes.

We showed earlier that BAGE (B melanoma antigen) loci are hypermethylated in normal tissues and hypomethylated in 98% of human cancers. More recently, we provided evidence that hypomethylation of BAGE loci represents an informative marker for colon cancer detection. In this study, we show that hypomethylation of BAGE loci was an early event that occurred in 43% of colorectal adenomas. Interestingly, hypomethylation of BAGE loci was frequent (50%) in tubulo-villous and villous adenomas, these adenomas having a high probability of being transformed into colorectal cancers.

Intersectin 1 (ITSN1) is an evolutionarily conserved adaptor protein that functions in clathrin-mediated endocytosis, cell signalling and cytoskeleton rearrangements. The ITSN1 gene encodes two main isoforms: a short form (ITSN1-s), which is ubiquitously expressed and consists of two Eps15 homology (EH) domains and five Src homology 3 (SH3) domains, and a long form (ITSN1-l), which is predominantly expressed in the brain and contains three additional domains, a Dbl homology (DH) domain, a Pleckstrin homology (PH) domain and a C2 domain. Using computational analysis of the EST database and 3' RACE we determined the length of the 3' untranslated region of ITSN1-l and demonstrated that the polyadenylation site is located 11,559 nt downstream of the stop codon of the ITSN1-l mRNA. Recently, additional splicing events affecting ITSN1 transcripts were reported, but full-length transcriptional isoforms with different combinations of alternatively spliced exons remained unknown. Here we report the identification of fifteen novel transcriptional isoforms of the human ITSN1 gene with full-length coding sequences that are the result of different combinations of the alternatively spliced exons 5, 6/6', 20, 23, 25, 26, 26a and 35. The isoforms identified differ in domain organization and expression level in different tissues and more likely contribute to the modulation of many complex protein interactions in which ITSN1 participates.

Intersectin 1 (ITSN1) is a conserved adaptor protein implicated in endocytosis, regulation of actin cytoskeleton rearrangements and mitogenic signaling. Its expression is characterized by multiple alternative splicing. Here we show neuron-specific expression of ITSN1 isoforms containing exon 20, which encodes five amino acid residues in the first SH3 domain (SH3A). In vitro binding experiments demonstrated that inclusion of exon 20 changes the binding properties of the SH3A domain. Endocytic proteins dynamin 1 and synaptojanin 1 as well as GTPase-activating protein CdGAP bound the neuron-specific variant of the SH3A domain with higher affinity than ubiquitously expressed SH3A. In contrast, SOS1, a guanine nucleotide exchange factor for Ras, and the ubiquitin ligase Cbl mainly interact with the ubiquitously expressed isoform. These results demonstrate that alternative splicing leads to the formation of two pools of ITSN1 with potentially different properties in neurons, affecting ITSN1 function as adaptor protein.

We report the first full-length sequence of an endogenous retrovirus from the genome of domestic chicken, that is not related to the Avian leukemia viruses (ALV). This retrovirus, designated ChiRV1, clusters with Murine leukemia virus (MLV)-related retroviruses and hence is the first complete gammaretrovirus from the genome of a bird. Nevertheless it is not related to exogenous MLV-related retroviruses infecting chicken. The provirus is 9133 bp long and contains 90%-identical LTRs as well as reading frames for the gag, pol and env genes, interrupted by in-frame stop codons. Expression analysis showed that ChiRV1 is a transcribed provirus. Screening of the chicken genome database revealed 100 ChiRV1-related sequences that are grouped into three classes based upon LTR alignment and subsequent phylogenetic analysis.

Compartmentalization and compaction of DNA in the nucleus is the characteristic feature of eukaryotic cells. A fully extended DNA molecule has to be compacted 100,000 times to fit within the nucleus. At the same time it is critical that various DNA regions remain accessible for interaction with regulatory factors and transcription/replication factories. This puzzle is solved at the level of DNA packaging in chromatin that occurs in several steps: rolling of DNA onto nucleosomes, compaction of nucleosome fiber with formation of the so-called 30 nm fiber, and folding of the latter into the giant (50-200 kbp) loops, fixed onto the protein skeleton, the nuclear matrix. The general assumption is that DNA folding in the cell nucleus cannot be uniform. It has been known for a long time that a transcriptionally active chromatin fraction is more sensitive to nucleases; this was interpreted as evidence for the less tight compaction of this fraction. In this review we summarize the latest results on structure of transcriptionally active chromatin and the mechanisms of transcriptional regulation in the context of chromatin dynamics. In particular the significance of histone modifications and the mechanisms controlling dynamics of chromatin domains are discussed as well as the significance of spatial organization of the genome for functioning of distant regulatory elements.

Invasive cancer cells form actin-rich membrane protrusions called invadopodia that degrade extracellular matrix and facilitate cell invasion and metastasis. WIP (WASP-interacting protein) together with N-WASP (neural Wiskott-Aldrich syndrome protein) are localized in invadopodia and play a crucial role in their formation. Here we show that WIP interacts with endocytic adaptor proteins of the intersectin (ITSN) family, ITSN1 and ITSN2. The interaction is mediated by the SH3 domains of ITSNs and the middle part of the WIP proline-rich motifs. We have also demonstrated that ITSN1, WIP and N-WASP can form a complex in cells. Endogenous ITSN1 and ITSN2 are located in invasive protrusions of MDA-MB-231 breast cancer cell line. Moreover, data from immunofluorescent analysis revealed co-localization of ITSN1 and WIP at sites of invadopodia formation and in clathrin-coated pits. Together, these findings provide insights into the molecular mechanisms of invadopodia formation and identify ITSNs as scaffold proteins involved in this process.

The distribution of seven groups of endogenous retroviruses (ALV-related ev loci, HERV-I-related proviruses, EAV-HP, EAV-0, E-33, E-51, ART-CH) in the genome of domestic chicken (Gallus gallus) was studied according to the composition (long-range variation of GC-content) of the host genome. GC-rich proviruses (ev loci, ART-CH and EAV-0) have been localized mainly in GC-richest isochore families H2, H3 and H4, GC-poor HERV-I-related proviruses, E-51 and E-33 localized in GC-poor isochore families L1, L2 and also in H1 (isopycnicity). GC-rich EAV-HP, except expected distribution GC-rich isochores, present also in GC-poor compartments. Investigation of expression by RT-PCR and analysis of EST databases provided a tissue-specific patterns that could change the picture of proviral distribution due to reintegration. Reasons of endogenous retrovirus isopycnicity are likely to be the compositional match between the integrant and the chromosomal region of the host, that led to the stability of integration. Розподіл семи груп ендогенних ретровірусів (ALV-родинні, HERV-I-родинні, EAV-HP, EAV-0, E-33, E-51, ART-CH) у геномі курки досліджували у зв'язку з композиційним складом (варіюванням GC-вмісту) геному хазяїна, GC-багаті pempoвіруси (ALV-родинні, ART-CH ma EAV-0) локалізовані, голо­вним чином, в GC-найбагатших родинах ізохор Н2, НЗ і Н4, GC-бідні HERV-1-родинні провіруси, Е-51 та Е-33 локалізовані в GC-бідних родинах ізохор LJ, L2, а також в НІ (ізопікнічність). GC-багатий ретровірус EAV-HP, окрім очікуваної наявності в GC-багатих ізохорах, присутній також в GC-бідних ком пар тментах. Дослідження експресії шляхом RTPCR, а також аналіз баз даних EST свідчать, що експресія ендогенних ретровірусів курки може бути тканиноспецифічною. Це, в свою чергу, може впливати на картину провірусної локалізації внаслідок реінтеграції. Причиною ізопікнічної ло­калізації ендогенних ретровірусів є композиційна відповідність між інтегрованою послідовністю та хромосомною ділянкою хазяїна, що забезпечує стабільність інтеграції. Распределение семи групп эндогенных ретровирусов (ALV-родственные, HERV-I-родственные, EAV-HP, EAV-0, E-33, E-51, ART-CH) в геноме курицы исследовали в связи с компо­зиционным составом (варьированием GC-содержания) генома хозяина. GC-богатые ретровирусы (ALV-родственные, ARTCH и EAV-0) локализованы, главным образом, в наиболее GC-богатых семействах изохор Н2, НЗ и Н4, GC-бедные HERV-I-родственные провирусы, Е-51 и Е-33 локализованы в GC-бедных семействах изохор LI, L2, а также в НІ (изопикничность). GC-богатый ретровирус EAV-HP, кроме ожидаемо­го наличия в GC-богатых изохорах, присутствует также в GC-бедных компартментах. Исследование экспрессии с по­мощью RT-PCR, а также анализ баз данных EST свидетельст­вуют о том, что экспрессия эндогенных ретровирусув курицы может быть тканеспецифичной. Это, в свою очередь, может влиять на картину провирусной локализации вследствие реин­теграции. Причиной изопикничной локализации эндогенных ретровирусов является композиционное соответствие между интегрированной последовательностью и хромосомным уча­стком хозяина, что обеспечивает стабильность интеграции.

Giant nuclear transcripts, and in particular the RNAs of the globin gene domains which are much larger than their canonical pre-mRNAs, have been an enigma for many years. We show here that in avian erythroblastosis virus (AEV)-transformed chicken erythroleukaemic cells, where globin gene expression is abortive, the whole domain of α-globin genes is transcribed for about 33 kb in the globin direction and that this RNA is part of the nuclear matrix. Northern blot hybridisation with strand-specific riboprobes, recognising genes and intergenic sequences, and RT-PCR with downstream primers, show that the continuous full domain transcript (FDT) starts in the vicinity of a putative LCR and includes all the genes as well as known regulatory sites, the replication origin, and the DNA loop anchorage region in the upstream area. Absent in chicken fibroblasts, the globin FDT overlaps the major part of the ggPRX housekeeping gene that is transcribed in the opposite direction. RT-PCR and in situ hybridisation with genic and extra-genic globin probes demonstrated that the globin FDT is a component of the nuclear matrix. We suggest that the globin FDTs keep the domain in an active state, and the globin RNAs on the processing pathway are a component of the nuclear matrix. They may take part in the dynamic nuclear architecture when productively processed, or turn over slowly when globins are not synthesised. © 2004 Wiley-Liss, Inc.

To establish criteria for and the limitations of novel gene identification, to identify novel genes of potential relevance to Down Syndrome and to investigate features of genome organization, 6.5 Mb of DNA sequence, dispersed throughout the long arm of human chromosome 21, have been annotated computationally and experimentally. Exon prediction with four programs, protein and EST database searches, two-sequence BLAST searches and CpG island characterization identified 41 genes with known or new protein homologies. Features of these genes suggested criteria for prediction of novel genes (those lacking any protein homology) with the following characteristics: (1) exon+EST genes: genes with excellent patterns of predicted exons and one or more matches in dbEST; (2) exon-EST genes: genes with good patterns of predicted exons and no matches in dbEST; (3) EST-exon genes: genes without any patterns of reliable exon prediction but with matches in dbEST; and (4) isolated CpG island genes: genes consisting of strong CpG islands that are apparently unique sequences and found in regions lacking any consistent exon predictions within >50 kb. In total, 41 novel gene models were predicted, and for a subset of these, RT-PCR experiments helped to verify and refine the models, and were used to assess expression in early development and in adult brain regions of potential relevance to Down syndrome. Results suggest generally low and/or restricted patterns of expression, and also reveal examples of complex alternative processing, especially in brain, that may have important implications for regulation of protein function. Analysis of complete gene structures of the known genes identified a number of very large introns, a number of very short intergenic distances, and at least one potentially bi-directional promoter. At least 3/4 of known genes and 1/2 of predicted genes are associated with CpG islands. For novel genes, three cases of overlapping genes are predicted. Results of these analyses illustrate some of the complexities inherent in mammalian genome organization and some of the limitations of current sequence analysis technologies. They also doubled the number of potential genes within the region.

Integration sites for HTLV-1 and HIV-1proviruses were detected by FISH on the chromosomes of HTHIV27 cells persistently infected by HIV-1 (strain IIIB). HTLV-1 signals were found on 9 loci of chromosomes 4, 6, 9, 15 and 16. Integration sites of GC-rich HTLV-1 provirus are located in GC-rich isochores, confirming an ‘isopycnic’ integration, namely an integration in which the GC level of the host sequences around the integration site match the GC level of the provirus. This conclusion is not only derived from the compositional map of human chromosomes, but also from HTLV-1 hybridization on compositional fractions of human DNA. Integration of GC-poor HIV- 1 provirus was found on 4 loci of chromosomes 2, 7, 17 and 19. One copy of a complete HIV-1 provirus, which is active, was integrated in H1 isochores, whereas other defective copies were located in GC-poor L isochores. These results are discussed in terms of regional integration of retroviral sequences.

We have reviewed here three sets of data concerning the integration of retroviral sequences in the mammalian genome: (i) our experimental localization of a number of proviruses integrated in isochores characterized by different GC levels; (ii) results from other laboratories on the localization of retroviral sequences in open chromatin regions and/or next to CpG islands; and (iii) our compositional analysis of genes located in the neighborhood of integrated retroviral sequences. The three sets of data have provided a very consistent picture in that a compartmentalized, isopycnic integration of expressed proviruses appears to be the rule (`isopycnic' refers to the compositional match between viral and host sequences around the integration site). The results reviewed here suggest that: (i) integration of proviral sequences is targeted initially towards `open chromatin regions'; while these exist in both GC-rich and GC-poor isochores, the `open chromatin regions' of GC-rich isochores are the main targets for integration of retroviral sequences because of their much greater abundance; (ii) isopycnicity is associated with stability of integration; indeed, even non-expressed integrated retroviral sequences tend to show an isopycnic localization in the genome; (iii) transcription of integrated viral sequences (like transcription of host genes) appears to be associated, as a rule, with an isopycnic localization, as indicated by transcribed sequences that show an isopycnic integration and act in trans ; (iv) selection plays a role in the choice of specific sites within an isopycnic region; in exceptional cases [such as mouse mammary tumor virus (MMTV) activating GC-rich oncogenes], selection may override isopycnicity.

Rearrangements of the long arm of human chromosome 3, including reciprocal translocations, inversions and deletion/duplication of bands 3q21–3q26, as well as deletions of 3q21 and reciprocal translocations between 3q21 and other chromosomes, are well documented in leukemia. Previous studies showed that the breakpoints within 3q21 cluster within a 10–40 kb region but no candidate genes were described. In this work, we have identified partial cDNAs corresponding to five to nine new transcripts from an 80 kb P1 clone that spans ten breakpoints. These transcripts, with one exception, appear to be expressed only at low levels in the set of cancer cell lines examined. Four transcripts are located between the previously mapped Ribophorin I gene and the most centromeric breakpoint; three map directly within the 20 kb spanning nine independent breakpoints. These data (i) show that among characterized leukemia breakpoint regions 3q21 is unusually gene rich, (ii) provide new candidates for relevance to leukemia in 3q21, and (iii) suggest possibilities for chromatin configuration effects.

Adaptor/scaffold proteins of the intersectin (ITSN) family are important components of endocytic and signalling complexes. They coordinate trafficking events with actin cytoskeleton rearrangements and modulate the activity of a variety of signalling pathways. In this review, we present our results as a part of recent findings on the function of ITSNs, the role of alternative splicing in the generation of ITSN1 diversity and the potential relevance of ITSNs for neurodegenerative diseases, cancer. Адапторні білки родини інтерсектинів (ITSN) є важливими компонентами ендоцитозних і сигнальних комплексів. Вони координують внутрішньоклітинний трафік і перебудови актинового цитоскелета та модулюють активність різних сигнальних шляхів. В огляді представлено результати наших досліджень, а також дані інших лабораторій стосовно функції ITSN, ролі альтернативного сплайсингу у формуванні різноманіття ізоформ ITSN1 і зв’язку інтерсектинів з нейродегенеративними хворобами, злоякісними пухлинами. Адапторные белки семейства интерсектинов (ITSN) – важные компоненты эндоцитозных и сигнальных комплексов. Они координируют внутриклеточный трафик и перестройки актинового цитоскелета, а также модулируют активность различных сигнальных путей. В обзоре представлены результаты наших исследований и данные других лабораторий относительно функции ITSN, роли альтернативного сплайсинга в формировании разнообразия изоформ ITSN1 и связи интерсектинов с нейродегенеративными заболеваниями, злокачественными опухолями.

Latent Membrane Protein 2A (LMP2A) is an Epstein–Barr virus-encoded protein that is important for the maintenance of latent infection. Its activity affects cellular differentiation, migration, proliferation and B cell survival. LMP2A resembles a constitutively activated B cell antigen receptor and exploits host kinases to activate a set of downstream signaling pathways. In the current study we demonstrate the interaction of LMP2A with intersectin 1 (ITSN1), a key endocytic adaptor protein. This interaction occurs via both the N- and C-tails of LMP2A and is mediated by the SH3 domains of ITSN1. Additionally, we identified the Shb adaptor and the Syk kinase as novel binding ligands of ITSN1. The Shb adaptor interacts simultaneously with the phosphorylated tyrosines of LMP2A and the SH3 domains of ITSN1 and mediates indirect interaction of ITSN1 to LMP2A. Syk kinase promotes phosphorylation of both ITSN1 and Shb adaptors in LMP2A-expressing cells. In contrast to ITSN1, Shb phosphorylation depends additionally on Lyn kinase activity. Considering that Shb and ITSN1 are implicated in various receptor tyrosine kinase signaling, our results indicate that LMP2A can affect a number of signaling pathways by regulating the phosphorylation of the ITSN1 and Shb adaptors.

Intersectin 1 (ITSN1) is a multidomain adaptor protein that functions in clathrin-mediated endocytosis and signal transduction. This protein is highly abundant in neurons and is implicated in Down syndrome, Alzheimer's disease and, possibly, other neurodegenerative disorders. Here we used an in vitro binding assay combined with MALDI-TOF mass spectrometry to identify novel binding partners of ITSN1. We found that the neuron-specific isoform of the stable tubule-only polypeptide (STOP) interacts with SH3A domain of ITSN1. STOP and ITSN1 were shown to form a complex in vivo and to partially co-localize in rat primary hippocampal neurons. As STOP is a microtubule-stabilizing protein that is required for several forms of synaptic plasticity in the hippocampus, identification of this interaction raises the possibility of ITSN1 participation in this process.

Передача митогенного сигнала от RTK (рецепторных тирозиновых киназ) тесно связана с эндоцитозом, регулирующим ее точность. Интерсектин 1 (ITSN1) – эволюционно-консервативный адапторный белок, вовлеченный в самые ранние стадии клатринопосредованного эндоцитоза, а также в злокачественную трансформацию в случае его сверхэкспрессии. Цель. Поиск белков, способных обеспечивать связь ITSN1 с процессом передачи сигнала от RTK. Методы. Предсказание мотивов взаимодействия in silico, экспрессия белков в бактериальной системе и в культуре клеток млекопитающих, иммунопреципитация, преципитация белков, слитых с GST, иммунофлуоресцентный анализ. Результаты. С применением сервиса «Scansite» предсказано связывание домена SH3A ITSN1 с SPRY2. Для экспериментального подтверждения этого взаимодействия GST-слитые домены ITSN1 получены и очищены из клеток Escherichia coli. Используя преципитацию белков, слитых с GST, установлено, что домены SH3A, N-SH3A (нейрон-специфический вариант), SH3C и SH3E способны преципитировать SPRY2-Flag из лизата клеток. Данные иммунофлуоресцентного анализа и коиммунопреципитации свидетельствуют о частичной колокализации белков Omni-ITSN1 и Flag-SPRY2 и формирование ими комплекса in vivo. Выводы. Полученные данные подтверждают ассоциацию эндоцитозного адапторного белка ITSN1 с сигнальным белком SPRY2 in vivo. Ключевые слова: интерсектин 1, передача митогенного сигнала, SPRY2, домен SH3. Передача мітогенного сигналу від рецепторних тирозинкіназ (RTK) у клітині тісно пов’язана з ендоцитозом, який регулює точність такої передачі. Інтерсектин 1 (ITSN1) – це еволюційно консервативний адапторний білок, що бере участь у найбільш ранніх етапах клатрин-опосередкованого ендоцитозу та залучений до процесу злоякісної трансформації за умов надекспресії. Мета. Пошук білків, які можуть забезпечити зв’язок ITSN1 із процесом передачі сигналу від RTK. Методи. Передбачення мотивів взаємодії in silico, експресія білків у бактерійній системі та культурі клітин ссавців, імунопреципітація, преципітація білків, злитих з GST, імунофлуоресцентні дослідження. Результати. За допомогою сервісу «Scansite» передбачено зв’язування домену SH3A ITSN1 із SPRY2. Для експериментального підтвердження цієї взаємодії злиті з GST SH3-домени ITSN1 отримано і очищено з бактерій Escherichia coli. Використовуючи преципітацію білків, злитих з GST, встановлено, що домени SH3A, N-SH3A (нейрон-специфічний варіант), SH3C і SH3E ITSN1 здатні преципітувати Flag-SPRY2 з лізату клітин. Дані імунофлуоресцентного аналізу та коімунопреципітації свідчать про часткову колокалізацію білків Omni-ITSN1 і Flag-SPRY2 та формування ними комплексу in vivo. Висновки. Отримані дані підтверджують асоціацію ендоцитозного адапторного білка ITSN1 із сигнальним білком SPRY2 in vivo. Ключові слова: інтерсектин 1, передача мітогенного сигналу, SPRY2, домен SH3.

WNT7A (wingless-type MMTV integration site family, member 7A) is a known tumor suppressor gene of non-small cell lung carcinomas (NSCLC) and is frequently inactivated due to CpG-island hypermethylation in human cancers. The members of WNT family are involved in cell signaling and play crucial roles in cancer development. In the present work hypermethylation of the WNT7A gene was detected in 66% (29/44) of analyzed clear cell renal cell carcinomas (RCCs) using methyl-specific PCR (MSP). Moreover, bisulfite sequencing confirmed intensive hypermethylation of the 5-CpG island of the WNT7A gene. Methylation analysis revealed positive correlations between tumor stage, Fuhrman nuclear grade and WNT7A hypermethylation. Additionally, restoration of WNT7A gene expression in the A498 cell line by 5-aza-2-deoxycytidine treatment confirmed a direct contribution of hypermethylation in silencing of the WNT7A gene. High frequency of loss of heterozygosity (LOH) was demonstrated on chromosome 3p25 in regions surrounding the WNT7A gene. The frequent down-regulation of WNT7A gene expression was detected in 88% (15/17) of clear cell RCCs. We have also shown that the WNT7A gene possesses tumor suppression function by colony-formation and cell proliferation assays in RCC cell lines. In summary, the WNT7A gene is inactivated by genetic/epigenetic alterations in clear cell RCC and demonstrates tumor suppressor properties. Funding Agencies|State Fond of Fundamental Research|F46/457-2011|Swedish Cancer Society||Swedish Institute||Swedish Research Council||EACR