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Fasciola hepatica es el agente etiológico de la fasciolosis, enfermedad descrita como la principal causa de pérdidas económicas en el sector agrícola y ganadero en países desarrollados y en vías de desarrollo como consecuencia de las tasas de morbilidad y mortalidad que origina en los animales de abasto. La OMS la describe como una enfermedad parasitaria re-emergente con un especial impacto en humanos alrededor de todo el mundo. Entre los distintos principios activos disponibles para hacer frente a esta enfermedad, el triclabendazol se erigió como el fármaco de elección en el tratamiento de la fasciolosis. Debido al uso de antihelmínticos como único medio eficaz para el control de la infección, se hace necesario el estudio e implementación de vías alternativas que permitan el control de esta enfermedad, como la obtención de líneas genéticas resistentes o el desarrollo de vacunas. La infección por F. hepatica desencadena la actuación de la respuesta inmunitaria como consecuencia del reconocimiento de numerosos antígenos de excreción-secreción (FhESPs) o de la superficie del parásito. Estas moléculas han sido identificadas y purificadas con el fin de realizar ensayos vacunales con los que determinar su capacidad inmunógena y qué antígeno pudiera constituir el candidato idóneo de una vacuna eficaz. La mayoría de los estudios vacunales realizados en rumiantes se han centrado en el empleo de antígenos obtenidos a partir de la fase adulta del parásito, si bien se torna de vital importancia identificar áquellos que juegan un papel relevante durante todas las fases de la infección. Con este motivo, se empleó en un primer estudio un antígeno (rFh14- 3-3z) de la familia de proteínas 14-3-3, con el que poder determinar el perfil inmunológico y el componente parasitológico, haciendo hincapié en el número de fasciolas asentadas en hígado y la dinámica de eliminación de huevos en heces. Se usaron 24 ovejas de raza merina de seis meses de edad divididas aleatoriamente en tres grupos (n=8) con el siguiente modelo: el grupo 1 fue inmunizado con la proteína recombinante Fh14-3-3z y el adyuvante Montanide™ ISA 71 VG, el grupo 2 se inmunizó únicamente con Montanide™ ISA 71 VG (control adyuvante) y el grupo 3 fue el grupo control de infección (infectado y no vacunado). Ocho semanas posteriores a la primera inmunización los animales fueron infectados oralmente con una única dosis de 150 metacercarias. A las 6 semanas de la infección se realizó un muestreo de heces semanalmente a todos los animales para analizar la dinámica de eliminación de huevos mediante McMaster con sulfato de zinc. La presencia de huevos en heces se detectó a las 8 semanas post-infección en el grupo 1 y las 9 semanas en los grupos 2 y 3. De la misma manera, una vez sacrificados se recogieron los adultos de F. hepatica de los hígados para realizar su recuento, así como la medición de los vermes. El grupo 1 presentó una carga de 52’25 ± 16’71 fasciolas, similar al grupo 3 con una carga media de 51’13 ± 12’84 y el grupo 2 evidenció una mayor carga parasitaria con 68’13 ± 23’79 adultos. La respuesta inmunitaria humoral, para los isotipos IgG1 e IgG2, analizada mediante ELISA indirecto mostró un incremento significativo en IgG1 tres semanas después de la inmunización, mientras que IgG2 aumenta su producción significativamente únicamente después de la inmunización en el grupo 2. Debido a los ensayos que han demostrado la falta de protección en animales inmunizados con diferentes antígenos de F. hepatica y a la capacidad inmunomoduladora del parásito se hace necesario conocer la respuesta inmunitaria que se desencadena en las primeras fases de la infección. Por ello, el segundo estudio tuvo como objetivo el análisis poblacional de linfocitos (TCD4, TCD8 y WC1+γδ), macrófagos (CD14), MHCII como célula presentadora de antígenos y células dendríticas (CD83) de cavidad peritoneal de animales infectados y sacrificados en fases iniciales y tardías. En este ensayo se emplearon 37 ovejas de raza merina de seis meses de edad, las cuales fueron divididas aleatoriamente en tres grupos atendiendo al momento del sacrificio: el grupo 1 (n=20) (estadios tempranos) y grupo 2 (n=10) (estadios tardíos) fueron infectados con una dosis de 150 metacercarias. Los animales del grupo 1 fueron sacrificados a los 1, 3, 9 y 18 días post-infección (dpi), así mismo, el grupo 2 fueron sacrificados a las 14 semanas post-infección (spi). El grupo 3 no se infectó y se describió como grupo control negativo. Los parámetros parasitológicos del grupo 2 mostraron una carga parasitaria de 67’78 ± 13’85 adultos con una tasa de implantación con niveles de 45’19% ± 9’24. La presencia de huevos en heces se detectó a las 8 semanas de la infección, alcanzando su máximo a la semana 13. El análisis de las distintas poblaciones leucocitarias se determinó mediante citometría de flujo con distintos anticuerpos monoclonales. Los animales sacrificados en las fases tempranas únicamente mostraron un descenso significativo de los TCD4 a los 1 y 18 dpi. Asimismo, la población de CD14 peritoneal evidenció un descenso a las 9 y 18 dpi, mientras que MHCII y CD83 describen un patrón similar con una significativa disminución a los 3 y 9 dpi. Los animales sacrificados a las 14 semanas aumentaron significativamente su población de WC1+γδ pero sufrieron un descenso significativo en las subpoblaciones de macrófagos y células dendríticas peritoneales. Continuando con una mejor compresión de los mecanismos defensivos del hospedador frente a esta enfermedad, el tercer trabajo realizado tuvo como objetivo analizar la dinámica poblacional en líquido peritoneal y la producción de radicales libres en animales infectados y vacunados. Para este estudio se emplearon 45 ovejas de raza merina de seis meses de edad agrupadas aleatoriamente como se describe: el grupo 1 (n=5) fueron animales no infectados ni vacunados y fue descrito como grupo control negativo, el grupo 2 (n=20) fue experimentalmente infectado con 150 metacercarias y el grupo 3 (n=20) fue inmunizado con rFhCL1 e infectado con 150 metacercarias. El grupo 1 fue sacrificado a las 12 spi mientras que los grupos 2 y 3 fueron sacrificados a los 1, 3, 9 y 18 dpi. La respuesta inmunitaria humoral evidenció diferencias significativas en IgG1 desde las 6ª semana post-vacunación en el grupo 3 y únicamente a los 1 dpi para IgG2. El número total de leucocitos reveló un aumento significativo a los 9 y 18 dpi para el grupo 2 y 3. Más específicamente, el grupo 2 evidenció un aumento significativo de granulocitos a los 9 dpi y de las tres poblaciones peritoneales a los 18 dpi. Por su parte, el grupo 3 aumentó el número de linfocitos a los 3 y 18 dpi, así como la población de macrófagos y granulocitos a los 9 y 18 dpi. La medición de radicales libres por parte de los leucocitos se determinó mediante citometría de flujo usando 2 reactivos diferentes: DAF-2DA para el óxido nítrico y DCFH-DA para el peróxido de hidrógeno. En relación a la producción H2O2, el grupo 2 incrementó su producción por parte de los macrófagos a los 3 y 9 dpi, y a los 18 dpi por parte de los granulocitos. Asimismo, los granulocitos en el grupo 3 mostraron un aumento de este radical libre a los 9 y 18dpi. Finalmente, la producción de NO en el grupo 2 sufrió un incremento significativo por parte de los granulocitos a los 9 y 18 dpi y en los macrófagos a los 18 dpi. Sin embargo, el grupo 3 aumentó la producción de NO a los 3 dpi por parte de los macrófagos y a los 3, 9 y 18 dpi en los granulocitos. Fasciola hepatica is the ethyological agent of fasciolosis, a disease described as the major cause of economic losses to the agricultural industry in developed and developing countries due to the high morbility and mortility rates in livestock. It has been described as a tropical reemerging disease by the WHO. Triclabendazole is the drug of choice against fasciolosis, among different drugs available for the control of the disease. Due to the use of anthelmintic as the only effective mean for the control of the infection, alternative ways for disease control are required, as genetically resistant species or the development of vaccines. Fasciola hepatica infection triggers the immune response as a consequence of the recognition of numerous excretory and secretory products (FhESPs) or tegumental proteins. These molecules have been identified and purified in order to perform vaccine trials aimed at determining their immunogenic capacity so as to develop a vaccine. Most of the vaccine trials carried out in ruminants had been conducted using the adult fluke antigens that are exposed to the immune system. Therefore, it is essential to identify the molecules that play a key role during the course of infection. On this reason, an antigen from the 14-3-3 protein family (14-3-3z) has been used in a first study. With the use of rFh14-3-3z antigen we determined the immunological and parasitological parameters since the first vaccination, with special attention to the number of adult flukes in the liver and the dynamic of faecal egg count. Twenty-four female Merino-breed sheep 6 month old were used for the study. Sheep were randomly allocated into three groups (n=8). Animals from group 1 were immunised with the recombinant antigen rFh14-3-3z in Montanide adjuvant (Montanide™ISA 71 VG -Seppic®). Group 2 was immunised with Montanide adjuvant (adjuvant control group) and animals from group 3 were not immunised and remained as positive infection control. Eight weeks after first immunisation all animals were orally challenged with a single dose of 150 metacercariae of F. hepatica. To assess egg output, faecal samples were individually collected weekly from week six after challenge until the end of the trial, and were analysed by a zinc sulphate-based flotation method using the McMaster chamber. Eggs were first detected at 8 wpi in group 1 and 9 wpi in group 2 and 3. Once sheep were slaughtered the livers were collected and the adult flukes were recovered for measurement and weighing. Fluke burden of group 1 was 52’25 ± 16’71, similar to the group 3 with a mean of 51’13 ± 12’84 adult flukes. The group 2 showed a higher fluke burden of 68’13 ± 23’79 adults. On regard to the humoral immune system, indirect ELISA showed a significant increase of IgG1 at week 3 after immunisation, while IgG2 increased significantly its values only after immunisation in group 2. Due to the failure of many vaccination trials using broad variety of F. hepatica antigens and to the immunomodulatory capacity of the liver flukes, the study of the immune response during the early stages of the infection is vital for a better understanding of the immunological pathways elicited during the host-parasite interaction. Thus, the second study was aimed at analysing the peritoneal lymphocyte (TCD4, TCD8 and WC1+γδ), macrophage (CD14), MHCII as an antigen presenting cell, and dendritic cells (CD83) populations of infected animals and slaughtered at the early and late stages of infection. Thirty-seven female Merino-breed sheep, aged 6 months, were used for the study. Animals were randomly allocated into 3 groups according to the slaughtering time: group 1 (n=20) (early stage) and group 2 (n=10) (late stage) were infected with a single dose of 150 metacercariae. Sheep from group 1 were sacrified at 1, 3, 9 and 18 days post-infection (dpi). In the same way, animals from group 2 were slaughtered at 14 weeks post-infection (spi). The group 3 was not infected and remained as a negative control group. Parasitological parameters from group 2 showed a fluke burden of 67’78 ± 13’85 adults with a implantation rate of 45’19% ± 9’24. Eggs in faecal samples were first detected at week 8 post-infection, reaching the highest figures at 13 wpi. The analysis of the different leukocyte populations was determined by flow cytometry with diverse monoclonal antibodies. Animals sacrified at the early stages of infection only showed a significant decrease of TCD4 at 1 and 18 dpi. Furthermore, CD14 peritoneal population showed a decrease at 9 and 18 dpi, while MHCII and CD83 described a similar pattern with a significant decrease at 3 and 9 dpi. Animals slaughtered at 14 wpi increase significantly WC1+γδ subpopulation but macrophage and dendritic cells peritoneal populations showed a significant decrease. Continuing with a better understanding of host immunological mechanisms against the disease, our third study aimed to analyse the dynamic of peritoneal populations and the production of free radicals in immunised and infected animals. For this study, Forty-five six-monthold male merino sheep were used and randomly allocated as described: group 1 (n=5) was not infected and not vaccinated and remained as negative control group, group 2 (n=20) was experimentally infected with 150 metacercariae and group 3 (n=20) was immunised with rFhCL1 and infected with 150 metacercariae. Group 1 was slaughtered at 12 wpi, while groups 2 and 3 were sacrified at 1, 3, 9 and 18 dpi. Humoral immune response showed significant differences in IgG1 at 6 postimmunisation in group 3 and only at 1 dpi for IgG2. Total number of leukocytes revealed a significant increase at 9 and 18 dpi for group 2 and 3. Granulocytes from group 2 increased significantly at 9 dpi and the three peritoneal populations at 18 dpi. Group 3 increased the number of lymphocytes at 3 and 18 dpi, as well as macrophage and granulocyte populations at 9 and 18 dpi. Free radical measurement was determined with flow cytometry analysis using two different reagent: DAF-2DA for nitric oxide and DCFH-DA for hydrogen peroxide. In relation to H2O2 production, macrophages from group 2 increased the production at 3 and 9 dpi, and granulocytes at 18 dpi. Finally, NO production in group 2 increased significantly in granulocytes at 9 and 18 dpi and in macrophages at 18 dpi. However, group 3 increased NO production at 3 dpi in macrophages and at 3, 9 and 18 dpi in granulocytes.

La fasciolosis causada por Fasciola hepatica es una enfermedad parasitaria de gran repercusión sanitaria y económica en rumiantes, principalmente en zonas de clima templado. Este parásito ha desarrollado mecanismos capaces de modular o suprimir la respuesta inmunitaria del hospedador, haciéndola inefectiva y permitiendo la instauración crónica del parásito. La investigación de los mecanismos de inmunomodulación de F. hepatica resulta crucial para poder diseñar una vacuna eficaz que pueda solventar el problema de la instauración de resistencias frente a los antihelmínticos tradicionalmente utilizados en el control de esta enfermedad. Se han llevado a cabo numerosos estudios para determinar los mecanismos de respuesta inmunitaria y acción del parásito en las fases crónicas de la enfermedad. Sin embargo, los estudios en las fases tempranas, cuando el parásito atraviesa el intestino y migra hacia el hígado a través del compartimento peritoneal son escasos y casi todos en el modelo murino. El principal objetivo de la presente Tesis Doctoral es estudiar la respuesta inmunitaria en el compartimento peritoneal y en el hígado en las fases tempranas de infecciones experimentales con F. hepatica en la oveja. Para la consecución de este objetivo, se llevaron a cabo dos experimentos (experimento 1 y experimento 2). En cada experimento se utilizaron 25 ovejas de 8 meses de edad de raza Merina las cuales fueron divididas en 5 grupos (n=5), cuatro de los cinco grupos se infectaron oralmente con una dosis de 150 metacercarias de F. hepatica. Estos grupos fueron eutanasiados a los 1, 3, 9 y 18 días post-infección (dpi). El quinto grupo se utilizó como grupo control no infectado y se sacrificó al final del experimento. Durante la necropsia, se realizaron lavados peritoneales de los animales inmediatamente después de los sacrificios para la recogida del líquido peritoneal y, posteriormente, se tomaron muestras de hígado. En los experimentos 1 y 2, el líquido peritoneal se utilizó para realizar el contaje absoluto y diferencial de los leucocitos peritoneales. Los resultados revelaron un reclutamiento activo de leucocitos hacia la cavidad peritoneal de la oveja en los animales infectados a partir de los 9 dpi, principalmente representado por eosinófilos. Los frotis de células peritoneales se sometieron a la técnica de inmunocitoquímica para determinar la expresión de los marcadores celulares: CD68, CD14, CD206, iNOS, CD83 y MHC-II, los cuales están presentes en macrófagos y en células dendríticas. El aumento significativo en la expresión de CD206 y escasa variación en la expresión de iNOS en los macrófagos peritoneales en ambos experimentos sugieren que existe una polarización hacia un fenotipo de activación alternativa o M2 desde el día uno tras la infección. El aumento significativo en la expresión del marcador CD14 desde el 3 dpi en comparación con el grupo no infectado en ambos experimentos, podría estar relacionado con fenómenos tanto de activación fagocítica en los macrófagos como de fibrosis. En el experimento 1, se observó un aumento en la expresión del marcador de células dendríticas maduras CD83 y del marcador de células presentadoras de antígeno MHC-II desde el 1 dpi. Sin embargo, este hecho no ocurrió de una manera tan obvia en el experimento 2, debido a la elevada variabilidad entre animales. El estudio de la expresión de citoquinas del líquido peritoneal mediante qRT-PCR de ovejas infectadas (18 dpi) y no infectadas del experimento 1, determinó la presencia elevada de las citoquinas IL-10, IL- 12, IL-13, IL-23 y TGF-β en ovejas a los 18 dpi, aunque sin diferencias significativas en comparación con los resultados del grupo control no infectado, indicando que la respuesta inmunitaria en este compartimento no ha sido todavía estimulada hacia una de tipo Th2, asociada con la enfermedad crónica. Con el fin de evaluar la presencia de posibles biomarcadores en la infección temprana con F. hepatica, se realizó un estudio de proteómica con muestras del líquido peritoneal y de inmunohistoquímica con muestras de hígado de los animales infectados y sacrificados a los 18 dpi y de los animales control no infectados del experimento 1. En el estudio proteómico del líquido peritoneal se identificaron proteínas relacionadas con la infección, incluyéndose diversas proteínas estructurales derivadas de la matriz extracelular hepática, relacionadas con el tejido conectivo y el epitelio, y proteínas relacionadas con el sistema inmunitario. Cabe destacar el marcado aumento de la proteína periostina en el líquido peritoneal y en el citoplasma de los hepatocitos localizados alrededor de los focos necróticos de animales infectados a los 18 dpi. Se ha relacionado que la periostina podría ser un biomarcador de respuestas inflamatorias de tipo Th2 en las que están involucradas los eosinófilos. El origen de la presencia de esta proteína en el líquido peritoneal podría ser el propio tejido hepático dañado por el parásito o los eosinófilos peritoneales, estando esta proteína involucrada en procesos de fibrosis. La molécula de adhesión celular vascular-1 (VCAM-1) también fue identificada mediante proteómica, estando presente de manera abundante en el líquido peritoneal de ovejas infectadas (18 dpi) y, además, se observó una marcada expresión en el tejido hepático. Esta proteína se asocia con procesos crónicos y podría estar involucrada, junto con la periostina, en la mediación del reclutamiento leucocitario que tiene lugar en la cavidad peritoneal, estando también relacionadas con desórdenes inflamatorios caracterizados por una eosinofilia marcada. Fascioliasis is a parasitic disease caused by Fasciola hepatica with important sanitary and economic repercussion on ruminants in temperate zones. This parasite has developed mechanisms that are able to suppress the host immune response, thus allowing the establishment of the parasite and resulting in chronic disease. Research based on the understanding of F. hepatica immunomodulatory mechanisms is crucial for the designing of an effective vaccine to solve the issue of the emerging resistance to the traditionally use of antihelmintic drugs. Numerous studies have been carried out to determine the modulatory effects of the parasite in the chronic phase of the disease. However, studies in the early stages of the infection are scarce and mostly focused on murine models. The principal aim of this Thesis is to study the immune response to F. hepatica infection in the early stages of infection within the peritoneal compartment and liver in sheep. Two experiments were carried out, namely experiment 1 and experiment 2. In each experiment, twenty-five 8-month-old Merino-breed sheep were used for each experiment and were allocated into five groups (n = 5). Four of the five groups were orally infected with a dose of 150 metacercariae of F. hepatica and euthanized at 1, 3, 9 and 18 days postinfection (dpi). The fifth additional group was used as uninfected control. During the necropsy, peritoneal lavages were performed and liver samples were taken. In experiments 1 and 2, absolute and differential number of peritoneal leucocytes were obtained. The absolute number of leucocytes increased from 9 dpi onwards in both experiments compared to the uninfected control group, being these leucocytes mainly composed by eosinophils. These results suggest that there is an active recruitment of leucocytes into the peritoneal cavity at these eary stages of infection. The peritoneal cells were fixed in smears and subjected to the immunocytochemistry technique to assess the following cellular markers: CD68, CD14, CD206, iNOS, CD83 and MHC-II. Macrophages and dendritic cells were considered for the immunocytochemical assessment. Peritoneal macrophages showed a marked increase in CD206 expression since one dpi onwards in both experiments respect to the uninfected control group, while mild change in iNOS expression was found along the infection in both experiments. These results suggest that a polarization towards an alternative phenotype (M2) was taking place in peritoneal macrophages from the first dpi onwards. The expression of CD14 increased since 3 dpi onwards in macrophages from both experiments comparing with the uninfected control group, which may be due to an increase in the macrophage activity related to tissue repair and phagocytosis. In experiment 1, there was an increase in the expression of the mature dendritic cell marker CD83 and the antigen-presenting cell marker MHC-II since one dpi onwards compared to the uninfected control group. Nevertheless, this fact was not found in experiment 2, perhaps due to the high individual variability found between sheep of the same group. In experiment 1, a study of the peritoneal fluid of infected (18 dpi) and uninfected sheep was carried out using the qRT-PCR technique. Cytokines IL-10, IL-12, IL-13, IL-23 and TGF-β gene expression showed a tendency to be enhanced with respect to the uninfected control group. Nevertheless, no statistical differences were found, suggesting that the immune response has not yet been skewed towards a Th2 type, associated with chronic disease. With the aim of evaluating the presence of possible biomarkers in the early infection with F. hepatica, a proteomic study using peritoneal fluid together with an immunohistochemical study with liver samples from infected (18 dpi) and non-infected animals from experiment 1 was conducted. Proteomic analysis of the peritoneal fluid identified infectionrelated proteins, including several structural proteins derived form the liver extracellular matrix, connective tissue and epithelium, and immune systemrelated proteins. A marked increase in the amount of periostin protein in the peritoneal fluid and in the cytoplasm of the hepatocytes located around the necrotic foci of infected animals at 18 dpi was observed. It has been pointed out that periosin could be a biomarker for Th2 type immune reponses in which eosinophils are involved. The vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) was also identified by proteomics, with marked increase at 18 dpi respect to the uninfected control group and strong expression within the liver tissue. This protein has been associated with chronic processes and could be involved, along with periostin, in the mediation of leucocyte recruitment that takes place in the peritoneal cavity of infected animals, being also present in inflammatory disorders characterized by marked eosinophilia.

Desde mediados del siglo XX ha ido aumentando la preocupación acerca de los efectos de los llamados disruptores endocrinos, efectos que se pueden apreciar en todas las especies animales, incluso en el hombre. Hacemos un recordatorio de características de estos disruptores endocrinos, su naturaleza y sus efectos sobre el medio ambiente, así mismo damos una visión de las actuaciones al respecto de la industria química. Para este estudio se utilizaron 120 individuos de de pez zebrafish (Danio rerio), machos y hembras al 50%, distribuidos en 4 lotes más un lote control. Se suministro, mezclado con la comida, durante 21 días a los 4 lotes 10, 40, 100 y 270 ng de 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD)/g de alimento al día, respectivamente. Se valoraron las variaciones de VTG (vitelogenina hepática) en los peces, así mismo se fue valorando la concentración de TCDD en el pez en cada lote. Se realizaron estudios estructurales y ultraestructurales de las branquias con microscopio óptico y con microscopio electrónico, tanto de transmisión como de barrido. El objetivo general de nuestro trabajo es tratar de conocer los patrones morfológicos microscópicos de las branquias en zebrafish (Danio rerio) y las alteraciones producidas por disruptores endocrinos, en nuestro caso el 2,3,7,8-tetracloro-dibenzo-p-dioxina (TCDD). El primer objetivo del trabajo que nos planteamos, usando zebrafish como modelo biológico, es conocer la evolución de las alteraciones producidas por los disruptores endocrinos, en nuestro estudio usando TCDD en la dieta, sobre la lamela secundaria o lamela respiratoria de las branquias, concretándose en el análisis de las modificaciones que se presentan en las branquias respiratorias, en cada uno de sus componentes como son: el revestimiento epitelial; las características de los capilares respiratorios y el papel desempeñado por las células del cloro. Del mismo modo, pretendemos conocer la afectación de la branquia sensitiva o no-respiratoria, observando el grado de afectación que puedan presentar las yemas sensitivas de las branquiespinas y la protección que le puedan dar todo el revestimiento mucoso de la zona, analizando las modificaciones que se presentan en las branquias sensitivas, en cada uno de sus componentes: el revestimiento epitelial; las yemas sensitivas y el papel de protección de las células mucosas.

La fasciolosis causada por Fasciola hepatica es una enfermedad económicamente muy importante en rumiantes en climas templados. F. hepatica ha desarrollado una amplia variedad de mecanismos para munomodular o suprimir la respuesta inmune del hospedador haciéndola inefectiva, esto permite la supervivencia del parásito durante años. Esto constituye un serio obstáculo para la creación de vacunas protectoras en rumiantes. El conocimiento de los mecanismos de inmunomodulación llevados a cabo por F. hepatica para evadir la respuesta inmunitaria del hospdador es crucial para mejorar el diseño de vacunas. En infecciones por helmintos, los eosinófilos juegan un importante papel tanto en el desarrollo de la patología como en la defensa del hospedador. La apoptosis de estas células efectoras ha sido descrita como uno de los principales mecanismos de inmunosupresión o evasión durante las infecciones por helmintos. Existen trabajos que sugieren que los productos de excreción y secreción de F. hepatica inducen la apoptosis de los eosinófilos y de macrófagos peritoneales in vitro, así en los infiltrados inflamatorios en ratas in vivo. El empleo de anticuerpos anti-caspasa 3 es un método fácil, reproducible y sencillo para estudiar la presencia de apoptosis. El primer objetivo de este estudio, incluido en el Primer Trabajo fue demostrar la existencia de este fenómeno, como método de evasión de la respuesta inmunitaria del hospedador en ovejas infectadas con F. hepatica, in vivo.En el Segundo Trabajo el objetivo fue el estudio de la apoptosis de los leucocitos peritoneales en ovejas infectadas experimentalmente con F. hepatica durante la fase migratoria peritoneal en el hospedador. Fueron empleados cinco grupos, (n=5). El grupo 1 fue usado como control no infectado (control negativo), mientras que los grupos 2-5 fueron infectados oralmente con 200 mtc y sacrificados a los 1, 3, 9 y 18 dpi, respectivamente. El fenómeno de la apoptosis fue detectado mediante el empleo de tres métodos diferentes: 1) inmunocitoquímica empleando un anticuerpo policlonal anticaspasa- 3 activa; 2) ensayo de citometría de flujo usando Anexina V-FITC/ yoduro de propidio; y 3) microscopía electrónica de transmisión (TEM). El objetivo del Tercer Trabajo de la presente Tesis Doctoral fue evaluar la presencia y distribución de linfocitos T reguladores en el hígado y en los nódulos linfáticos en ovejas y cabras infectadas con F. hepatica durante las fases agudas y crónicas de la infección. Fasciolosis caused by Fasciola hepatica is an economically important disease of ruminants in temperate climates. F. hepatica has developed a variety of mechanisms to modulate or suppress the host response making it ineffective, which allows the parasite to survive in the host for years. The parasite host immune response modulation is a serious obstacle for developing protective vaccines for ruminants. The knowledge of the immunomodulation mechanisms carried out by F. hepatica to avoid the host immune response is a key to improve the vaccines development. In helminth infections, eosinophils play important roles both in developing tissue pathology and in the host effector response. Apoptosis of effector cells such as eosinophils and macrophages may play a role in the host immune evasion/suppression induced by helminth infection. Studies in the rat model have demonstrated that secreted excretory products of F. hepatica (FhESP) are able to induce apoptosis in eosinophils and peritoneal macrophages -in vitro- and in the inflammatory infiltrate - in vivo-, suggesting that apoptosis of effector cells may play a role in the host immune evasion/suppression induced by F. hepatica infection. The use of activated caspasa 3 antibodies is an easy, reliable and sensitive method to study the presence of apoptosis in tissue sections. The aim of this study, included in the First Work of this Thesis was to identify and quantify apoptosis of eosinophils in the hepatic inflammatory infiltrates of sheep challenged with F. hepatica during the migratory and biliary stages of infection. The aim of the Second Work was to evaluate the presence and number of inflammatory peritoneal leucocytes undergoing apoptosis in peritoneal fluid from sheep experimentally infected with F. hepatica during the peritoneal migratory stages in the host. Twenty five- merino sheep were used. They were divided into five groups (n=5): Group 1 was used as an uninfected control group (UC) and groups 2–5 were orally infected with one dose of 200 F. hepatica metacercariae and sheep from these groups were sacrificed by an intravenous injection of thiobarbital at 1, 3, 9, and 18 dpi, respectively. Apoptosis was detected using three different methods: 1) immunocytochemistry (ICC) with a polyclonal antibody anti-active caspase-3; 2) Flow cytometry assay using the Annexin V-FITC/propidium iodide (PI) kit; and 3) transmission electron microscopy (TEM). The aim of the Third Work of this Thesis was to evaluate the presence of Foxp3+ Tregs in liver and hepatic lymph nodes (HLN) from experimentally infected sheep and goats during acute and chronic stages of infection.

El principal objetivo de este trabajo es conocer el inicio y el desarrollo de la docencia de Histología y Anatomía Patológica desde la incorporación de estas disciplinas al plan de estudios de la Escuela Especial de Veterinaria de León en 1912 hasta la transformación de la Escuela Superior de Veterinaria de León en Facultad en 1943. Se relacionan también los profesores y alumnos agregados a la Cátedra de Histología y Anatomía Patológica, así como los textos utilizados, cursos impartidos y emisión de informes anatomopatológicos.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária As neoplasias mamárias estão entre as mais comuns na cadela, sendo conhecidas pela sua heterogeneidade biológica e histomorfológica. Os sarcomas mamários são mais comuns em canídeos do que no Homem, o que permite obter dados oncológicos comparativos potencialmente valiosos. O objetivo deste trabalho foi a caracterização histopatológica e imuno-histoquímica de sarcomas e carcinossarcomas mamários caninos. Foram incluídos nestes estudo 30 sarcomas (15 fibrossarcomas e 15 osteossarcomas) e 15 carcinossarcomas mamários caninos, avaliando-se características clínico-patológicas e imuno-histoquímicas com recurso a diferentes marcadores de diferenciação celular (pan-queratina, vimentina, α-SMA, desmina, calponina, NSE e β-catenina). Adicionalmente, foi possível efetuar um estudo de sobrevivência em 28 cadelas, de forma a serem avaliadas possíveis associações entre as variáveis clinicopatológicas e a sobrevida total e livre de doença. Relativamente aos parâmetros clinicopatológicos, a maioria das neoplasias surgiu em cadelas com média de idades de 11 anos, de raça indeterminada, sendo caracterizadas por grandes dimensões, localizadas nas glândulas mamárias caudais e exibindo a nível histológico um crescimento geralmente de tipo infiltrativo, grau histológico elevado e frequente comportamento invasor. Pela análise estatística dos resultados, relativamente à imunohistoquímica, verificou-se que existem diferenças estatisticamente significativas para a imunomarcação com pan-queratina e vimentina entre os sarcomas e os carcinossarcomas e com NSE entre os osteossarcomas e os fibrossarcomas/carcinossarcomas, o que estará associado à sua histogénese. Relativamente à influência de parâmetros clínico-patológicos na sobrevida total e sobrevida livre de doença apenas se encontraram diferenças estatisticamente significativas para a invasão vascular, apresentando as cadelas com neoplasias invasivas piores tempos de sobrevivência. Mammary neoplasias are among the most common neoplasia in dogs and are known for their biological and histomorphological heterogeneity. Although uncommon, mammary sarcomas are more frequent in dogs than in humans, which may allow us to obtain potentially valuable comparative oncological data. The objective of this work was the histopathological and immunohistochemical characterization of canine mammary sarcomas and carcinosarcomas. Thirty canine mammary sarcomas (15 fibrosarcomas and 15 osteosarcomas) and 15 carcinosarcomas were enrolled in the present study, with clinicopathological and immunohistochemical assessments using different types of cellular differentiation markers (pan-keratin, vimentin, α-SMA, desmin, calponin, NSE and β-catenin). In addition, it was possible to conduct a survival study on 28 dogs in order to evaluate possible associations between the clinicopathological variables and overall and disease-free survival. With regard to clinicopathological parameters, most neoplasias occurred in dogs with an average age of 11 years, of undetermined breed, large in size, located in the rear mammary glands, and exhibiting, in histological terms, a generally infiltrative type of growth, high histological grade and frequent invasive behaviour. Following statistical analyses of results, with regard to immunohistochemistry, there were statistically significant differences for immunoexpression with pan-keratin and vimentin between sarcomas and carcinosarcomas and with NSE among the osteosarcomas and the fibrosarcomas/carcinosarcomas, which is likely due to histogenesis. Regarding the influence of clinicopathological parameters on overall survival and disease-free survival, statistically significant differences only existed for vascular invasion, with the dogs harbouring invasive neoplasias showing lower survival rates.

Presentado a la XXVIII Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria celebrada en Córdoba del 8 al 10 de junio de 2016.

Trabajo presentado a la XXVIII Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria celebrada en Córdoba del 8 al 10 de junio de 2016.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária O exame post mortem é uma ferramenta importante no estudo da vida selvagem. O objetivo do nosso trabalho foi conhecer as espécies de animais que morrem em Centros de Recuperação de Animais Selvagens e Zoológicos e de contribuir para a compreensão das causas de morte dos mesmos. Assim, efetuamos necropsia a todos os animais que morreram num centro de recuperação e num zoológico, durante 5 meses. Durante o período do estudo, analisamos 229 animais: 58.1% pertenciam à Classe das Aves, 23.58% à Classe Mammalia, 14.41% à Classe Reptilia, 2.62% Classe Amphibia, 0.44% Classe Actinopterygii e 0.44% Classe Arachnida. Na totalidade da amostra, as causas de admissão foram: pertencente à coleção zoológica (n=18), doação (n=17), encontrado cria (n=5), encontrado debilitado (n=65), entrada/encontrado morto (n=16), encontrado com traumatismos (n=101), crias da coleção (n=6) e peça de uma montaria (n=1). Noventa e quatro animais foram eutanasiados. As causas de morbilidade/mortalidade foram traumáticas em metade dos animais: afogamento (n=1), colisão com veículos automóveis (n=5), colisão com edifícios (n=6), eletrocussão (n=2), predação (n=17), arma de fogo (n=2) e traumatismo de origem desconhecido em 81 animais. Nos restantes animais, a morte foi atribuída a doenças degenerativas (n=3), infeciosas/parasitárias (n=32), neoplasias (n=1), nutricionais (n=39, das quais 5 órfãos) e tóxicas (n=3), sendo que em 36 animais o quadro lesional foi inespecífico e a causa considerada desconhecida. Na Classe das Aves, os 134 animais analisados pertenciam a 17 ordens, principalmente às ordens Accipitriformes (n=32) e Charadriiformes (n=33). Trinta por cento eram fêmeas, e mais de metade das aves eram adultas (n=68) e apresentavam na sua maioria uma condição corporal magra (75.19%). Os animais foram admitidos aos centros/zoo por apresentarem traumatismos (n=68), 54 foram encontrados debilitados, 7 deram entrada/encontrados mortos, 4 pertenciam à coleção e 1 deu entrada como cria. Cinquenta e três animais foram eutanasiados. As principais lesões foram observadas no aparelho urinário (n=105) e nos sistemas músculo-esquelético e tegumentar (n=72). A principal causa de morbilidade/mortalidade foi o traumatismo de origem desconhecida. Na Classe Mammalia foram examinados 54 animais, pertencentes a 7 ordens diferentes, sendo as principais a Ordem Erinaceomorpha com 12 animais e a Ordem Chiroptera com 18. Destes, 46.29% eram fêmeas, a maioria dos animais era adulta (70.37%); 12.96% juvenis e 16.66% crias. Metade dos animais apresentava uma condição corporal magra. Nas causas de admissão, 23 animais foram encontrados com traumatismo, 11 debilitados, 6 deram entrada/encontrados mortos, 5 pertenciam à coleção zoológica, 4 eram crias da coleção e 1 uma peça de montaria. Metade dos animais foram eutanasiados. As principais lesões foram observadas no aparelho respiratório (n=30), e nos sistemas músculo-esquelético e tegumento (n=22). As principais causas de morbilidade/mortalidade foram a nutricional e a predação. Na Classe Reptilia foram examinados 33 animais, que foram categorizadas em 4 ordens/subordens, principalmente da Ordem Testudinata (n=17) e Subordem Ophidia (n=8). Destes, metade eram fêmeas (n=11), 60.61% eram adultos e a maioria tinha uma condição corporal magra. Como causas de admissão, 16 animais foram doados ao parque, 7 pertenciam à coleção zoológica, 6 foram encontrados com traumas, 2 foram encontrados/entraram já mortos e 2 eram crias da coleção. Catorze animais foram eutanasiados. As principais lesões foram observadas no sistema músculo-esquelético e tegumento (n=24) e aparelho urinário (n=17). A principal causa de morbilidade/mortalidade foi a nutricional. Apesar da informação recolhida ir de encontro com o que tem sido realizado pelos mais variados autores um pouco por todo o mundo, ainda é escassa a bibliografia, principalmente em Portugal. Os conhecimentos adquiridos no exame post mortem de animais selvagens, preferencialmente, complementados com outros exames adicionais, poderão ser uma mais-valia na preservação da vida selvagem. The post-mortem examination is an important tool in the study of wildlife. The aim of our study was to know the species of animals that die in Wildlife Recovery Centers and Zoos and contribute to the understanding of the causes of death of the same. Thus, we performed necropsies of all the animals that died in a recovery center and a zoo for 5 months. During the study, we analyzed 229 animals: 58.1% belonged to the class of Birds, 23.58% to the Class Mammalia, 14.41% to Class Reptilia, 2.62% Class Amphibia, 0.44% to Class Actinopterygii% and 0.44% to Class Arachnida. In the entire sample, the causes of admission were: belonging to the zoological collection (n = 18), donation (n = 17) orphans (n = 5), found debilitated (n = 65), entry / found dead (n = 16), found with trauma (n = 101), cubs from the collection (n = 6) and game hunt (n=1). Ninety-four animals were euthanized. The causes of morbidity / mortality were traumatic in half of the animals: drowning (n = 1), motor vehicle collision (n = 5), collision with buildings (n = 6), electrocution (n = 2), predation (n = 17), gunshot (n = 2) and unknown trauma in 81 animals. In other animals, the death was attributed to the following type of diseases: degenerative (n = 3), infectious / parasitic (n = 32), neoplasms (n = 1), nutritional (n = 39, including 5 orphans) and toxic (n = 3), which is in 36 animals the lesional picture was unspecific and cause considered unknown. In the class of Birds, 134 animals analyzed belonged to 17 orders, mainly to orders Accipitriformes (n = 32) and Charadriiformes (n = 33). Thirty percent were female, and more than half of the birds were adults (n = 68) and had mostly a weak body condition (75.19%). The animals were admitted to the centers / Zoo for presenting trauma (n = 68), 54 were found debilitated, 7 were received / found dead, 4 belonged to the collection and one was admitted as orphan. Fifty-three animals were euthanized. The main lesions were observed in the urinary tract (n = 105) and musculoskeletal system and skin (n = 72). The main causes of morbidity / mortality was traumatism of unknown origin. In Class Mammalia 54 animals were examined, belonging to 7 different orders, the main ones being Erinaceomorpha order (12 animals) and in Chiroptera order (18). Of these, 46.29% were female, most of the animals were adult (70.37%); 12.96% and 16.66% juveniles. Half of the animals had a weak body condition. The causes of admission were: 23 animals were found with trauma, 11 debilitated, 6 were received / found dead, 5 belonged to the zoological collection, 4 were offspring of the collection and 1 game hunt. Half of the animals were euthanized. The main lesions were observed in the respiratory tract (n = 30), and musculoskeletal systems and tegument (n = 22). The main causes of morbidity / mortality were nutritional diseases and predation. In Class Reptilia 33 animals were examined, which were categorized into 4 orders / suborders, especially the Order Testudinata (n = 17) and suborder Ophidia (n = 8). Of these, half were female (n = 11), 60.61% were adults and most had a weak body condition. The causes of admission were: 16 animals were donated to the park, 7 belonged to the zoological collection, 6 were found with trauma, 2 were found / entered dead and two were young collection. Fourteen animals were euthanized. The main lesions were observed in the musculoskeletal system and tegument (n = 24) and urinary tract (n = 17). The main causes of morbidity / mortality was nutritional diseases. Although our data were according with other authors all over the world, the studies are still scarce, especially in Portugal. The knowledge obtained from post-mortem examination of wild animals, preferably supplemented with additional tests may be important in wildlife preservation.

El Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS, del inglés Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) es una enfermedad vírica caracterizada por inducir una respuesta inmune errática en el hospedador y es considerada como una de las enfermedades más importantes en la industria del porcino debido a las importantes pérdidas económicas que provoca. A pesar de que varios estudios se han realizado con el objetivo de elucidar la respuesta inmune provocada frente al virus del PRRS (PRRSV, del inglés PRRS virus) todavía quedan muchos aspectos por entender. El PRRSV se replica, principalmente, en los macrófagos alveolares porcinos (MAPs) y, en menor medida, en macrófagos de otros órganos y en las células dendríticas, describiéndose la replicación del virus tanto en pulmón como en los órganos linfoides de cerdos infectados con el PRRSV, y sugiriéndose que estos órganos tendrían un importante papel en la patogenia de esta enfermedad. Sin embargo, la mayoría de los estudios centrados en analizar la respuesta inmune provocada tras una infección con el PRRSV se han realizado principalmente sobre muestras de suero y de pulmón. El principal objetivo de esta tesis fue evaluar el papel de la expresión de citoquinas y los fenómenos de apoptosis en los órganos linfoides en la patogenia del PRRS. Para llevar a cabo este estudio, se utilizaron veintiocho lechones, de cinco semanas de edad, que fueron inoculados con el aislado 2982 del PRRSV, y sacrificados a 3, 7, 10, 14, 17, 21 y 24 días post-inoculación (dpi). Cuatro lechones, de las mismas características, fueron usados como control, inoculándolos con medio estéril, y sacrificándolos al final del experimento. De todos los animales se tomaron muestras de pulmón, tonsila y nódulos linfáticos que fueron fijadas en formol tamponado al 10 %, en solución de sales de Zinc, y en solución de Bouin, para el estudio histopatológico e inmunohistoquímico. En nuestro estudio evaluamos la expresión de IL-1¯, IL-6 y TNF-¯ en la tonsila, y en los nódulos linfáticos retrofaríngeo y mediastínico de cerdos infectados con el PRRSV, encontrando una expresión diferente de cada citoquina en función del órgano analizado, lo que muestra un comportamiento diferente del PRRSV en los órganos linfoides. Este hallazgo podría estar relacionado con la falta de una respuesta inmune eficaz del hospedador frente al PRRSV. Así, mientras que en la tonsila la expresión de estas citoquinas proinflamatorias fue muy pobre, en el nódulo linfático mediastínico se observó un incremento de la expresión de TNF-¯ e IL-1¯, siendo la IL-6 la citoquina más expresada en el nódulo linfático retrofaríngeo El antígeno del PRRSV se observó fundamentalmente en la médula o paracorteza de los órganos linfoides analizados, encontrando tanto en la tonsila como en el nódulo linfático retrofaríngeo una expresión bimodal, con un primer pico a los 3 dpi y un segundo a los 14 dpi, mientras que en el nódulo linfático mediastínico observamos un pico de expresión al comienzo del experimento disminuyendo posteriormente hasta el final del mismo. Las células inmunomarcadas tanto para el PRRSV como para las citoquinas proinflamatorias fueron principalmente macrófagos...

Mites collected from the auditory canal of Cebus apella (capuchin monkey), family Cebidae, were identified as Fonsecalges johnjadini (Psoroptidae, Cebalginae). It is the first record of this parasite from this monkey. This paper emphasizes the importance of clinical and anatomopathological examinations for parasitic diagnosis in wild animals.

Comunicación presentada en ticEDUCA2010, I Encontro Internacional TIC e Educação, Lisboa, 19-20 noviembre 2010. El presente trabajo resume la experiencia práctica de sus autores en la asimilación de las Tecnologías de la Información y las Comunicaciones dentro de la enseñanza de la Anatomía Patológica Veterinaria, la cual se concreta en el diseño y aplicación de entrenadores digitales para contribuir al desarrollo de las habilidades intelectuales específicas necesarias para arribar a un diagnóstico anatomopatológico. Los resultados alcanzados en el trabajo experimental con los estudiantes en correspondencia con las acciones de intervención realizadas permitieron comprobar que se alcanzaron diferencias significativas estadísticamente o los máximos resultados posibles, lo que reconoce el papel de los entrenadores digitales desde esta óptica comparativa de carácter global, los cuales, por su concepción, el grado de desarrollo alcanzado y por las posibilidades de desarrollo que abren, constituyen resultados prácticos para el desarrollo presente y futuro de la enseñanza de la Anatomía Patológica Veterinaria en Cuba, así como en otros contextos internacionales. This article summarizes the practical experience of its authors in the assimilation of the Information and Communications Technologies inside the teaching of the Veterinary Pathological Anatomy, which is summed up in the design and digital trainers' application to contribute to the development of the necessary specific intellectual abilities to arrive to anatomopatological diagnosis. The results reached in the experimental work with the students in correspondence with the carried out intervention actions allowed to check that significant differences were reached statistically or the maxima possible results, what recognizes the paper of the digital trainers from this comparative optics of global character, those which, for their conception, the degree of reached development and for the development possibilities that open up, they constitute practical results for the present development and future of the teaching of the Veterinary Pathological Anatomy in Cuba, as well as in other international contexts.

Las tonsilas, al igual que otros tejidos linfoides asociados a mucosas como las placas de Peyer del intestino delgado, debido a su localización, se presentan como la puerta de entrada de numerosos agentes patógenos, y por sus características estructurales e inmunológicas, protegen los tractos respiratorios y digestivos de los antígenos que son constantemente inhalados e ingeridos. En los bovinos, distintos agentes patógenos replican en las tonsilas en las primeras fases de la infección, destacando virus como el de la diarrea vírica bovina (vDVB). En rumiantes jóvenes, las placas de Peyer ileales son responsables de la generación de la mayoría de células B, habiéndose especulando con su posible papel como órgano linfoide primario ya que, al igual que ocurre con el timo, también involuciona a edades jóvenes. El tejido linfoide asociado a mucosas se presenta como el principal lugar de replicación del vDVB, siendo además la localización en la que se producen las lesiones más importantes en el transcurso de esta enfermedad, dando lugar a una intensa depleción linfoide que se traduce, a nivel sistémico, en una marcada leucopenia. Por este motivo y con el fi n de profundizar en los mecanismos patogénicos del vDVB, es necesario estudiar y comprender en profundidad tanto la estructura como las funciones inmunológicas de estos tejidos linfoides.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias Na espécie canina, os tumores mamários espontâneos representam a segunda neoplasia mais comum, sendo apenas ultrapassados pelos tumores de pele. Considerando os indivíduos do sexo feminino, os tumores de mama constituem a neoplasia espontânea mais frequente, representando os tumores malignos cerca de 50% dos casos observados. Estes factos suscitam um interesse crescente na pesquisa de factores de prognóstico credíveis na área dos tumores mamários caninos e à semelhança do que ocorre em Medicina Humana, o patologista veterinário pode assumir um papel fundamental ao fornecer não apenas um diagnóstico histológico, como também informação adicional acerca do prognóstico de um determinado indivíduo. Actualmente, e apesar de vários estudos de prognóstico nesta área, os resultados não são consensuais pelo que se torna necessária a validação dos parâmetros clínico-patológicos considerados clássicos e a pesquisa de novos factores com valor prognóstico. Assim, tendo como objectivo central a pesquisa de factores com possível impacto no prognóstico dos tumores de mama de cadela, procedemos ao estudo de diversas características clínico-patológicas e moleculares, que se encontram discriminadas ao longo deste trabalho. A presente dissertação é constituída por sete capítulos: um capítulo inicial de revisão bibliográfica (Capítulo I); os Capítulos II a VI, que correspondem aos artigos científicos resultantes da investigação desenvolvida; e o Capítulo VII, onde se promove uma discussão geral do trabalho efectuado. O Capítulo I (Introdução Geral) consiste numa revisão bibliográfica actualizada acerca dos tumores de mama de cadela, em especial no que diz respeito a estudos de prognóstico. É ainda dado ênfase particular a alguns marcadores moleculares utilizados ao longo do nosso trabalho, tendo em consideração estudos efectuados em tumores mamários caninos e humanos. No fim deste capítulo, são enumerados os objectivos da presente dissertação. Ao longo do Capítulo II (Tumores mamários caninos: parâmetros clínico-patológicos como factores preditivos da sobrevivência total e sobrevivência livre de doença –análise uni- e multivariada) procedeu-se à caracterização clínica e histopatológica de uma série de 156 tumores de mama de cadela (46 benignos e 110 malignos). Com o objectivo de investigar o valor prognóstico de variáveis clínico-patológicas, foi efectuado um estudo de sobrevivência após exérese cirúrgica em 69 animais, durante um período mínimo de 12 meses. A análise univariada revelou que o tamanho do tumor, o tipo histológico, o modo de crescimento, o grau histológico, a invasão estromal e linfo-vascular, a presença de metástases ganglionares, e os índices de proliferação se encontravam significativamente associados com as sobrevivências total e livre de doença. A presença de ulceração cutânea encontrou-se associada apenas com a sobrevida total. A análise multivariada revelou a presença de metástases ganglionares como o único factor de prognóstico independente. No Capítulo III (Expressão da caderina E, caderina P e β-catenina em tumores mamários caninos malignos em relação a parâmetros clínico-patológicos, proliferação e sobrevivência) efectuou-se a avaliação imunohistoquímica de moléculas de adesão numa série de 65 tumores mamários malignos de cadela. Tendo em conta vários estudos que demonstram a função importante da adesão mediada por caderinas durante os processos de desenvolvimento e na manutenção da arquitectura dos tecidos adultos, bem como o seu envolvimento durante a invasão e progressão tumoral, investigámos a expressão das moléculas acima descritas em tumores mamários malignos de cadela e a sua possível associação com parâmetros clínico-patológicos clássicos, índices de proliferação e sobrevivência. Observámos que a redução da expressão da caderina E esteve significativamente associada com o tamanho do tumor, alto grau histológico, invasão, presença de metástases ganglionares e elevado índice mitótico; por outro lado, a redução da expressão da β-catenina encontrou-se significativamente associada com alto grau histológico e invasão. Relativamente à caderina P, a sua expressão encontrou-se significativamente associada apenas com a invasão. No que diz respeito ao estudo de sobrevivência, a redução da caderina E e β-catenina encontrou-se significativamente associada com menor tempo de sobrevivência total e livre de doença. Apesar deste estudo ter sido efectuado com um número reduzido de amostras, observou-se que a expressão alterada do complexo caderina-catenina é um evento comum nestas neoplasias. A realização de novos estudos com maior número de casos irá certamente esclarecer o valor prognóstico destas moléculas no contexto dos tumores mamários caninos. No Capítulo IV (Expressão imunohistoquímica do Receptor para o Factor de Crescimento Epidérmico (EGFR) em tecidos mamários caninos), descreveu-se a avaliação do EGFR através da técnica de imunohistoquímica numa série de 136 tumores mamários caninos (46 benignos e 90 malignos). Avaliou-se ainda a sua expressão na glândula mamária normal e hiperplásica adjacente. Apesar da existência de vários trabalhos em tumores mamários caninos com recurso a métodos imunoenzimáticos para a avaliação do EGFR, não existem ainda estudos de imunohistoquímica, pelo que considerámos importante avaliar a sua expressão em tumores benignos e malignos, nomeadamente a sua localização celular, informação que não é disponibilizada recorrendo às metodologias previamente descritas na literatura. Na glândula mamária canina normal e hiperplásica, a expressão do EGFR foi observada principalmente ao nível das células mioepiteliais. No entanto, detectou-se positividade para este receptor em algumas células epiteliais luminais ductais, assim como no estroma perilobular. Relativamente aos tumores benignos, o EGFR foi observado no componente epitelial e mioepitelial, apresentando as células epiteliais um nível de expressão reduzido, quando comparado com os tumores malignos. De facto, a expressão de EGFR encontrou-se significativamente associada com a malignidade tumoral, tendo sido detectada uma imunoexpressão membranar completa de EGFR em mais de 10% das células neoplásicas em 42.2% de tumores malignos, versus 19.6% tumores benignos. Não se observou qualquer associação entre a expressão neoplásica do EGFR e os parâmetros clínico-patológicos, à excepção da idade e do tamanho do tumor. Apesar da sobre-expressão do EGFR mostrar uma tendência para um pior prognóstico, não foram encontradas associações estatisticamente significativas neste estudo. Acreditamos serem necessários estudos futuros acerca deste receptor, nomeadamente analisando a presença de amplificação do gene EGFR, já que este receptor pode constituir um potencial alvo terapêutico. No Capítulo V (Expressão e valor prognóstico da citoqueratina (CK) 19 em tumores mamários malignos da cadela) procedeu-se à avaliação imunohistoquímica da CK19 numa série de 102 tumores mamários malignos de cadela, analisando-se a possível associação entre o seu padrão de expressão e parâmetros clínico-patológicos, proliferação e tempos de sobrevivência. À luz de estudos recentes em carcinomas humanos que demonstram uma associação entre a redução da expressão de CK luminais e uma maior agressividade biológica, julgámos pertinente investigar o padrão de expressão da CK19 (CK luminal) nos tumores mamários malignos da cadela,nomeadamente o seu potencial valor prognóstico e também a sua possível associação a um fenótipo basal/mioepitelial, para tal utilizando marcadores específicos de diferenciação celular Neste trabalho, observámos que a redução ou ausência da CK19 se encontrou significativamente associada com o tipo histológico, invasão, alto grau histológico e índice Ki-67 elevado. A expressão da CK19 encontrou-se significativamente associada com a presença de receptores de estrogénio (ER), enquanto a sua redução se revelou associada com a presença de marcadores basais/mioepiteliais. Relativamente ao estudo de sobrevivência, a redução ou ausência da expressão deste marcador luminal provou estar associada a menores tempos de sobrevivência; no entanto, a CK19 não foi considerada como factor de prognóstico independente em análise multivariada. Apesar de, neste estudo, a ausência ou redução da expressão da CK19 se encontrar associada a um fenótipo tumoral mais agressivo, o significado biológico deste achado relativamente à progressão neoplásica permanece por esclarecer. O Capítulo VI (Identificação de fenótipos moleculares em carcinomas mamários caninos com implicação clínica: aplicação de uma classificação humana) reflecte a tentativa de aplicação de uma classificação recentemente descrita para os carcinomas mamários humanos a uma série de 102 carcinomas mamários caninos. Esta classificação teve como base estudos de expressão genética e foi posteriormente comprovada através da técnica de imunohistoquímica, distinguindo diferentes fenótipos moleculares de cancro de mama humano. Recorrendo a marcadores válidos em Medicina Humana para a sua identificação (ER, HER-2, CK5, p63 and caderina P), classificámos os carcinomas mamários caninos em 4 subtipos principais: luminal A (ER+, HER-2-), luminal B (ER+, HER-2+), basal (ER-, HER-2- e um marcador basal positivo) e HER-2 (ER-, HER-2+). À semelhança da mulher, os tumores classificados como luminal A apresentaram baixo grau histológico e menores índices de proliferação, enquanto os carcinomas “basais” se caracterizaram geralmente por alto grau histológico e elevados índices de proliferação. Quanto à sobrevivência, também nos carcinomas de mama de cadela observámos uma associação entre o fenótipo basal e tempos de sobrevivência menores. Estes resultados parecem apontar para a existência de fenótipos moleculares semelhantes aos descritos em Medicina Humana, sugerindo o carcinoma de mama da cadela como um potencial modelo natural de estudo para o carcinoma de mama da mulher. No Capítulo VII (Discussão geral e conclusões) procede-se à discussão global do trabalho desenvolvido, evidenciando-se os seus aspectos mais relevantes. In canine species, spontaneous mammary tumours constitute the second most frequent neoplasia, surpassed only by skin tumours. When considering female dogs, mammary tumours represent the most common neoplasia, with malignant tumours accounting for up to 50% of cases. These facts have raised an increasing interest on the research of reliable prognostic factors in canine mammary tumours, and similarly to humans, the veterinary pathologist might assume a fundamental role by providing both histological diagnosis as well as additional information regarding the prognosis of a particular animal. At present, and despite several prognostic studies in this area, results are not consensual, which is mandatory for the validation of classical clinicopathological parameters and the search of novel prognostic factors. Therefore, the central goal of our thesis was the research of clinicopathological and molecular factors with potential impact on the prognosis of canine mammary tumours. The present thesis is composed by seven chapters: an initial chapter (Chapter I) corresponding to the state of the art; Chapters II-VI, which correspond to scientific articles resulting from our investigation; and Chapter VII, which promotes a global and final discussion of the results. Chapter I (General Introduction) is a review of the most recent literature concerning canine mammary tumours, especially with regard to prognostic studies. A particular emphasis is given to several molecular cell markers, in view of both canine and human scientific literature. At the end of this chapter, we have delineated the main goals of the present thesis. In Chapter II (Canine mammary gland tumours: clinical and pathological parameters as predictors of overall and disease-free survival - a univariate and multivariate analysis), we have performed a clinical and histopathological characterization of a hundred and fifty six canine mammary tumour specimens (46 benign and 110 malignant). In order to investigate the prognostic value of clinical and pathological variables, a follow-up study was performed in 69 female dogs for a minimum period of 12 months after surgical procedure. Univariate analysis showed that tumour size, histological type, tumour growth, differentiation grade, stromal and lymphovascular invasion, lymph node status, mitotic and Ki-67 labelling indices were significantly associated with overall and disease-free survival. Skin ulceration was only associated with poorer overall survival rates. Cox regression multivariate analysis revealed lymph node status as the only independent prognostic factor. Chapter III (Expression of E-cadherin, P-cadherin and β-catenin in canine malignant mammary tumours in relation to clinicopathological parameters, proliferation and survival) describes the immunohistochemical evaluation of several adhesion molecules on a series of 65 canine malignant mammary tumours. Given the critical role assigned to cadherin-mediated cell adhesion during embryogenesis and in the maintenance of normal adult tissue architecture, as well as its putative involvement in tumour cell invasion and progression, we sought to investigate their expression in canine malignant mammary tumours and their association with clinicopathological variables, proliferation and survival. Reduction in E-cadherin expression was significantly associated with increased tumour size, high histological and invasion grades, lymph node metastasis and high mitotic index, whereas reduced β-catenin expression was associated with high histological and invasion grades. P-cadherin expression was only associated with invasion. In 39 cases for which follow-up data was available, reduced E-cadherin and β-catenin expression was significantly associated with shorter overall survival and disease-free survival. Although this study has been performed with a relatively small number of cases, we have observed that an abnormal expression of adhesion molecules is a common phenomenon in canine mammary malignant tumours and, therefore, may play a central role in tumour progression. Further studies with a larger series will certainly highlight the prognostic value of these molecules in the context of canine mammary tumours. In Chapter IV (Immunohistochemical expression of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) in canine mammary tissues), an evaluation of EGFR immunohistochemical expression was performed in a series of 136 canine mammary tumours (46 benign and 90 malignant) and representative areas of adjacent normal and hyperplastic mammary tissue. Despite the availability of several biochemical studies of EGFR in canine mammary tumours, there are still no immunohistochemical studies concerning its expression, which directed us to its evaluation both in benign and malignant tumours. Immunohistochemistry has the advantage of disclosing the precise cellular location of a particular protein, which is not possible by using immunoenzymatic methodologies. In normal and hyperplastic canine mammary glands, EGFR expression was consistently observed in myoepithelial cells, with luminal cells usually negative. Perilobular stroma was commonly positive. In benign tumours, EGFR was present in both epithelial cell components, but luminal cells were weakly positive, when compared to malignant tumours. In fact, EGFR overexpression was found in 9 benign (19.6%) and 38 malignant (42.2%) lesions, with EGFR positivity significantly related with malignancy. Besides animal age and tumour size, there were no significant associations between other clinicopathological parameters and EGFR overexpression. On survival analysis, tumours with EGFR overexpression showed a reduced disease-free and overall survival; however, these associations failed to reach statistically significant levels. Further studies are warranted, namely concerning the analysis of EGFR gene amplification, given that EGFR might represent a potential therapeutic target. Chapter V (Expression and prognostic significance of cytokeratin (CK) 19 in canine malignant mammary tumours) describes the immunohistochemical evaluation of CK19 in a series of 102 malignant canine mammary tumours and investigates the possible association between CK19 pattern of expression and clinicopathological parameters, proliferation and survival. This study was based on recent evidence demonstrating a significant association between the reduction of luminal CK (such as CK19) and a more aggressive behaviour of human breast cancer, usually associated with a basal phenotype. Therefore, besides the evaluation of the prognostic potential of this luminal cell marker, we have also investigated its association with a basal/myoepithelial phenotype, by using additional specific cell differentiation markers. Reduced/absent CK19 was significantly associated with histological type, invasiveness, high histological grade and an elevated Ki-67 index. CK19 positive expression was significantly associated with the presence of ER, whereas its reduced immunostaining was associated with basal/myoepithelial cell markers positive expression. Survival analysis demonstrated that down-regulation of this luminal CK is significantly associated with shorter overall and disease-free survival rates; however, CK19 was not an independent prognostic factor in multivariate analysis. In our series, CK19 down regulation was significantly related to an aggressive phenotype; yet, the real implication of this phenomenon is not known, namely during tumour progression. Chapter VI (Identification of molecular phenotypes in canine mammary carcinomas with clinical implications: application of the human classification) illustrates the application of a recently described classification for human breast carcinomas to a series of 102 canine mammary carcinomas. This classification was initially based on gene expression profiling analysis and it was later on reinforced at the protein level, by using immunohistochemistry; both methodologies identified distinct phenotypes of human breast cancer associated with distinct clinical behaviours. Similarly to human studies, by using an immunohistochemistry surrogate panel based on five molecular markers (estrogen receptor, HER-2, cytokeratin 5, p63 and P-cadherin), we were able to classify canine mammary carcinomas into four different subtypes: luminal A (ER+/HER-2-), luminal B (ER+/HER-2+), basal (ER-/HER-2- and a basal marker positive) and HER-2 overexpressing tumours (ER-/HER-2+). Luminal A-type tumours were characterized by lower grade and proliferation rate, whereas basal-type tumours were mostly high grade, high proliferative and positive for CK5, p63 and P-cadherin. In addition, as in humans, basal subtype was significantly associated with shorter disease-free and overall survival rates. Although we consider these findings as preliminary results, which require further validation, this study pointed out to similar phenotypes to the ones described in the human literature. So, canine mammary carcinomas might represent a suitable natural model for the study of human breast carcinomas, in particular to the basal subset, given the putative high percentage of basal carcinomas identified in the dog. The final Chapter (Chapter VII – General discussion and concluding remarks) encloses a global discussion of our investigation, stressing the most relevant and significant findings.

El Virus de la diarrea vírica bovina (vDVB) es un virus ARN clasificado dentro de la familia Flaviviridae junto con otros pestivirus como el virus de la peste porcina clásica y el virus de la enfermedad de la frontera de la oveja. El vDVB se ha dividido tradicionalmente en base a sus diferencias genéticas en 2 genotipos o especies distintas, conocidas como genotipo 1 y 2 habiéndose podido tipificar genéticamente distintos aislados de ambos genotipos. Independientemente del genotipo al que pertenezcan, el virus se clasifica en función del efecto que produce sobre ciertos cultivos de células epiteliales bovinas en 2 biotipos: biotipos citopáticos (CP) y biotipos no citopáticos (NCP). Sin embargo, la importancia de las lesiones en el transcurso de procesos causados por cepas NCP no se correlaciona con su virulencia in vitro. Un aspecto poco estudiado en la DVB, fundamental para el desarrollo y mejora de vacunas, es el referente a la respuesta inmunitaria que se desarrolla tanto a nivel sistémico como local en el tejido linfoide de la mucosa intestinal. Trabajos recientes han puesto de manifiesto la existencia de una translocación de la respuesta inmunitaria Th1/Th2, lo que dará lugar a una respuesta inmune aberrante, en la que la respuesta Th1 protectora estaría inhibida por la Th2. Este hecho favorecería unainadecuada proliferación y transformación de los linfocitos B hacia células plasmática, comprometiendo la activación de una respuesta inmunitaria específica frente al vDVB y la producción de anticuerpos neutralizantes. Esta alteración de la respuesta Th1 protectora, junto a la intensa depleción debida a una masiva apoptosis de linfocitos ,que sufre tanto el tejido linfoide asociado a la mucosa intestinal (tonsilas y placas de Peyer) como distintos órganos linfoides, serían las responsables del estado de inmunosupresión que caracteriza a estos animales y predispone a la aparición de procesos bacterianos secundarios.

La collezione dei 2837 oggetti del Museo di Anatomia Patologica e Teratologia Veterinaria “Alessandrini-Ercolani”, fondato nel 1863 come Museo di Patologia Comparata, ha interesse storico e didattico, e comprende: plastiche in gesso e cera di lesioni organiche in colori e dimensioni originali, preparati a secco di animali con alterazioni teratologiche, una speciale raccolta di artropatie e numerosi disegni di patologie eseguiti dal famoso ceroplasta Cesare Bettini. Le plastiche a colori, uniche nel loro genere, riproducono anche malattie scomparse in Europa. Il volume contiene note sulla storia della collezione e dei fondatori, l’intero catalogo di Ercolani e 336 fotografie di preparazioni e disegni selezionati. The collection of 2837 items housed in the museum of Veterinary Pathology and Teratology “Alessandrini-Ercolani”, established in 1863 as Museum of Comparative Pathology, has an educational and an historical interest, and comprises: plastics in chalk, clay and wax, reproducing organic diseases in original volumes and colours, “dry” preparations of animals with teratological defects, a special exhibit of arthropathies, and large numbers of colour drawings of pathological specimens made by Cesare Bettini, the famous wax modeller of the same specimens. The coloured plastics are rare to the point of being unique and some of them reproduce diseases disappeared in Europe. This volume comprises historical notes on musem collections and founders, the entire Ercolani’s catalogue and 336 photographs of selected pathological anatomy preparations and drawings.

A tuberculose bovina causa prejuízos à pecuária e risco à saúde pública. Este trabalho objetivou associar recursos diagnósticos complementares ao exame post mortem. Foram examinados 57641 animais abatidos entre novembro de 2004 e agosto de 2005 em tres matadouros-frigorificos sob Inspeção Estadual, dos quais 27 (0,05%) foram condenados por apresentarem linfonodos com lesões sugestivas de tuberculose, que foram avaliados histopatológica, bacteriologica e molecularmente. A histopatologia revelou lesões granulomatosas características de tuberculose em 23 (85,2%) das amostras. Entre 24 a 87 dias de cultivo, seis (22,2%) amostras apresentaram isolamento de colonias com morfologia compatível com Mycobacterium bovis. A reação em cadeia da polimerase (PCR) e análise da PCR por enzimas de restrição (PRA) possibilitaram identificar o genero Mycobacterim em todas as seis amostras isoladas, sendo quatro (66,7%) amostras, a espécie Mycobacterium bovis, e uma, a subespécie Mycobacterium paratuberculosis. Em nenhuma das 27 amostras cl?nicas foi determinada a etiologia pela PCR. Os resultados permitem concluir que a tuberculose causada por M. bovis está presente em bovinos de corte do Estado de Mato Grosso. A otimização das técnicas de isolamento e de padronização dos métodos moleculares para estabelecimento de diagnóstico definitivo a partir de amostras clínicas à uma área demandante de pesquisa. Bovine tuberculosis causes losses to the livestock industry and public health hazards. The purpose of this paper was to add complimentary diagnostic tools to post mortem examination. A number of 57641 animals, all slaughtered at three officially inspected packing plants, were examined from November 2004 to August 2005. Out of those carcasses, the 27 (0,05%) that were condemned by presenting lymph node lesions suggestive of tuberculosis were evaluated through pathological, bacteriological and molecular techniques. Granulomatous lesions, compatible with those described for tuberculosis, were present in 23 samples (85.2%). In six samples (22.2%), colonies morphologically compatible with Mycobacterium bovis were observed after the 24 up to the 87 days of bacterial culturing in specific medium. Polimerase chain reaction (PCR) and PCR analysis by restriction enzymes (PRA) allowed Mycobacterium identification in all those six isolated samples. Mycobacterium bovis was the species identified in four samples (66.7%) and Mycobacterium paratuberculosis in another one. In none of the 27 clinical samples etiology was determined by PCR. The results allowed a conclusion that tuberculosis caused by M. bovis is present in the beef cattle population in the Brazilian State of Mato Grosso. Isolation and standardized molecular techniques optimization toward definitive diagnostic procedures in clinical samples are a demanding area of research.