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Thymol and carvacrol are the main compounds found in Lippia mycrophylla essential oil (LM-OE) and have presented some spasmolytic effects. This work was designed to explore a possible vasorelaxant effect of LM-OE and its major monoterpenes constituents on rat pulmonary artery. For that, the organ was in vitro stimulated with phenylephrine (Phe) 3 mM and over the tonic contraction the relaxant effect of LM-OE, carvacrol and thymol was observed in both intact and denuded-endothelium. Moreover, atropine, L-NAME, indomethacin, 2,3-O-isopropylidene adenosine, H-89 and Y-27632 were incubated before the relaxant curve of thymol over Phe-tonic contraction. Furthermore, the effects of thymol on KCl 30 or 80 mM and S-(−)-Bay K8644-induced tonic contractions were evaluated, as well as its inhibitory effect on CaCl2-induced cumulative contractions. LM-OE, carvacrol and thymol presented relaxant effect on pulmonary artery, thymol was the most potent and its relaxant potency in intact-endothelium preparations was reduced by atropine, L-NAME, indomethacin, 2,3-O-isopropylidene adenosine and H-89, despite there was not change on its maximum relaxat effect. Also, the monoterpene relaxed equipotently KCl 30 or 80 mM pre-contracted pulmonary artery, antagonized CaCl2-induced cumulative contractions and relaxed S-(−)-Bay K8644 pre-contracted organ. Ultimately, thymol relaxant potency was not modified by Y-27632. Therefore, thymol acts by endothelium-dependent and independent mechanisms, possibly positively modulating the endothelial cholinergic pathway, prostanoids release and further activation of AC/PKA and also inhibiting Ca2+ influx through CaV. Timol y carvacrol son los principales compuestos que se encuentran en el aceite esencial de Lippia mycrophylla (LM-OE) y tienen actividad espasmolítica. Este trabajo se desarrolló con el fin de explorar un posible efecto vasorrelajante de LM-OE y sus principales constituyentes en la arteria pulmonar de ratas. Para ello, el órgano se estimuló in vitro con fenilefrina (Phe) 3 mM y, en la contracción tónica, se añadieron de forma acumulativa LM-OE, carvacrol y timol, en ausencia o presencia de endotelio. Además, se evaluó el efecto relajante del timol en presencia de atropina, L-NAME, indometacina, 2,3-O-isopropilideno adenosina, H-89 e Y-27632. Además, los efectos del timol sobre las contracciones tónicas inducidas por KCl 30 u 80 mM y S-(-)-Bay K8644, así como su efecto inhibidor sobre las contracciones acumulativas inducidas por CaCl2. LM-OE, carvacrol y timol tuvieron efecto relajante sobre la arteria pulmonar, siendo timol el mas poderoso. Su potencia relajante en preparaciones con endotelio intacto se redujo con atropina, L-NAME, indometacina, 2,3-O-isopropilideno adenosina y H-89, sin alterar su máximo efecto relajante. Además, el monoterpeno relajó la arteria pulmonar precontraída por KCl 30 u 80 mM, antagonizó las contracciones acumulativas inducidas por CaCl2 y relajó el órgano precontraído por S-(-)-Bay K8644. Finalmente, el poder relajante del timol no fue modificado por Y-27632. Por tanto, el timol actúa mediante mecanismos dependientes e independientes del endotelio, posiblemente modulando positivamente la vía endotelial colinérgica, la liberación de prostanoides y la posterior activación de la vía AC/PKA, así como inhibiendo el influjo de Ca2+ por CaV. Timol e carvacrol são os principais compostos encontrados no óleo essencial de Lippia mycrophylla (LM-OE) e apresentam atividade espasmolítica. Este trabalho foi desenvolvido a fim de explorar um possível efeito vasorrelaxante do LM-OE e seus constituintes majoritários sobre artéria pulmonar de ratos. Para tanto, o órgão foi estimulado in vitro com fenilefrina (Phe) 3 mM e, sobre a contração tônica, LM-OE, carvacrol e timol foram adicionados de maneira cumulativa, na ausência ou na presença de endotélio. Além disso, o efeito relaxante do timol foi avaliado na presença de atropina, L-NAME, indometacina, 2,3-O-isopropilideno adenosina, H-89 e Y-27632. Ademais, os efeitos do timol sobre as contrações tônicas induzidas por KCl 30 ou 80 mM e S-(-)-Bay K8644, bem como seu efeito inibitório nas contrações cumulativas induzidas por CaCl2. LM-OE, carvacrol e timol apresentaram efeito relaxante na artéria pulmonar, sendo o timol o mais potente. Sua potência relaxante em preparações com endotélio intacto foi reduzida pela atropina, L-NAME, indometacina, 2,3-O-isopropilideno adenosina e H-89, sem alteração do seu efeito relaxante máximo. Além disso, o monoterpeno relaxou de maneira equipotente a artéria pulmonar pré-contraída por KCl 30 ou 80 mM, antagonizou as contrações cumulativas induzidas por CaCl2 e relaxou o órgão pré-contraído por S-(-)-Bay K8644. Em última análise, a potência relaxante do timol não foi modificada por Y-27632. Portanto, o timol atua por mecanismos dependentes e independentes do endotélio, possivelmente modulando positivamente a via endotelial colinérgica, liberação de prostanoides e posterior ativação da via AC/PKA, bem como inibindo o influxo de Ca2+ pelo CaV.

En este trabajo se caracterizó la adenilil ciclasa TczAC. Se determinó que el gen que codifica para esta enzima se encuentra altamente conservado con los genes de adenilil ciclasas identificados en otros tripanosomátidos, es parte de una familia multigénica y se expresa en todos los estadios del ciclo de vida de T. cruzi. Se determinó que el producto de este gen es una enzima funcional capaz de complementar una cepa de levaduras carente de actividad adenilil ciclasa. Esta enzima es específica para AMPc, presenta una mayor actividad en presencia de Mn+2 que de Mg+2 y es inhibida por Zn+2 y el inhibidor del sitio P, 2'-deoxy-3'AMP. Por otro lado, el Ca+2 estimula la actividad de la misma manera independiente de calmodulina. Utilizando la técnica de doble híbrido en levaduras se demostró que TczAC dimeriza a través de su dominio catalítico y se identificaron 13 clones capaces de interaccionar específicamente con la misma. En particular se analizó la interacción de TczAC con el clon correspondiente a la proteína de flagelo paraflagellar rod. Asimismo, TczAC fire expresada en una cepa mutante de levaduras S. pombe. Los resultados obtenidos con estos experimentos sugieren que este sistema de expresión podría ser de gran utilidad para la búsqueda de inhibidores específicos. Por otra parte, se identificó y caracterizó el gen TczPDE que codifica para la primer fosfodiesterasa de AMPc de T. cruzi. Se determinó que este gen es parte de una familia multigénica y codifica para una proteína que presenta un posible péptido señal, dos dominios GAF de unión a GMPc y un dominio catalítico altamente conservado. La funcionalidad de esta proteína se confirmó por ensayos de complementación en levaduras carentes de actividad fosfodiesterasa. En dichas levaduras TczPDE se encontró asociada a la fracción particulada, mostró una alta afinidad por el AMPc y no fue capaz de hidrolizar GMPc. Por ensayos de Western blot se confirmó la asociación de TczPDE a la membrana de las levaduras y se observó que esta se encuentra fuertemente asociada a la misma. La localización subcelular de TczPDE en T. cruzi se estudió por fraccionamiento subcelular e inmunolocalización. Estos experimentos demostraron que TczPDE se encuentra localizada en la membrana plasmática del parásito y concentrada en el flagelo. In this work we have characterized TczAC adenylyl cyclase. The gene encodes an enzyme which is highly conserved with the adenylyl cyclase genes identified in other trypanosomatids, is part of a multigene family and is expressed in all the stages of T. cruzi life cycle. The product of this gene is a functional enzyme that can complement a yeast strain deficient in adenylyl cyclase activity. The enzyme is specific for cAMP, has a higher activity in the presence of Mn+2 instead of Mg 2+, and is inhibited by Zn+2 and the P-site inhibitor, 2'-deoxy-3 'AMP. On the other hand, Ca+2 stimulates its activity in a calmodulin independent manner. Using the yeast two-hybrid technique it was demonstrated that TczAC dimerizes through its catalytic domains, and 13 clones that interact with this protein were identified. In particular, the interaction of TczAC with the flagellar protein paraflagellar rod was analyzed. Besides, TczAC was expressed in a S. pombe mutant strain. The results obtain in these experiments suggest that this expression system could be useful for the identification of specific inhibitors. Apart from that, the gene TczPDE that codes for the first cAMP phosphodiesterase of T. cruzi was identified and characterized. It was found that this gene is part of a mutligene family and encodes a protein that presents a putative signal peptide, two GAF domains for cGMP binding and a highly conserved catalytic domain. The functionality of this protein was confirmed by complementation assays in yeasts lacking phosphodiesterase activity. In these yeasts TczPDE was found to be associated to the particulate fraction, showed a high affinity for CAMP and was not able to hydrolyze cGMP. By Western blot analysis, the association of TczPDE to the yeast membrane was confirmed, and it was observed that this enzyme is strongly associated to it. The subcellular localization of TczPDE in T. cruzi was studied by subcellular fractionation and immunolocalization. These experiments demonstrated that TczPDE is localized in the plasma membrane of the parasite and concentrated in the flagellum. Fil: D'Angelo, Maximiliano A.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Phytomonas es un género de la familia Trypanosomatidae que parasita plantas. Si bien muchos de sus componentes no provocan daño a sus respectivos huéspedes, otros en cambio, son responsables de afecciones que acarrean pérdidas económicas. Tal es el caso de las palmas aceiteras en paises como Colombia, Venezuela y Guyana, el café en Brasil y algunos reportes de daño en algunos frutos como el tomate, tanto en Brasil como en España (Granada). La especie objeto de este estudio no es patogénica y corresponde a la aislada de Euphorbia characias (planta laticífera). Contiene una adenilil ciclasa unida a membranas y un sistema transductor de señales de proteínas G, del tipo Gs y Gi. Estas proteínas afectan la actividad de la adenilil ciclasa y posiblemente participan en un mecanismo que involucra a una señal de tipo hormonal. Si bien no existen evidencias directas de la existencia de un receptor, la proteína del tipo Gi es capaz de interaccionar con el peptido tóxico Mastoparán, que mimetiza la acción de los receptores acoplados a proteínas G. Se analizaron distintas fracciones subcelulares para caracterizar una actividad de quinasa de proteínas modulada por AMPc (PKA). Las fracciones subcelulares purificadas por cromatografía en DEAE-celulosa mostraton dos picos de actividad enzimática frente a histona IIA y a kémptido como sustratos. Usando un anticuerpo policlonal contra la subunidad catalítica de PKA de corazón bovino, se inmunoprecipitó un polipéptido con un peso molecular de 40 kDa. Estos datos en conjunto sugieren la presencia de dos tipos de actividad de quinasa de proteína de pendiente de AMPc (tipo I y 11). Experimentos in vivo con toxina del cólera, dieron como resultado un arresto del ciclo celular del parásito, poniendo en evidencia un efecto ambiguo de la vía de señalización mediada por AMPc, que requerirá de futuros estudios para su profundización. Datos preliminares, aunque incompletos nos dan un primer indicio de la conservación de este tipo de vía en una cepa patógena (responsable del Hartrot de las palmas aceiteras). La extrapolación de los resultados anteriores, nos permitirán diseñar aquellos experimentos tendientes a tratar de develar dónde reside la diferencia de patogenicidad de ambas cepas. Phytomonas constitutes a genus of flagellated trypanosomatids with the capacity to infect plants. Although these trypanosomatids parasitize many plants species without apparent pathogenicity, in some cases they are responsible for economically important diseases including those affecting Solanum lycopersicum (tomato), Coffea liberica (coffee), Cocos nucifera (coconut), and Elaeis guineesis (oilpalm). Phytomonas sp membranes have an Adenylyl cyclase activity wich is greater in the presence of Mn2+ than with Mg2+. The Mg2+ and Mn2+ activity ratio varies from one preparation to another suggesting that the Adenylyl cyclase has a variable activation state. A [35S] GTP- -S binding activity with a Kd of 171 nM was detected in Phytomonas membranes. Incubation of these membranes with activated cholera or pertussis toxin and [adenylate 32P]NAD+ led to incorporation of radioactivity into bands of about 40-44 kDa. Crude membranes were electrophoresed on SDS-polyacrylamide gels and analysed, by Western blotting, with the 9188 anti- s antibody and the AS/7 antibody (anti- t, anti- i1, anti- i2). These procedures resulted in the identification of polipeptides of approximately 40-44 kDa. Phytomonas Adenylyl cyclase could be activated by treatment of membrane preparation with cholera toxin in the presence of NAD+, while treatment with pertussis toxin did not affect this enzime activity. These studies indicate that in Phytomonas, Adenylyl cyclase activity is coupled to an unknown receptor entity trough G s proteins. We have identified two types of cyclic AMP-dependent protein kinase activity in Phytomonas citosol. Criteria to assert authenticity of this activity are the followings: 1- The enzime is specifically activated by cAMP; 2- Specificity for phosphate acceptors characteristic of this type of phosphotransferase activity; 3- DEAE-cellulose fractions specifically binds [3H] cAMP; 4- Polyclonal antibodies to bovine heart catalytic subunit immunoprecipitates a 40 kDa phosphorylated polypeptide; 5- As occures with mammalian type II cAMP dependent protein kinase, the activity corresponding to peak II is able to phosphorilate its own "regulatory component" an this doesn't occur with the enzime obtained in peak Y. As the present results were done in Phytomonas isolated from E.characias (a non-pathogenic specie) our next goal is to verify the regulation of this signal pathway in others strains, trying to understand the relationship with the host, and find out, why some of them are responsible of plant's deseases. Fil: Farber, Marisa Diana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil: Kornblihtt, Alberto Rodolfo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.