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Objetivo: Relatar o primeiro caso no Brasil das mutações de beta(β)-talassemia HBB:c.315+1G>C (IVS-II-1) e HBB:c.92+5G>A (IVS-I-5) e o impacto no perfil hematológico e hemoglobínico. Materiais e métodos: Amostra de sangue total de um indivíduo adulto (47 anos), proveniente do Centro de Hematologia e Hemoterapia do Maranhão (HEMOMAR), foi encaminhada ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular (UFMS/CPTL) para diagnóstico confirmatório de hemoglobinopatias. O hemograma apresentou Hb (7,60 g/dL), VCM (87,10 fL), HCM (27,40 pg), CHCM (31,50 g/dL) e RDW (27,20%). A amostra foi submetida à Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC, Premier Resolution, Trinity Biotech) e, para confirmação molecular, o DNA genômico foi extraído (protocolo por fenol-clorofórmio) e foram realizadas as técnicas de PCR-AE, PCR-RE e sequenciamento do gene da β-globina (HBB) pelo método de Sanger (3730xl DNA Analyzer, Thermo Fisher Scientific). Resultados: O perfil cromatográfico do paciente apresentou uma fração globínica compatível com Hb F em alta concentração (88,6%, RRT/F 1.02), e duas frações indicando Hb A e Hb A2, respectivamente, em baixas concentrações (2,6%, RRT/A 0.98 e 2,2%, RRT/S 0.94). Os baixos níveis de Hb apresentados no hemograma, associados à significativa redução das concentrações de Hb A, sugeriram perfil compatível com β-talassemia. As PCR-AE e PCR-RE revelaram ausência de alelos mutantes para as β0-talassemias CD39 e IVS-I-I, respectivamente. O sequenciamento do gene HBB elucidou a presença da mutação HBB:c.315+1G>C (IVS-II-1), correspondente a uma β0-talassemia, acompanhada da mutação HBB:c.92+5G>A (IVS-I-5), uma β+grave-talassemia, ambas em heterozigose. Discussão: Ambas as mutações de β-talassemia relatadas aqui afetam o processamento do RNAm codificado pelo gene HBB, acarretando na redução total (IVS-II-1, β0) ou parcial (IVS-I-5, β+) da síntese de cadeias β-globinas maduras. A mutação IVS-II-1 é caracterizada por uma substituição G>C na posição +1 do íntron II do gene HBB, a qual elimina o sítio doador de splicing 5’do RNAm, enquanto a IVS-I-5 caracteriza-se por uma substituição G>A na posição +5 do íntron I do mesmo gene, comprometendo o reconhecimento correto do local de splicing. A presença simultânea das duas mutações resulta em um déficit quase total na síntese das cadeias β, prejudicando a formação da Hb A e resultando em quadro clínico grave de β-talassemia. Devido os parâmetros hematológicos, hemoglobínicos e histórico transfusional, o paciente apresenta β-talassemia não dependente de transfusão, porém com frequentes necessidades transfusionais. Conclusão: A significativa variabilidade fenotípica observada em pacientes β-talassêmicos torna difícil prever a gravidade do quadro clínico apenas com base nos fatores genéticos, devido à complexidade das interações genéticas subjacentes aos fenótipos da β-talassemia. Assim, a identificação molecular do genótipo dos pacientes β-talassêmicos, associada a análises complementares e ao perfil clínico dos mesmos, são cruciais para fornecer terapia e aconselhamento adequados, dada a diversidade de manifestações clínicas e a necessidade de abordagens individualizadas de tratamento.

Objetivo: Avaliar a associação de polimorfismos de base única (SNPs) do sistema endocanabinoide (ECS) com o subfenótipo de acidente vascular encefálico (AVE) em pacientes com anemia falciforme (AF). Materiais e métodos: O grupo amostral foi composto por 217 pacientes com AF, provenientes da Fundação de Hematologia e Hemoterapia de Pernambuco (Hemope, PE), subdivididos em: (1) 73 com AVE (mediana do desenvolvimento de AVE de 8 anos [1-58 anos]) e (2) 144 pacientes como grupo controle, sem AVE (mediana de 29 anos [18-65 anos]). O fenótipo da AF foi diagnosticado por HPLC e confirmado por PCR-RE, e mutação da -α3,7kb talassemia foi detectada por GAP-PCR. Com base no impacto funcional e nas frequências alélicas mínimas (MAF) > 10%, selecionamos quatro SNPs do ECS que poderiam estar relacionados com o AVE na AF (FAAH rs324420, MAGL rs604300, CNR1 rs7766029 e CNR2 rs35761398) e a genotipagem foi realizada com ensaios TaqMan no PCR em Tempo Real, QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific). Resultados: Os dados de gênero, hemoglobina total (Hb), contagem de reticulócitos, bilirrubina indireta, desidrogenase láctica, quantidade de crise vaso oclusivas (VOCs)/ano e o genótipo para -α3,7kb-talassemia não foram associados ao AVE, enquanto níveis mais baixos de Hb F (%) foram associados ao desenvolvimento de AVE (AVE, Hb F 5 ± 3,3 vs. grupo de controle, Hb F 9,6 ± 5,6, p < 0,0001). Em relação aos SNPs, todos encontraram-se dentro do Equilíbrio de Hardy Weinberg (p > 0,05), e o modelo de herança adotado foi o de dominância para o MAGL rs604300 e sobredominância para os demais. As frequências alélicas e genotípicas não diferiram estatisticamente entre os grupos, bem como a distribuição dos alelos não diferiu do MAF para a população adotada (NCBI's ALFA dataset, Latin America 1). Os modelos de regressão logística binária, ajustados para a Hb F como covariável, não demonstraram associação entre os SNPs e o desenvolvimento de AVE. Discussão: O AVE é um subfenótipo da AF relacionado à hemólise, à disfunção endotelial e à lesão vascular. No âmbito do ECS, estudos com modelos animais de AVE isquêmico já demonstraram a ação neuroprotetora do antagonismo de receptores CB1, codificados pelo gene CNR1, e do agonismo de receptores CB2 (CNR2), estes últimos ainda relacionados à neurogênese pós AVE. Portanto, ainda que nossos dados tenham revelado que os SNPs analisados não são bons preditores para o AVE, existem evidências crescentes para considerar estes genes como candidatos na modulação desse e de outros subfenótipos da AF. Além disso, nosso estudo fornece pela primeira vez um modelo de herança para os SNPs do ECS na AF e sua caraterização em uma coorte brasileira. O modelo de herança de um SNP pode ser vital para desvendar as características genéticas de doenças complexas, como a AF, e associar fenótipos da doença a genótipos específicos. Conclusão: Fornecemos aqui a primeira associação de SNPs do ECS com o subfenótipo da AVE na AF. Considerando os recentes avanços no sentido da utilização de canabinoides nessa e em diversas outras doenças, nossos resultados também abrem caminho para futuros estudos de caraterização dos polimorfismos genéticos do ECS nesta população.

Objetivo: Relatar um estudo familial de probando com hemoglobina (Hb) Korle-Bu e β talassemia. Material e métodos: Amostras de sangue total do probando, sexo masculino, 8 meses e de seus progenitores (mãe com 31 anos e pai com 26 anos), provenientes do ambulatório do Centro de Hematologia e Hemoterapia do Maranhão, foram enviadas ao Laboratório de Genética da UFMS/CPTL para diagnóstico molecular de perfil hemoglobínico inconclusivo. Foram realizados hemograma, reticulograma (ADVIA 2120i-Siemens Healthineers), análises bioquímicas (ARCHITECT ci4100-Abott), análises cromatográficas e análises moleculares (PCR-RE e sequenciamento do gene beta globina –HBB, sequenciador 3770xl DNA analyser). Resultados: O hemograma e reticulograma do probando, pai e mãe apresentaram respectivamente os seguintes parâmetros: E = 5.95, 5.71, 5.40 milhões/mm3; Hb = 11.2, 17.2, 12,0 g/dL; Ht = 33.8, 49.7, 38.6%; VCM = 56.8, 87.0, 71.4 fL; HCM = 18.8, 30.0, 22.2 pg; CHCM = 33.0, 34.5, 31.0%; RDW = 18.5, 13.5, 17.1%; Reticulócitos = 38.500, 34.300, 92.100/mm3; CHr = 20.4, 31.7, 25.4 pg; VCMr = 72.8, 106.3, 91.0 fL. Os resultados das dosagens de ferro sérico, ferritina, índice de saturação da transferrina do probando foram respectivamente: 57 ug/dL, 15.6 ng/mL, 21%. O perfil cromatográfico do probando indicou Hb Variante com tempo de retenção relativo (RRT) a Hb A2 (70.2%), Hb F (18.0%) e Hb A0 (5.7%). A cromatografia do pai apontou a presença de Hb A0 (47.9%) e Hb Variante (43.5%) com RRT de Hb A2. A sobreposição de picos entre Hb Variante e Hb A2 impossibilitou a quantificação da Hb A2 do probando e pai. A mãe apresentou Hb A0 (84.4%), Hb F (0.6%) e aumento de Hb A2 (5.3%). A análises moleculares detectaram a presença de um alelo com a mutação HBB:c.220G>A (Hb Korle Bu) para o pai e mutação HBB:c.92+5G>A (β+ grave talassemia IVS-I-5) em heterozigose para a mãe. Por fim, as análises moleculares do probando confirmaram a dupla heterozigose no gene HBB, formada pela presença de um alelo mutante para Hb Korle-Bu e de outro para talassemia β+ grave IVS-I-5. Discussão: A análise do hemograma do probando e da mãe não indicou anemia para a idade, mas revelou anisocitose com intensa microcitose. O hemograma do pai não apresentou alterações. O reticulograma do probando, pai e mãe não mostrou aumento absoluto na contagem de reticulócitos, no entanto, o VCMr do probando e da mãe estava diminuído. O perfil de ferro do probando não apresentou alterações, excluindo a possibilidade de deficiência de ferro e avaliado com o perfil do eritrograma, suspeitou-se de uma hemoglobinopatia quantitativa. A análise cromatográfica do probando revelou um perfil hemoglobínico inconclusivo. Contudo, com base na observação do eritrograma do probando e nos cromatogramas dos progenitores, em que a mãe possui um aumento de Hb A2 e o pai com presença de heterozigose para Hb Variante, concluiu-se tratar-se de uma provável β talassemia (herdada da mãe) em heterozigose composta com uma Hb Variante (herdada do pai) não identificável por HPLC. As análises moleculares foram realizadas para o diagnóstico confirmatório, com a presença de mutações correspondentes a Hb Korle-Bu e talassemia β+ grave IVS-I-5. Conclusão: A combinação de diferentes metodologias laboratoriais, especialmente as técnicas de biologia molecular, foi essencial para o diagnóstico preciso deste caso complexo, evitando interpretações errôneas e tratamentos inadequados.

Objetivo: Relatar um estudo de caso de uma hemoglobina (Hb) rara denominada Hb I-Interlaken, a qual foi recebido e diagnosticado pelo Laboratório de Genética e Biologia Molecular da UFMS/CPTL. Materiais e métodos: Amostra de sangue de uma paciente do sexo feminino de 64 anos de idade, procedente de Campinas/SP, foi encaminhada para Laboratório de Genética e Biologia Molecular (UFMS/CPTL) para análise laboratorial de perfil hemoglobínico inconclusivo, juntamente com exames hematológicos complementares. Para determinar as frações hemoglobínicas da paciente, a amostra foi submetida à Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC-Premier Resolution, Trinity Biotech). Para confirmação molecular do genótipo, os genes da α-globina (HBA2 e HBA1) foram amplificados por PCR-Touchdown e sequenciados pelo método de Sanger (sequenciador 3730xl DNA Analyzer, Thermo Fisher Scientific). Resultados: Após análises por HPLC, o perfil cromatográfico da paciente apresentou Hb A (67,9%), Hb A2 (2,0%) e Hb variante (22,2%) com o tempo de retenção relativo (RRT) a Hb A de 0,84 (RRT/A = 0,84). O sequenciamento completo do gene HBA2 não demonstrou presença de mutações para Hb variantes, enquanto o sequenciamento do gene HBA1 demonstrou a presença da mutação HBA1:c.47G>A em heterozigose, correspondente à Hb I-Interlaken (genótipo αα/ααI-Interlaken). Em relação aos dados hematológicos, os seguintes parâmetros foram observados: Eritrócitos de 4,27 milhões/mm3, Hb de 13,3 g/dL, Hct de 39,7%, VCM de 93 fl, HCM de 31,2 pg, CHCM de 33,5 g/dL e RDW de 13,3 %. Discussão: A Hb I-Interlaken (também conhecida como Hb J Oxford) corresponde a uma Hb α-variante rara, caracterizada por uma substituição de glicina na posição 15 da cadeia α por um ácido aspártico (GlyAsp), e ocorre principalmente entre os indivíduos descendentes de ingleses e italianos. Relatamos aqui o segundo caso dessa Hb no Brasil, sendo seu primeiro relato curiosamente também em paciente proveniente de Campinas/SP, demonstrando o efeito da imigração europeia e da miscigenação na composição gênica dessa população. Apesar da alteração estrutural na proteína final, a Hb Interlaken não apresenta alterações funcionais, sendo estável e possuindo afinidade normal pelo oxigênio; portanto, seus portadores não apresentam manifestações clínicas, com parâmetros hematológicos dentro dos valores de referência. No entanto, mesmo assintomática, a detecção dessa e de outras variantes raras de Hb é imprescindível para a determinação de sua incidência e para o entendimento do fluxo dessas mutações na população brasileira. Além disso, a combinação de Hb α-variantes com outras mutações estruturais ou talassemias pode resultar em fenótipos clinicamente relevantes, realçando a importância da identificação dessas Hb. Nesse sentido, a associação de diferentes metodologias laboratoriais, como análises cromatográficas e moleculares, permite a detecção correta de Hb raras. Conclusão: A Hb I-Interlaken é uma Hb α-variante rara e tem pouco significado clínico. A presença de Hb anormais podem refletir o grau de miscigenação no Brasil e evidenciam a importância do estabelecimento de padrões e estratégias cromatográficas e moleculares para análises das amostras de Hb da população, além de desenvolver estudos com métodos combinados visando um diagnóstico preciso.

Objetivo: Desenvolver modelo preditivo, usando a concentração da Hb S, como ferramenta de diagnóstico de alfa talassemia em portadores de traço falciforme. Metodologia: Foram analisados 241 indivíduos adultos com traço falciforme. Desses, 16 com alfa-talassemia em homozigose (–α3.7/–α3.7), 86 com alfa-talassemia em heterozigose (–α3.7/αα) e 139 sem coerança de alfa talassemia. Análises cromatográficas por HPLC (Ultra2 Resolution e Premier Resolution, Trinity Biotech) foram utilizadas para caracterização dos perfis de Hb e as análises moleculares para Hb S (PCR-RE) e alfa talassemia (GAP PCR-Multiplex) foram aplicadas para confirmação de diagnóstico. As análises estatísticas incluíram a construção de curvas ROC e o cálculo do índice de Youden para determinar valores de corte específicos da Hb S nos diferentes grupos. Resultados: As concentrações de Hb S obtidos nos dois equipamentos, Ultra2 e Premier, respectivamente, foram: grupo Hb AS sem alfa-talassemia foi 38,2 ± 1,6% e 38,8 ± 2,1%, grupo Hb AS (–α3.7/αα) 32,9 ± 1,4 % e 31,3 ± 1,35% e grupo Hb AS (–α3.7/–α3.7) 26,4 ± 2,5% e 25,7 ± 1,7% com diferença estatística (p < 0,05) avaliada nos dois equipamentos. No grupo Hb AS (–α3.7/αα), o valor de corte da Hb S, para o Ultra2, foi de 35,35% com 99% de sensibilidade (S), 97% de especificidade (E) e 0,998 de área sob a curva ROC (AUC) e, para o Premier, foi de 34,6% com 100% de S, 97,7% de E e 1 de AUC. No grupo Hb AS (–α3.7/–α3.7), o valor de corte da Hb S, para o Ultra2, foi de 31,05% com 100% de S, 95,4% de E e 0,994 de AUC e, para o Premier, foi de 28,65% com 100% de S, 100% de E e 1 de AUC. Discussão: A α-talassemia é uma hemoglobinopatia subdiagnosticada, especialmente em portadores de traço falciforme, devido à complexidade e ao custo dos métodos diagnósticos convencionais. A base molecular da coerança de α-talassemia em indivíduos portadores de Hb S justifica os valores diferenciais encontrados nos grupos (1) sem α+-talassemia (genótipo αα/αα), (2) heterozigotos (αα/–α3.7kb ou αα/–α4.2kb) e (3) homozigotos para α+-talassemia (–α3.7kb/–α3.7kb), uma vez que a redução de cadeias α-globinas leva à diminuição da formação de tetrâmeros α2βSS2 (Hb S). Assim, este estudo demonstrou um modelo preditivo utilizando a concentração da Hb S, quantificada por HPLC, para identificar a presença dessa hemoglobinopatia em indivíduos com traço falciforme. Este estudo fornece base para futuras pesquisas com maior amostragem para validar o modelo preditivo em diferentes populações, com potencial para reformular o diagnóstico e o tratamento das hemoglobinopatias em ambientes de recursos limitados. Além disso, pode ser um norteador de direcionamento de tratamento e manejo de traços falciformes com microcitose e hipocromia persistente sem deficiência de ferro. Conclusões: O modelo baseado na concentração de Hb S provou ser uma ferramenta diagnóstica promissora para a detecção de α-talassemia em portadores de traço falciforme, oferecendo um método menos invasivo e mais econômico. Esta abordagem pode melhorar significativamente o manejo clínico e a alocação de recursos em locais e sistemas com recursos limitados.

Objetivo: Demonstrar o impacto da alfa-talassemia em um caso heterozigoto de hemoglobina (Hb) variante Hope como auxílio de diagnóstico. Materiais e métodos: Amostra de sangue total de uma paciente do sexo feminino (20 anos) proveniente do Instituto de Pesquisas, Ensino e Diagnósticos da APAE (IPED-APAE) de Campo Grande/MS, foi recebida no Laboratório de Genética e Biologia Molecular (LGBM) para diagnóstico confirmatório de hemoglobinopatias. Em seu hemograma constava Hb (11,1 g/dL), VCM (72.5 fl), HCM (22.6 pg), CHCM (31.1 %) e RDW (13.7 %). Com base nos dados, foram realizadas análises eletroforéticas de Hb em pH alcalino e ácido, cromatográficas (HPLC de troca iônica, Premier Resolution, Trinity Biotech) e moleculares (GAP-PCR e sequenciamento de DNA por método de Sanger, sequenciador 3730xl DNA Analyzer, Thermo Fisher Scientific). Resultados: Na corrida de eletroforese alcalina, a Hb variante migrou anodicamente para a posição da Hb A e, na eletroforese ácida, na posição da Hb F. O perfil cromatográfico indicou a presença de Hb A (49,9%, RRT/A 0.99), Hb A2 (3,7%, RRT/A2 1.00) e uma fração globínica de 30,0% eluindo no tempo de retenção da Hb F (RRT/F 0.99). A associação das análises eletroforéticas e cromatográficas, bem como informações do hemograma, orientaram a investigação molecular de Hb beta(β)-variante com coerança de alfa(α)-talassemia. A GAP-PCR detectou a mutação delecional de α-talassemia (-α3.7kb) em homozigose, e o sequenciamento do gene da β-globina (HBB) identificou a mutação de ponto HBB:c.410G>A em heterozigose, compatível com a Hb Hope. Discussão: O conjunto dos resultados possibilitou o diagnóstico de heterozigoto para Hb Hope (Hb A/Hb Hope) e homozigoto para -α3.7kb -talassemia (-α3.7kb/-α3.7kb). Hb β-variantes com carga global mais positiva do que a Hb A, como a Hb S, Hb C e Hb D-Los Angeles, formam menos dímeros (globinas-β mutante com globinas-α) do que a Hb A e, por isso, apresenta menores concentrações quando analisadas, por exemplo, por HPLC. Na presença de α-talassemia, a menor disponibilidade de globinas-α impacta ainda mais na formação dessas Hb β-variantes (atingindo 20-30%), onde a menor atração eletrostática das globinas-β variantes se torna uma etapa limitante na competição entre cadeias para a formação dos dímeros. Este pode ser um indicativo de α-talassemia na ausência de análises moleculares, sendo proporcional ao número de mutações de α-talassemia herdadas. No referido caso, era de esperar, como na maioria dos casos, a diminuição da concentração da Hb variante devido a coerança de alfa talassemia. Entretanto, a Hb Hope é uma variante de cadeia β [(G>A) β136 Gly>Asp] carregada negativamente e sua concentração em heterozigose, sem α-talassemia, é de 30 a 40%. O indivíduo apresentou Hb de 30,0%, mesmo em homozigose para α-talassemia e não houve diminuição da concentração da Hb Hope devido a relação à carga das globinas-β Hope, próxima das globinas-βA. Conclusão: Conhecer os princípios teórico-práticos, desde o comportamento das globinas com suas interações até as associações dos métodos laboratoriais para identificação e determinação genotípica, garantem a compreensão e diagnóstico preciso das hemoglobinopatias. Levando posteriormente a um aconselhamento genético adequado e condizente. Além disso, o estudo dessas interações amplia o conhecimento sobre a fisiopatologia de hemoglobinopatias complexas, como a α-talassemia.

Objetivo: Avaliar a incidência de hemoglobinas (Hb) variantes sintomáticas e assintomáticas em recém nascidos (RN) vivos e triados no estado de Mato Grosso do Sul (MS) entre 2015 e 2022. Materiais e métodos: trata-se de um estudo de coorte retrospectivo e descritivo de 288.753 RN vivos triados pelo Programa Nacional de Triagem Neonatal (PNTN) de 2015 a 2022, abrangendo todos os 79 municípios do estado de MS. Os dados para confecção de dados epidemiológicos foram fornecidos pelo Instituto de Pesquisas, Ensino e Diagnóstico da Associação de Pais e Amigos dos Especiais (IPED-APAE), centro de referência em triagem neonatal do estado MS. As amostras de casos inconclusivos foram enviados para o Laboratório de Genética e Biologia Molecular (UFMS/CPTL) para diagnóstico confirmatório molecular. Os RN com hemoglobinopatias foram separados em assintomáticos, sintomáticos leves e graves. Resultados: De todos os 288.753 RN triados pelo PNTN, 7.525 foram diagnosticados com alguma hemoglobinopatia e apresentaram uma incidência de 1:38,4 (2,61%) entre os RN triados nos oito anos de estudo. Os RN com Hb variantes assintomáticas apresentaram uma incidência de 1:39 RN e agrupou os perfis FAS, FAC, FAD, FA/Korle-Bu, FA/Basking Ridge, FA/Deer Lodge, FA/Tyne, FA/Hasharon, FA/Stanleyville-II, FAS/Chicago e S/PHHF. Os perfis FAS e FAC foram os mais comuns, incidindo em 1:52 e 1:155 RN, respectivamente. Já as hemoglobinopatias sintomáticas leves tiveram incidência de 1:22.212 RN, caracterizado pelos perfis FAE, FC e FC/Beta+ talassemia, sendo o primeiro mais frequente com 1:32.083 RN. Os sintomáticos graves incidiram em 1:4.734 RN, comparativamente maior ao anterior, e compreende os perfis FS e FSC, com respectivas incidências de 1:6.875 e 1:15.197 RN. Além disso, a HbS foi a variante hemoglobínica mais comum no estado de MS, apresentando uma incidência do alelo BS em 1:33 RN. Discussão: Estudos epidemiológicos são instrumentos essenciais para os profissionais de saúde, atuantes no diagnóstico neonatal das hemoglobinopatias, em virtude da ampla gama de Hb variantes documentadas ao direcionarem o diagnóstico de casos inconclusivos, tornando-o mais rápido e preciso, além de contribuírem para ações de saúde pública. Ademais, nossos dados corroboram valores estabelecidos na literatura acerca das Hb anormais mais frequentes na população. Estudos indicam a prevalência das hemoglobinopatias em 3,7% no Brasil, valor maior que a incidência de 2,6% no MS, refletindo assim sua heterogeneidade. Contudo, o traço falciforme segue como mais frequente, sendo 2,5% da população portadora da HbS, em concordância com o presente estudo que apontou 2,4% dos RN com esse perfil. Conclusão: A incidência das hemoglobinopatias em RN triados no estado de MS foi de 1:38,4, destacando-se o perfil FAS como o mais frequente, incidindo em 1:52 RN e o alelo BetaS sendo a mutação mais comum com 1:33 RN. A caracterização epidemiológica, em especial da HbS, é de alta relevância clínica por esta constituir quadros sintomáticos graves, como na Doença Falciforme. Os perfis assintomáticos ressaltam a alta frequência de indivíduos portadores deste alelo na população, contribuindo ao direcionamento do profissional de triagem, desde o diagnóstico correto até o momento do aconselhamento genético familiar e eventual tratamento da hemoglobinopatia.

Objetivo: Relatar o primeiro caso no Brasil de interação da hemoglobina (Hb) variante Ottawa com alfa talassemia em um estudo familial. Materiais e métodos: Amostra de sangue total de uma criança do sexo feminino de dez meses, proveniente da APAE – Salvador/BA, foi recebida pelo Laboratório de Genética e Biologia Molecular (LGBM) da UFMS/CPTL, juntamente com as amostras de ambos os progenitores para confirmação diagnóstica de hemoglobinopatias. No hemograma do probando constava Hb (9,8 g/dL), VCM (78,6%), HCM (26,8%), CHCM (34,0%) e RDW (14,4%). Com base nesses dados, a amostra da criança, bem como a dos pais, foi submetida a Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC), Trinity Biotech, e análises moleculares (PCR-RE, PCR-Multiplex e Sequenciamento de DNA por Sanger). Resultados: O perfil cromatográfico do probando indicou uma concentração incomum de Hb A (66,4%) e elevada concentração de Hb A2 (3,1%), acompanhadas de uma Hb variante no tempo de retenção relativo a Hb S de 1.06 (RRT/S 1.06) em uma concentração sugestiva de Hb alfa(α)-variante (18,9%), com possível presença de α-talassemia. A cromatografia do pai revelou a presença de Hb A (69,6%), Hb A2 (2,7%) e uma Hb variante (20,8%) de comportamento similar à encontrada no probando, enquanto a mãe apresentou um perfil cromatográfico sem sinais aparentes de hemoglobinopatias, com concentrações normais de Hb A (95,3%) e Hb A2 (2,7%). Os perfis cromatográficos guiaram as análises moleculares, onde identificou-se a mutação delecional de α-talassemia (-α3,7kb) em heterozigose tanto no probando quanto na mãe, e ausência de Hb S no probando e no pai. Devido às suspeitas de Hb α-variante, as amostras foram encaminhadas para sequenciamento dos genes HBA2 e HBA1 , no qual foi identificada a presença da mutação HBA1:c.46G>C (Hb Ottawa) em heterozigose tanto no probando, quanto no genitor. Discussão: Os resultados obtidos permitiram a conclusão do diagnóstico do probando como heterozigoto para Hb Ottawa e coerança de alfa talassemia (-α3,7kb) em heterozigose (-α3,7/ααOttawa). A Hb Ottawa (ou Siam) é uma variante rara de cadeia alfa, onde a mutação resulta na substituição de uma glicina por uma arginina no códon 15 do gene HBA2 ou HBA1 . Até o momento, essa variante não havia sido documentada no Brasil em coerança com alfa talassemia, tornando este o primeiro registro dessa associação. Em heterozigose, a Hb Ottawa é assintomática, sugerindo que a anemia microcítica e hipocrômica observada no hemograma do probando é decorrente da presença da α+talassemia, a qual acarreta na redução das sínteses de cadeias alfa, e portanto, no prejuízo, principalmente, da formação do tetrâmero Hb A. Apesar da sua baixa ocorrência e ausência de manifestações clínicas em heterozigose, a associação da Hb Ottawa com o traço falciforme (HbAS), pode desencadear crises vaso-oclusivas graves, e a não detecção dessa variante por análises moleculares pode levar ao falso diagnóstico de doença falciforme, considerando que seu perfil cromatográfico e padrão de migração eletroforética são similares a Hb S. Conclusão: Casos de Hb variantes raras acompanhadas de talassemias demonstram a relevância da associação das metodologias laboratoriais, bem como de laboratórios de apoio com profissionais especializados na identificação molecular de variantes globínicas para a determinação genotípica os pacientes, permitindo uma posterior orientação genética e acompanhamento clínico adequados aos familiares.

Objetivo: Analisar se a heterozigose composta de hemoglobina (Hb) S com beta(β)+ talassemia silenciosa representa fenótipo clínico da Doença Falciforme (DF). Material e Métodos: Amostras de sangue total de oito pacientes, com idades variando de 1 mês a 1 ano, foram enviadas pela Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais (APAE - Salvador/BA) para o Laboratório de Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (LGBM - UFMS/CPTL), devido ao perfil de hemoglobina inconclusivo. As amostras foram submetidas à Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC – Premier Resolution, Trinity Biotech ), extração de DNA genômico (Fenol-Clorofórmio) e análises moleculares (Reação em Cadeia da Polimerase seguida de Restrição Enzimática [PCR-RE] e sequenciamento do gene da beta globina [HBB , sequenciador 3730xl DNA Analyzer , Thermo Fisher Scientific ]). Resultados: A análise por PCR-RE detectou em todos da amostra a presença de um alelo com a mutação HBB:c.20A>T (Hb S), e o sequenciamento demonstrou as mutações para β+ talassemia silenciosa: (1) HBB:c.-151C>T (-101C>T), em sete pacientes e (2) HBB:c.-176C>A (-126C>A), em apenas um paciente, ambas em heterozigose composta para a mutação de Hb S. Por meio de análises prévias, obtiveram-se as seguintes médias de concentração das frações hemoglobínicas e hematológicas para as mutações -101C>T e -126C>A, respectivamente: Hb A = 23.6 e 34.7%, Hb A2= 3.0 e 4.6%, Hb F= 31.0 e 6.7%, Hb S = 36.4 e 47.7%, Eritrócito = 4.10 e 4.07 x106/mm3, Hb total= 11.02 e 10.21 g/L, Hematócrito = 33.12 e 33.80%, VCM = 82.17 e 83.05 fL, HCM = 26.38 e 25.10 pg, RDW = 16.74 e 12.50%. Discussão: DF é um termo amplo que define um grupo caracterizado pela presença da Hb S, tanto em homozigose (Anemia Falciforme, Hb SS) quanto em heterozigose composta com outra mutação no gene HBB , ocasionando diferentes complicações clínicas. Dito isso, a coexistência de mutações para β-talassemia e Hb S no mesmo indivíduo gera casos de DF. Entretanto, existem diferentes manifestações clínicas a depender da natureza da mutação de β-talassemia, que pode acarretar na redução total (β0) ou parcial (β+) da síntese de cadeias β-globina, o que impacta na concentração da Hb A. Os pacientes aqui relatados apresentaram concentração de Hb A próximas da Hb S, aspecto que atenua os processos fisiopatológicos cruciais na DF, a exemplo da polimerização da Hb S e falcização dos eritrócitos. Portanto, o perfil hemoglobínico desses pacientes é compatível com um fenótipo assintomático, justificando a reflexão sobre essas mutações de β+-talassemia silenciosa, na associação com Hb S, pertencerem ou não ao grupo da DF. Conclusão: As mutações de β+ talassemia silenciosa caracterizadas nesse estudo, associado com a Hb S, não resulta em perfis hemoglobínicos e hematológicos condizentes com a DF, o que pode auxiliar no acompanhamento e manejo da doença.

Objetivo: : Aplicar o conhecimento da expressão dos genes HBA2 e HBA1 como ferramenta de direcionamento de diagnóstico para casos complexos de hemoglobinopatias. Material e métodos: Duas amostras (probando, 3 meses, e mãe, 28 anos) de sangue total, provenientes da APAE/Salvador-BA, foram encaminhadas ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular (UFMS/CPTL) para diagnóstico confirmatório de hemoglobinopatias, por suspeita de perfil Hb A/D-Los Angeles. Análises cromatográficas foram realizadas a partir de Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) - Premier Resolution (Trinity Biotech) e análises moleculares utilizadas foram PCR-Multiplex (diagnóstico de alfa-talassemia), PCR-RE (Hb D-Los Angeles) e sequenciamento de DNA (método de Sanger). Resultados: A análise cromatográfica da mãe revelou Hb variante com 90,6% (RRTA2 de 1,06 - Premier Resolution) e um pico menor de 4% (RRTS de 1,00). A amostra do probando demonstrou HbA (58,8%), HbF (4,4%), Hb variante de 32,3% (RRTA2 de 1,06) e um pico menor de aproximadamente 1% (RRTS de 1,00). A partir das concentrações da Hb beta-variante e do RRT do HPLC, a primeira suspeita foi de heterozigoto para Hb beta-variante (Hb D-Los Angeles) (probando) e Hb D-Los Angeles/Beta0-talassemia (mãe). Entretanto, o resultado da PCR-RE para Hb D-LA e o sequenciamento do gene HBB não detectaram mutações nos genes HBB. Descartada a possibilidade de Hb beta-variante e evidenciando a presença do pico menor (fração referente à associação de cadeias alfa mutantes com delta normal), suspeitou-se de Hb alfa variante, embora houvesse coerência com alfa-talassemia devido às concentrações estarem acima dos valores esperados para alfa variantes (> 25%). O teste de GAP-PCR Multiplex identificou mutações de α-talassemia em homozigose (-α3.7/-α3.7) na mãe e em heterozigose (αα/-α3.7) no probando. O sequenciamento dos genes HBA2 e HBA1 revelou, na amostra da mãe, a mutação G-philadelphia (HBA1C>G) em ambos os genes α funcionais (-α3.7+G-phil/-α3.7+G-phil) e no probando (-α3.7+G-phil/αα). Discussão: O diagnóstico das interações de Hb variantes com alfa-talassemia é complexo devido às mutações que alteram o padrão normal da expressão dos genes das globinas. Por isso, surge a necessidade de um profissional capacitado com apoio de técnicas moleculares. No presente caso, demonstramos que o entendimento da expressão das cadeias alfa globinas pode ser útil no direcionamento de casos complexos de hemoglobinopatias. Os diferentes níveis de concentração das Hb alfa-variantes foram impactados pela coerência com alfa-talassemia, pela presença do pico menor e pela ausência da Hb A na amostra da mãe. Conclusão: O perfil cromatográfico pode ser interpretado de forma incorreta em casos de interações de Hb alfa-variante com alfa-talassemia, pois, nessa situação, a concentração da alfa-variante assemelha-se à da beta-variante. Diante desse cenário, este relato demonstra a importância do conhecimento da expressão dos genes alfa-globina e da associação de técnicas laboratoriais para o diagnóstico preciso de hemoglobinopatias.

Objetivo: : Descrever o perfil cromatográfico de recém-nascidos (RN) com hemoglobinas (Hb) alfa variante como direcionamento de diagnóstico para as hemoglobinopatias. Materiais e métodos: : Oito amostras de sangue total de RN com idades entre 0 e 3 meses, provenientes da APAE/IPED-Campo Grande/MS, foram enviadas ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular da UFMS/CPTL para confirmação de Hb variante inconclusiva. O perfil cromatográfico dos RN foi obtido por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (Ultra2 , Trinity Biotech , Kit Resolution ). Para os estudos moleculares, após a extração de DNA genômico, foram realizados protocolos de PCR para amplificação dos genes HBA1 e HBA2 e sequenciamento pelo método de Sanger. Resultados: As análises cromatográficas de quatro RN: Hb Hasharon (n = 2), Hb Chapel Hill (n = 1) e Hb Stanleyville II (n = 1) apresentaram Hb F (48 ±5,8%); Hb A (24 ±7,3%), fração híbrida (10,8 ±6,6%) e Hb variante (7,9 ±1,9%). Por outro lado, as outras quatro amostras de RN: Hb Stanleyville II (n = 2) e Hb Hasharon (n = 2), apresentaram F (31,6 ± 21,6%), Hb A (46,8 ±10,6%), onde fração híbrida eluiu no tempo da Hb A, e Hb alfa variante (14,5 ± 8,3%). O sequenciamento dos genes HBA2 e HBA1 confirmaram as mutações correspondentes as Hb alfa variantes em heterozigose diagnosticadas, Hb Hasharon (HBA2 :c.142G>C), Hb Stanleyville II (HBA2 :c.237C>A) e Hb Chapel-Hill (HBA1 :c.224A>G). Discussão: As Hb alfa variantes em RN resultam, além do pico no HPLC correspondente a Hb alfa variante (cadeias alfa mutantes com beta normais), na formação das frações híbridas que são correspondentes à associação das cadeias alfa mutantes com as gama normais. Tais frações são importantes no direcionamento de diagnóstico de Hb alfa variantes em RN, o que não ocorre nas Hb beta variantes. Cada Hb alfa variante terá suas respectivas frações híbridas eluindo em tempo de retenção específicos, às vezes, próximas às Hb normais, como a Hb A. Dessa forma, observamos que no cromatograma haverá quatro picos característicos, exceto quando há sobreposição da fração híbrida com Hb A. Conclusão: A compreensão e identificação precisa do perfil cromatográfico das Hb alfa variantes e suas frações híbridas, garantem um direcionamento de diagnóstico adequado o que permite a combinação de metodologias laboratoriais para confirmação diagnóstica em recém-nascido.

Objetivo: Investigar a associação de polimorfismos de base única (SNPs) nos genes ACE2 e CNR2 e a severidade da infecção pelo vírus SARS-CoV-2. Materiais e métodos: Pacientes diagnosticados com COVID-19 por RT-qPCR (n = 469) foram triados no Laboratório de Doenças Infecciosas e Parasitárias (LABDIP/UFMS) quanto à gravidade clínica da infecção entre casos leves (sem necessidade de hospitalização) ou graves (com a necessidade de hospitalização e suplementação de O2). Amostras de sangue total foram coletadas e enviadas ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular (LGBM/UFMS). O DNA genômico foi extraído (PureLink Genomic DNA Mini Kit) e as amostras foram genotipadas para os polimorfismos ACE2 rs2285666 (C>T) e CNR2 rs35761398 (TT>CC) via TaqMan Genotyping SNP Assays em qPCR (QuantStudio5, Thermo Fisher Scientific). Foram realizados modelos ajustados de regressão logística binomial, com cálculo de razão de probabilidades (OR) e intervalo de confiança para 95% dos dados (p < 0,05). Resultados: Para o SNP ACE2 rs2285666 , os indivíduos foram clinicamente classificados em leves (n = 245) e graves (n = 224), e os fatores associados ao risco aumentado da forma grave de COVID-19 foram: gênero masculino [OR = 2,99 (1,96–4,57)], idade ≥ 60 anos [OR = 4,43(2,32–8,44)] e apresentar comorbidades [OR = 4,40(2,87–6,74)]. Em mulheres, o risco maior de COVID-19 severa foi associado ao polimorfismo de ACE2 em homozigose para o alelo mutante [TT = 7,1%; OR = 2,97(1,02–8,62)], e em homens (hemizigotos), o maior risco foi também associado ao alelo mutante [T = 29,9%; OR = 2,37(1,18–4,75)]. Já para o SNP CNR2 rs35761398 , obteve-se maior frequência em casos leves (n = 235) comparativamente aos graves (n = 203), de modo que os fatores idade ≥ 60 anos [OR = 1,06(1,04–1,08)], ser do gênero masculino [OR = 3,17(1,99–5,03)] e a presença de comorbidades [OR = 3,52(2,20–5,64)], foram também associados à maior severidade. A presença do alelo mutante desse SNP em heterozigose (TT-CC) demonstrou ter efeito protetivo à forma grave da doença [TT-CC; OR = 0,35(0,19–0,64)]. Discussão: A Enzima Conversora de Angiotensina-2 (ECA2), codificada pelo gene ACE2 , é responsável pela internalização do SARS-CoV-2 nas células hospedeiras. O SNP rs2285666 está localizado no início do íntron 3 deste gene, no cromossomo X, possivelmente responsável por aumentar sua expressão. Portanto, o risco aumentado de desenvolver o fenótipo grave da COVID-19 estaria associado aos portadores do alelo mutante devido ao aumento da ECA2 nas células hospedeiras, potencializando a carga viral. Já o SNP rs35761398 é caracterizado por uma mutação missense no códon 63 do gene CNR2, sendo o receptor mutante (CB2-R63) menos funcional e, portanto, associado a uma resposta imune desbalanceada ao inibir a proliferação de linfócitos. Indivíduos heterozigotos poderiam, possivelmente, manter a expressão equilibrada dos receptores CB2 Q63/R63, garantindo uma resposta imune balanceada e um menor risco de desenvolver a forma grave da doença em até 2 vezes. Conclusão: A presença do SNP rs2285666 no gene ACE2 em homozigose (mulheres) ou hemizigose (homens) está relacionado com o aumento de chance, em até 3 vezes, no estabelecimento do quadro mais grave da COVID-19. Já a presença do SNP rs35761398 em heterozigose está associada a um risco reduzido, em aproximadamente 3 vezes, no desenvolvimento de quadros severos da infecção por SARS-CoV-2.

Objetivo: O estudo se refere ao relato de caso de uma criança com dupla heterozigose de beta talassemia, sendo portanto, o primeiro registro da interação entre as mutações HBB:c.48G>A (Códon 15) e HBB:c.137C>T (Códon 87). Materiais e métodos: Uma amostra de sangue total de um paciente com 12 anos proveniente do estado do Maranhão (MA) foi encaminhada ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular (LGBM - UFMS/CPTL), juntamente às informações do indivíduo e seu hemograma para uma confirmação de diagnóstico de hemoglobinopatias. A análise cromatográfica foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC), Trinity Biotech (Premier Resolution) e o DNA genômico foi extraído por fenol clorofórmio. A caracterização dos alelos mutantes para o gene HBB foi realizado por sequenciamento de DNA pelo método de Sanger e análise de Persistência Hereditária da Hemoglobina Fetal (PHHF) por PCR-Multiplex. Resultados: O hemograma do paciente evidenciou anemia hemolítica (reticulócitos = 166.300 mm3), microcítica (VCM = 62,5 fL) e hipocrômica (HCM = 20,60 pg), enquanto o resultado da cromatografia indicou Hb F (86,5%), Hb A (3,3%) e Hb A2 (2,7%), inicialmente levando à suspeita de heterozigose composta para beta talassemia e PHHF. Entretanto, a PCR-GAP não identificou mutações para PHHF. O sequenciamento demonstrou duas mutações, ambas em heterozigose, HBB:c.48G>A (Códon 15) e HBB:c.137C>T (Códon 87), ou seja, uma de Beta0 e uma de Beta+ talassemia, respectivamente. Discussão: Na presença de uma beta talassemia, a síntese da cadeia beta globina é reduzida (Beta+) ou ausente (Beta0), levando a formação de cadeias alfa globínicas em excesso, as quais são instáveis e precipitam nas membranas dos precursores eritróides e dos eritrócitos, ocasionando a eritropoiese ineficaz e a hemólise. Por isso, a anemia hemolítica, microcítica e hipocrômica detectada no hemograma indicou a existência desta hemoglobinopatia, a qual por apresentar uma ampla variedade de alterações genéticas, se faz essencial a realização do sequenciamento a fim da correta identificação da mutação no gene HBB. A PHHF foi investigada pela alta concentração de HbF para idade do investigado, porém não condizente com perfil do hemograma. Dessa forma, a amostra foi sequenciada e duas mutações foram detectadas sendo equivalentes a uma redução parcial e uma total da síntese das cadeias beta-globina. Ou seja, um dos alelos não sintetiza cadeia beta-globina, enquanto o outro produz em baixa concentração, explicando os níveis reduzidos de HbA. A elevação da HbF se trata de uma reação de compensação, em que o gene gama, localizado no cluster do gene HBB, é hiperexpresso para suprir a demanda da beta-globina deficiente. Conclusão: A associação de diversas metodologias de análises hematológicas e moleculares laboratoriais foi determinante para o diagnóstico preciso do paciente, dado que a beta talassemia apresenta vasta possibilidades de mutações, especialmente as de ponto. Além disso, a determinação acurada da hemoglobinopatia serve de base para o tratamento e cuidado adequado ao indivíduo, além de ser essencial para o responsável pelo aconselhamento genético à família e ao afetado.

Objectives: Evaluate the association of single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the endocannabinoid system (ECS) with the hemolytic and vasculopathy subphenotypes in sickle cell anemia (SCA) patients. Methodology: The study was performed with 297 SCA patients (median age 30 years, range 6 to 66 years, 171 males, 57.6%), enrolled and regularly followed in a reference center in northeast Brazil. Clinical and laboratory data were obtained from medical records. Patients were divided into subgroups according to clinical complications. The control group was patients without complications. Peripheral blood samples from all patients were collected, and genomic DNA was extracted using the phenol-chloroform protocol. The SCA genotype was confirmed with PCR followed by restriction analysis with Dde I, and alpha thalassemia (-α3.7kb) mutation was detected with GAP-PCR. MAGL (rs604300, A>G), FAAH (rs324430, C>A), CNR1 (rs7766029, T>C), and CNR2 (rs35761398, TT>CC) polymorphisms were genotyped using TaqMan assays. Results: Overall, 73 patients developed stroke (24.6%), 80 of the men presented priapism (46.8%), and 144 (48.5%) were assigned as the control group (for priapism, n = 58). Regarding clinical and laboratory data, gender, total hemoglobin (Hb), reticulocyte count, indirect bilirubin, and lactate dehydrogenase were not associated with clinical complications. Lower levels of Hb F (%) were associated with stroke (stroke, Hb F 5 ± 3.3% vs. control group, Hb F 9.6 ± 5.6, p < 0.0001), and the non-mutated genotype for -α3.7kb was associated with priapism (p < 0.0001). Due to a better fit of data, the overdominant model of inheritance was adopted for all SNPs. The TT-CC genotype for CNR2 SNP (33 [42.3%] in the priapism group and 31 [53.4%] in control) was independently associated with priapism, even when -α3.7kb was included as a confounder (OR = 0.386 [0.175 – 0.854], p = 0.019). No statistical association was found for the other SNPs analyzed. Discussion: SCA is an inherited disease characterized by the homozygous genotype of HBB:c.20 T>A mutation, which encodes Hb S. The main determinant of SCA severity is the Hb S polymerization level, leading to hemolysis, vasculopathy, vaso-occlusion, and an inflammatory state. In a quest for new insights into the pathophysiology and therapies in SCA, the ECS posts as a potential candidate once it demonstrates a significant role in several biochemical and physiological pathways of clinical interest. The receptor cannabinoid 2 (CB2), encoded by the CNR2 gene, is mainly expressed in immune cells and plays a crucial role in the regulation of the immune system. Activation of CB2 receptors exerts potent anti-inflammatory effects, reducing the production of pro-inflammatory cytokines such as TNF-α and IL-1β and reducing leukocyte infiltration and migration, decreasing tissue damage and inflammation. In our study, the lower chance of developing priapism associated with the TT-CC genotype for CNR2 demonstrates a potential CB2 effect in regulating SCA complications by modulating inflammation. Conclusion: The genetic and biochemical basis of SCA complications still needs to be completed, and searching for new predictors is essential. Based on CB2 functions and our findings, this gene represents a potential candidate for modulating SCA pathophysiology. Now, it's important to find out how this modulation functionally occurs.

Objetivo: Relatar o primeiro caso de heterozigose composta para hemoglobinas (Hbs) S e Rush. Material e métodos: Amostra de sangue total do paciente, sexo masculino, 14 anos, proveniente do ambulatório do Centro de Hematologia e Hemoterapia do Maranhão, foi enviada ao Laboratório de Genética da UFMS/CPTL para diagnóstico molecular de perfil hemoglobínico inconclusivo. Foram realizados hemograma, reticulograma (ADVIA 2120i-Siemens Healthineers), análises bioquímicas (ARCHITECT ci4100-Abott), análises cromatográficas (HPLC-Premier Resolution, Trinity Biotech), eletroforese de Hb (ELH) em pH ácido e alcalino (SPIFE® 3000-Helena Laboratories) e análises moleculares (PCR-RE e sequenciamento do gene beta globina – HBB, sequenciador 3770xl DNA analyser). Resultados: O hemograma e reticulograma apresentaram os seguintes parâmetros: E= 4,59 milhões/mm3; Hb = 12,6 g/dL; Ht = 36,3%; VCM= 79,2 fL; HCM = 27,5 pg; CHCM= 34,7%; RDW= 19,5%; Reticulócitos= 261.900/mm3; CHr = 31,9 pg; VCMr = 98,4 fL e a análise microscópica complementar mostrou anisocitose +++/4+, microcitose +/4+, policromasia +/4+, hemácias em alvo +/4+. Os resultados das dosagens de ferro sérico, ferritina, índice de saturação da transferrina, LDH, bilirrubina total, direta e indireta foram, respectivamente: 119 ug/dL, 235,5 ng/mL, 51,5%, 186,5 U/L, 1,55 mg/dL, 0,39 mg/dL e 1,16 mg/dL. O perfil cromatográfico apresentou Hb S (87,7%), Hb F (1,3%) e Hb A2 (3,3%). A ELH em pH alcalino apresentou três frações, uma correspondente à Hb S e dois distintos, na região de Hb F. A eletroforese em pH ácido apresentou uma banda correspondente à Hb S e outra entre as regiões S e C. As análises moleculares detectaram a presença de uma mutação no éxon 1 do HBB, HBB:c.20A>T (Hb S) e no éxon 2 do HBB, HBB:c.304G>C, ambas em heterozigose. Discussão: O hemograma não apresentou anemia para a idade, entretanto, possuía anisocitose às custas de micrócitos, policromasia e hemácias em alvo. O reticulograma apresentou aumento relativo e absoluto na contagem de reticulócitos, indicando um aumento de produção eritroide. O perfil no ferro não apresentou alterações. Os testes bioquímicos indicaram um quadro de hemólise, confirmado pela presença de bilirrubina total e indireta elevadas e aumento da LDH. A análise cromatográfica revelou um perfil hemoglobínico sugestivo de anemia falciforme, no entanto, a partir da observação do eritrograma e ausência de drepanócitos após microscopia complementar, a hipótese foi excluída. A realização de ELH em pH ácido e alcalino evidenciou a ausência de uma única banda no grupo S, comprovando que não se tratava de uma anemia falciforme, mas de uma doença falciforme em que a Hb variante possuía o mesmo RRT de Hb S em HPLC. As análises moleculares foram realizadas para o diagnóstico confirmatório, com a presença de mutações correspondentes a Hb S e Hb Rush. A Hb Rush é uma variante estrutural rara que resulta da substituição do aminoácido glutamato (carregado negativamente) pela glutamina (neutra) na posição G3, o que altera as propriedades funcionais da hemoglobina, incluindo instabilidade térmica, causando hemólise mesmo em heterozigose. Conclusão: A combinação de diferentes metodologias laboratoriais foi fundamental para o diagnóstico preciso deste caso, evitando assim interpretações errôneas e tratamentos inadequados.

Objetivos: Realizar a caracterização de mutações de beta talassemia em pessoas com doença falciforme (Hb S/Beta-talassemia). Material e métodos: No período de cinco anos, 29 amostras de pessoas com diagnóstico molecular inconclusivo para a doença falciforme foram enviadas ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular da UFMS/CPTL. As análises laboratoriais consistiram em cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (Ultra 2 Kit Resolution, Trinity Biotech) e análises moleculares por PCR-AE, PCR-RE e sequenciamento do gene HBB pelo método de Sanger. Resultados: Das 29 amostras avaliadas, 14 mutações de beta talassemia foram detectadas e apresentadas da seguinte forma: 03 HBB:c.-151C>G com Hb S (40,2% ± 5,4) e Hb A (29,9% ±8,9); 04 HBB:c.118C>T com Hb S (51,4% ±20,9); 04 HBB:c.92+5G>A com Hb S (50,5% ±12,5) e Hb A (7,5% ±12,2); 01 HBB:c.75T>A com Hb S (60,6%) e Hb A (16,9%); 01 HBB:c.93-21G>A com Hb S (77,7%); 03 HBB:c.92+6T>C com Hb S (60,3 ± 3,8) e Hb A (22,6% ±5,4); 01 HBB:c.*110T>C com Hb S (59,5%); 05 HBB:c.-79A>G (-29>G) com Hb S (57,9% ± 4,3) e Hb A (14,3 ± 3,5); 01 HBB:c.93-2A>G com Hb S (64,9%); 01 HBB:c.316-7C>A com Hb S (48,9%) e Hb A (34,1%), 02 HBB:c.92+5G>C com Hb S (64,8% ±7); 01 HBB:c.315+1G>A com Hb S (72,8%); 01 HBB:c.-126C>T com Hb S (45,5%) e Hb A (34,7%); e 01 HBB:c.48G>A com Hb S (72,6%). Discussão: A beta talassemia é resultante da redução parcial ou inibição total da produção de globinas. A combinação da hemoglobina (Hb) S com beta talassemia gera uma condição de heterozigoto composto conhecida como Hb S/Beta talassemia, que pode ser classificada conforme a expressão das globinas em Hb S/Beta0-talassemia e Hb S/Beta+-talassemia. No primeiro caso, como não há produção de Hb A, a clínica é quase indistinguível da anemia falciforme, já na Hb S/Beta+-tal, como ainda há presença de Hb A, o fenótipo é mais brando. Dentre as mutações encontradas, 07 foram classificadas como Beta+-tal (HBB:c.92+5G>A, HBB:c.75T>A, HBB:c.93-21G>A, HBB:c.92+6T>C, HBB:c.*110T>C, HBB:c.-79A>G e HBB:c.92+5G>C), 04 Beta0-tal (HBB:c.118C>T, HBB:c.93-2A>G,HBB:c.315+1G>A e HBB:c.48G>A) e 03 Beta+ silenciosa (HBB:c.-151C>G, HBB:c.316-7C>A e HBB:c.-126C>T). A caracterização adequada das mutações de Hb S/Beta-tal é importante para direcionamento de conduta médica adequada, aconselhamento genético e estudos de prevalência nas populações. Conclusão: As Hb S/Beta talassemia resultam de diferentes mutações e geram uma variedade de fenótipos, podendo levar a quadros muito semelhantes a anemia falciforme. O rastreio e diagnóstico correto dessas mutações é essencial para ampliar o conhecimento e, consequentemente, melhorar o acompanhamento e tratamento.

Objetivo: Avaliar a influência da alfa talassemia em portadores da hemoglobina S (Hb AS) e determinar as concentrações de hemoglobina S (Hb S) como suporte de diagnóstico laboratorial. Materiais e métodos: Foram encaminhadas 182 amostras de sangue total com suspeitas de traço falciforme, provenientes de doadores de sangue do Centro de Hematologia e Hemoterapia de Mato Grosso do Sul (HEMOSUL), ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular (UFMS/CPTL) para a confirmação de diagnóstico molecular. Os perfis cromatográficos foram obtidos por Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) - Ultra 2 Resolution e Premier Resolution (Trinity Biotech). As análises moleculares foram realizadas após extração do DNA genômico, seguido de PCR-RE (Hb S) e GAP-PCR (alfa talassemia). Para as análises estatísticas foram realizados testes de ANOVA com post hoc de Tukey, p < 0,05. Resultados: Dos 182 doadores avaliados, 139 indivíduos (76,4%) apresentaram o perfil Hb AS sem alfa talassemia e 43 (23,6%) apresentaram alfa talassemia, sendo 37 (86%) heterozigotos para mutação -α3.7 e 6 (14%) homozigotos para deleção -α3.7. A concentração da Hb S obtida no HPLC Premier e Ultra 2 em indivíduos Hb AS foi de 36,33 ±3,15% e 38,37 ±2,29%, respectivamente. Indivíduos Hb AS com alfa-talassemia em heterozigose apresentaram Hb S de 32,25 ± 3,58% (Premier) e 32,96 ± 2,94% (Ultra2). Nos indivíduos Hb AS com alfa-talassemia em homozigose a média de Hb S foi 27,86 ±3,18% (Premier) e 29,58 ±3,41% (Ultra2). Foi observado diferença significativa (p < 0,0001) em relação às concentrações médias de Hb S nos perfis encontrados, sendo menor para o perfil AS/homozigoto para alfa talassemia, independente dos equipamentos avaliados. Discussão: De acordo com os resultados apresentados podemos verificar que houve diminuição da concentração de Hb S nos indivíduos Hb AS com coerança de alfa talassemia. Tal diminuição é reflexo da característica das Hb beta-variantes, como a Hb S, mais carregada positivamente em comparação com a Hb A, e forma menos dímeros de Hb (globinas-beta com globinas-alfa), por isso, sua concentração é reduzida. Na presença de alfa-talassemia, a menor disponibilidade de globinas-alfa impacta ainda mais na formação de Hb beta-variante e este pode ser um indicativo de alfa-talassemia na ausência de análises moleculares. Logo, é importante estabelecer os valores de corte da Hb S em indivíduos com a presença e ausência da alfa talassemia para auxiliar no direcionamento de diagnóstico, principalmente, em diferentes modelos de HPLC disponíveis no mercado. Conclusão: Compreender a coerança de alfa talassemia em indivíduos com Hb AS é importante para auxiliar no diagnóstico laboratorial das hemoglobinopatias, principalmente, na ausência de análise molecular para alfa-talassemia, uma vez que com dados da análise cromatográfica foi possível estabelecer a concentração da Hb S para os diferentes tipos de indivíduos que foram avaliados neste estudo.

Objetivo: Descrever a importância do Sequenciamento de DNA para conclusão de diagnóstico de hemoglobinas (Hb) raras em recém-nascidos relatando o primeiro caso descrito no Brasil de Hb Basking Ridge. Materiais e métodos: Amostras de sangue total, procedente do centro de triagem neonatal, APAE/IPED- Campo Grande/MS, da probanda (22 dias) e da mãe (25 anos) foram enviadas para o Laboratório de Genética e Biologia Molecular da UFMS/CPTL afim de identificar perfis de Hb inconclusiva triadas na triagem neonatal. Os perfis cromatográficos foram avaliados por HPLC (Ultra2, Trinity Biotech, Kit Resolution) e o estudo molecular foi realizado, após a extração de DNA genômico, por sequenciamento do gene HBB (método Sanger - sequenciador 3730xl DNA analyser). Resultados: A análise cromatográfica da probanda evidenciou a presença de Hb F (71,3%), Hb A0 (14,4%), Hb A2 (0,2%) e uma variante com o Tempo de Retenção Relativo a Hb A (RRTA) de 0,99 (11,7%). A mãe apresentou Hb A0 (42,8%), Hb A2 (2%) e Hb variante com RRTA de 1,00 (32,4%). O sequenciamento completo do gene HBB demonstrou a presença da mutação HBB:c.250G>A em heterozigose, tanto na probanda quanto na mãe. A mutação no éxon 2 do gene HBB correspondente a Hb Basking Ridge. Discussão: De acordo com os dados relatados, nós sugerimos a presença de Hb variante de cadeia beta devido a concentração apresentada na amostra da mãe (Hb variante proporcional à Hb A) e ausência de pico híbrido na amostra do recém-nascido (pico híbrido = frações formadas por globinas alfa mutante com gama normal). Avaliando os exemplares de cromatografia presentes no manual do fabricante, o RRTA de 0,99 (probanda) e RRTA de 1,00 (mãe) foram compatíveis com as Hb variantes: Hb Calais e Hb La Desirade (ambas de cadeia beta). Descartando a possibilidade de Hb variante de cadeia alfa, realizamos o sequenciamento do gene HBB e identificamos a presença da Hb Basking Ridge, ou seja, o primeiro relato no Brasil desta Hb. Essa variante é resultante da substituição do aminoácido glicina (apolar) pela serina (polar não carregada) na posição 83; portanto sugere-se que alterações nas propriedades estruturais e/ou funcionais da hemoglobina possam estar presentes. No entanto, não há relatos na literatura que corroborem essa hipótese, até o presente momento. Conclusão: Os métodos de triagem neonatal para as hemoglobinopatias disponíveis atualmente são sensíveis e permitem a detecção de perfis de Hb anormais em diferentes combinações. Entretanto, a conclusão de diagnóstico só é possível perante a associação de técnicas laboratoriais e pessoal qualificado. Diante disso, a identificação da Hb Basking Ridge só foi possível pela alta sensibilidade do HPLC na triagem, conhecimento profissional sobre diagnóstico e a utilização do sequenciamento de DNA.

Objetivo: Demonstrar a relevância do diagnóstico molecular na identificação de heterozigoto composto para beta talassemias HBB:c.118C>T (CD39) e HBB:c.-138C>T (-88C>T) em recém-nascido da triagem neonatal. Materiais e métodos: Amostra de sangue de um paciente do sexo masculino, três meses de idade, procedente do Hospital Universitário Júlio Müller (HUJM-UFMT), foi encaminhada para Laboratório de Genética e Biologia Molecular (UFMS/CPTL) para análise laboratorial de perfil hemoglobínico inconclusivo, juntamente com exames hematológicos complementares. Para determinar as frações hemoglobínicas do paciente, a amostra foi submetida à Cromatografia Líquida de Alta Performace (HPLC-Ultra2, Trinity Biotech, Kit Resolution) e para o estudo molecular foi realizado o sequenciamento do gene beta globina (HBB) (sequenciador 3770xl DNA analyser). Resultados: Após análises por HPLC e sequenciamento, o perfil de hemoglobina da criança foi Hb F (90,2%), Hb A (3%) e Hb A2 (0,9%) com a presença das mutações HBB:c.-138C>T (Beta++ talassemia, -88C>T) e HBB:c.118C>T (Beta0 talassemia, CD39), ambas em heterozigose. Em relação aos dados hematológicos os seguintes parâmetros foram observados: RBC de 3,77 milhões/mm3, Hb de 9,9 g/dL, Hct de 29,3%, VCM de 77,7 fl, HCM de 26,4 pg, CHCM de 34,0 g/dL, RDW de 23,5%, contagem de reticulócitos 4,62%, ferritina 384,3 ng/mL, Lactato Desidrogenase (LDH) 418 U/L, bilirrubina total 1,2 mg/dL, bilirrubina direta 0,4 mg/dL e bilirrubina indireta 0,8 mg/dL. Discussão: Na mutação CD39 um códon de parada é gerado impedindo a tradução eficaz do RNAm do gene HBB, o que leva ao fenótipo β0. Por outro lado, a mutação -88C>T, presente na região promotora, causa uma leve redução na expressão da β-globina. A interação dessas mutações resulta no fenótipo de beta talassemia intermédia, a qual é caracterizada por uma heterogeneidade clínica que se situa entre os sintomas leves do traço talassêmico e as manifestações graves da beta talassemia maior. Neste relato, o probando apresentou anemia discreta, acentuada anisocitose, aumento de reticulócitos, de LDH e de bilirrubina indireta, caracterizando uma anemia hemolítica. O aumento da ferritina pode ser resultado de um processo inflamatório. No entanto, o perfil clínico poderá ser melhor avaliado após os seis meses de vida, uma vez que nesse período ocorre a estabilização nas concentrações das Hbs. É importante salientar que outros fatores genéticos, como a presença de alfa talassemia e mutações que influenciam em maior expressão de Hb F, podem estar associados, contribuindo assim para uma forma mais leve da doença. Conclusão: Considerando a diversidade de manifestações fenotípicas, a heterogeneidade genotípica e a gravidade dos sintomas clínicos, a detecção e o tratamento adequados dos pacientes com talassemia intermédia permanecem um desafio significativo. Análises moleculares são imprescindíveis para um diagnóstico confirmatório da doença, permitindo assim a implementação de estratégias que visam otimizar a qualidade de vida dos pacientes e minimizar possíveis complicações.

Objetivo: Relatar um estudo familial de um caso de coeranças de três mutações nos genes que expressam as cadeias alfa e beta da hemoglobina (Hb), o qual foi recebido e diagnosticado pelo Laboratório de Genética e Biologia Molecular (LGBM) da UFMS/CPTL. Materiais e métodos: Amostra de sangue total de uma criança do sexo feminino de cinco meses, proveniente da APAE ‒ Salvador/BA, foi recebida com a suspeita de Hb beta-variante (Hb C) com beta talassemia. No hemograma constava RBC (4,92 milhões/mm3), Hb (8,69 g/dL), VCM (60 fl), HCM (17,65 pg), CHCM (29,54 g/dL) e RDW 16,5%). O solicitante informou, adicionalmente, que o probando possuía uma irmã de seis anos diagnosticada com Hb C/Beta talassemia. Com base nesses dados, a amostra do probando, bem como, a de ambos os genitores, foram submetidas a Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC), Trinity Biotech (Premier Resolution) e análises moleculares (PCR-RE, PCR-Multiplex e Sequenciamento de DNA por Sanger). Resultados: O perfil cromatográfico do probando indicou a presença de Hb variante com tempo de retenção relativo a Hb C em uma concentração (63%) distante dos valores esperados para heterozigose ou homozigose, acompanhada de uma elevada concentração de Hb A2 (4,8%) e de Hb F (24,6%) e baixa concentração de Hb A (3,9%), sugerindo a presença de beta-talassemia. A cromatografia da mãe apontou a presença de Hb variante compatível com Hb C em uma concentração (33,2%) similar à de um perfil heterozigoto, porém, mais baixa do que o esperado e, por isso, a suspeita de alfa-talassemia. O pai apresentou concentração de Hb A (87,2%) e elevada concentração de Hb A2 (5,8%). As análises moleculares dos genitores identificaram um alelo para a mutação HBB:c.19G>A (Hb C) para mãe e um alelo para a mutação HBB:c.92+5G>A (beta+ grave talassemia IVS-I-5) no pai. Ademais, as análises dos pais, bem como a baixa concentração da Hb C da mãe, foram confirmadas pela presença da mutação delecional -α3.7em heterozigose em ambos os genitores. Por fim, as análises moleculares do probando confirmaram a dupla heterozigose no gene HBB, formada pela presença de um alelo mutante para Hb C e de outro para talassemia beta+ grave IVS-I-5, e de alfa+ talassemia em homozigose. Discussão: Os resultados obtidos permitiram a conclusão do diagnóstico do probando como Hb C/Beta+ grave talassemia com alfa+ talassemia homozigota (βC/βtal e -α3.7/-α3.7), justificando assim as pequenas variações observadas no hemograma e a possível anemia microcítica e hipocrômica que a criança venha a desenvolver, haja vista que em casos de coerança de Hb beta variantes e beta+ talassemia grave, a redução quase total da síntese de cadeias beta normais leva ao aumento da concentração da Hb variante. Em contrapartida, a alfa talassemia reduz a síntese de cadeias alfa, resultando na concentração de Hb C abaixo do esperado para a heterozigose e melhora clínica de Hb C/Beta+ talassemia grave devido a diminuição de cadeias alfas livres. Conclusão: A frequência de casos complexos como o relatado, em que há a associação de Hb variante com talassemias ainda são subestimados, haja vista que a emissão de um diagnóstico confirmatório, como o descrito, só é possível mediante a combinação de metodologias laboratoriais, em específico as análises moleculares. Esses diagnósticos permitem o acompanhamento e tratamento clínico correto do paciente, além de uma orientação genética para os membros da família.