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【目的】研究一种在哺乳动物细胞中高效的基因敲入方法，比较带有oriP-EBNA1 序列的episomal CRISPR/Cas9载体与普通CRISPR/Cas9载体的基因敲入效率是否有差别。【方法】首先利用慢病毒载体构建稳定表达红色荧光蛋白DsRedE2的人胚肾细胞系（293FT）与人诱导多能干细胞系（hiPS）；利用CRISPR/Cas9序列设计网站，设计和合成靶向DsRedE2的向导RNA（sgRNA），分别克隆至带有oriP-EBNA1的episomal CRISPR/Cas9敲除载体与普通CRISPR/Cas9敲除载体中，测序筛选插入正确片段的克隆；然后设计靶向DsRedE2的同源臂，把同源臂连接在绿色荧光蛋白（GFP）的两端，构建GFP敲入片段的载体。把两种敲除载体分别导入到DsRedE2-293FT与DsRedE2-hiPS细胞系中，在不同时间点通过荧光显微镜观察以及流式细胞分析比较细胞的敲除效率，同时利用PCR 检测靶基因的敲除情况；在筛选获得有效的sgRNA 片段后，把两种敲除载体和同源臂同时导入到DsRedE2-293FT与DsRedE2-hiPS细胞系中，在不同时间通过荧光显微镜观察以及流式细胞分析比较细胞的敲入效率，同时利用PCR检测DsRedE2序列中GFP的敲入情况。【结果】成功构建表达DsRedE2的293FT与hiPS细胞系；获得靶向DsRedE2的episomal CRISPR/Cas9敲除载体、普通CRISPR/Cas9敲除载体及带有GFP的同源臂载体；荧光显微镜观察与流式细胞分析结果显示，转染两种CRISPR/Cas9质粒均可以使DsRedE2阳性细胞明显减少，而且episomal CRISPR/Cas9质粒组的DsRedE2阳性细胞数量显著低于转染普通CRISPR/Cas9质粒组。同时，敲入实验证实episomal CRISPR/Cas9组的GFP阳性细胞数量比普通CRISPR/Cas9组更多；TA克隆测序证实打靶位点有敲除与敲入片段。【结论】episomal CRISPR/Cas9载体与普通CRISPR/Cas9载体在细胞上都能实现基因的敲除与敲入；带有oriP-EBNA1序列的episomal CRISPR/Cas9载体敲除和敲入的效率均比普通CRISPR/Cas9载体高。以上结果为利用episomal CRISPR/Cas9载体进行人多能干细胞的基因敲入研究和谱系追踪动物模型的建立提供了重 要的实验基础。 more...

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