Search

214 σ., Στην παρούσα διδακτορική διατριβή παρουσιάζεται μια ολοκληρωμένη μελέτη για την διερεύνηση διαδικασιών παραγωγής βιοντήζελ (ομογενής-ετερογενής κατάλυση, μεθανόλυση-αιθανόλυση) από πρώτες ύλες του Ελλαδικού χώρου. Τα πειραματικά αποτελέσματα αξιολογήθηκαν σύμφωνα με το ΕΝ 14214. Παράλληλα διερευνήθηκε η βελτιστοποίηση της οξειδωτικής σταθερότητας των μελυλεστέρων. Μελετήθηκαν έλαια από τυπικές καλλιέργειες της Ελληνικής γης και παραπροϊόντα της Ελληνικής βιομηχανίας. Ραφιναρισμένα έλαια όπως ηλιέλαιο, σογιέλαιο, βαμβακέλαιο και καπνέλαιο και μη ραφιναρισμένα όπως χρησιμοποιημένα μαγειρικά έλαια, ζωικά λίπη, καστορέλαιο και έλαια από υπολείμματα καφέ αξιολογήθηκαν στις αντιδράσεις της μεθανόλυσης. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν με την χρήση ενώσεων καλίου και νατρίου, τυπικών ομογενών καταλυτών. Tα πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν ότι τα έλαια που χρησιμοποιήθηκαν αποτελούν ελκυστικές εναλλακτικές πρώτες ύλες για την παραγωγή βιοντήζελ. Παράλληλα μελετήθηκε η αντίδραση της αιθανόλυσης με τα περισσότερα έλαια που ήδη έχουν αναφερθεί προς παραγωγή βιοντήζελ. Η παραγωγή αιθυλεστέρων αντί μεθυλεστέρων έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, καθώς επιτρέπει την παραγωγή ενός νέου εναλλακτικού καυσίμου. Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκε η παρασκευή νέων στερεών ετερογενών καταλυτών. Διερευνήθηκε η καταλυτική συμπεριφορά αυτών στην αντίδραση της μετεστεροποίησης. Διερευνήθηκαν οι παράγοντες που επηρεάζουν την απόδοση και την ταχύτητα της αντίδρασης. Βρέθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες των μεταβλητών της αντίδρασης και αξιολογήθηκαν οι φυσικοχημικές ιδιότητες των τελικών προϊόντων. Η χρήση στερεών καταλυτών απλοποιεί την διαδικασία της μετεστεροποίησης, με την εξάλειψη των σταδίων πλύσης και ξήρανσης των μεθυλεστέρων. Τέλος διερευνήθηκε η αντιοξειδωτική δράση των κυριοτέρων εμπορικών αντιοξειδωτικών προσθέτων. Συντέθηκαν νέα φαινολικά προσθετά και αξιολογήθηκε η επίδραση τους. Η αξιολόγηση των προσθέτων πραγματοποιήθηκε σε διαφορετικούς τύπους μεθυλεστέρων και σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Οι μετρήσεις οξειδωτικής σταθερότητας εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας την επίσημη μέθοδο του Ευρωπαϊκού προτύπου. Η σταθερότητας στην οξείδωση για το αυτούσιο βιοντήζελ προσδιορίζεται από την μέθοδος Rancimat (EN 14112-ελάχιστο 6 h). Παράλληλα οι μετρήσεις οξειδωτικής σταθερότητας προσδιορίστηκαν με την μέθοδο Petrotest PetroOXY (prΕΝ 16091). Στην μέθοδο αυτή, το Ευρωπαϊκό πρότυπο δεν έχει θεσπίσει όριο προδιαγραφής., This thesis presents a comprehensive study to investigate biodiesel production processes (homogeneous-heterogeneous catalysis methanolysis-aithanolysi) from raw materials in Greece. Experimental results were evaluated in accordance with EN 14214. Alongside investigated the optimization of the methylesters oxidation stability. Studied oils from crops typical of Greek land and products of Greek industry. Refined oils such as sunflower, soybean, cottonseed, tobacco seed and unrefined as used cooking oil, animal fats, castor oils and residues from spent coffee grounds assessed the reactions of methanolysis. The reactions were performed with the use of sodium and potassium compounds, typical homogeneous catalysts. The experimental results showed that the oils used are attractive alternative raw materials for production of biodiesel. The reaction of aithanolysis with most oils have been reported to produce biodiesel. The production of ethyl ethyl instead of particular interest as it allows the production of a new alternative fuel. Then held the preparation heterogeneous catalysts. Investigated the catalytic behavior of those in the reaction of transesterification. Investigated the factors that influence the efficiency and speed of the reaction. Found the optimum conditions of the reaction variables evaluated and the physicochemical properties of the final products. The use of solid catalysts simplifies the process of transesterification, by eliminating the step of washing and drying methyl. Finally investigated the antioxidant effects of major commercial antioxidant additives. New phenolic additives synthesized and evaluated their effect. The assessment of additives in different types methyl esters and at different concentrations.The oxidation stability measurements were performed using the official method of the European standard. The oxidation stability of the biodiesel is defined as such by the method Rancimat (EN 14112-minimum 6 h). While the oxidation stability measurements were determined by the method Petrotest PetroOXY (prEN 16091). In this method, the European model has not adopted specification limit., Δεληγιάννης Δ. Αλέξανδρος

176 σ., Η υψηλή απόδοση των σύγχρονων κινητήρων των οχημάτων, η απαίτηση για χαμηλότερες εκπομπές ρύπων σε συνδυασμό με τις υψηλές τιμές του πετρελαίου έχουν οδηγήσει σε αυξημένη ευαισθησία τόσο τους καταναλωτές όσο και το κράτος, σχετικά με την ποιότητα των καυσίμων. Επιπρόσθετα, οι διαφορές στον Ειδικό Φόρο Κατανάλωσης μεταξύ των προϊόντων πολύ συχνά λειτουργούν ως κίνητρο για λαθρεμπόριο, με αποτέλεσμα την αλλοίωση των προϊόντων και την απώλεια κρατικών εσόδων. Στην παρούσα διατριβή, σαν πρώτο βήμα εξετάστηκε επιστάμενα η εφοδιαστική αλυσίδα υγρών καυσίμων (από το διυλιστήριο έως τον τελικό καταναλωτή) τόσο από άποψη λειτουργίας όσο και από άποψη αγοράς και περιγράφηκε η εφοδιαστική αλυσίδα μεσαίου μεγέθους εταιρίας εμπορίας πετρελαιοειδών, που αποτέλεσε το αντικείμενο της έρευνας. Ακολούθως μελετήθηκε το κόστος έλλειψης ενός ολοκληρωμένου Συστήματος Διαχείρισης Ποιότητας στην εφοδιαστική αλυσίδα υγρών καυσίμων., Modern vehicle engines high performance, the demand for lower emissions combined with high oil prices have led to increased sensitivity to both consumers and the state concerning fuel quality. In addition, differences in excise duty between products often act as an incentive for smuggling, resulting in product spoilage and loss of government revenue. As the first step of this thesis we have examined the downstream fuel supply chain (from the refinery to the end consumer) in operation and in market terms, and we described the supply chain of the medium-sized petroleum marketing company that was our case study. Then we investigated the implementation and completion of the Quality Management System in the liquid fuels supply chain for, the cost of this implementation as well as the cost for a company that lacks a system like this., Νικόλαος Χ. Λιάπης

240 σ., Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει ως σκοπό την ενζυμική ακυλίωση της κυτταρίνης. Η παραγωγή των αντίστοιχων αλειφατικών εστέρων είναι ιδιαιτέρως σημαντική, καθώς οι τελευταίοι ανήκουν σε μία άκρως ενδιαφέρουσα και χρήσιμη τάξη βιοπολυμερών∙ τα θερμοπλαστικά. Το γεγονός της προέλευσης τους από την κυτταρίνη αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για τη διαδικασία παραγωγή τους. Η κυτταρίνη, λόγω του εκτεταμένου δικτύου δεσμών υδρογόνου που αναπτύσσεται ανάμεσα στις αλυσίδες της, παρουσιάζει μία εξαιρετικά συμπαγή και σχεδόν αδιαπέραστη μοριακή δομή. Έτσι η διαλυτότητα της είναι ιδιαιτέρως περιορισμένη, με αποτέλεσμα να δυσχεραίνεται η όποια χημική επεξεργασία της. Στη συγκεκριμένη εργασία σχεδιάζονται και αναπτύσσονται δυο διαφορετικές και ανεξάρτητες διεργασίες, που ως στόχο έχουν τη διάνοιξη της δομής της κυτταρίνης και την αύξηση της διαθεσιμότητας και της δραστικότητας των υδροξυλίων της. Η πρώτη διεργασία αφορά στη διάλυση και την προκατεργασία της κυτταρίνης (Avicel και ινώδους) σε συγκεκριμένα ιοντικά υγρά ([bmim]Cl, [emim]OAc), έτσι ώστε να αλλοιωθεί η συμπαγής δομή της και να μειωθεί ο αντίστοιχος δείκτης κρυσταλλικότητας. Μετά την παραλαβή της αναγεννημένης κυτταρίνης που προκύπτει, επιχειρείται η ενζυμική της ακυλίωση σε διάφορα μη συμβατικά συστήματα βιοκατάλυσης (οργανικοί διαλύτες, ιοντικά υγρά, συστήματα ελεύθερα διαλυτών). Ως ακυλο-δότες χρησιμοποιήθηκαν οι βινυλ-εστέρες του προπιονικού, του λαυρικού και του στεατικού οξέως. Τα ένζυμα που δοκιμάστηκαν ήταν η λυοφιλιωμένη λιπάση B από Candida αntarctica, η λυοφιλιωμένη λιπάση από Candida cylindracea, η λυοφιλιωμένη λιπάση από Aspergillus niger, η λυοφιλιωμένη λιπάση από Rhizomucor miehei, η ακινητοποιημένη λιπάση B από Candida antarctica, η λυοφιλιωμένη εστεράση από ήπαρ χοίρου, η ακινητοποιημένη εστεράση από ήπαρ χοίρου και η ακινητοποιημένη κουτινάση από Fusarium solani pisi. Από τα αντιδρώντα συστήματα που δοκιμάστηκαν, μόνο στα ελεύθερα διαλυτών επετεύχθη η επιθυμητή αντίδραση εστεροποίησης της κυτταρίνης με τους τρείς διαφορετικούς ακυλο-δότες. Επίσης τα ένζυμα που κατέστησαν ικανά να καταλύσουν τις παραπάνω ακυλιώσεις ήταν η λυοφιλιωμένη εστεράση από ήπαρ χοίρου, η ακινητοποιημένη εστεράση από ήπαρ χοίρου και η ακινητοποιημένη κουτινάση από Fusarium solani pisi. Αντιθέτως, καμία από τις λιπάσες δεν εξέφρασε δραστικότητα. Στο πλαίσιο της μελέτης των επιτυχών αντιδράσεων, εξετάστηκε και η επίδραση που έχουν ορισμένες βασικές παράμετροι στην πορεία των ενζυμικών ακυλιώσεων. Ως αποτέλεσμα παράχθηκαν τρείς διαφορετικοί εστέρες κυτταρίνης∙ η προπιονική κυτταρίνη με μέγιστο ποσοστό εστέρα 1.9%, η λαυρική κυτταρίνη με μέγιστο ποσοστό εστέρα 1.3% και η στεατική κυτταρίνη με μέγιστο ποσοστό εστέρα 0.9%. Η δεύτερη διεργασία αποτελείται από ένα μόνο στάδιο και στηρίζεται στην ταυτόχρονη διόγκωση και ενζυμική ακυλίωση της (ινώδους) κυτταρίνης, σε περιβάλλον υπερκρίσιμου διοξειδίου του άνθρακα. Ως ακυλο-δότες χρησιμοποιήθηκαν οι βινυλ-εστέρες του προπιονικού, του λαυρικού και του στεατικού οξέως. Τα ένζυμα που δοκιμάστηκαν ήταν η ακινητοποιημένη λιπάση B από Candida antarctica, η ακινητοποιημένη εστεράση από ήπαρ χοίρου και η ακινητοποιημένη κουτινάση Fusarium solani pisi. Και οι τρείς βιοκαταλύτες επέδειξαν την ικανότητα ακυλίωσης της κυτταρίνης στο συγκεκριμένο σύστημα με το υπερκρίσιμο ρευστό. Τα προϊόντα που παράχθηκαν ήταν η προπιονική κυτταρίνη με μέγιστο ποσοστό εστέρα 4.4%, η λαυρική κυτταρίνη με μέγιστο ποσοστό εστέρα 4.0% και η στεατική κυτταρίνη με μέγιστο ποσοστό εστέρα ίσο με 3.3%. Επίσης πραγματοποιήθηκε και μελέτη της επίδρασης που είχαν ορισμένες βασικές παράμετροι στην πορεία των μελετώμενων ενζυμικών αντιδράσεων. Τέλος οι παραγόμενοι εστέρες κυτταρίνης αξιολογήθηκαν ως προς ορισμένες χαρακτηριστικές τους ιδιότητες. Ειδικότερα υπολογίστηκε το μέτρο ελαστικότητας Young των παραγόμενων εστέρων (ενδεικτικό της σκληρότητας των συγκεκριμένων υλικών). Επίσης μετρήθηκε ο δείκτης κρυσταλλικότητας τους και μελετήθηκε η μορφολογία της επιφάνειας τους. Θα πρέπει να σημειωθεί πως με τις δυο παραπάνω προσεγγίσεις επιτυγχάνεται για πρώτη φορά η ενζυμική ακυλίωση της κυτταρίνης, με αλειφατικές αλυσίδες μεγάλου μήκους., The present study focuses on the enzymatic acylation of cellulose. Aliphatic esters of cellulose have recently raised the interest on the field of biopolymers, because of their thermoplastic properties. Due to the extended intra- and intermolecular hydrogen bonding between the cellulose chains, this biopolymer has a high crystalline structure. As a result it is completely insoluble in water or in common solvents leading to difficulties in chemical manipulation. In this work there have been developed two different processes in order to open the strict structure of cellulose and make its hydroxyl groups as permeable as possible. In the first methodology, cellulose (Avicel and fibrous) was putted into specific ionic liquids ([bmim]Cl, [emim]OAc), in order to facilitate the unwrap of the structure of the polysaccharide molecule and make it accessible to the enzyme. Thus, after this pretreatment the enzymatic esterification reaction was tested using various media (organic solvents, ionic liquids, solvent free systems). There were used three different acyl donors: vinyl propionate, vinyl laurate and vinyl stearate. The biocatalysts used were the following hydrolases: lyophilized lipase B Candida αntarctica, lyophilized lipase Candida cylindracea, lyophilized lipase Aspergillus niger, lyophilized lipase Rhizomucor miehei, immobilized lipase B Candida antarctica, lyophilized esterase from hog liver, immobilized esterase from hog liver and immobilized cutinase Fusarium solani pisi. From the reaction systems tested, only the solvent free were able to produce the cellulose esters. The enzymes capable of catalyzing the acylation of cellulose were found to be the lyophilized and immobilized esterases from hog liver and the immobilized cutinase from Fusarium solani pisi, while the lipases used did not show any catalytic activity. In order to investigate those reactions further, a number of parameters that affect the reaction course were also studied. Cellulose esters of propionate, laurate and stearate were synthesized with a maximum ester content of 1.9, 1.3 and 0.9%, respectively. Concerning the second methodology, there was designed a system at which cellulose swelling by supercritical carbon dioxide and enzymatic esterification of the swelled macromolecule by acyl groups, are occurred in one step. The cellulosic substrate was fibrous cellulose. The acyl donors used were vinyl propionate, vinyl laurate and vinyl stearate, while the biocatalysts used for this reaction were immobilized lipase B Candida antarctica, immobilized esterase from hog liver and immobilized cutinase Fusarium solani pisi. All the reactions tested with those immobilized enzymes were successful; the formed products were cellulose propionate, cellulose laurate and cellulose stearate with a maximum ester content of 4.4, 4.1 and 3.3%, respectively. In order to investigate those reactions further, a number of parameters that affect the reaction course were also studied. Finally, the produced cellulose esters were mechanically tested as thermoplastic materials; Young’s modulus was calculated as a measure of their stiffness. Additionally the crystallinity index of those materials was measured and the morphology of their surface was also studied. It must be noted that the above novel biocatalytical processes are the first successful attempts on the enzymatic acylation of cellulose with long chain fatty acids., Σταύρος Σ. Γκρέμος

201 σ., Σκοπός της διατριβής ήταν η μελέτη της αντίδρασης της μετεστεροποίησης φυτικών ελαίων και της εστεροποίησης των ελεύθερων λιπαρών οξέων σε αντιδραστήρες διαλείποντος έργου και εμβολικής ροής, ο προσδιορισμός των παράλληλων αντιδράσεων που πραγματοποιούνται στον αντιδραστήρα, καθώς και η μοντελοποίηση των διεργασιών. Η διατριβή επικεντρώθηκε κυρίως στη μελέτη εναλλακτικών μεθόδων εστεροποίησης υψηλής οξύτητας ελαίων ως στάδιο προετοιμασίας για την περαιτέρω παραγωγή βιοντίζελ, και συγκεκριμένα το ενδιαφέρον επικεντρώθηκε στην χρήση ετερογενή υπερόξινου καταλύτη (ρητίνης εναλλαγής ιόντων Purolite CT-275). Με τη συγκεκριμένη διεργασία, αποφεύγονται προβλήματα που εμφανίζονται από τη χρήση ομογενών όξινων καταλυτών και ταυτόχρονα αξιοποιούνται φθηνές πρώτες ύλες όπως χρησιμοποιημένα ή και απόβλητα έλαια, απλοποιώντας αντίστοιχα την διεργασία παραγωγής του βιοντίζελ και συμβάλλοντας στην μείωση του κόστους παραγωγής του βιοκαυσίμου. Η παρούσα διατριβή χωρίζεται σε δύο κύρια μέρη: Μελέτη, μοντελοποίηση και προσομοίωση της διεργασίας της μετεστεροποίησης 1. φυτικών ραφινέ και όξινων ελαίων. 2. Μελέτη, μοντελοποίηση και προσομοίωση της διεργασίας εστεροποίησης ελεύθερων λιπαρών οξέων. Στο 1ο μέρος της διατριβής προσδιορίζεται η κινητική της αντίδρασης της μετεστεροποίησης σε εργαστηριακό αντιδραστήρα διαλείποντος έργου για τη διερεύνηση της συνεισφοράς της θερμικής δράσης, της καταλυτικής δράσης των ελεύθερων λιπαρών οξέων καθώς και στερεού ετερογενούς καταλύτη σε ραφινέ και όξινα έλαια. Η εκτίμηση της συνεισφοράς κάθε παραμέτρου ξεχωριστά δίνει τη δυνατότατα χρήσης ενιαίου κινητικού μοντέλου το οποίο περιγράφει με επιτυχία όλο το σύστημα. Δίδεται έμφαση στον περιορισμό των σφαλμάτων εκτίμησης της επίδρασης διαφόρων παραγόντων όπως η πυκνότητα και η αέρια φάση της μεθανόλης στον προσδιορισμό των κινητικών παραμέτρων της αντίδρασης. Αρχικά, η προσπάθεια επικεντρώθηκε στον προσδιορισμό κινητικού μοντέλου το οποίο να περιγράφει με ακρίβεια τις παραμέτρους της μετεστεροποίησης των ραφινέ ελαίων, τα οποία αποτέλεσαν τη βάση των μετέπειτα υπολογισμών. Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκε μελέτη της αντίδρασης της μετεστεροποίησης σε όξινο βαμβακέλαιου 9,8 % κ.β. και προσδιορισμός των κινητικών παραμέτρων λαμβάνοντας υπόψη τα βασικά ραφινέ πειράματα. Για την περαιτέρω μελέτη της αντίδρασης πραγματοποιήθηκε προσαρμογή του μαθηματικού μοντέλου σε αποτελέσματα καταλυτικής μετεστεροποίησης με τη χρήση ετερογενούς καταλύτη τόσο σε ραφινέ όσο και σε όξινο έλαιο. Η χρήση σταθερών χημικής ισορροπίας αλλά και η εκτίμηση της συνεισφοράς κάθε δράσης βοήθησαν στη βέλτιστη μοντελοποίηση του συστήματος. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων έδειξαν καταλυτική επίδραση από τα ελεύθερα λιπαρά οξέα τόσο στη θερμική όσο και στην καταλυτική μετεστεροποίηση. Ενδιαφέρουσα αποδείχθηκε και η χρήση του στερεού βασικού καταλύτη ο οποίος λειτουργεί συνεργικά με την οξύτητα και μάλιστα η δράση του ενισχύεται από την παρουσία της. Από την επεξεργασία των πειραματικών δεδομένων υπολογίστηκε η ενέργεια ενεργοποίησης για την αντίδραση των τριγλυκεριδίων ίση με 67,30 kJ×mol-1 των διγλυκεριδίων ίση με 58,65 kJ×mol-1 και των μονογλυκεριδίων ίση με 60,41 kJ×mol-1. Η ενέργεια ενεργοποίησης για την αντίδραση της εστεροποίησης των λιπαρών οξέων υπολογίστηκε στα 67,05 kJ×mol-1. Στο 2ο μέρος της διατριβής πραγματοποιήθηκε η μελέτη της αντίδρασης εστεροποίησης των ελεύθερων λιπαρών οξέων που προέρχονται από φυτικά έλαια με τη μεθανόλη παρουσία ετερογενούς υπερόξινου καταλύτη σε αντιδραστήρα πλήρους ανάμιξης διαλείποντος έργου. Ως πρώτη ύλη χρησιμοποιήθηκε όξινο έλαιο υποπροϊόν κολώνας κλασματικής απόσταξης ραφινερίας οξύτητας 38,1 % κ.β. Στα πειράματα, που πραγματοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των κινητικών παραμέτρων και των σταθερών ισορροπίας, η μοριακή αναλογία της μεθανόλης ως προς τα ελεύθερα λιπαρά οξέα διατηρήθηκε σταθερή στο 2,89:1 και 6,6:1 molmol-1, και η θερμοκρασία αντίδρασης στους 90 - 120 οC. Από τα πειραματικά δεδομένα υπολογίστηκαν οι σταθερές της χημικής ισορροπίας της αντίδρασης, η καταλυτική συνεισφορά των ελεύθερων λιπαρών οξέων και οι κινητικές παράμετροι της αντίδρασης. Τα πειραματικά αποτελέσματα επίσης έδειξαν μια αποδοτική λειτουργία του ετερογενή καταλύτη ιδιαίτερα σε θερμοκρασίες λίγο μεγαλύτερες από τους 100 οC και μια ικανοποιητική διατήρηση της καταλυτικής δραστικότητάς του. Από την προσομοίωση των πειραματικών δεδομένων με τη χρήση ψευδο-ομογενούς μοντέλου, θεωρώντας την εστεροποίηση ως αντιστρεπτή αντίδραση δεύτερης τάξης υπολογίστηκε η ειδική ταχύτητα του ρυθμού εστεροποίησης στους 100 οC ίση με 11,3 g2×min-1×mol-1×gcat -1. Τέλος υπολογίστηκε η ενέργεια ενεργοποίησης, η οποία βρέθηκε ίση με 75,16 kJ×mol-1 για την αντίδραση εστεροποίησης και 42,65 kJ×mol-1 για την αντίδραση στης υδρόλυσης. Στο 2ο μέρος της διατριβής μελετήθηκε επίσης η αντίδραση της εστεροποίησης των ελεύθερων λιπαρών οξέων σε αυλωτό ισοθερμοκρασιακό αντιδραστήρα κλίνης σωματιδίων με την παρουσία της ίδια καταλυτικής ρητίνης. Χρησιμοποιήθηκαν χαμηλής οξύτητας φυτικά έλαια της τάξης του 3 % κ.β. και η μοριακή αναλογία μεθανόλης ελεύθερων λιπαρών οξέων ρυθμίστηκε ίση με 10:1 molmol-1. Εκτιμήθηκαν οι κινητικές παράμετροι και η αποδραστικοποίηση του καταλύτη. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε πίεση συστήματος 7 - 10 bar και σε θερμοκρασία 70 - 120 οC, επιτυγχάνοντας αποδόσεις που κυμαίνονται από 10 έως 80 %. Στην προσομοίωση της λειτουργίας του αντιδραστήρα εμβολικής ροής παράλληλα με την αντίδραση της εστεροποίησης συνυπολογίστηκε και η καταλυτική αντίδραση της υδρόλυσης - διάσπασης των γλυκεριδίων. Λαμβάνοντας υπόψη κατά τη μοντελοποίηση του αντιδραστήρα την αντίδραση της διάσπασης επιτεύχθηκε εξαιρετική προσαρμογή των πειραματικών αποτελεσμάτων. Επίσης πραγματοποιήθηκε επιτυχής προσαρμογή του προτεινόμενου μοντέλου σε βιβλιογραφικά δεδομένα. Από τα πειραματικά δεδομένα υπολογίστηκε η ενέργεια ενεργοποίησης της αντίδρασης της εστεροποίησης ίσης με 71 kJ×mol-1 και η αντίστοιχη της υδρόλυσης των γλυκεριδίων ίσης με 264 kJ×mol-1 τιμές η οποίες βρίσκεται κοντά σε αντίστοιχες βιβλιογραφικές αναφορές., The aim of this thesis was to study the transesterification reaction of vegetable oils and esterification reaction of free fatty acids in batch and plug flow reactors, the identification of parallel reactions taking place in the reactor, and the modeling of the process. The thesis focused primarily on the study of alternative methods of esterification of high acidity oils as preparation for further production of biodiesel, particularly with the use of heterogeneous strongly acidic catalyst (ion exchange resign Purolite CT-275). With this process, problems arising from the use of homogeneous acid catalysts are avoided and simultaneously cheap raw materials such as used or waste oils and fats are exploited, simplifying the production process of biodiesel and helping to reduce production cost of biofuels. This thesis is divided into two main parts: Kinetic modeling and simulation of the transesterification process of both 1. refined and acid vegetable oils 2. Study, kinetic modeling and simulation of the esterification reaction process of free fatty acids. In the first part, the kinetics of the transesterification reaction in a laboratory batch reactor was determined with the aim to investigate the contribution of the thermal effect, the catalytic effect of free fatty acids and solid heterogeneous catalyst in both refined and acid oils. Estimating separately the contribution of each parameter gives possibility to use a single kinetic model that successfully describes the whole system. The emphasis is to reduce the error of evaluating the effect of various factors such as density and vapor phase of methanol in the determination of kinetic parameters of the reaction. Initially, efforts focused on identifying a kinetic model that successfully describes the transesterification reactions taking place in refined oils and which became the basis for subsequent calculations. After, the reaction of transesterification in acid cottonseed oil (9.8 wt %) was studied and the kinetic parameters were determination taking into account the key refined experiments. To further study the reaction, the mathematical model was fitted to catalytic transesterification data using a heterogeneous catalyst for both refined and acid oils. The use of chemical equilibrium constants and the assessment of the contribution of each effect helped the optimum model fitting. The experimental results revealed the catalytic effect of free fatty acids in both the thermal and catalytic transesterification. The use of the solid base catalyst which acts synergistically with the acidity was proved interesting and indeed its catalytic effect is enhanced by the presence of the free fatty acids. From the analysis of the experimental data the activation energy for the conversion reaction of triglycerides was calculated equal to 67.30 kJ×mol-1, for diglycerides equal to 58.65 kJmol-1 and for monoglycerides equal to 60.41 kJ×mol-1. The activation energy for the reaction of fatty acids esterification was estimated 67.05 kJ×mol-1. In the second part of this thesis the esterification reaction of the free fatty acids derived from vegetable oils was studied, in the presence of a strongly acidic heterogeneous catalyst in a batch reactor. The feedstock used was a highly acidic oil (38.1 wt %) derived as byproduct from a vegetable oil refinery distillation column. In experiments performed to determine the kinetic parameters and equilibrium constants, the molar ratio of methanol to free fatty acids was kept constant at 2.89:1 and 6.6:1 molmol-1, while the reaction temperature ranged from 90 to 120 oC. From the experimental data there were calculate the equilibrium constants, the catalytic contribution of free fatty acids and the kinetic parameters of the reaction. The experimental results also showed an effective operation of the heterogeneous catalyst at temperatures slightly higher than 100 oC and a good preservation of the catalytic activity. From the simulation of the experimental data, the specific rate constant of the esterification at 100 oC was calculated equal to 11.3 g2×min-1×mol-1×gcat -1 using a pseudo-homogeneous model and considering the esterification as a second-order reversible reaction. Finally, the calculated activation energy was equal to 75.16 kJ×mol-1 for the reaction of esterification and 42.65 kJ×mol-1 for the reverse hydrolysis reaction. In the second part, the free fatty acid esterification reaction in an isothermal fixed bed reactor was studied in the presence of the same catalytic resin. We used low acidity vegetable oils with about 3 wt% FFAs and the methanol to free fatty acids molar ratio was adjusted equal to 10:1 molmol-1. The kinetic parameters as well as the catalyst deactivation were estimated. The reaction was performed at 7 - 10 bar pressure and temperatures from 70 to 120 oC, achieving yields ranging from 10 to 80 %. In simulating the plug flow reactor operation the catalytic reaction of glycerides hydrolysis - fat splitting was taken into account in parallel with the esterification reaction. Taking into account the decomposition reaction in the reactor modeling, excellent fitting of the experimental results was achieved. A successful fitting of the proposed model in literature data has also been achieved. The activation energy of the esterification reaction calculated from experimental data of the fixed bad reactor was equal to 71 kJ×mol-1 and the corresponding for glycerides hydrolysis equal to 264 kJ×mol-1, values which are close to the corresponding literature references., Στέργιος Α. Πασιάς

338 σ., Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν τόσο σε μοριακό όσο και σε βιοχημικό επίπεδο δύο εστεράσες του φερουλικού οξέος των ημικυτταρινών από δύο ευκαρυωτικούς μικροοργανισμούς, το μεσόφιλο μύκητα Fusarium oxysporum και το θερμόφιλο μύκητα Sporotrichum thermophile. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε in silico ανάλυση των γονιδιωμάτων των παραπάνω μικροοργανισμών και στη συνέχεια των αλληλουχιών των εστερασών του φερουλικού οξέος που συναντώνται σε αυτούς. Οι αλληλουχίες δύο γονιδίων που κωδικοποιούν για εστεράσες του φερουλικού οξέος απομονώθηκαν και πολλαπλασιάστηκαν με τη βοήθεια αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και έπειτα κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν λειτουργικά μέσω του συστήματος έκφρασης του μεθυλότροφου ζυμομύκητα Pichia pastoris Χ33. Επιπλέον, μελετήθηκαν οι φυσικοχημικές ιδιότητες των ανασυνδυασμένων ενζύμων που παρήχθησαν, FoFaeC και StFaeB. H ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε για μια τρίτη ημικυτταρινάση, την ξυλανάση FoXyn11 της οικογένειας 11 των γλυκοζυλ-υδρολασών από το F. oxysporum και επιχειρήθηκε επιτυχώς η ενίσχυση της παραγωγής των ενζύμων FoFaeC και FoXyn11 μέσω βελτιστοποίησης των συνθηκών ζύμωσης του μύκητα P. pastoris. Σε επόμενο στάδιο της διατριβής, κατευθυνόμενες σημειακές μεταλλάξεις στις νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των καταλυτικών κέντρων των ενζύμων FoFaeC και StFaeB, οδήγησαν στον εντοπισμό της καταλυτικής σερίνης η οποία μετέχει στο μηχανισμό υδρόλυσης των εστερικών δεσμών, επαληθεύοντας την κατηγοριοποίησή τους στην οικογένεια των εστερασών σερίνης και συγκεκριμένα στην ομάδα των εστερασών του φερουλικού οξέος. Περαιτέρω ανάλυση της αμινοξικής αλληλουχίας της StFaeB, με τη βοήθεια εργαλείων της Bιοπληροφορικής, συνέβαλλε στην πρόβλεψη της τρισδιάστατης δομής της. Ο πλήρης χαρακτηρισμός της εξειδίκευσης υποστρώματος των υπό μελέτη εστερασών του φερουλικού οξέος διενεργήθηκε με τη χρήση διαφόρων συνθετικών και φυσικών υποστρωμάτων, συμπεριλαμβανομένων των κινναμικών μεθυλεστέρων, των αλκυλ-εστέρων του φερουλικού οξέος και των π-νιτροφαινυλ-αραβινοφουρανοζιτών. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτών οδήγησαν στην κατηγοριοποίηση των εστερασών FoFaeC και StFaeB στις ομάδες C και Β, αντίστοιχα, σύμφωνα με βιβλιογραφικά δεδομένα, ενώ η σύγκριση των αμινοξικών τους αλληλουχιών με αλληλουχίες γνωστών από τη βιβλιογραφία εστερασών του φερουλικού οξέος, επέτρεψαν την κατηγοριοποίηση τους στις υποοικογένειες (Subfamilies) SF1 και SF6 αντίστοιχα. Παράλληλα, τα εν λόγω πρωτεϊνικά μόρια εξετάστηκαν ως προς τις βέλτιστες συνθήκες δράσης τους και τη σταθερότητα που εμφανίζουν σε ένα εύρος τιμών pH και θερμοκρασιών. Στη συνέχεια μελετήθηκε εκτενώς η συνεργιστική δράση μεταξύ των εστερασών του φερουλικού οξέος και των ξυλανασών. Και οι δύο εξεταζόμενες ανασυνδυασμένες εστεράσες, αποδείχθηκε ότι έχουν την ικανότητα να απελευθερώνουν φερουλικό οξύ από λιγνινοκυτταρινούχα υλικά, μόνο με τη βοήθεια ξυλανασών. Η μέγιστη τιμή παραγόμενου - από τα ζεύγη των ενζύμων - φερουλικού οξέος μετρήθηκε κατά τη συνεργιστική δράση της εστεράσης FoFaeC και της εμπορικής ξυλανάσης TlXyn11 από το μύκητα Trichoderma longibrachiatum. Ο συγκεκριμένος συνδυασμός ενζύμων χρησιμοποιήθηκε και σε αντιδράσεις υδρόλυσης του στερεού υπολείμματος βύνης, ενώ περαιτέρω ενίσχυση της απελευθέρωσης φερουλικού οξέος παρατηρήθηκε κατόπιν προσθήκης πολυενζυμικού εκχυλίσματος από το μύκητα F. oxysporum. Τέλος, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ανενεργών μορφών των υπό μελέτη εστερασών, οι οποίες δημιουργήθηκαν κατόπιν σημειακής μεταλλαξιγένεσης, και των ολιγοσακχαριτών από αραβινοξυλάνη σίτου, διερευνήθηκαν μέσω Θερμιδομετρίας Ισόθερμης Τιτλοδότησης, με σκοπό την κατανόηση της ποικιλομορφίας των ενζύμων αυτών και του ρόλου τους στην αποικοδόμηση των φυτικών κυτταρικών τοιχωμάτων. Ο φερουλοποιημένος αραβινο-ξυλοτρισακχαρίτης εμφάνισε ισχυρότερη δέσμευση στην εστεράση FoFaeC S217A, ενώ η 1,5-α-L-αραβινοτετραόζη φάνηκε να μην αλληλεπιδρά με τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες. Για πρώτη φορά, πραγματοποιήθηκε μια επιτυχημένη προσπάθεια μελέτης και ερμηνείας των μηχανισμών κατάλυσης των εστερασών του φερουλικού οξέος από τους μύκητες F. oxysporum και S. thermophile, με χρήση μοριακών τεχνικών και εργαλείων Bιοπληροφορικής, σηματοδοτώντας έτσι την απαρχή μιας νέας πορείας στην εκμετάλλευση των ενζύμων αυτών στους διάφορους τομείς της βιομηχανίας., The present PhD thesis focuses on the molecular and biochemical study of the ferulic acid esterases of hemicellulose by two eukaryotic microorganisms, the mesophilic fungus Fusarium oxysporum and the thermophilic fungus Sporotrichum thermophile. An in silico analysis of the microorganism genomes followed by esterase of ferulic acid sequences analysis were held. The sequences of two genes coding for ferulic acid esterases were isolated and amplified using polymerase chain reaction and then cloned and functionally expressed in the expression system of methylotrophic yeast Pichia pastoris X33. Furthermore, the physicochemical properties of the produced recombinant enzymes FoFaeC and StFaeB, were studied. The same procedure was followed using a third hemicellulose, xylanase FoXyn11, member of fungal glycosyl-hydrolase family 11 from F. oxysporum and the production enhancement of the enzymes FoFaeC and FoXyn11 was successfully carried out by optimizing the P. pastoris fermentation conditions. The molecular biology technique site-directed mutagenesis was chosen in order to experimentally prove that the enzymes FoFaeC and StFaeB harbor the catalytic serine and classified in serine esterases family, especially in ferulic acid esterases group. Additional analysis of the amino acid sequence of StFaeB, using several bioinformatics tools, resulted in three-dimensional structure prediction. The complete characterization of ferulic acid esterases hydrolytic profiles was performed using various synthetic and natural substrates, including methyl esters of hydroxycinnamates, alkyl ferulates and monoferuloylated 4-nitrophenyl glycosides. The results of these experiments allowed the classification of the esterases FoFaeC and StFaeB into types C and B, respectively, according to literature, while the comparison of the amino acid sequences of these enzymes with known ferulic acid esterases allowed their categorization into subfamilies SF1 and SF6, respectively. The optimum temperature and pH value of the above enzyme activities and their thermo- and pH-stability were also determined. The synergism of ferulic acid esterases with xylanases was extensively studied. Both of the studied recombinant esterases showed the ability to release ferulic acid from ligninocellulosic materials only with the aid of xylanase. The maximum ferulic acid production was achieved by the synergistic action of esterase FoFaeC with commercial xylanase TlXyn11 by the fungus Trichoderma longibrachiatum. This certain combination of enzymes was used for the hydrolysis of brewers’ spent grain, while further increase of the ferulic acid release was observed after the addition of crude extract from F. oxysporum in the reaction. The synergistic interaction between the inactive forms of the enzymes that were produced after site-directed mutagenesis, and oligosaccharides from wheat arabinoxylan, were investigated using Isothermal Titration Calorimetry, in order to understand the ferulic acid esterases diversity and their role in plant cell wall degradation. The feruloylated oligosaccharide was showed stronger binding affinity to esterase FoFaeC S217A, while 1,5-α-L-arabinotetraose didn’t interact with any of the above proteins. This is the first report concerning a successful study and understanding of the catalytic mechanisms of ferulic acid esterases from the fungi F. oxysporum and S. thermophile, using molecular techniques and bioinformatics tools, indicating a new beginning in the exploitation of these enzymes in various fields of industry., Μαρία Δ. Μουκούλη

163 σ., Τα τοιχώματα των φυτικών κυττάρων αποτελούν την πιο άφθονη πηγή οργανικού άνθρακα στη γη και η αξιοποίησή τους σε βιοτεχνολογικές εφαρμογές έχει προσελκύσει τα τελευταία χρόνια έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον. Τα ένζυμα που συμβάλλουν στην αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον λόγω της εφαρμογής τους σε πληθώρα διεργασιών όπως είναι η βιομηχανία χάρτου, η αρτοποιία, η υφαντουργία, η παραγωγή ζωωτροφών και απορρυπαντικών και η παραγωγή βιοαιθανόλης δεύτερης γενιάς, χρησιμοποιώντας ως πρώτη ύλη κυτταρινούχα φυτά, αγροτικά ή δασικά παραπροϊόντα ή ακόμα και απορρίματα. Ειδικότερα, οι ερευνητικές προσπάθειες των τελευταίων ετών έχουν στραφεί στη μείωση του ενζυμικού φορτίου και κατά συνέπεια του κόστους που απαιτείται για τη μετατροπή της βιομάζας σε ζυμώσιμα σάκχαρα ώστε να είναι εφικτή και συμφέρουσα η παραγωγή βιοαιθανόλης σε βιομηχανικό επίπεδο. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη βιοκαταλυτών που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας με τη βοήθεια εργαλείων μοριακής και δομικής βιολογίας. Πιο συγκεκριμένα, χαρακτηρίστηκαν βιοχημικά δύο πρωτεΐνες της οικογένειας 61 της βάσης δεδομένων CAZy (Carbohydrate-Active enZYmes Database) και μελετήθηκαν κρυσταλλογραφικά δύο ένζυμα η δράση των οποίων ήταν ήδη γνωστή, μία ξυλανάση και μία εστεράση του φερουλικού οξέος. Αρχικά γίνεται μία ανασκόπηση της σύστασης του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος και των ενζύμων που συμβάλλουν στην αποικοδόμησή του. Τα ένζυμα αυτά έχουν κατηγοριοποιηθεί σε οικογένειες ανάλογα με την αμινοξική τους αλληλουχία. Αναλύονται ειδικότερα οι ιδιότητες και τα χαρακτηριστικά των ενζύμων που ανήκουν στις οικογένειες των γλυκοζιδικών υδρολασών 61 και 10 της CAZy και που μελετήθηκαν στo πλαίσιo της παρούσας εργασίας. Παρουσιάζεται επίσης η μέθοδος της κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ ως εργαλείο για τη δομική μελέτη των μακρομορίων. Οι πρωτεΐνες της οικογενείας 61 που μελετήθηκαν προέρχονταν από τους μύκητες Fusarium oxysporum (FoCel61) και Sporotrichum thermophile (StCel61). Κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν μέσω της μεθυλότροφης ζύμης Pichia pastoris και χαρακτηρίστηκαν ως προς την ικανότητά τους να υδρολύουν μία ποικιλία σακχαρούχων υποστρωμάτων. Εξετάστηκε επίσης η συμβολή τους στην αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας παρουσία των κλασικών κυτταρινασών και συσχετίστηκε η παρατηρούμενη συνεργιστική δράση με τη σύσταση των χρησιμοποιούμενων υλικών. Βρέθηκε ότι τα ένζυμα αυτά έχουν την ικανότητα να αυξάνουν το βαθμό μετατροπής των λιγνινοκυτταρινούχων υποστρωμάτων όταν συνδυάζονται με τα γνωστά υδρολυτικά ένζυμα που χρησιμοποιούνται ευρέως στις διεργασίες αυτές και ότι η βελτίωση αυτή σχετίζεται με την περιεκτικότητα του υποστρώματος σε λιγνίνη. Η δομική μελέτη δύο ημικυτταρινασών που προέρχονται από το F. oxysporum, μίας ξυλανάσης της οικογένειας 10 (FoXyn10a) και μίας εστεράσης του φερουλικού οξέος τύπου C (FoFaeC) πραγματοποιήθηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Κρύσταλλοι των δύο ενζύμων με ικανότητα περίθλασης των ακτίνων Χ αναπτύχθηκαν σε μία ποικιλία συνθηκών. Για τον προσδιορισμό της δομής της FoXyn10a εφαρμόστηκε η τεχνική της μοριακής αντικατάστασης χρησιμοποιώντας ως αρχικό μοντέλο τη δομή μίας ομόλογης ξυλανάσης από το Cellumonas fimi. Η καινούρια δομή ανέδειξε ότι η FoXyn10a υιοθετεί τη διαμόρφωση (β/α)8 barrel, μία αναδίπλωση κοινή σε όλα τα μέλη της οικογένειας 10, αλλά και την παρουσία ενός καινούριου βρόχου κοντά στην είσοδο του ενεργού κεντρού με πιθανό λειτουργικό ρόλο., Plant cell walls are the most abundant source of organic carbon on the planet and their exploitation in biotechnological applications has attracted significant research interest. The enzymes implicated in plant biomass degradation are employed in a variety of industrial processes, ranging from paper, bread-making, textile, animal feed and detergent industry to the production of second generation bioethanol from cellulosic plants, agricultural and forestry byproducts or waste. Recent research efforts have focused on the reduction of protein loading required for the breakdown of lignocellulose to fermentable sugars, as the enzymic cost is currently the main obstacle of bioethanol production at industrial scale. The aim of the present PhD thesis was the biochemical and structural study of biocatalysts implicated in plant cell wall degradation. Two enzymes that belong to family glycoside hydrolase (GH) family 61 of CAZy (Carbohydrate-Active enZYmes) database were characterized biochemically while structural studies were carried out on a xylanase and a feruloyl esterase. In the first part of the thesis, the plant cell wall composition as well as the enzymes involved in its degradation are described. The latter have been divided into different families based on their amino acid sequence. The properties and characteristics of enzymes that belong to the GH families 61 and 10 of CAZy database are presented in more detail. The basic principles of X-ray crystallography, employed for the structural study of macromolecules, are also outlined. FoCel61, a Fusarium oxysporum GH61 and StCel61, a Sporotrichum thermophile GH61 were cloned and heterologously expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Their ability to hydrolyze a variety of polysaccharide substrates was subsequently investigated. Synergism experiments were performed by combining these enzymes with common cellulases and the resulting findings were correlated to the composition of the hydrolyzed material. It was found that both enzymes had the ability to increase the degree of lignocellulose conversion when combined with other cellulases and that this enhancing effect was dependent on the lignin content of the substrate. The structural characterization of two hemicellulases derived from F. oxysporum, a GH10 xylanase (FoXyn10a) and a type C feruloyl esterase (FoFaeC) was performed by X-ray crystallography. Diffracting crystals of both enzymes were grown under a variety of conditions. The structure of FoXyn10a was solved by molecular replacement using an homologous Cellumonas fimi xylanase as a starting model. FoXyn10a folds in the classical (8 barrel (TIM barrel) while the most striking difference observed, upon comparison with related GH10 structures, is the presence of an elongated loop above the catalytic cleft with possible functional role., Μαρία Β. Δημαρόγκωνα

147 σ., Αντικείμενο της παρούσης διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη των μηχανισμών ρύθμισης δυο οργανισμών βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος, του φυτού της ελαιοκράμβης και του βακτηρίου Escherichia coli, με μεθοδολογίες Βιολογίας Συστημάτων. Προκειμένου οι βιολογικοί μηχανισμοί να γίνουν κατανοητοί με την έννοια του συστήματος, είναι απαραίτητη η ολιστική εξέταση των βιολογικών δομών σε διάφορα επίπεδα οργάνωσης (γονιδιώματος, κυττάρου, ιστού κ.α.) καθώς και των δυναμικών ιδιοτήτων τους, αντί για τη μελέτη των χαρακτηριστικών των μεμονωμένων μερών ενός κυττάρου ή ενός οργανισμού. Αρχικά, παρουσιάζεται η ανάπτυξη υπολογιστικού μοντέλου μεγάλης κλίμακας του κεντρικού μεταβολισμού του εμβρύου της ελαιοκράμβης (Brassica napus) που θεωρείται κυτταρικό εργοστάσιο παραγωγής ελαίου υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η ανάπτυξη μοντέλων για την εφαρμογή προσομοιώσεων επιτρέπει τη συστηματική εισαγωγή διαταραχών και συνεπακόλουθη μελέτη των επιπτώσεών τους. Στο υπολογιστικό μοντέλο εφαρμόστηκαν μαθηματικές μέθοδοι μείωσης της πολυπλοκότητας έτσι ώστε οι ιδιότητες του μεταβολικού δικτύου να αναχθούν σε μικρό αριθμό σημαντικών ρυθμιστικών αντιδράσεων. Συνεπώς, επετεύχθη η ποσοτικοποίηση του ρυθμιστικού ρόλου των ενζυμικών δραστικοτήτων και αναδείχθηκαν οι πιο σημαντικοί εν δυνάμει ενζυμικοί στόχοι για την ρύθμιση του μεταβολισμού, με έμφαση στη βιοσύνθεση των λιπιδίων. Οι υπολογιστικές προσομοιώσεις της ανάπτυξης του εμβρύου που πραγματοποιήθηκαν, ήταν σύμφωνες με πειραματικές παρατηρήσεις από τη βιβλιογραφία και απέδειξαν τη λειτουργικότητα του μοντέλου αλλά και τη χρησιμότητά του για τη μελέτη του ρυθμιστικού ρόλου μεταγραφικών παραγόντων. Επίσης, πιθανοί ενζυμικοί στόχοι για την ρύθμιση της βιοσύνθεσης των λιπιδίων εξετάστηκαν μέσω της εφαρμογής υπολογιστικής προσομοίωσης γενετικών τροποποιήσεων. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής παρουσιάζεται η ανάπτυξη μιας υπολογιστικής διαδικασίας πρόβλεψης στόχων μεταγραφικών παραγόντων, σε επίπεδο ολόκληρου γονιδιώματος του βακτηρίου Escherichia coli. Οι μεταγραφικοί παράγοντες αποτελούν το κύριο μέσο ρύθμισης της έκφρασης των γονιδίων και μετάδοσης σήματος στο κύτταρο. Μια κατηγορία μεταγραφικών παραγόντων, οι ρυθμιστές απόκρισης, αποτελούν μέρη των συστημάτων δυο συστατικών και ελέγχουν την μεταγραφική απόκριση των βακτηριακών κυττάρων στα εξωτερικά ερεθίσματα του περιβάλλοντος. Η μελέτη των συστημάτων δυο συστατικών παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον στη Βιοτεχνολογία, καθώς αυτά αποτελούν τη μοριακή βάση μιας σειράς βασικών βακτηριακών ιδιοτήτων (χημειόταξη, αντίσταση στα αντιβιοτικά, βιοσύνθεση μεταβολικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας κ.α). Η υπολογιστική διαδικασία που αναπτύχθηκε στα πλαίσια της διατριβής επιτρέπει την αυτόματη ανίχνευση πολλαπλών θέσεων πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων και συνεπακόλουθης στατιστικής ανάλυσης Όρων Γονιδιακών Οντολογιών, με σκοπό τη σύνδεση των θέσεων πρόσδεσης με βιοχημικά μονοπάτια. Η διαδικασία αυτή εφαρμόστηκε στη μελέτη του συστήματος δυο συστατικών AtoSC και ανέδειξε πιθανούς γονιδιακούς στόχους, εκ των οποίων 21 επιβεβαιώθηκαν και πειραματικά. Συνεπώς, η υπολογιστική διαδικασία που παρουσιάζεται, εκτός από την ανάδειξη της μοριακής βάσης λειτουργιών του AtoSC, αποτελεί συμβολή στη διαλεύκανση των πολύπλοκων δικτύων των βακτηριακών σηματοδοτικών μηχανισμών ρύθμισης, μέσω της στατιστικής σύνδεσης βιολογικών μονοπατιών με ελάχιστα διατηρημένες ρυθμιστικές αλληλουχίες DNA., The scope of the present thesis is the study of regulatory mechanisms of two organisms of great biotechnological interest, the plant rapeseed and the bacterium Escherichia coli, by applying Systems Biology methodologies. In order to understand a biological mechanism as a system, it is necessary to examine the biological structures and their dynamic properties in a holistic manner and in different levels of organization (genomic, cellular, tissue etc.), instead of investigating the properties of isolated components. Firstly, the development of a large-scale computational model is presented, which describes the central metabolism of the rapeseed embryo (Brassica napus) that is considered as a cellular factory of production of oil with high added value. The computational modeling permits the simulation of the systematic application of perturbations and the subsequent investigation of their effect. The developed computational model was subjected to mathematical methods for complexity reduction in order to reduce the metabolic network properties to a small number of important regulatory reactions. Therefore, the quantification of the regulatory role of the enzymatic activities was achieved, resulting to the highlight of the most important potential enzymatic targets for the regulation of metabolism, with emphasis to lipid biosynthesis. The computational simulations of seed development were consistent with experimental measurements from the literature and they hence confirmed the model functionality as well as its usefulness to the study of the regulatory role of transcription factors. Further, potential enzymatic targets for lipid biosynthesis regulation were investigated by applying computational simulations of genetic modifications. In the second part, a computational procedure is presented, which performs automatic detection of transcription factor binding sites in the level of the whole genome of the bacterium Escherichia coli. The transcription factors are the main mechanism of gene expression regulation and signal transduction in the cell. A particular category of transcription factors, the response regulators, control the transcriptional response of the bacterial cells to external environmental stimuli, as parts of Two-Component Systems. The study of these systems is important to Biotechnology as they are behind the molecular basis of main bacterial properties (chemiotaxis, resistance to antibiotics, biosynthesis of high added-value products etc). The developed computational procedure permits the automatic detection of multiple transcription factor binding sites and the subsequent statistical analysis of Gene Ontology Terms, in order to correlate the binding sites with biochemical pathways. The procedure was applied to the study of the Two-Component System AtoSC and detected many potential gene targets, 21 of which were experimentally confirmed. Thus, the presented computational procedure not only revealed the molecular basis of AtoSC functions, but it also represents an important contribution to the examination of networks of bacterial signal transduction regulatory mechanisms, by statistically correlating biological functions with weakly conserved regulatory DNA sequences., Ελευθέριος Δ. Πιλάλης

336 σ., Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, μελετήθηκαν σε συνθήκες υγρής βυθισμένης καλλιέργειας (ΥΒΚ) δύο είδη μακρομυκήτων με σκοπό τη βιοτεχνολογική τους αξιοποίηση ως φυσική πηγή βιολειτουργικών διατροφικών συστατικών. Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε το εδώδιμο Pleurotus ostreatus, καθώς και το Ganoderma australe, το γένος του οποίου θεωρείται από τα σημαντικότερα ως προς την παραγωγή φαρμακευτικών ενώσεων. Τα στελέχη των παραπάνω μακρομυκήτων που μελετήθηκαν για πρώτη φορά, συλλέχτηκαν από τον Ελλαδικό χώρο και βρίσκονται κατατεθειμένα στη Συλλογή Καλλιεργειών ATHUM του Πανεπιστημίου Αθηνών (ATHUM 4438 και ATHUM 4345, αντίστοιχα). Ο αρχικός στόχος της μελέτης προσανατολίστηκε στον προσδιορισμό του καταλληλότερου μέσου ανάπτυξης για μέγιστη παραγωγής βιομάζας από τα δύο στελέχη μακρομυκήτων. Σε αυτήν την κατεύθυνση, η επιλεκτική αφομοίωση 95 διαφορετικών πηγών άνθρακα από τους μακρομύκητες με τη χρήση της μεγάλης αποδοτικότητας μεταβολικής ανάλυσης FF Biolog επέτρεψε την αρχική χαρτογράφηση του μεταβολισμού τους και τον περεταίρω ορθότερο σχεδιασμό του μέσου ανάπτυξης για την παραγωγή βιομάζας. Αφού αξιολογήθηκαν και διαφορετικές πηγές αζώτου (απλές και σύνθετες), διερευνήθηκε η βέλτιστη σύνθεση του μέσου ανάπτυξης για μέγιστη παραγωγή μυκηλιακής βιομάζας με τη μεθοδολογία της επιφανειακής απόκρισης (RSM), βασιζόμενη σε κεντρικό πειραματικό σχεδιασμό. Μετά τη δοκιμή του άριστου μέσου ανάπτυξης σε κλίμακα βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου συνεχούς ανάδευσης όγκου 20 L, η παραγωγή βιομάζας έλαβε τη μέγιστη τιμή 10.1 g/L μετά από 112 h για την περίπτωση του G. australe, και 39.2 g/L μετά από 68 h καλλιέργειας για το P. ostreatus. Η παραγωγικότητα δε, αυξήθηκε κατά 60% και 79%, αντίστοιχα για το G. australe και το P. ostreatus. Λαμβάνοντας υπόψη το έντονο ενδιαφέρον για την αξιοποίηση των μακρομυκήτων στη βιομηχανία τροφίμων και φαρμάκων, μελετήθηκε ακόμα η σύσταση της βιομάζας από την ανάπτυξη των δύο στελεχών μακρομυκήτων στο βιοαντιδραστήρα ως προς το περιεχόμενό τους σε βιολειτουργικά συστατικά (π.χ. διαιτητικές ίνες, α- και β- γλουκάνες, πρωτεΐνες, διατροφικά πολύτιμα λιπαρά οξέα) Μάλιστα, στις μυκηλιακές δομές και των δύο στελεχών μακρομυκήτων ανακτήθηκαν φαρμακοδιατροφικά συστατικά που σε πολλές περιπτώσεις τα ποσοστά τους βρέθηκαν υψηλότερα σε σχέση με των αντίστοιχων καρποσωμάτων που απαντώνται στην φύση. Παράλληλα, με σκοπό την οικονομική συμφέρουσα μέγιστη απόδοση διατροφικά πολύτιμων βιοενεργών πολυσακχαριτών, μελετήθηκε η επίδραση διαφορετικών πηγών άνθρακα και αζώτου στο μέσο ανάπτυξης για την παραγωγή αυτών σε συνθήκες ΥΒΚ. Τέλος, το αντικείμενο της διατριβής κινήθηκε στην επιστημονική περιοχή των φυσικών προϊόντων μικροβιακής προέλευσης, την απομόνωσή τους και τη δομική ταυτοποίησή τους. Με σκοπό την απομόνωση και ταυτοποίηση των μεταβολιτών που παράχτηκαν από τους δύο μακρομύκητες σε συνθήκες YBK σε βιοαντιδραστήρα διεξάχθηκε εκχύλιση της συλλεγόμενης βιομάζας με κατάλληλους οργανικούς διαλύτες. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός των εκχυλισμάτων βασίστηκε κυρίως σε χρωματογραφικές τεχνικές [π.χ. υγρή χρωματογραφία ανοιχτής στήλης, παρασκευαστική TLC και HPLC, υγρή χρωματογραφία μέσης πίεσης (MPLC), χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού σε στήλη Sephadex LH-20, χρωματογραφία προσρόφησης με ρητίνη τύπου XAD-4, χρωματογραφία κατανομής με φυγοκέντριση (FCPC)]. Για την ταυτοποίηση των ουσιών που απομονώθηκαν χρησιμοποιήθηκαν φασματοσκοπικές τεχνικές (13C-NMR, 1H-NMR, και 2D NMR, ESI-HRMS), χημικές συσχετίσεις σε συνδυασμό με τις GC/MS αναλύσεις και συγκρίσεις με βιβλιογραφικά δεδομένα. Όλοι οι μεταβολίτες που απομονώθηκαν βρίσκουν ευρύ φάσμα εφαρμογών στη βιομηχανία τροφίμων, φαρμάκων και καλλυντικών βασιζόμενοι σε βιβλιογραφικά δεδομένα. Συγκεκριμένα, από το μυκήλιο του G. australe, απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν συνολικά 5 μεταβολίτες. 2 τερπενοειδή μόρια και 3 λιπαρά οξέα. Για πρώτη φορά αναφέρεται η παρουσία του 9-παλμιτολεϊκού οξέος και της εργοστα-5,7,22-τριεν-3β-όλης στο μυκήλιο, ενώ το 19-οκτακοσενοϊκό οξύ απομονώθηκε για πρώτη φορά από το G. australe. Από το μυκήλιο του P. ostreatus, απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν συνολικά 18 μεταβολίτες, και συγκεκριμένα: λιπαρά οξέα και οι αντίστοιχοι εστέρες τους, 4 φαινολικοί μεταβολίτες, 3 αλκαλοειδή και 2 νουκλεοτίδια. Η trans-3,4-διυδρο-3,4,8-τριυδροξυναφθαλεν-1(2Η)-όνη, το ινδολο-3-καρβοξυλικό οξυ, η 3-φορμύλ-πυρρόλη και το π-υδροξυ-βενζοϊκό οξύ αποτελούν φυσικά προϊόντα που απομονώθηκαν για πρώτη φορά από το P. ostreatus. Συνοψίζοντας, η προτεινόμενη διεργασία ανάπτυξης του G. australe και του P. ostreatus σε συνθήκες YBK οδήγησαν σε υψηλή παραγωγή βιομάζας πλούσια σε βιοενεργούς μεταβολίτες. Επιπλέον, τα ευρήματα της παρούσας διατριβής θέτουν τη βάση και για μια ελκυστικά συμφέρουσα και αποδοτική προσέγγιση παραγωγής αυτών των χρήσιμων φυσικών προϊόντων σε συνθήκες ΥΒΚ σε βιομηχανική κλίμακα., The current dissertation focuses on two promising Greek strains of Basidiomycetes growing in submerged liquid cultures, aiming at their biotechnological application in discovery of natural products. Specifically, it was investigated the cosmopolitan edible Pleurotus ostreatus and the wild, medicinal Ganoderma australe. Both strains which were of Greek origin, were obtained from the ATHUM Culture Collection of Fungi of the National and Kapodistrian University of Athens (P. ostreatus ATHUM 4438 and G. australe ATHUM 4345) and are studied for the first time. The primary objective of the study was oriented to identify the most suitable culture medium for maximum biomass production for both strains. The Biolog FF MicroPlate was used to screen 95 different carbon sources for growth monitoring. The pattern of substrate catabolism formed a substrate assimilation fingerprint which was useful in selecting components for media optimization of maximum biomass production. Response surface methodology (RSM), based on the central composite design was applied to explore the optimum concentrations of carbon and nitrogen sources of culture medium. When the improved culture medium was tested in a 20 L stirred tank bioreactor, the biomass reached its maximum value 10.1 g/L after 112 h and 39.2 g/L after 68 h of growth in the cases of G. australe and P. ostreatus, respectively. Additionally, the productivity was increased by 60% and 79% for the G. australe and P. ostreatus bioprocess, respectively.Considering the interest of mushrooms for using them as food supplements, this work also demonstrates the nutraceutical composition (e.g. dietary fibers, α- and β- glucans, proteins, essential fatty acids) of biomass obtained by submerged fermentation of the studied strains in bioreactor. Indeed, in many cases, nutraceuticals were obtained in highest levels in the mycelium comparing with those of corresponding fruitbodies found in nature. In addition, it was investigated the effect of carbon and nitrogen sources on the production of bioactive dietary fibres and glucans in submerged cultures of both strains.Finally, this study presents the isolation and identification of compounds derived from biomass obtained by submerged fermentation of both strains in bioreactor. For this purpose, the biomass extracted with suitable organic solvents. The chromatographic separation of extracts was mainly based on different techniques [e.g. flash column chromatography, preparative TLC and HPLC, medium pressure liquid chromatography (MPLC), Sephadex LH-20 column chromatography, adsorption chromatography using as sorbent resin XAD-4, fast centrifugal partition chromatography (FCPC)]. The pure compounds were elucidated with 13C-NMR, 1H-NMR, 2D NMR-spectroscopic analyses, ESI-HRMS, chemical correlations combined with GC/MS experiments and direct comparison with the respective literature. Based on existing literature data, all compounds isolated exert numerous health benefits. Specifically, the fractionation of the G. australe extract led to the isolation of 5 metabolites; 2 terpenoids and 3 fatty acids. It is reported for the first time the presence of 9-palmitoleic acid and ergosta-5,7,22-trien-3β-ol in the mycelium of G. australe, while 19-octacosenoic acid has not been isolated again from this mushroom strain. Besides, from the mycelium of P. ostreatus, 19 metabolites (fatty acids and their esters, 4 phenolic metabolites, 2 nucleotides and 3 alkaloids) were isolated and identified. An interesting observation was that trans 3,4-dihydro-3,4,8-trihydroxynapthalen-1(2H)-one, indolo-3-carboxylic acid, 3-formyl-pyrrole and 4-hydroxy-benzoic acid were isolated for the first time from P. ostreatus.From the data presented herein, the findings of this study are regarded valuable, as the established fermentation process led to the efficient production of biomass by the studied strains containing bioactive natural products. This work indicates the great potentiality of the established bioprocess for the production of G. australe and P. ostreatus mycelia with enhanced metabolic profile., Λευκή-Μαρία Κ. Παπασπυρίδη