Search

Termostabil bir enzim olan Tgo DNA polimerazhipertermofilik bir arkea olan Thermococcusgorgonarius tarafından sentezlenmektedir. Çalışmamızda 3’-5’ ekzonükleazaktivitesiyle yüksek kalitede DNA sentezi gerçekleştiren Tgo DNA polimeraz,rekombinant olarak üretimi hedeflenmiştir. Bu amaçla, ürettirilen yapay genuygun restriksiyon enzimleri ile kesilip aynı enzimlerle kesilmiş olan pET28avektör sistemine ligasyon ile birleştirilmiştir. E. coli BL21 hücrelerinde eksprese edilen enzim aktivitesi, PCRreaksiyonu gerçekleştirilerek kontrol edilmiştir., A thermostable enzyme Tgo DNA polymerase was produced by a hyperthermophilic archaea, Thermococcus gorgonarius. In this study, it was aimed to produce the Tgo DNA polymerase which synthesizes highly qualified DNA by its 3’-5’-exonuclease activity, by recombinant DNA technology. For this purpose, synthesized synthetic DNA was cut with restriction enzymes and ligated into a pET28a vector. The activity of the enzyme expressed in E. coli BL21 was controlled by PCR reaction.

Bu çalışmada 21 farklı çevreden toprak ve su örnekleri alınmış izole edilen toplam 38 tane organik çözgen tolerant mikroorganizma arasından en toksik organik çözgen olan %30 toluende üreyebilen P21 izolatı aynı zamanda en iyi lipaz üreticisi organizma (3,5 U/l) olarak belirlenmiştir.P21 izolatının lipaz üretim ortamının optimizasyonu yapılarak indükleyici olarak zeytinyağı ve azot kaynağı olarak pepton varlığında en yüksek lipaz üretimine ulaşılmıştır (15 U/l). Bu optimizasyondan sonra başlangıç aktivitesi % 428 arttırılmıştır.Çalışmamızda, lipaz enziminin fiziksel ve moleküler özelliklerinin belirlenmesi amacıyla lipaz üretiminin en yüksek olduğu büyüme eğrisinin erken stasyoner fazında ekstraselüler enzim süpernatantı alınmış ve ultrafiltrasyon ve amonyum sülfat çöktürme yöntemleri ile deriştirilmiştir. Kısmi saflaştırılmış enzim preperatında lipaz aktivitesinin optimum pH'sı 7.0 ve optimum termal aktivitesi 30°C olarak belirlenmiştir.Organik çözgenlere tolerant mikroorganizmalardan organik çözgenlere tolerant lipaz enzimi üretilebileceği konusunda kurduğumuz hipotez üzerine P21 izolatının lipaz enziminin organik çözgenlere toleransı incelenmiştir. Elde edilen veriler sonucunda organik çözgenlere tolerant P21 lipazının, mikroorganizmalara oldukça toksik olan toluene yüksek tolerans gösterdiği, %75 toluen içinde 2 saat inkübasyon sonunda aktivitesinin %66,7sini koruduğu gözlenmiştir. Bu veri hipotezimizi doğrulamıştır.Ham enzim preperatında bulunan lipaz enziminin molekül ağırlığının belirlenmesi amacıyla SDS-PAGE ve zimogram yapılmıştır. Buna göre, 15 ve 38 kDa ağırlığında ekstraselüler iki lipaz enzimi bulunmuştur.P21 izolatının tanılanması için biyokimyasal ve moleküler yöntemler kullanılmıştır. Verilere göre bu izolatın Pseudomonas fluorescens türü olduğu bulunmuş ve P. fluorescens P21 suşu adı altında FJ605510 giriş numarası ile http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ adresinde kayıt altına alınmıştır.Çalışmamızda organik çözgenlere tolerant P. fluorescens P21 izolatının üretmiş olduğu ekstraselüler lipazların genomdaki baz dizisini belirlemek ve tüm dizi sekansı belirlenmiş tip tür olan P. fluorescens Pf5'in dizilerini kullanarak, lipaz geni regülasyonu üzerine tahminler yapmak amacıyla mini Tn5 transpozonu aracılığıyla mutasyonlar yapılmıştır.Yapılan mutasyonlar sonucunda doğrudan lipaz gen bölgesi dizisi elde edilememiş ancak, lipaz gen regülasyonu ve salgılama sistemleri hakkında önemli verilere ulaşılmıştır.Bu bilgiler ışığında yapılan mutasyon sonucu lipaz aktivitesinin kaybolmasının sebebi1) Lipaz gen regülasyonu kontrolünde rol oynayan kuorum sensing mekanizmasının ekspresyonunun durmasıa) Lux genlerinde meydana gelen inhibisyonb) Substrata yönelmeyi sağlayan twitching hareketinin inhibisyonu2) Lipazların salgılanmasında görev alan transporterları kodlayan genlerin ifade edilememesi3) Lipazların salgılanması için gerekli üç boyutlu yapıyı sağlayan genlerin susturulması4) Lipazların posttranskripsiyonel seviyede üretiminin, ekstrasitoplazmik proteazlardan koruyan operonun inhibe olması5) Lipaz/esteraz aktivitesi gösteren lizofosfolipaz veya fosfolipaz gibi virülans faktörleri ile karboksilik hidrolazlar, epoksid hidrolaz, CFA sentetaz, tiyoesteraz, dienlakton hidrolaz gibi hidrolazların ekspresyonunun durması olarak görülmüştür In this study, 38 organic solvent tolerant bacteria have been isolated from 21 different soil and water environments and the bacterium called P21 has been isolated among them due to its ability of surviving in 30 % toluene which is highly toxic to microorganisms and its capability of high lipase production (3.5 U/l).The lipase production medium has been optimized and the medium containing olive oil as an inducer and peptone as a nitrogen source has been selected as the best ingredients for the highest lipase production conditions (15 U/l). After this optimization, initial lipase activity has increased to 428 %.In our study, to identify the physical and molecular properties of the lipase, the supernatant has been obtained at the highest production value in early stationer phase of the P21?s growth curve and the supernatant has concentrated by ultrafiltration and ammonium sulphate precipitation. Partially purified lipase is optimum active at pH 7.0 and 30°C.According to our hypothesis suggested that the organic solvent tolerant microorganisms are able to produce organic solvent tolerant lipases; the solvent tolerance of the lipase from P21 strain has been investigated. Due to the data obtained from the experiments, the lipase of the organic solvent tolerant microorganism P21 has a high tolerance to the highly toxic toluene, and can protect its activity of 66.7 % after 2 h incubation in toluene (75%). This data has proved our hypothesis.In order to determine the molecular weight of the P21 extracellular lipase, SDS-PAGE and zymogram has done and two extracellular lipases with molecular weights 15 kDa and 38 kDa have visualized.P21 strain has identified as Pseudomonas fluorescens by biochemical and molecular techniques and has recorded as P. fluorescens P21 in www.ncbi.nih.gov with an accession number, FJ605510.In this study, we have mutated the P. fluorescens P21 chromosomal DNA by Tn5 transposon in order to determine the DNA sequences coding extracellular lipase genes and the lipase gen regulation of P. fluorescens P21, in a comparison of a completely sequenced strain of P. fluorescens Pf5.We didn?t get any lipase gen mutations but we got some data on lipase gene regulations and secretion systems.Under the light of the data, the reason of the disappearance of the lipase activity is belongs to;1) Knock out of quorum sensing gene which regulates the lipases.a) Inhibition in Lux geneb) Inhibition of twitching motility which helps direction towards to substrate2) Knocking out of the expression of the transporter genes of the secretion.3) Inhibition of the genes which gives the three dimension of lipase necessary for secretion.4) Inhibition of the operon which protects the lipase from extracytoplasmic protease in posttranscription process5) Inhibition of lysophospholipases or phospholipases related to the virulence, epoxide hydrolases from carboxylic hydrolases, CFA synthase thioesterases or a lipase from dienelactone family. 334