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The epithelial intermediate-conductance calcium/calmodulin-regulated KCa3.1 channel is considered to be a regulator of intestine function by controlling chloride secretion and water/salt balance. Yet, little is known about the functional importance of KCa3.1 in the intestinal epithelium in vivo. Our objective was to determine the impact of epithelial-specific inducible overexpression of a KCa3.1 transgene (KCa3.1+) and of inducible suppression (KCa3.1&minus, ) on intestinal homeostasis and function in mice. KCa3.1 overexpression in the duodenal epithelium of doxycycline (DOX)-treated KCa3.1+ mice was 40-fold above the control levels. Overexpression caused an inflated duodenum and doubling of the chyme content. Histology showed conserved architecture of crypts, villi, and smooth muscle. Unaltered proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immune reactivity and reduced amounts of terminal deoxynucleotide transferase mediated X-dUTP nick end labeling (TUNEL)-positive apoptotic cells in villi indicated lower epithelial turnover. Myography showed a reduction in the frequency of spontaneous propulsive muscle contractions with no change in amplitude. The amount of stool in the colon was increased and the frequency of colonic contractions was reduced in KCa3.1+ animals. Senicapoc treatment prevented the phenotype. Suppression of KCa3.1 in DOX-treated KCa3.1&minus, mice caused no overt intestinal phenotype. In conclusion, inducible KCa3.1 overexpression alters intestinal functions by increasing the chyme content and reducing spontaneous contractions and epithelial apoptosis. Induction of epithelial KCa3.1 can play a mechanistic role in the process of adaptation of the intestine.

β-Galactosidase accumulates in the lysosomes of senescent cells of certain tissues. Cell staining with X-gal is a common procedure to detect senescent cells in culture. However, the organelle nature of the staining makes automatic count impossible, requiring time-consuming manual counting or expensive alternative techniques such as flow cytometry to effectively determine the amount of stained cells. Here we present an analysis strategy for images of X-gal stained cells which can be implemented into a macro for the ImageJ software overcoming some of the drawbacks of computational analysis of organelle staining.

Resumen Introduccion El sindrome metabolico (SM) y la hiperlipidemia familiar combinada (HLFC) comparten una parte importante de sus rasgos clinicos, y se ha postulado para ambos una etiologia parcialmente coincidente. Se considera que su expresion esta afectada por multiples loci geneticos, existiendo adicionalmente interaccion gen-ambiente. En este trabajo se explora la posible implicacion en el desarrollo de SM de USF1, un gen previamente asociado con HLFC. Metodos Se desarrollo un estudio caso-control en el que se analizo la variabilidad genetica en USF1 mediante genotipado por pirosecuenciacion de los SNP rs2516837, rs2516838, rs6686076, rs2516839, rs2073653, rs2774276, rs2073656, rs2073658 y rs3737787. Se estudiaron 192 sujetos con SM segun los criterios ATPIII y 197 sujetos control. Se analizaron las frecuencias alelicas y genotipicas y se estimaron los haplotipos compuestos por los citados polimorfismos. Se analizo estadisticamente la asociacion de SNP aislados y haplotipos estimados con el desarrollo de SM. Resultados Las frecuencias de los 9 SNP estudiados mostraron que se encontraban en equilibrio de Hardy-Weinberg tanto en casos como en controles. Se aprecio un importante grado de desequilibrio de union entre ellos, pero las diferencias en su distribucion entre casos y controles no alcanzaron significacion estadistica. La estimacion de haplotipos de los SNP analizados en los grupos estudiados detecto 6 haplotipos principales, pero ninguno de ellos mostro una asociacion estadisticamente significativa con la condicion de SM. Conclusiones En la muestra de pacientes estudiados no se ha observado una asociacion de la variabilidad genetica en el locus USF1 con el desarrollo de SM definido segun los criterios ATPIII.

Resumen Introduccion La apolipoproteina A-I Zaragoza (apo A-I Z, mutacion L144R) es una variante de la apolipoproteina A-I cuyos portadores tienen muy baja concentracion de colesterol-HDL (c-HDL) pero, aunque presenten factores de riesgo aterogenicos adicionales, paradojicamente no muestran signos de aterosclerosis a nivel subclinico. Estudios metabolicos in vivo realizados en los portadores heterocigotos de esta variante de apo A-I revelaron que tiene una tasa de catabolismo que duplica la de la proteina nativa sugiriendo la posibilidad de que tuviera un efecto favorable sobre el proceso global de transporte reverso de colesterol. Objetivo Establecer un sistema de expresion y purificacion de apo A-I nativa y apo A-I Z recombinantes de alto rendimiento y elevada pureza con el fin de comparar sus propiedades en distintos aspectos relativos al transporte reverso de colesterol, asi como otras caracteristicas antiaterogenicas de la apo A-I. Metodologia Partiendo del cDNA de apo A-I nativa se amplifico mediante PCR de la secuencia de la apo A-I madura y se disenaron los oligonucleotidos cebadores que permitieron el clonaje en un plasmido de expresion inducible pET-45 que incorpora una cola de Histidinas en la posicion N-terminal del peptido expresado. Mediante mutagenesis dirigida se introdujo la mutacion L144R en la secuencia madura de apo A-I para expresarla con el mismo sistema. Bacterias E. coli de la cepa BL21(DE3) fueron transformadas con los plasmidos preparados, la expresion de las correspondientes proteinas fue inducida y su purificacion realizada en condiciones no desnaturalizantes mediante cromatografia de afinidad en columnas de niquel. Resultados La expresion y la purificacion de las dos proteinas se realizo con exito y fue comprobada mediante SDS-PAGE y tecnicas inmunoquimicas. Se obtuvieron rendimientos medios superiores a 30 mg de proteina purificada por litro de cultivo con un grado de pureza del 94% para la proteina nativa y 93% para la mutante. Conclusiones Se ha conseguido un sistema de expresion y purificacion para apo A-I nativa y apo A-I Z de alto rendimiento y pureza adecuados que constituye la base para su posterior caracterizacion estructural y funcional de las propiedades antiaterogenicas de esta variante de la apo A-I.

Introduccion y objetivo Entre el 30 y el 50% de los sujetos con diagnostico genetico de hipercolesterolemia familiar (HF) heterocigota presentan xantomas tendinosos (XT), pero el mecanismo por el cual unos sujetos HF desarrollan XT y otros no se desconoce. Previamente, nuestro grupo de investigacion ha demostrado que los macrofagos de sujetos HF con y sin XT desarrollan una respuesta inflamatoria diferente frente a lipoproteinas de baja densidad oxidadas (LDLox). Por ello, el objetivo de este trabajo fue analizar la expresion genica de diversas moleculas inflamatorias que podrian estar involucradas en la aparicion y desarrollo de XT. Material y metodos Se selecciono a 10 pacientes con diagnostico genetico de HF, en los que se midio el diametro anteroposterior del tendon de Aquiles mediante ecografia de alta resolucion. Se aislaron sus monocitos a partir de 40 ml de sangre periferica. Una vez diferenciados a macrofagos, se suplementaron con 50 μg/ml de LDLox durante 1, 3, 6 y 18 h. Mediante RT-PCR en tiempo real, se analizo la expresion de los genes PPARγ, IL-8, IL-1β, CXCL3, triptasa, NF-κBIA y TNF-α . Resultados y conclusion Los sujetos HF con XT (HF XT+) mostraron una tendencia a sobreexpresar el gen IL-8 tras 18 h de incubacion con LDLox, mientras que el grupo de sujetos HF sin XT (HF XT–) tendio a sobreexpresar el gen TNF-α tras 1 h de incubacion con LDLox. El gen CXCL3 se sobreexpreso significativamente en todos los tiempos de incubacion en el grupo HF XT+. Ademas, se hallo una correlacion positiva entre la expresion de CXCL3 y el tamano del tendon de Aquiles, que fue maxima a 3 h del tratamiento con LDLox (R = 0,782; p = 0,008). Estos resultados sugieren que CXCL3 podria desempenar un papel importante en la etiologia de los xantomas, y se puede considerar como un posible marcador predictor de estos depositos lipidicos.