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Human enteroviruses (EV), members of the Picornaviridae family, comprise more than 100 genotypes belonging to four species: Enterovirus A, B, C and D. These viruses are responsible for a wide range of pathologies and play an important role in Public Health. The classic method for typing EVs consists in a seroneutralisation assay with specific antisera using strains isolated by cell culture; this technique is cumbersome, expensive and unable to type currently antigenic variants and new serotypes. In addition, it is limitated to culturable serotypes. New methods of molecular typing by partial sequencing of the genome have been recently developed; they consist in analysing a variable part of the region coding for capsid protein (VP1 or alternatively VP2 or VP4). However, these techniques are usually performed on strains isolated by cell culture. The aim of this work was to develop a typing method able to work from clinical specimens by partial sequencing of the VP2 region, which had been shown to exhibit a good typing performance (Nasri et al., 2007). For the design of primers, we used the CODEHOP (COnsensus DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer) strategy on order to improve the sensitivity and the specificity of the amplification assay. We present herein a first article that describes in details the new VP2 typing method and requests its use for typing clinical specimens found positive by a PCR assay targeting the 5’ non coding region of EVs over a period of three years. The second paper describes for the first time the direct use of a typing method on environtmental wastewater samples. The third article shows the interest of coupling 2 typing techniques targeting different regions (VP1 and VP2) of the EV genome for the identification of strains isolated by cell culture in Republic of Central Africa. Despite a loss of sensitivity, the new VP2 typing method used directly on specimens was found to be of great help both for human diagnosis and environmental surveillance, Les entérovirus (EV) humains, membres de la famille des Picornaviridae, comprennent plus de 100 génotypes appartenant à 4 espèces : Enterovirus A, B, C et D. Ces virus sont à l’origine de pathologies très variées et occupent une place importante en santé publique. La méthode conventionnelle de typage des EV consiste en une réaction de séroneutralisation avec des antisérums spécifiques à partir de souches isolées en culture cellulaire ; cette technique est longue, coûteuse et limitée par sa capacité à identifier correctement les variants antigéniques et les nouveaux génotypes. De plus, elle est limitée aux génotypes cultivables. De nouvelles méthodologies de typage moléculaire par séquençage partiel du génome ont été récemment développées ; elles consistent à analyser une partie variable de la région codant une des protéines de capside (VP1 ou alternativement VP2 ou VP4). Cependant ces techniques sont le plus souvent réalisées à partir de souches isolées en culture cellulaire. Le but de ce travail a été de développer une technique de typage des EV directement sur des prélèvements cliniques en se basant sur le séquençage partiel de la région VP2 dont le laboratoire avait montré précédemment l’intérêt (Nasri et al., 2007). Pour le dessin des amorces, nous avons utilisé la stratégie CODEHOP (COnsensus DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer) de manière à améliorer à la fois la spécificité et la sensibilité de la méthode d’amplification. Nous présentons ici un premier article décrivant la nouvelle technique de typage VP2 et rapportons son application au typage d’échantillons cliniques trouvés positifs par une PCR ciblant la région 5’ non codante du génome des EV sur une période de trois ans. Le deuxième article présente pour la première fois l’application d’une technique de typage direct à des échantillons environnementaux d’eaux usées. Le troisième article montre l’intérêt de coupler deux techniques de typage ciblant des régions différentes (VP1 et VP2) pour l’identification de souches d’EV isolées par culture cellulaire en Centre-Afrique. Malgré des problèmes de sensibilité, cette nouvelle technique de typage directement à partir d’échantillons peut rendre de grands services tant en clinique humaine que pour la surveillance environnementale

Heterosexual transmission of HIV from men to women is the main route of contamination by this agent worldwide. This mode of transmission involves the contact between infected semen and healthy female genital mucosa, and then the crossing of cell-free or cell-associated viruses through the mucosa. The mechanisms involved in HIV transmission from men to women as well as the role of seminal plasma in selective transmission of R5-tropic viruses stay partially unknown. During the course of my PhD we visualized the crossing of cell-associated and cell-free virus through the endocervical genital mucosa. Initially, the study focused on the transmigration of infected immune cells through an in vitro model of endocervical mucosa, as well as on the role of seminal plasma in HIV transmission and selection of R5-tropic strains. Afterwards, we developed a fluorescent, replicative competent, infectious chimeric virus allowing its detection by confocal microscopy after several replication cycles. After contact of the endocervical mucosa with X4- or R5-tropic chimeric viruses, we visualized by confocal microscopy the infection of endocervical epithelial cells and the transmission of HIV to immune cells placed in the basal compartment. The use of a mathematical model allowed standardizing and quantifying the detection of infected cells in the mucosa. My PhD work describes as a first step the importance of the crossing of cell-associated HIV particles in the heterosexual transmission, as well as the involvement of seminal plasma in the selection of R5-tropic strains. Moreover, the virological model developed herein allows the direct visualization of HIV transmission through the female genital mucosa. I have thus demonstrated that it is possible to localize and quantify viral particles within the mucosa. This virological tool help to better understand the mechanisms involved in HIV heterosexual transmission and the selection of R5-tropic strains, La transmission hétérosexuelle de HIV de l’homme vers la femme est le principal mode de contamination dans le monde. Il implique la mise en contact du sperme infecté avec la muqueuse génitale féminine saine, puis le passage du virus libre ou associé aux cellules à travers la muqueuse. Les mécanismes impliqués dans la transmission de HIV de l’homme vers la femme ainsi que l’impact du plasma séminal sur la transmission sélective des virus à tropisme R5 sont encore mal connus. Au cours de mon séjour doctoral nous avons visualisé le passage du virus associé aux cellules ainsi que du virus libre à travers la muqueuse génitale endocervicale. Dans un premier temps l’étude s’est focalisée sur la transmigration de cellules immunitaires infectées par HIV à travers un modèle in vitro de muqueuse endocervicale reconstruite, ainsi que sur le rôle du plasma séminal dans la transmission de HIV et la sélection des virus à tropisme R5. Par la suite, un virus chimérique fluorescent, réplicatif et infectieux, permettant sa détection par microscopie confocale sur plusieurs cycles de réplication, a été développé. Après mise en contact de ce virus chimérique, à tropisme X4 ou R5, avec la muqueuse endocervicale, nous avons visualisé par microscopie confocale l’infection des cellules épithéliales endocervicales et la transmission de HIV à des cellules immunitaires disposées au pôle basal. L’utilisation d’un modèle mathématique nous a permis de standardiser et quantifier la détection de cellules infectées dans la muqueuse. Mes travaux de thèse décrivent dans un premier temps l’importance du passage de HIV associé aux cellules dans la transmission hétérosexuelle, ainsi que l’implication du plasma séminal dans la sélection des virus à tropisme R5. De plus, le modèle virologique développé permet de visualiser directement la transmission hétérosexuelle de HIV à travers la muqueuse génitale féminine. J’ai ainsi démontré qu’il est possible de visualiser directement, de localiser et de quantifier la présence du virus au sein de la muqueuse. Cet outil virologique permettra d’approfondir les connaissances et la compréhension des mécanismes impliqués dans la transmission hétérosexuelle de HIV et dans la sélection des virus à tropisme R5

Dendritic cells, among them Langerhans cells, are recognized as presenters of Human Immunodeficiency Virus (HIV) to CD4 + T lymphocytes. The recruitment of Langerhans cells in the vaginal mucosa is modulated by Chemokine CC motif ligand 20 (CCL20) produced by epithelial cells of the female genital mucosa. The aim of this study was to evaluated the capacity of seminal plasma, saliva and vaginal secretions to induce the production of CCL20 by monostratified endocervical epithelium cells culture (HEC-1A), also, the relation of this production with the presence of lactoferrin and its cleavage products (G- 12-I) in seminal plasma and saliva. Cultures of HEC-1A cells were stimulated with seminal plasma, saliva and vaginal secretions of HIV-seronegative and HIV-seropositive participants, and the CCL20 production measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in its cellular supernatant. ELISA for Lf was performed on all samples, and the peptide cleavage Lf (G-12-I) observed in the samples which more and less induced the CCL20 secretion on western blot. We observed that the seminal plasma of seropositive participants were responsible for a higher stimulation of CCL20 production by HEC-1A cells, when compared to the seminal plasma of HIV-seronegative participants. Lf concentration in seminal plasma was positively related to the CCL20 production by HEC-1A cells, the higher production of CCL20 was also more associated with Lf peptide cleavage Lf (G-12-I), on western blot. Saliva stimulated CCL20 production by HEC-1A cells, and such stimulation was not correlated to Lf concentration. In conclusion, the presence of Lf in seminal plasma positively related to the production of CCL20 by HEC-1A cells, and saliva may induce the production of CCL20 in the female genital mucosa, Les cellules dendritiques présentes dans les muqueuses comme les cellules de Langerhans, sont capables de présenter le Virus d'Immunodéficience Humaine (VIH) aux lymphocytes T CD4+, aboutissant à l'infection par le VIH lors de contacts hétérosexuels non protégés. Le recrutement des cellules de Langerhans dans la muqueuse vaginale est assuré par la chimiokine Quimiocin C-C motif ligant 20 (CCL20) produite par les cellules épithéliales de la muqueuse. L'objectif de ce travail a été d’étudier la capacité du plasma séminal, de la salive et de la sécrétion vaginale à stimuler la production de CCL20 par les cellules de l’épithélium endocervical (cellules HEC-1A), et de corréler cette production avec la présence de la lactoferrine (LF) et de ses produits de clivage dans ces différents fluides biologiques. Des cellules HEC-1A ont été cultivées avec les plasmas séminaux, les salives et les sécrétions vaginales de patients séronégatifs et séropositifs pour le VIH, et la production de CCL20 a été mesurée dans les surnageants cellulaires en ELISA. Le dosage de la Lf par ELISA a été réalisé sur tous les échantillons. La présence d’un petide de clivage de la Lf (G-12-I) a été analysée en western blot. Les résultats obtenus montrent que les plasmas séminaux des patients séropositifs ont une plus grande capacité à stimuler la sécrétion de CCL20 que les patients séronégatifs pour le VIH. La concentration de la Lf dans le plasma séminal est corrélée à la stimulation de cette sécrétion par les cellules HEC-1A. Il semble que les échantillons ayant la plus grande capacité à stimuler la sécrétion de CCL20 possèdent une plus forte concentration en petide de clivage de la Lf (G-12-I), bien que ce résultat, obtenu en western blot. La salive est également capable de stimuler de la production de CCL20 par les cellules HEC-1A, mais cette stimulation n'est pas corrélée avec sa concentration en Lf. Nous concluons que la sécrétion de CCL20 par l’épithélium génital féminin induite par le plasma séminal est corrélée à la présence de la Lf dans ce fluide. Bien que les mécanismes puissent être différents, la salive peut également induire la production de CCL20 par les cellules épithéliales de la muqueuse génitale féminine, As células dentríticas, dentre elas as células de Langerhans, são capazes de apresentar o vírus da imunodeficiência humana (HIV) aos linfócitos T CD4+, cujo processo culmina com a infecção por esse vírus. O recrutamento das células de Langerhans na mucosa vaginal é modulada pela Quimiocin C-C motif ligant 20 (CCL20), produzida pelas células epiteliais da mucosa genital feminina. O objetivo desse trabalho foi estudar a capacidade do plasma seminal, da saliva e do conteúdo vaginal de induzir a produção de CCL20 pela cultura de células do epitélio monoestratificado endocervical (HEC-1A), relacionando tal produção com a presença da lactoferrina (Lf) e de seu produto de clivagem (G-12-I) nestes fluidos. Culturas de células HEC-1A foram estimuladas com plasmas seminais, salivas e conteúdos vaginais de participantes soronegativos e soropositivos para o HIV, visando avaliar a produção de CCL20, a qual foi mensurada utilizando-se o Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). A dosagem de Lf (ELISA) foi realizada em todas as amostras estudadas e a presença do peptídeo de clivagem da Lf (G-12-I) observada nas amostras que mais e que menos induziram a secreção de CCL20 pelas células HEC-1A por Western blot. Verificou-se que os plasmas seminais de participantes soropositivos foram responsáveis por maior estimulação da produção de CCL20 pelas células HEC-1A, quando comparados aos plasmas seminais de participantes soronegativos para o HIV. A concentração de Lf no plasma seminal associou-se à indução na produção de CCL20 pelas células HEC-1A, assim como as amostras que mais induziram a produção de CCL20 apresentaram presenças mais evidentes do peptídeo de clivagem da Lf (G-12-I). A saliva foi responsável pela estimulação na produção de CCL20 pelas células HEC-1A, no entanto, tal estimulação não se associou à concentração de Lf salivar. Concluímos que a presença de Lf no plasma seminal esteve correlacionada à produção de CCL20 pelas células HEC-1A, e que a saliva pode induzir a produção da CCL20 pelas células epiteliais endocervicais