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En la actualidad, como consecuencia del cambio climático, la eutrofización de las aguas y el desarrollo de actividades antropogénicas, se está produciendo un aumento en la frecuencia y presencia de floraciones de cianobacterias productoras de cianotoxinas a nivel mundial. El hombre puede estar expuesto a estas toxinas mediante diferentes vías de exposición, siendo la oral a través del consumo de agua y alimentos contaminados la principal. Por ello, es necesario realizar una correcta caracterización del perfil toxicológico de estas toxinas, y en concreto, de las mezclas de cianotoxinas, al ser el escenario de exposición más posible, al encontrarse de manera simultánea en la naturaleza. Conocer más detalladamente la toxicidad de las combinaciones de cianotoxinas permitiría realizar una evaluación de riesgos más realista y fiable. Uno de los aspectos principales para poder llevar a cabo una correcta caracterización del peligro de las cianotoxinas es determinar su presencia, su capacidad de acumulación y su toxicidad. Por ello, con el fin de establecer y describir el estado del arte sobre las cianotoxinas, y en concreto de las Microcistinas (MCs), nos pareció necesario revisar la información existente en la literatura científica sobre la presencia, concentración y toxicidad de los congéneres de MCs diferentes de MC-LR, ya que aunque esta variante es la más estudiada por su toxicidad, ubicuidad y prevalencia, existen otras muchas que van cobrando cada vez más importancia. En primer lugar, nos centramos en el análisis de la bibliografía publicada sobre MC-RR, al ser el congénere más estudiado tras MC-LR. MC-RR es la variante más detectada en aguas del continente asiático, y está presente en alimentos de consumo humano (peces, bivalvos, vegetales, etc.), y su toxicidad ha sido observada tanto in vitro como in vivo. Sin embargo, son escasos los estudios que evalúan de modo específico sus propiedades toxicológicas, siendo necesarios para determinar los riesgos asociados a su exposición, tanto en el hombre como en el medioambiente. Posteriormente, se realizó una revisión de la literatura científica sobre congéneres minoritarios de MCs. En relación con su incidencia, Europa fue el continente donde más se detectó la presencia de dichas variantes de MCs, siendo MC-YR una de los principales congéneres identificados tanto en aguas como en alimentos de consumo humano. Sin embargo, a pesar del gran número de congéneres de MCs identificados hasta la fecha, son escasas las investigaciones sobre su toxicidad, siendo necesarios más estudios toxicológicos, como es el caso de MC-LF o las combinaciones de estas cianotoxinas. At present, as a consequence of climate change, eutrophication of waters and anthropogenic activities, there is an increase in the frequency and presence of cyanobacterial blooms producers of cyanotoxins worldwide. Humans can be exposed to these toxins through different exposure routes, and the oral intake through consumption of contaminated food and water is the main one. For this reason, it is necessary to carry out a correct characterization of the toxicological profile of these toxins, and in particular, of the cyanotoxin mixtures, as this is the most likely exposure scenario, since they are found simultaneously in nature. A more detailed understanding of the toxicity of cyanotoxins combinations would allow a more realistic and reliable risk assessment. One of the main aspects to perform a correct characterization of the risk of cyanotoxins is to determine their presence, accumulation capacity and toxicity. Therefore, in order to establish and describe the state of the art on cyanotoxins, and specifically Microcystins (MCs), it was considered necessary to review the existing information in the scientific literature on the presence, concentration and toxicity of MCs congeners different from MC-LR, since although this variant is the most studied due to its toxicity, ubiquity and prevalence, there are many others that are gaining more and more importance. First, we focus on the analysis of the published literature on MC-RR, as it is the most studied congener after MC-LR. MC-RR is the variant most detected in waters of the Asian continent, and it is present in food for human consumption (fish, bivalves, vegetables, etc.), and its toxicity has been observed both in vitro and in vivo. However, there are few studies that specifically evaluate its toxicological properties, being necessary to determine the risks associated with its exposure, both in human and in the environment. Afterwards, a review of the scientific literature on minority MCs congeners was carried out. In relation to its incidence, Europe was the continent where the presence of these MCs variants was most detected, with MC-YR being one of the main congeners identified in both water and food for human consumption. However, despite the large number of MC congeners identified to date, there is still scarce research on their toxicity, and more toxicological studies are necessary. This is the case of MC-LF or combinations of these cyanotoxins.

Las cianobacterias son bacterias Gram negativas fotoautótrofas presentes en ecosistemas acuáticos, que suponen una amenaza para la salud humana y ambiental debido a la producción de floraciones. Éstas, a su vez, pueden producir también cianotoxinas, las cuales pueden actuar como hepatotoxinas, neurotoxinas, citotoxinas o dermatotoxinas. Entre las cianotoxinas de mayor interés se encuentran las microcistinas (MC) y la cilindrospermopsina (CYN) por su amplia distribución y toxicidad. La CYN puede causar daños en distintos órganos, tales como hígado o riñón, siendo este último objeto del presente estudio, es decir, el objetivo principal de esta revisión bibliográfica se centra en poner de manifiesto las alteraciones que produce la CYN a nivel renal. Tras la realización de una búsqueda bibliográfica, se han seleccionado un total de veintiocho artículos en relación con la nefrotoxicidad de la CYN. Se evidencian efectos producidos como resultado de una exposición a CYN por diferentes vías tanto en modelos experimentales in vivo como in vitro, sin embargo, la nefrotoxicidad de CYN sigue siendo un tema aún poco estudiado. Los principales resultados observados incluyeron cambios histopatológicos, acompañados de variaciones en niveles de biomarcadores séricos tanto en organismos acuáticos como en mamíferos. Por tanto, se considera que la CYN presenta un alto potencial nefrotóxico, siendo de interés abordar una investigación más profunda sobre su mecanismo de acción tóxica en este órgano. Universidad de Sevilla. Grado en Farmacia

Introducción: El objetivo de esta tesis doctoral es analizar las ganancias globales en salud que pueden derivarse de la implantación de las medidas contenidas en el Plan de Mejora de Calidad del Aire de la Zona Industrial Bahía de Algeciras de forma que sea posible estimar la relación coste-beneficio de esta política pública. Para ello, se va a realizar una Evaluación de Impacto en Salud de los principales ejes del plan, ya que su metodología proporciona unos beneficios adicionales a otras evaluaciones tradicionales como la evaluación de impacto ambiental. Entre ellas, destaca la posibilidad de optimizar y priorizar las medidas en función de las especiales características del proyecto, como son la distribución espacial y demográfica de la población potencialmente afectada, la ubicación y características de las principales fuentes de contaminación del aire existentes y las especiales condiciones ambientales del Campo de Gibraltar. Existe un renovado interés en este tipo de análisis como parte del nuevo modelo de salud adoptado en los países desarrollados en estas últimas décadas (Estrategia de Salud en Todas las Políticas), que postula que una buena parte de los factores que influencian en la salud individual y colectiva en realidad quedan fuera del control de la administración sanitaria. Dentro de estos factores, denominados determinantes de la salud, uno de los grupos más importantes son los ambientales y, de acuerdo con la mejor evidencia científica actual, el mayor impacto sobre la salud es causado por la contaminación atmosférica. De ahí la importancia de este trabajo, que se entronca en una estrategia europea de reducción de la contaminación ambiental y que obliga a tomar medidas para reducir los niveles de contaminación hasta niveles de riesgo que se consideren aceptables para la población. El ámbito de actuación resulta también idóneo ya que se trata de un área muy poblada y con elevados niveles históricos de contaminación ambiental, lo que ha generado una importante preocupación ciudadana ante la cual debe responderse con la mayor transparencia y exhaustividad de datos. Materiales y métodos: El abordaje del proyecto ha requerido la combinación de las metodologías de evaluación de impacto en salud, la evaluación de riesgos y la valoración económica de dichos riesgos, así como la recopilación y tratamiento de datos sanitarios y ambientales. De forma secuencial se realizaron las siguientes actividades: • Describir y valorar la eficacia de las medidas propuestas a la hora de disminuir la contaminación • Identificar y caracterizar la población potencialmente afectada • Describir y priorizar los impactos sobre la calidad del aire y otros determinantes de la salud, usando AirQ+ en particular para los datos de aire • Evaluar la exposición a que se ve sometida la población • Calcular las variaciones en morbimortalidad asociados a la exposición a partículas (PM10) • Evaluar económicamente las ganancias en salud asociadas Finalmente, se realizan dos estudios adicionales que se refieren a la influencia de las condiciones ambientales particulares de la zona sobre los impactos agudos en salud en años recientes. Las condiciones estudiadas se refieren al régimen de vientos característico del estrecho de Gibraltar y a la intrusión de masas de aire procedentes del norte de África. La primera es relevante ya que el estudio de los vientos muestra que los mismos poseen intensidades más elevadas de lo normal, así como direcciones preferentes muy marcadas. La segunda lo es por el transporte de material particulado del desierto del Sáhara, que supone una aportación de partículas significativa que no puede modificarse con ninguna de las medidas previstas en el plan. Resultados: Los contaminantes más relevantes de cara a sus impactos en salud son el material particulado (se superaron los valore límite anual para PM10 en los años 2005, 2006 y 2007) y los valores límite horario o diario de SO2 en los años 2005 y 2006. Las PM10 presentan además niveles altos de material crustal y componentes inorgánicos secundarios. El Plan de Actuación consta de 45 medidas, algunas de las cuales se mantienen de planes anteriores. Se han identificado como más relevantes de cara a la protección de la salud las que se refieren al abatimiento de emisiones industriales (13% menos) y a la reducción del tráfico en la zona (9% menos). La población total es de 230.203 habitantes y se ha mantenido estable en los últimos años. Se trata de una población relativamente joven y con escasa inmigración. Existen diversas zonas desfavorecidas que, como suele ser habitual, se encuentran en zonas de peor calidad de aire. Los datos económicos son buenos, en general, por el empleo generado por la industria y el puerto de Algeciras, aunque existe mucha economía irregular. En la zona existe una sobremortalidad histórica, especialmente en La Línea de la Concepción y zonas cercanas al núcleo industrial, que alimenta la preocupación ciudadana en el área. En toda la zona de estudio, la ejecución y puesta en marcha de las medidas del PMCA supondría salvar unas 23 vidas al año (IC 95%: 15; 30), debido a la reducción de los niveles de partículas en el aire ambiente. Si esta reducción fuese mayor y los niveles de partículas alcanzasen los niveles guía de la OMS, se salvarían unas 148 vidas anuales (IC 95%: 98; 195). Los beneficios estimados por la mejora en salud por la implementación efectiva del PMCA alcanzarían los 54,6 millones de euros al año (IC 95%: 35,7; 72,1). Si los objetivos hubieran sido más ambiciosos y se lograra que los niveles de partículas alcanzasen los valores guía de la OMS, los beneficios en salud alcanzarían los 365,8 millones de euros anuales (IC 95%: 240,9; 480,3). Discusión: La ejecución de las medidas tendrá un impacto muy positivo en la ciudadanía. La mejora principal en salud sería la reducción de la mortalidad, principalmente por causas pulmonares y cardiovasculares asociada a la exposición a largo plazo a partículas, y esta mejora en salud implicaría un beneficio económico considerable, muy superior a los costes de la ejecución de las medidas. Los resultados obtenidos en la ERS-CA y en la valoración económica de los impactos en salud son coherentes con el estado actual de conocimientos. Las principales incertidumbres detectadas en el proceso se refieren a la eficacia y el grado de cumplimiento real del plan, la validez y representatividad de los datos empleados, la posible interferencia causada por potenciales efectos sinérgicos con otros contaminantes o con la composición del material particulado y la eliminación de las exposiciones laborales. Esta evaluación es muy novedosa en España, contándose tan solo con experiencias puntuales similares como proyectos de regeneración urbana. Sí que se han hecho algún otro estudio de coste-beneficio, como el del carril-bici de Sevilla, o de los costes económicos por los efectos en la salud de la contaminación atmosférica, como en el marco del proyecto Aphekom o en un estudio de la contaminación en Barcelona, si bien no se ha hecho de modo integral, en el marco de un plan o programa. Se estima que realizar este tipo de evaluaciones con carácter previo o simultánea a la elaboración de los planes tendrían numerosas ventajas, pues las predicciones de los impactos se realizan de acuerdo con el estado actual de las pruebas científicas, lo que confiere fiabilidad a las estimaciones, y transparencia y credibilidad a todo el proceso. Ello podría ayudar al compromiso de las administraciones y a la aceptación y apoyo de la población afectada. La identificación de poblaciones vulnerables puede ayudar a priorizar y optimizar las medidas que se deben implantar. Conclusiones: 1. La conclusión principal de la valoración del impacto en salud del Plan de Mejora de la Calidad del Aire de la Zona Industrial Bahía de Algeciras es que la ejecución de las medidas tendrá un impacto muy positivo en la ciudadanía. La mejora principal en salud sería la reducción de la mortalidad, principalmente por causas pulmonares y cardiovasculares asociada a la exposición a largo plazo a partículas, y esta mejora en salud implicaría un beneficio económico considerable, muy superior a los costes de la ejecución de las medidas. 2. Se ha estimado que la ejecución de las medidas del plan en la zona de estudio supondría que se evitasen una media de veintitrés muertes prematuras al año, con un beneficio económico total por reducción de la morbimortalidad de 54,6 millones de euros anuales. Si los objetivos del PMCA hubieran sido más ambiciosos y los niveles de partículas alcanzasen los valores guía de la OMS, se evitarían unas 148 muertes anuales prematuras y tendríamos unos beneficios en salud por reducción de la morbimortalidad que alcanzarían los 365,8 millones de euros anuales. 3. Se recomienda que todos los futuros planes de mejora de calidad del aire: • Caractericen correctamente la población afectada y, dentro de ella, la población vulnerable. Dentro de la población vulnerable tiene especial interés identificar y caracterizar la población desfavorecida por razón socioeconómica, ya que se ubica en una zona delimitada que pudiera implicar la existencia de inequidades potenciales en salud. • Orienten todas las medidas que sean posibles a la población vulnerable, especialmente aquellas que padezcan enfermedades respiratorias y a poblaciones desfavorecidas. Por ejemplo, si se ha identificado y caracterizado ésta última, se pueden priorizar la implementación de medidas relacionadas con el tráfico, con la accesibilidad a servicios o con el transporte en las áreas donde se localice población desfavorecida. También las medidas de sensibilización podrían tener en cuenta en primer lugar estas poblaciones. • Incluyan medidas para aumentar la concienciación efectiva entre la ciudadanía sobre la importancia de los sectores institucional, comercial y doméstico. Para ello, se recomienda el uso de procesos participativos desde el principio del proceso de elaboración del Plan. El Manual de proyectos incluye un anexo en el que se indican algunas técnicas que podrían resultar de utilidad. • Realicen un análisis coste-beneficio, incluyendo en la parte de beneficios los resultantes de las ganancias en salud por la mejora de la calidad del aire. 4. Como conclusión final, se demuestra que la evaluación de impacto en salud puede ser una herramienta muy útil para evaluar políticas públicas.

La incidencia de alertas o crisis alimentarias están afectando a la confianza del consumidor. Ésto ha provocado un incremento en la preocupación por la seguridad alimentaria. Para velar por la seguridad alimentaria, se han creado organismos como la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) y a nivel nacional, la Agencia Española de Consumo, Seguridad Alimentaria y Nutrición (AECOSAN). Entre sus funciones estarán, ofrecer garantías a los consumidores, mediante comunicados claros, comprensibles y útiles y poder evaluar la percepción del riesgo en alimentos por parte del consumidor actual. La percepción del riesgo está asociada no solo a la comunicación del riesgo sino también a factores psicológicos o culturales del consumidor. Es tanta su importancia que la EFSA junto con la Dirección General de Salud y Protección de los Consumidores de la Comisión Europea realizó una encuesta al respecto tanto en 2005 como en 2010, denominadas “Special Eurobarometer” 238 y 354, respectivamente. Por este motivo, el objetivo de nuestro estudio va a consistir en realizar una encuesta a nivel nacional en base al modelo Eurobarómetro 2010, con el fin de estudiar la percepción del riesgo alimentario desde varios puntos de vista. Primero analizaremos el nivel de preocupación que provoca en el consumidor los diferentes riesgos alimentarios propuestos, en los que podremos deducir que el tipo de respuesta va a estar condicionada por la edad, el sexo y el nivel de estudios. Los resultados se han comparado con los del Eurobárometro 2005, 2010 y 2019, ofrecidos por EFSA. Se analiza la confianza en las autoridades competentes y se establece qué tipo de reacción es mostrada por el consumidor, frente a noticias sobre alimentos inseguros, que provocan un rechazo no permanente del alimento. Finalmente se evidencia que los profesionales sanitarios tienen un papel importante en la comunicación de riesgos. Universidad de Sevilla. Grado en Farmacia

Las cianobacterias son bacterias Gram negativas fotosintéticas capaces de producir floraciones a nivel mundial. Estas cianobacterias pueden producir también cianotoxinas perjudiciales para la salud de humanos, animales y plantas, y pueden actuar como hepatotoxinas, citotoxinas, neurotoxinas o dermatotoxinas. Las cianotoxinas de mayor in terés son las microcistinas (MC) y la cilindrospermopsina (CYN) por su extensa distribución y toxicidad. Aunque se conoce que principalmente las MC son hepatotóxica s y la CYN citotóxica , se ha observado que pueden producir alteraciones en otros órganos y s istemas, de los cuales el sistema inmune está aún escasamente estudiado. La presente revisión tiene, por tanto, como objetivo poner de manifiesto en modelos experimentales tanto in vitro como in vivo las alteraciones que se producen en el sistema inmune tr as la exposición a estas cianotoxinas y la importancia que ello tiene en la respuesta inmunitaria. Tras la realización de una búsqueda bibliográfica se seleccionaron veintitrés y siete artículos relacionados con la inmunotoxicidad de MC y CYN, respectivame nte. En ellos se evidencia el efecto de las MC sobre la proliferación de los linfocitos y la expresión de múltiples citoquinas, entre otros. Así mismo, se ha observado el efecto de la CYN sobre la viabilidad y capacidad de los linfocitos a pesar de que los estudios de inmunotoxicidad sobre ésta sean escasos. Por tanto, ambas cianotoxinas presentan potencial inmunotóxico que debería ser estudiado en mayor profundidad, especialmente en el caso de la CYN. Universidad de Sevilla. Grado en Farmacia

Revisando los antecedentes bibliográficos, se pone de manifiesto la importancia de conocer las implicaciones que tiene, en materia de Seguridad Alimentaria, el consumo de aceites sometidos a procesos repetidos de fritura. Se investiga, en concreto, los efectos tóxicos que pueden inducir una dieta suplementada con un aceite de oliva con un nivel de compuestos polares similar al límite marcado por la legislación (26,5% CP), inferior (12,5% CP) o superior (33,6% CP) en ratas Wistar expuestas de forma subcrónica (90 días). Los objetivos específicos planteados en el presente trabajo son los siguientes: 1. Estudiar a nivel histopatológico las lesiones producidas tras la exposición en corazón, aorta, hígado y riñón. 2. Evaluar el estado oxidativo del tejido cardíaco, sanguíneo, hepático y renal, mediante medidas de peroxidación lipídica y determinación de enzimas antioxidantes, como: catalasa, superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa y glutatión reductasa. 3. Valorar el comportamiento de los individuos en relación a la ingesta de alimento y agua con el fin de identificar variaciones significativas entre los distintos grupos de experimentales. 4. Analizar diferentes parámetros bioquímicos en sangre para evaluar si dicha ingestión subcrónica produce algún tipo de consecuencia. CONCLUSIONES PRIMERA.- La ingestión subcrónica de aceite de oliva virgen extra (variedad Hojiblanca), sometido a repetidos procesos de fritura, da lugar a efectos tóxicos tanto a nivel histológico como bioquímico, incluso en los que contienen un nivel de compuestos polares inferior al establecido en la legislación. SEGUNDA.- El daño oxidativo ocurre a nivel de todos los componentes celulares, pero es en las membranas celulares donde el efecto es mayor; de ahí que, de todos los indicadores de estrés oxidativo medidos, la peroxidación lipídica sea el más sensible. TERCERA.- Se observa una depleción de la actividad en algunos sistemas enzimáticos, probablemente porque éstos estén desbordados. A la luz de los resultados obtenidos en el análisis de las preparaciones histológicas, parece que el sistema defensivo antioxidante no es capaz de frenar el efecto producido por los compuestos polares. CUARTA.- El órgano menos afectado, en cuanto a la actividad de enzimas antioxidantes se refiere, fue el hígado. Esto está en consonancia con el hecho de que el hígado sea el órgano destoxicador por excelencia. QUINTA.- A nivel histológico, el sistema más afectado es el cardiovascular. SEXTA.- Comparando con el grupo Control, el esperado efecto protector del aceite de oliva virgen extra en el grupo Inicial, no se produce. Podría deberse a dos razones: o bien porque el tiempo de exposición a las dietas ha sido insuficiente, o porque se han degradado la mayor parte de las sustancias antioxidantes durante el proceso de almacenamiento. SÉPTIMA.- Si pudiésemos extrapolar estos resultados al ámbito doméstico, la ingestión de aceite sometido a repetidos procesos de fritura no supondría mayor peligro, ya que el aceite probablemente se desecharía antes de que éste alcanzara un nivel de compuestos polares peligroso para el organismo. No obstante, habría que prestar mayor atención al ámbito industrial o de restauración. OCTAVA.- Aunque los resultados se refieren en todo momento al modelo experimental de rata Wistar, éstos sugieren la conveniencia de una revisión de la legislación actualmente en vigor; la cual data de 1989.

Las cianobacterias se encuentran distribuidas globalmente, siendo las aguas dulces su hábitat más común. Dichos microorganismos son capaces de sintetizar numerosos metabolitos, entre ellos los denominados cianotoxinas. Dentro de dichas toxinas destaca la Cilindrospermopsina (CYN), cianotoxina emergente de los últimos años, siendo responsable de episodios hepatoentéricos en Australia y Brasil. La CYN, con una estructura de alcaloide tricíclico, posee distintos mecanismos de acción, tales como la inhibición de la síntesis de proteínas y del glutatión, el incremento de especies reactivas de oxígeno y la capacidad para actuar como agente genotóxico. Sin embargo, hasta la fecha, estudios que se centren en la determinación de sus efectos genotóxicos y epigenéticos son escasos y contradictorios. Es por ello, que el presente trabajo indaga acerca del potencial genotóxico de la CYN, usando como modelo experimental la línea celular de adenocarcinoma de colon humano Caco-2, la cual se expuso a concentraciones de CYN de 0, 0,625, 1,25 y 2,5 μg/ml durante 24 y 48 h. Se ha utilizado el ensayo cometa estándar, para la evaluación del daño genotóxico directo, y su versión modificada con las enzimas Formamido pirimidina ADN glicosilasa (FPG) y Endonucleasa III (Endo III). Estas enzimas permiten reconocer las bases del material genético que se hayan oxidado, evaluando de esa forma el proceso de oxidación de las bases púricas y pirimidínicas, respectivamente. Los resultados obtenidos mostraron que la CYN no produce daño genotóxico directo en la hebra de ADN de las células Caco-2 a ninguna de las concentraciones de exposición empleadas. Del mismo modo, la incubación con las enzimas de restricción no mostró oxidación en las hebras de ADN. Estos resultados son de gran utilidad para esclarecer el perfil toxicológico de esta cianotoxina emergente. Sin embargo, sería necesario completar dicho estudio con otros ensayos de genotoxicidad para confirmar los resultados negativos que hemos obtenido tras la exposición de Caco-2 a CYN. Universidad de Sevilla. Grado en Farmacia

El diseño de nuevos materiales de envasado con propiedades mecánicas, térmicas y de barrera mejoradas, destinados a incrementar la vida media de los productos alimenticios en el mercado, es una apuesta segura llevada a cabo por la industria alimentaria. Estos envases son conocidos como materiales nanocompuestos y difieren del polímero tradicional en que cuentan en su estructura con arcillas modificadas que presentan láminas de grosor nanométrico. Entre estas arcillas se encuentra Clay3, una arcilla modificada desarrollada por el Instituto Tecnológico de Embalaje, Transporte y Logística de Valencia. Dicha arcilla se basa en la modificación de la montmorillonita con un silano, el 3-aminopropiltrietoxisilano. Aunque las mejoras tecnológicas son bien conocidas, poco se sabe acerca de la toxicidad de estos nuevos materiales, siendo necesario su conocimiento para asegurar la salud de los consumidores y evitar futuros daños por exposición a estas arcillas debido a migraciones del envase al alimento. En el presente trabajo se investiga la genotoxicidad de Clay3 mediante el ensayo in vitro de micronúcleos con bloqueo de la citocinesis (CBMN) en la línea celular hepática humana HepG2. La inducción de micronúcleos (MN) y otras malformaciones nucleares se analizaron tras 24 h de exposición a concentraciones subcitotóxicas de Clay3 (0-250 μg/ml). Los resultados obtenidos no indicaron una alteración notable de las células tratadas con respecto a los grupos control bajo las condiciones de ensayo establecidas. El ensayo de MN forma parte de un conjunto de ensayos obligatorios solicitados por parte de las autoridades competentes en los procesos de autorización de materiales destinados al contacto con alimentos. Por tanto, es necesario ampliar los datos disponibles acerca de la toxicidad de este nuevo material antes de su potencial utilización comercial Universidad de Sevilla. Grado en Farmacia

RESUMEN Resumen La biocompatibilidad de la aparatología ortodóncica es una fuente de investigación en los últimos años ya que está íntimamente relacionada con la liberación de iones metálicos al organismo humano e inducción potencial de efectos biológicos. Dentro del medio intraoral, durante un tratamiento de ortodoncia, que habitualmente comprende 2-3 años, las células orales están en contacto directo con la aparatología ortodóncica. Así mismo, la cavidad oral es un medio ideal para los procesos de corrosión, dadas sus características de humedad, pH y microbiológicas. La aparatología ortodóncica está compuesta por bandas, brackets, arcos y muelles, entre otros dispositivos. A lo largo de los años, los materiales ortodóncicos han evolucionado siguiendo las necesidades de los tratamientos, apareciendo materiales como la aleación níquel-titanio en los años 70, que se caracteriza por un 55% de níquel y 43% de titanio, utilizándose en las primeras fases de tratamiento para el alineamiento y nivelación. Así mismo, aparecieron materiales como el acero, ßTi y TMA (titanio-molibdeno-aluminio). Con el fin de englobar la literatura ortodóncica en relación a la liberación de metales en la cavidad oral, se realizó una revisión de los estudios más recientes examinando tanto la propia liberación de iones metálicos, como los efectos tóxicos de dichos iones con especial interés en su citotoxicidad y genotoxicidad. Estudios previos sugieren que se debe realizar un análisis de cada caso para tener conciencia del aumento de la variabilidad de los materiales, su composición y los procesos de manufacturación. Los estudios acerca de la toxicidad in vivo son escasos, por lo que se deberían realizar nuevas investigaciones para intentar clarificar los resultados contradictorios existentes hasta la actualidad, así como para investigar los mecanismos tóxicos implicados en los efectos observados, con especial énfasis en el daño oxidativo. Por otra parte, son necesarios nuevos estudios de monitorización in vitro e in vivo que permitan establecer relaciones de causa-efecto entre la liberación de iones metálicos y biomarcadores de citotoxicidad y genotoxicidad. Los resultados de esta revisión dieron lugar a la siguiente publicación: IN VITRO AND IN VIVO EVIDENCE OF THE CYTOTOXIC AND GENOTOXIC EFFECTS OF METAL IONS RELEASED BY ORTHODONTIC APPLIANCES: A REVIEW (Martín-Cameán A y col., 2015. Enviado a Environmental Toxicology and Pharmacology, en revisión). Además, se ha llevado a cabo una revisión sistemática siguiendo las directrices PRISMA (Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Empleando tanto fuentes electrónicas [CENTRAL,MedLine;SCOPUS; EMBASE, Cochrane Library, ISI Web of Science, PASCAL, OVID HealthSTAR, y EBM] y búsquedas manuales [OpenGrey; Google Scholar] se analizaron los efectos cito/genotóxicos de este tipo de aplicaciones ortodoncias en humanos. Se seleccionaron 17 artículos y 6 estudios finalmente cumplieron los criterios (PICOS). Se observaron diferencias significativas en la mayoría de los estudios (5 de 6) respecto a daños citotóxicos y genotóxicos después de un tratamiento corto (1-3 meses) y a mas largo plazo (24- 48 meses). Algunos estudios que evaluaron efectos post-tratamiento (2 de 3) no encontraron diferencias significativas con respecto a los controles después de eliminar las aplicaciones ortodóncicas. Se concluye por tanto, la necesidad de llevar a cabo rigurosos ensayos clinicos aleatorios para determinar la continuidad de los daños cito/genotóxicos inducidos durante el tratamiento ortodóncico en población joven (12-26 años). Los resultados de esta revisión dieron lugar a la siguiente publicación: GENOTOXIC, CYTOTOXIC EFFECTS AND GENE EXPRESSION CHANGES INDUCED BY ORTHODONTIC FIXED APPLIANCES OVER ORAL MUCOSA CELLS: A SYSTEMATIC REVIEW. Martín-Cameán A et al., 2015. Submitted to Dental Materials (under revision) Diversos estudios han evaluado la liberación de iones metálicos a partir de aparatología ortodóncica en fluidos biológicos. La liberación de los elementos se ha medido principalmente mediante espectrometría de absorción atómica (AAS), espectrometría de emisión atómica con plasma acoplado inductivamente (ICPAES) o a través de espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). La mayoría de ellos han concluido que no se alcanzan concentraciones tóxicas en saliva y suero. Sin embargo, concentraciones no tóxicas pueden ser suficientes para producir cambios biológicos en la mucosa oral. Debido a que la liberación de metales en células de mucosa oral, que han estado en contacto prolongado con la aparatología fija, en pacientes de ortodoncia se ha estudiado mínimamente y no existen datos de validación previa disponibles, consideramos de importancia desarrollar y optimizar un procedimiento analítico para determinar titanio (Ti), vanadio (V), zirconio (Zr), cobalto (Co), cromo (Cr), cobre (Cu) y níquel (Ni) en células de mucosa oral en pacientes con y sin tratamiento de ortodoncia mediante ICP-MS. El procedimiento analítico se basa en la extracción y digestión de las muestras en medio ácido y cuantificación simultánea de los elementos. El método fue validado adecuadamente: la ecuación de regresión fue calculada a partir de los estándares preparados en la misma matriz sin células de mucosa oral y el rango lineal fue de 0.5-50.0 ng/mL para el Zr, de 5.0-50.0 ng/mL para Ti y V, y de 2.0-100.0 ng/mL para Co, Cr, Cu y Ni. Los límites de detección fueron de 0.9, 2.8 y 0.4 ng/mL para Ti, V y Zr, respectivamente; mientras que fueron de 0.10, 0.38, 0.49 y 0.67 ng/mL para Co, Cr, Cu y Ni, respectivamente. Los límites de cuantificación fueron de 1.8, 3.4 y 0.7 ng/mL para Ti, V y Zr, respectivamente, mientras que fueron de 0.20, 1.13, 0.98 y 1.81 ng/mL para Co, Cr, Cu y Ni, respectivamente. Los porcentajes de recuperación (%) obtenidos oscilaron entre 101-108 para el Ti, 98-111 para el V, 92-104 para el Zr, 104-109 para el Co, 103-107 para el Cr, 106-113 para el Cu y 84-110 para el Ni. Los datos de precisión intermedia (RSD%) fueron adecuados para todos los elementos, a los tres niveles de concentración elegidos. El método resultó robusto para los tres factores que se consideraron en el proceso de tratamiento de la muestra: tiempo de calentamiento, volumen de agua desionizada, y volumen de HNO3 PlasmaPure 65% utilizado para diluir las muestras, lo cual permite su validación y aplicación a células de mucosa oral en pacientes ortodóncicos. Los métodos validados se aplicaron con éxito a la determinación de la liberación de dichos iones metálicos en 40 pacientes, 20 de los cuales se encontraban bajo tratamiento de ortodoncia (13-15 meses) y 20 individuos control. Se evaluaron los resultados obtenidos, encontrándose contenidos significativamente superiores de Co, Cr , Cu y Ni en el grupo tratado en comparación con el grupo control, siendo las concentraciones detectadas inferiores a las Ingestas diarias tolerables (IDT) (Ni, Co) o a sus niveles máximos de ingesta tolerable establecidos (UL) de los elementos estudiados (Cr, Cu). Los resultados de estos experimentos han dado lugar a las siguientes publicaciones: VALIDATION OF A METHOD TO QUANTIFY TITANIUM, VANADIUM AND ZIRCONIUM IN ORAL MUCOSA CELLS BY INDUCTIVELY COUPLED PLASMA-MASS SPECTROMETRY (ICP-MS) (Martín Cameán A y col., 2014. Talanta 118:238-244) DEVELOPMENT AND VALIDATION OF AN INDUCTIVELY COUPLED PLASMA MASS SPECTROMETRY (ICP-MS) METHOD FOR THE DETERMINATION OF COBALT, CHROMIUM, COPPER AND NICKEL IN ORAL MUCOSA CELLS (Martín-Cameán A y col., 2014. Microchemical Journal 114:73-79) La cavidad oral es un medio particularmente ideal para la biodegradación de metales debido a sus propiedades iónicas, térmicas, microbiológicas y enzimáticas. En este contexto, las aleaciones ortodóncicas emiten corrientes electrogalvánicas tomando como medio la saliva, produciendo una liberación de iones metálicos a la mucosa oral. Diversos factores afectan a la liberación de iones, tales como el proceso de manufacturación, tipo de aleación, características de la superficie del material y envejecimiento de la aleación. Los metales no son biodegradables, y su liberación constante puede producir efectos tóxicos irreversibles debido a su acumulación en los tejidos. El pelo de cuero cabelludo humano es un vehículo de excreción de sustancias diversas (metales pesados, drogas de adicción etc.,), llegando a estar considerada esta matriz no invasiva como uno de los materiales biológicos más importantes de monitorización ambiental. A pesar de las numerosas ventajas que presenta el pelo en biomonitorización humana, los procedimientos analíticos para la determinación de liberación de metales en ortodoncia en dicha matriz son escasos, existiendo únicamente un estudio preliminar (procedimiento no validado, muy escaso número de pacientes) que demostró la no existencia de diferencias significativas en el contenido de algunos elementos metálicos en pelo de pacientes bajo tratamiento. Nuestro estudio se centró en la evaluación de niveles de Cu, Cr, Fe, Mn y Ni en pelo humano de una amplia población tratada con aparatología ortodóncica (n=70) para determinar, si la concentración de un metal dado estaba influenciado por el tratamiento ortodóncico en comparación a un grupo control (n=56). Los niveles de los compuestos metálicos se determinaron a través de espectrometría de absorción atómica (AAS), con diferentes modalidades, llama (Cu, Fe) y cámara de grafito (GF-AAS) (Cr, Mn, Ni). Se estudió la influencia de factores individuales (género, edad) en las concentraciones de metales, se estudiaron interacciones interelementales mediante la evaluación de coeficientes de correlación entre elementos, así como mediante un análisis de regresión múltiple. Las diferencias en el contenido metálico en pelo fue significativamente mayor sólo en el caso de Mn cuando se comparó con el grupo control, aunque los contenidos pueden considerarse de la misma magnitud que otras poblaciones control y, consecuentemente, no se asocian a riesgos debidos al tratamiento. El tratamiento de ortodoncia incrementó significativamente los niveles de Mn en pacientes jóvenes ( BIOMONITORIZATION OF CHROMIUM, COPPER, IRON, MANGANESE AND NICKEL IN SCALP HAIR FROM ORTHODONTIC PATIENTS BY ATOMIC ABSORPTION SPECTROMETRY (Martín-Cameán A y col., 2014. Environmental Toxicology and Pharmacology 37:759-771). Los microtornillos se utilizan, a día de hoy, habitualmente en los tratamientos de ortodoncia gracias a sus buenos resultados en la práctica clínica. Estos aditamentos se han popularizado ampliamente debido a su simplicidad en el manejo, bajo coste y la mínima necesidad de colaboración por parte del paciente. A pesar del elevado uso de los microtornillos en ortodoncia recientemente, los datos en la literatura ortodóncica en relación a su biocompatibilidad son muy escasos. Algunos metales propios de su composición como Ni y Cr pueden causar hipersensibilidad, dermatitis, asma y citotoxicidad. Así mismo, tienen un potencial genotóxico y carcinogénico significativo, efectos no relacionados con la dosis de exposición. La evaluación de los agentes genotóxicos se puede llevar a cabo mediante el análisis del daño de ADN primario, como se realiza en el ensayo cometa o “alkaline single cell gel electrophoresis”. Este ensayo es el método de elección para la medición de daño de ADN en células humanas en poblaciones expuestas a agentes genotóxicos. Hasta ahora, no existían estudios acerca del potencial genotóxico de los microtornillos en células de mucosa oral en humanos. Teniendo en cuenta la ausencia de estudios en este campo, el objetivo de nuestro estudio fue investigar el daño de ADN en células bucales de pacientes en tratamiento de ortodoncia mediante el ensayo del cometa en comparación con pacientes en tratamiento ortodóncico con microtornillos, y con respecto a un grupo control no tratado y un grupo de personas fumadoras (grupo control positivo). En el grupo de pacientes con tratamiento ortodóncico y en el de ortodoncia+microtornillos se obtuvo un incremento significativo (2 veces más) de %ADN en la cola del cometa en comparación con el grupo control. Las mujeres mostraron un aumento significativo del %ADN en todos los tratamientos en comparación con el grupo control, mientras que los hombres mostraron daño de forma significativa únicamente en el grupo de ortodoncia y microtornillo. En conclusión, la aparatología ortodóncica convencional induce genotoxicidad, y la incorporación de los microtornillos estudiados no implica un aumento adicional de daño del ADN. Los resultados de este experimento dieron lugar a la siguiente publicación: EVALUATION OF GENOTOXICITY OF ORTHODONTIC MINISCREWS ON MUCOSA ORAL CELLS BY THE ALKALINE COMET ASSAY (Martín- Cameán A y col., 2014. Toxicology Mechanisms and Methods, aceptado abril 2015) Tras confirmar el efecto genotóxico de la aparatología ortodóncica y la inocuidad de los microtornillos en cuanto al daño celular adicional, quisimos cuantificar las diferencias en la liberación de metales como el aluminio (Al), cobre (Cu), cromo (Cr), manganeso (Mn), níquel (Ni), titanio (Ti) y vanadio (V) en células orales de pacientes bajo tratamiento ortodóncico convencional (brackets, bandas y arcos) en comparación con pacientes tratados adicionalmente con microtornillos, y con, respecto a un grupo control, utilizando ICP-MS. Las resultados obtenidos revelaron el siguiente orden ascendente: Cr < Ni < Ti < Cu < Al, y el Co y V fueron prácticamente no detectados. Se encontraron diferencias significativas en comparación con el grupo control para el Cu en el grupo ortodóncico, y para el Ni en ambos grupos, tanto grupo ortodóncico como grupo ortodoncia+microtornillo. Se realizaron correlaciones potenciales entre los elementos metálicos, encontrándose una correlación positiva Al/Ti, y en relación a varios factores clínicos. Se concluye que los microtornillos no incrementan de forma significativa la liberación de metales. Los resultados de este experimento dieron lugar a la siguiente publicación: IN VIVO DETERMINATION OF ALUMINIUM, COBALT, CHROMIUM, COPPER, NICKEL, TITANIUM AND VANADIUM IN ORAL MUCOSA CELLS FROM ORTHODONTIC PATIENTS WITH MINI-IMPLANTS BY INDUCTIVELY COUPLED PLASMA-MASS SPECTROMETRY (ICP-MS) (Martín-Cameán A y col., 2015. Enviado a Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, en revisión) Para finalizar, teniendo en cuenta los resultados derivados de los experimentos realizados en la presente Tesis Doctoral, queda demostrada la liberación de iones metálicos a partir de aparatología ortodóncica, incluyendo microtornillos, a partir de pelo y células de mucosa oral, y su componente genotóxico, contribuyendo de esta forma a ampliar el conocimiento que actualmente podemos encontrar en la bibliografía científica en relación a estos materiales. A la vista de los antecedentes bibliográficos expuestos anteriormente, se constata la necesidad de actualizar de forma global y sistemática las últimas contribuciones al avance del conocimiento sobre la biocompatibilidad de los materiales ortodóncicos considerando las últimas aportaciones que se hayan publicado sobre la liberación de los elementos metálicos a partir de los mismos y sus principales efectos tóxicos, haciendo especial hincapié en los estudios de citotoxicidad y genotoxicidad realizados con este tipo de materiales en células de la mucosa oral, habida cuenta del potencial citotóxico y genotóxico de muchos de ellos. En este sentido, se plantearon revisiones bibliográficas que implican una puesta al día de los efectos citotóxicos y genotóxicos que pueden presentarse potencialmente tras la liberación de diversos cationes metálicos, como Ni, Cr, Co, Fe, Cu, revisando los aspectos toxicológicos más relevantes de los mismos; incluyendo una revisión sistemática enfocada sobre una de las matrices objeto de este estudio, células de mucosa oral, que incluya específicamente los efectos agudos celulares y sobre el ADN inducidos por contacto directo con las aplicaciones ortodóncicas. Al constatarse la escasez de métodos adecuados que permitan valorar in vivo la liberación de elementos metálicos mediante diversas técnicas espectroscópicas, y que los aplicados hasta la actualidad carecían de validación, se decidió desarrollar, optimizar y validar métodos que permitieran cuantificar de forma simultánea, exacta y reproducible los elementos que potencialmente pueden liberarse de aplicaciones ortodoncias fijas, en células de mucosa oral de pacientes mediante la técnica de Emisión de Plasma acoplado inductivamente- Espectrometría de Masas (ICP-MS). Por otro lado, se ha considerado necesario investigar la utilidad del pelo como nueva matriz para cuantificar y valorar la exposición a metales procedentes de lixiviados a partir de aparatología ortodóncica de forma crónica, identificando así los riesgos tóxicos a largo plazo, empleando la técnica de Espectrometría de Absorción atómica (AAS). Debido a la implantación cada vez mayor del uso de mini-implantes en ortodoncia, nos resultó interesante identificar y valorar la posible contribución que puede suponer su empleo en la liberación de metales iónicos en la mucosa oral de pacientes, así como investigar sus posibles efectos genotóxicos in vivo, utilizando para ello el ensayo cometa, siendo estas investigaciones pioneras en el caso de mini-implantes. Por todo ello, los objetivos específicos propuestos en la presente Tesis Doctoral han sido: 1. Realizar una revisión de actualización de la bibliografía científica sobre los efectos tóxicos, en particular citotóxicos, y genotóxicos inducidos por aparatología ortodóncica in vitro, e in vivo. Además, se revisará de forma sistemática la literatura científica relativa a las células de la mucosa oral, una de las matrices objeto de estudio. 2. Desarrollar y validar métodos analíticos-toxicológicos, incluyendo ensayos de robustez, que permitan la cuantificación simultánea de la liberación de elementos metálicos diversos, como Co, Cr, Cu, Ni, Ti, V y Zr a partir de aparatología ortodóncica in vivo, en células de mucosa oral de pacientes tratados, por Espectroscopia de Plasma inducido acoplado a Espectrometría de Masas ( ICP-MS). 3. Investigar la idoneidad del pelo como matriz no invasiva que permita evaluar la potencial acumulación de metales in vivo en pacientes tratados con aplicaciones ortodoncias fijas, en comparación con una población control. Estudiar la posible interrelación entre dichos elementos metálicos liberados, y valorar si las posibles diferencias de los contenidos de cationes metálicos cuantificados en ambas poblaciones pueden estar ligadas bien a factores humanos (edad, sexo), y/o factores ligados a los tratamientos (tiempo de tratamiento, maloclusión, extracción). 4. Evaluar in vivo la contribución que puede suponer el empleo de microtornillos en la liberación de metales en células de mucosa oral de pacientes sometidos a un tratamiento ortodóncico. Investigar posibles interrelaciones de los contenidos metálicos entre sí, y su relación con el tipo de tratamiento. 5. Poner a punto y optimizar el ensayo del cometa in vivo en células de mucosa oral humana y su aplicación para valorar daños genotóxicos derivados de las aplicaciones ortodoncicas fijas y mini-implantes en pacientes sometidos a dichos tratamientos. Esta Tesis Doctoral esta estructurada como una recopilación de artículos científicos. Los tratamientos ortodóncicos y la obtención de muestras se ha llevado a cabo en las instalaciones de la Clínica Universitaria de la Facultad de Odontología de la Universidad de Sevilla. Los estudios han contado con la aprobación del Comité Ético de la Universidad de Sevilla, y con el consentimiento escrito firmado por todos los pacientes. El trabajo experimental se ha realizado en el Área de Toxicología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, haciendo uso así mismo de las instalaciones de los Servicios de Biología, Microscopía y de Radioisótopos del Centro de Investigación, Tecnología e Innovación de la Universidad de Sevilla (CITIUS). Asimismo, las investigaciones sobre la determinación de metales en pelo se han llevado a cabo en los laboratorios del área de Toxicología del Departamento de Medicina Legal, Toxicología y Antropología Física de la Universidad de Granada, gracias a la colaboración de la Dra. Molina-Villalba, y muy especialmente al trabajo y supervisión del Profesor Dr. Fernando Gil Hernández, Catedrático de Toxicología de la Universidad de Granada. Siguiendo la normativa de la Universidad de Sevilla, el resumen, la justificación y objetivos, y las conclusiones se redactan tanto en castellano como en inglés para optar a la “Mención Internacional en el Título de Doctor”.

En la actualidad, la industria alimentaria está apostando por la incorporación de sustancias naturales a envases alimentarios con el fin de incrementar la perdurabilidad del alimento en el mercado. Debido al empleo de estas sustancias en esta nueva aplicación, la seguridad de los consumidores y del medio ambiente puede verse comprometida debido a una mayor exposición, desconociéndose en gran medida, hasta el momento, las posibles consecuencias. De entre las sustancias naturales seleccionadas por la industria alimentaria para este fin, destacan las arcillas y minerales de arcillas, y los aceites esenciales y sus respectivos componentes mayoritarios, constituyendo las primeras (arcillas) el principal objeto de estudio de la presente Tesis Doctoral. Por todo ello, decidimos realizar una evaluación toxicológica mediante una batería de ensayos tanto in vitro como in vivo, para investigar los posibles efectos tóxicos que pueden desencadenarse tras la exposición a estas sustancias, tanto puras como ya incorporadas en el envase. La relevancia de la información toxicológica de estas sustancias es tal que constituye un requisito reglamentario por parte de las autoridades competentes antes de su comercialización. En el caso de las arcillas y minerales de arcilla, se ha demostrado una mejora de las propiedades mecánicas, térmicas y barrera de las matrices poliméricas debido a su incorporación, lo que está, íntimamente relacionado con el incremento de la vida útil de los alimentos. Con el fin de contextualizar la situación ante la que se encontraban las arcillas y sus derivados en el área del envasado de la industria alimentaria y así abordar posteriores estudios, nos pareció importante realizar una exhaustiva revisión bibliográfica sobre los datos de toxicidad publicados en la literatura científica hasta la actualidad. La disparidad de los resultados disponibles hasta el momento hace necesaria una evaluación toxicológica caso por caso. Diferentes parámetros pueden estar involucrados en la respuesta obtenida, incluyendo: (i) condiciones de exposición tales como concentraciones seleccionadas o tiempos ensayados; (ii) modelos experimentales elegidos; (iii) modificadores o surfactantes incorporados a la estructura de la arcilla, (iv) sensibilidad de los ensayos llevados a cabo, etc. Dicha revisión bibliográfica ha dado lugar a la siguiente publicación: •TOXICOLOGICAL EVALUATION OF CLAY MINERALS AND DERIVED NANOCOMPOSITES: A REVIEW. (Maisanaba y col., 2015; Environmental Research 138, 233-254). La vía de exposición más importante en el contexto que nos engloba es la vía oral, dado que las arcillas van a ser incorporadas a un envase que posteriormente se va a poner en contacto con un alimento, y éste último será ingerido por los consumidores. En este caso los órganos que principalmente se podrían ver afectados serán los que componen el sistema digestivo, destacando entre ellos el intestino, encargado de la absorción de nutrientes, y el hígado, crucial en la biotransformación de xenobióticos. Se llevó a cabo una batería de ensayos de los materiales objeto de estudio con el fin de esclarecer sus principales efectos tóxicos, teniendo en cuenta la escasez y disparidad de los datos disponibles. Las líneas celulares seleccionadas fueron una línea celular de hepatoma humano (HepG2) y una línea celular de adenocarcinoma de colon (Caco-2). Éstas fueron expuestas a diversas arcillas no modificadas y modificadas con sales de amonio cuaternario, tanto comercializadas (Cloisite®Na+ (CNa+), Cloisite®20A (C20A) y Cloisite®30B (C30B)) o desarrolladas por el Instituto Tecnológico de Embalaje, Transporte, y Logística (ITENE) de Valencia (Clay1 y Clay2). Los experimentos llevados a cabo incluyeron la evaluación de: citotoxicidad basal, análisis de la morfología celular, genotoxicidad (ensayo cometa y ensayo de micronúcleos (MN)) y estrés oxidativo (producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) y contenido de glutatión (GSH)). De forma general se obtuvo ausencia de toxicidad en el caso de las arcillas CNa+, C20A y Clay1, y sólo en el caso de la primera arcilla mencionada se obtuvo una inducción de MN significativa y alguna alteración de la morfología celular. Sin embargo, pudimos observar daño en ambas líneas celulares tras la exposición a C30B y Clay2 en la mayoría de los parámetros evaluados. Además, se ha llevado a cabo por primera vez en la línea celular HepG2 el estudio de la influencia de las arcillas en la modulación de la expresión génica de un extenso grupo de genes involucrados en activación/destoxicación y otros mecanismos de acción tóxica. CNa+ y Clay2 sí demostraron alterar la regulación de distintos genes, no así C30B y Clay1. Los resultados de estos experimentos han dado lugar a las siguientes publicaciones: •IN VITRO TOXICOLOGICAL ASSESSMENT OF CLAYS FOR THEIR USE IN FOOD PACKAGING APPLICATIONS. (Maisanaba y col., 2013, Food and Chemical Toxicology 37, 266-275). •GENETIC POTENTIAL OF MONTMORILLONITE CLAY MINERAL AND ALTERATION IN THE EXPRESSION OF GENES INVOLVED IN TOXICITY MECHANISMS IN THE HUMAN HEPATOMA CELL LINE HEPG2. (Maisanaba y col., 2015; Journal of Hazardous Materials (en revision/ under revision)). •INDUCTION OF MICRONUCLEI AND ALTERATION OF GENE EXPRESSION BY AN ORGANOMODIFIED CLAY IN HEPG2 CELLS. (Maisanaba y col., 2015; Archives of Toxicology (en revisión/ under revision)). •EFFECTS OF TWO ORGANOMODIFIED CLAYS INTENDED TO FOOD CONTACT MATERIALS ON THE GENOMIC INSTABILITY AND GENE EXPRESSION OF HEPATOMA CELLS. (Maisanaba y col., 2015); Toxicology Letters (en revision/ under revision). •TOXIC EFFECTS OF A MODIFIED MONTMORILLONITE CLAY ON THE HUMAN INTESTINAL CELL LINE CACO-2. (Maisanaba y col., 2014; Journal of Applied Toxicology 34, 714-725). •TOXICITY ASSESSMENT OF ORGANOMODIFIED CLAYS USED IN FOOD CONTACT MATERIALS ON HUMAN TARGET CELL LINES. (Houtman y col., 2014; Applied Clay Science 90, 150-158). Aunque los órganos y tejidos del sistema digestivo serían probablemente los más afectados por exposición a las arcillas, hay otras dianas que también podrían verse dañadas, destacando el tejido endotelial vascular, involucrado en la distribución y absorción. Hasta el momento los datos disponibles acerca de los efectos de este modelo experimental expuesto a arcillas son limitados. Por ello, se ha llevado a cabo la evaluación de la viabilidad de la línea celular endotelial de vena umbilical humana (HUVEC) expuestas a CNa+, C30B, Clay1 y Clay2. Los resultados obtenidos indicaron que las células HUVEC seguían un patrón de respuesta muy similar al de HepG2 y Caco-2 ante la exposición a las arcillas, presentando una sensibilidad parecida a la línea celular hepática. Además, el estudio del potencial mutagénico mediante el Test de Ames es una prueba exigida antes de la comercialización de cualquier producto que vaya a entrar en contacto con alimentos (EFSA 2011b, 2015), siendo en este caso necesaria la evaluación de las arcillas que estén destinadas a ser incorporadas al envasado alimentario. El modelo experimental seleccionado fue Salmonella typhimurium (5 cepas), el cual se expuso a las cuatro arcillas mencionadas, en ausencia y presencia de fracción metabólica externa. Únicamente pudimos observar una respuesta mutagénica positiva en el caso de C30B y Clay1. Los resultados obtenidos se reflejan en la siguiente publicación: •CYTOTOXICITY AND MUTAGENICITY ASSESSMENT OF ORGANOMODIFIED CLAYS POTENTIALLY USED IN FOOD PACKAGING. (Maisanaba y col., 2015; Toxicology In Vitro 29, 1222-1230).La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) no sólo propone la evaluación de los materiales que se incorporan a las matrices poliméricas de envasado, sino también, siendo incluso de mayor importancia, la evaluación de los envases resultantes (EFSA, 2011a,b). En este sentido, ITENE desarrolló dos materiales nanocompuestos basados en ácido poli(láctico) (PLA) y Clay1/Clay2, ambas arcillas diseñadas por ellos. Con estos materiales se llevaron a cabo ensayos de migración, utilizando como simulante alimentario agua destilada, aceptado por el Reglamento UE Nº 10/2011 dado el tipo de alimentos hacia los que van dirigidos los mismos (hidrófilos). Una vez obtenidos los extractos de migración de PLA-Clay1 y PLA-Clay2, se evaluaron distintos parámetros con el fin de determinar los posibles efectos tóxicos debido a la migración de las arcillas tras la exposición a los mismos. En este sentido, se evaluó la viabilidad celular de HepG2 y Caco-2 expuestas a ambos extractos, así como el potencial mutagénico de los mismos mediante el Test de Ames. En los ensayos llevados a cabo se observó la ausencia de citotoxicidad y mutagenicidad en las condiciones ensayadas. Por otro lado, teniendo en cuenta que la presencia de los metales mayoritarios de la estructura de las arcillas son Al, Ca, Fe, Mg y Si, se evaluó el contenido de los mismos en los extractos de migración mediante Espectrometría de Masas con Plasma Acoplado Inductivamente (ICPMS) y Espectroscopía de Plasma Inductivo acoplado a Espectroscopía de Emisión Óptica (ICP-OES), no obteniéndose diferencias significativas con respecto al grupo control. Estos resultados se recogen en la siguiente publicación: •CYTOTOXICITY AND MUTAGENICITY STUDIES ON MIGRATION EXTRACTS FROM NANOCOMPOSITES WITH POTENTIAL USE IN FOOD PACKAGING. (Maisanaba y col., 2014 Food and Chemical Toxicology 66, 366-372). Una vez realizado el estudio toxicológico in vitro de las arcillas y considerando las mejoras tecnológicas presentadas por los polímeros nanocompuestos resultantes, se seleccionó la arcilla de mejor perfil toxicológico y tecnológico, siendo en este caso Clay1 la seleccionada para continuar la investigación. Con el fin de completar los resultados obtenidos in vitro y dada la escasez de información in vivo, se realizó un ensayo de toxicidad subcrónica durante 90 días en ratas Wistar expuestas a Clay1 (40 mg/kg/día) en la dieta y su extracto de migración (PLA-Clay1) como agua de bebida (ad libitum). En este sentido, transcurrido el periodo de exposición, los animales fueron sacrificados y se extrajeron sus órganos (hígado, riñón, intestino, cerebro, corazón, testículos, pulmones y bazo) y sangre mediante punción cardiaca. Se evaluaron una serie de parámetros, incluyendo: análisis histopatológico de todos los tejidos, bioquímica clínica del suero sanguíneo, liberación de interleucina 6 (IL-6), biomarcadores involucrados en la respuesta del posible estrés oxidativo generado en hígado y riñón, tales como la ratio glutatión reducido/glutatión oxidado (GSH/GSSG), peroxidación lipídica (LPO), y actividades de enzimas antioxidantes (superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GPx) y glutatión–S-transferasa (GST). Además, la expresión génica y abundancia proteica de SOD y CAT en hígado y riñón también fueron evaluadas. Podemos destacar un aumento de la actividad de CAT en riñón, así como de expresión génica y abundancia proteica, observado tras la exposición a Clay1. El resto de los marcadores evaluados tras la exposición a la arcilla o al extracto no se vieron afectados. Por otro lado, nos pareció interesante evaluar el contenido de los metales característicos de la composición de la arcilla en bazo de ratas expuestas a la arcilla y el extracto, no hallando diferencias notables con respecto a las ratas controles. Los resultados obtenidos en estos experimentos han dado lugar a las siguientes publicaciones: •EFFECTS OF THE SUBCHRONIC EXPOSURE TO AN ORGANOMODIFIED CLAY MINERAL FOR FOOD PACKAGING APPLICATIONS ON WISTAR RATS. (Maisanaba y col., 2014; Applied Clay Science 95, 37-40). •IN VIVO EVALUATION OF ACTIVITIES AND EXPRESSION OF ANTIOXIDANT ENZYMES IN WISTAR RATS EXPOSED FOR 90 DAYS TO A MODIFIED CLAY. (Maisanaba y col., 2014; Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A: Current Issues 77,456-466). •IN VIVO TOXICITY EVALUATION OF THE MIGRATION EXTRACT OF AN ORGANOMODIFIED CLAY-POLY(LACTIC) ACID NANOCOMPOSITE. (Maisanaba y col., 2014; Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A: Current Issues 77,731-446). •EVALUACIÓN DE LA SEGURIDAD DE UNA ARCILLA MODIFICADA Y SU EXTRACTO DE MIGRACIÓN EN BAZO DE RATAS WISTAR EXPUESTAS DE FORMA SUBCRÓNICA. (Maisanaba y col., 2013 Revista de Toxicología 30, 125- 130). Para la realización de esta Tesis Doctoral, la doctoranda realizó una estancia de investigación en ITENE, bajo la dirección de las Dras. Susana Aucejo y María Jordá, en la que se abordaron varios objetivos. Durante la estancia, se llevó a cabo el desarrollo de nuevas arcillas basadas en CNa+ modificadas con silanos, Clay3, Clay4A y Clay4B, destinadas al envasado. La caracterización de las mismas se realizó por espectroscopía de infrarrojos (FTIR), difracción de rayos X y termogravimetría (TGA). Los resultados preliminares mostraron una buena incorporación de los modificadores y mejoraron el perfil tecnológico de la arcilla original no modificada. Posteriormente, se evaluó la toxicidad de las tres arcillas sintetizadas. Los biomarcadores estudiados incluyeron citotoxidad basal, genotoxicidad (mediante el ensayo cometa) y estrés oxidativo (producción de ERO y contenido de GSH) en las líneas HepG2 y Caco-2. Por otro lado, también se determinó mediante citometría de flujo el posible mecanismo de muerte celular de células Caco-2 expuestas a Clay4A y Clay4B. Además, se evaluó el potencial mutagénico de las arcillas mediante el Test de Ames. De forma general, los resultados preliminares dieron lugar a una ausencia de efectos tóxicos por parte de Clay3, sin embargo, tanto Clay4A y Clay4B mostraron toxicidad en la mayoría de los parámetros ensayados. Dado que Clay3 fue la arcilla con mejor perfil tecnológico y toxicológico ésta fue seleccionada para realizar ensayos de vida útil, observándose un incremento de aproximadamente 24h en comparación con el control. Por otro lado, se valoró la migración de metales (Al, Ca, Fe, Mg y Fe) en dos simulantes diferentes, etanol al 10% e isooctano, procedentes de materiales nanocompuestos de polipropileno (PP) más Clay3 o PP-Clay4A. En todos los casos se obtuvieron diferencias con el control en alguno de los metales determinados. Los resultados obtenidos en estos experimentos darán lugar a diferentes publicaciones, aún pendientes de envío: •DEVELOPMENT, CHARACTERIZATION AND CYTOTOXICITY OF NOVEL SILANES MODIFIED CLAYS INTENDED TO PACKAGING (Título provisional). •TOXICITY EVALUATION OF A NEW SILANE-MODIFIED CLAY AND ITS MIGRATION EXTRACT FROM A NANOCOMPOSITE INTENDED TO FOOD PACKAGING (Título provisional). •TOXICOLOGICAL ASSESSMENT OF TWO SILANE-MODIFIED CLAYS IN HUMAN HEPATOMA CELLS AND SALMONELLA TYPHIMURIUM STRAINS (Título provisional). •CYTOTOXICITY, OXIDATIVE STRESS AND GENOTOXICITY ASSAYS OF SILANES-MODIFIED CLAYS IN THE HUMAN INTESTINAL CELL LINE CACO-2 (Título provisional). En relación a los aceites esenciales y sus componentes mayoritarios, también éstos están teniendo un gran auge en la industria alimentaria, empleándose en un nuevo tipo de envasado conocido como envasado activo. En este sentido, en vez de dar lugar a mejoras tecnológicas en sí como en el caso de las arcillas, lo que se aprovecha de estos aceites y sus componentes es su potencial antioxidante y antimicrobiano natural. Sin embargo, debe ser establecido un rango de concentraciones seguro para evitar los posibles efectos contraproducentes que puedan desencadenarse por un abuso de los mismos. En primer lugar, vimos necesario realizar una contextualización del uso actual de este tipo de envasado y las propiedades antimicrobianas y antioxidantes que presentan, así como una revisión de los principales efectos citotóxicos en diferentes líneas celulares de origen humano. Dicha revisión ha dado lugar a la presente publicación: •NEW ADVANCES IN ACTIVE PACKAGING INCORPORATED WITH ESSENTIAL OILS OR THEIR MAIN COMPONENTS FOR FOOD PRESERVATION. (Maisanaba y col., 2015. Food Reviews International (en revisión, under revision). Por último, la evaluación de los componentes mayoritarios de los aceites esenciales antes de ser incorporados a los envases es también obligatoria, tal y como establece la EFSA (EFSA, 2011b). En este sentido, el aceite esencial de orégano es uno de los más utilizados por sus destacadas propiedades antimicrobianas, siendo timol y carvacrol sus dos componentes mayoritarios. Existen en la bibliografía resultados sobre sus perfiles genotóxicos obtenidos por otros autores (Azizan y Blevins, 1995; Stammati y col., 1999; Ipek y col., 2005; Buyukleyla y Recuzogullari, 2009; Llana-Ruíz-Cabello y col., 2014). Estos resultados son dispares en algunos aspectos, siendo necesaria una evaluación de su toxicidad más amplia con el fin de esclarecer el perfil genotóxico de estos dos compuestos mayoritarios. Por consiguiente nos pareció interesante llevar a cabo el ensayo de MN, y, por primera vez, elensayo de Linfoma de Ratón. Los resultados obtenidos no mostraron una relevancia biológica notable para ninguno de los compuestos bajo las condiciones ensayadas. Dichos resultados se reflejan en la siguiente publicación: •IN VITRO GENOTOXICITY TESTING OF CARVACROL AND THYMOL USING THE MICRONUCLEUS AND MOUSE LYMPHOMA ASSAYS. (Maisanaba y col., 2015; Mutation Research 784-785, 37-44). Premio Extraordinario de Doctorado US

La importancia de las cianobacterias radica en su capacidad de formar floraciones que pueden ser tóxicas debido a la producción de cianotoxinas, lo cual constituyen una preocupación mundial en materia de contaminación ambiental. Se ha documentado que las Microcistinas (MCs) son hepatotóxicas en humanos, siendo capaces además de inducir alteraciones gastrointestinales, reacciones alérgicas, y sínt omas como irritación y neumonía. Asimismo en los últimos años la preocupación por los efectos que tienen dichas toxinas sobre la salud se ha incrementado, sobre todo desde que se conoce la carcinogenicidad de la MC-LR. Por todo ello manifestamos la importancia de incidir en el estudio de los efectos tóxicos de las MCs sobre el aparato gastrointestinal en humanos, debido al riesgo de exposición por ingestión de aguas y alimentos contaminados, dada su bioacumulación a través de la cadena alimentaria. Para ello, se utilizó la línea celular Caco-2, el modelo in vitro enterocítico más usado, establecido a partir del carcinoma de colon humano, que imita estrechamente al sistema in vivo, permitiendo la medida de marcadores y actividades bioquímicas. Los efectos tóxicos producidos por las MCs en las células fueron estudiadas a dos niveles de diferenciación: no diferenciadas y totalmente diferenciadas, y se expusieron a tres congéneres de MCs: MC-LR, MC-RR y MC-YR, durante 24 y 48 horas de exposición. Los resultados mostraron que la sensibilidad de las células Caco-2 a los efectos tóxicos de los distintos congéneres de MCs está influenciada en mayor medida por el tiempo de exposición en comparación con el grado de diferenciación. Además, MC-LR y MC-YR muestran un grado de toxicidad similar, si bien los efectos tóxicos inducidos por MC-YR comienzan a aparecer a concentraciones más bajas. MC-RR por otro lado, manifiesta una menor toxicidad. En general, el bioindicador más sensible a la acción tóxica de las MCs fue el contenido proteico, seguido del marcador rojo neutro (RN). Las principales alteraciones morfológicas observadas en la línea Caco-2 fueron la disminución del número de células y la degeneración hidrópica.

Texto completo descargado desde Teseo Las cianobacterias han ido adquiriendo gran importancia a lo largo de los años debido a su capacidad de formar floraciones o ¿blooms¿, las cuales pueden llegar a ser tóxicas debido a la producción de cianotoxinas, por lo que se han convertido en una preocupación a nivel mundial en materia de contaminación ambiental, toxicológica, sanitaria y económica, ya que pueden afectar tanto a animales y plantas como a seres humanos. La Cilindrospermopsina (CYN) es una de estas cianotoxinas, citotoxina que ha demostrado en roedores in vivo tener acción hepato y nefrotóxica, además de afectar a otros órganos, como pulmón, corazón, estómago, glándulas adrenales y sistemas vascular y linfoide. Además, se ha visto que es hepatotóxica e irritante en humanos. Se ha documentado que la CYN inhibe la síntesis de proteínas, interfiere la síntesis de glutatión reducido (GSH) y es genotóxica, aunque los estudios que se centran en ella aún son escasos. Debido a que la principal vía de entrada de CYN en el organismo es la oral, por ingestión de aguas y alimentos contaminados, consideramos de importancia el estudio de los efectos tóxicos de CYN sobre el tracto gastrointestinal (GI) y el tejido endotelial humano, ya que la CYN se absorbe a nivel GI y se distribuye por el resto del organismo a través de la sangre. Para ello, se emplearon como modelo experimental in vitro la línea celular intestinal humana Caco-2, modelo enterocítico in vitro más usado, establecido a partir de un carcinoma de colon humano, y la línea celular endotelial humana HUVEC, establecida a partir de endotelio vascular de cordón umbilical, las cuales imitan al sistema in vivo, permitiendo la medida de marcadores y actividades bioquímicas de interés. Los efectos tóxicos producidos por CYN en ambas líneas celulares fueron estudiados durante 24 y 48 horas de exposición para los ensayos de citotoxicidad basal y morfológicos, y durante 24 horas de exposición para los ensayos de estrés oxidativo, ya que no existen estudios sobre estas líneas celulares que traten la generación de estrés oxidativo por parte de la CYN. Los resultados de citotoxicidad basal mostraron que la sensibilidad de las células Caco-2 y HUVEC a los efectos tóxicos de la CYN está influenciada tanto por el tiempo de exposición, como por la concentración a la que se expusieron las células, siendo la línea celular HUVEC la más sensible de las dos. El bioindicador más sensible a la acción tóxica de la CYN en la línea Caco-2 fue la reducción de la sal de tetrazolio (MTS), mientras que en la línea celular HUVEC fue el ensayo de captación de rojo neutro (RN). En cuanto a los resultados de estrés oxidativo, se comprobó que ambas líneas celulares sufrían un incremento de las especies reactivas de oxígeno (ERO) a la vez que un descenso en los niveles de GSH y de la actividad ¿-glutamilcisteina sintetasa (GCS), enzima limitante de la síntesis de GSH, a dosis de CYN bajas; a las dosis más elevadas, estos marcadores se veían incrementados y se reducía la cantidad de ERO. Las principales alteraciones morfológicas observadas en la línea celular Caco-2 fueron degeneración lipídica, daño mitocondrial y segregación nucleolar con núcleos alterados, mientras que en la línea celular HUVEC, se observaron principalmente segregación nucleolar con núcleos alterados, aumento del número de gránulos secretores, degeneración del aparato de Golgi y apoptosis Los resultados de estos experimentos han dado lugar a las siguientes publicaciones: BIOCHEMICAL AND PATHOLOGICAL TOXIC EFFECTS INDUCED BY PURE CYLINDROSPERMOPSIN ON THE HUMAN CELL LINE CACO-2 (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Enviado a Water Research, en revisión) ALTERATIONS OBSERVED IN ENDOTHELIAL HUVEC CELL LINE EXPOSED TO PURE CYLINDROSPERMOPSIN (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Enviado a Archives of Toxicology) Siguiendo con los estudios in vitro y comprobados los efectos tóxicos de la CYN sobre las líneas celulares humanas, quisimos investigar el efecto que podría tener sobre la línea celular hepática del ciprínido Poeciliopsis lucida, PLHC-1, ya que, hasta la fecha, los estudios sobre la toxicidad de la CYN en modelos piscícolas tanto in vitro como in vivo son muy escasos, a pesar de su posible exposición al compartir hábitat. Para tratar esta cuestión, se realizaron nuevamente ensayos de citotoxicidad basal (24 y 48 horas) y de estrés oxidativo (24 horas). Los ensayos de citotoxicidad basal mostraron que la sensibilidad de las células PLHC-1 a los efectos tóxicos de la CYN era dependiente tanto de la concentración como del tiempo de exposición, siendo el bioindicador más sensible el contenido proteico total (PT). Se comprobó que la línea celular PLHC-1 era la menos sensible de las tres líneas celulares ensayadas. Con respecto a los ensayos de estrés oxidativo, se observó un aumento de la producción de ERO así como un descenso en los niveles de GSH y de la actividad de la enzima GCS. Los resultados de este experimento dieron lugar a la siguiente publicación: TOXICITY AND GLUTATHIONE IMPLICATION IN THE EFFECTS OBSERVED BY EXPOSURE OF THE LIVER FISH CELL LINE PLHC-1 TO PURE CYLINDROSPERMOPSIN (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Ecotoxicology and Environmental Safety 74, 1567-72) La CYN es una cianotoxina que se encuentra, en gran parte, de forma libre disuelta en el medio, por lo que un gran número de organismos acuáticos (fitoplancton, zooplancton, plantas y animales) pueden entrar en contacto con ella. Por ello, y una vez conocidos los efectos tóxicos que produce en los modelos celulares in vitro, consideramos de gran importancia investigar los efectos y repercusiones de dicha toxina in vivo sobre tilapias (Oreochromis niloticus), ya que es una especie de pez que crece en aguas susceptibles de contaminación por CYN, y además cada vez está cobrando mayor importancia como fuente de alimento para humanos. Nuestro estudio se centró en investigar la inducción de estrés oxidativo como mecanismo de toxicidad asociada a CYN en función de la vía de exposición y el tiempo de sacrificio, así como los posibles daños histopatológicos que podía ocasionar. Para este fin, se intoxicaron tilapias con una dosis única de 200 ¿g CYN pura/kg p.c. (seleccionada en base a estudios previos) por vía oral, mediante sonda gástrica (gavage) y por vía intraperitoneal (i.p.). Tras 24 horas y 5 días, los peces fueron sacrificados y se analizaron diferentes actividades enzimáticas, nivel de peroxidación lipídica (LPO), oxidación de proteínas y ADN, y contenido de GSH. De esta forma, comprobamos que la CYN producía un incremento de la actividad NADPH oxidasa, de los niveles de LPO y de la oxidación de proteínas, no producía oxidación del ADN en las condiciones ensayadas, y disminuía el contenido de GSH y la actividad GCS, lo que indica la importancia de estas enzimas en la patogenicidad de la CYN. Además, se comprobó que el tiempo de sacrificio influía más en los resultados que la vía de administración de la toxina, ya que los peces sacrificados a los 5 días tras la exposición presentaban la recuperación de algunos de los biomarcadores estudiados, mientras que otros parámetros mostraban mayor afectación. Al mismo tiempo, nos planteamos el estudio de las variaciones en la expresión génica de las enzimas Glutatión peroxidasa (GPx) y Glutatión-S-transferasa (GST), así como la abundancia relativa de GST en hígado y riñón bajo las mismas condiciones. El objetivo principal fue evaluar la alteración de los niveles de ARNm y la abundancia de proteínas de estas enzimas, ya que estos marcadores pueden proporcionar una información temprana sobre el estado del pez. Los resultados mostraron que estos parámetros se veían más afectados por la vía i.p. y en peces sacrificados tras 5 días. Por último, también se estudiaron los daños histopatológicos producidos en los diferentes órganos (hígado, riñón, intestino, corazón y branquias), comprobándose que no se producía una recuperación de las lesiones histopatológicas inducidas a los 5 días de la exposición a la toxina, lo cual demuestra la toxicidad retardada de CYN en este modelo experimental. Los resultados de este experimento dieron lugar a las siguientes publicaciones: OXIDATIVE STRESS RESPONSES IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS) EXPOSED TO A SINGLE DOSE OF PURE CYLINDROSPERMOPSIN UNDER LABORATORY CONDITIONS: INFLUENCE OF EXPOSURE ROUTE AND TIME OF SACRIFICE (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Aquatic Toxicology 105, 100-6) INFLUENCE OF THE EXPOSURE WAY AND THE TIME OF SACRIFICE ON THE EFFECTS INDUCED BY A SINGLE DOSE OF PURE CYLINDROSPERMOPSIN ON THE ACTIVITY AND TRANSCRIPTION OF GLUTATHIONE PEROXIDISE AND GLUTATHIONE-S-TRANSFERASE ENZYMES IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS) (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Enviado a Toxicon) TIME-DEPENDENT HISTOPATHOLOGICAL CHANGES INDUCED IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS) AFTER ACUTE EXPOSURE TO PURE CYLINDROSPERMOPSIN BY ORAL AND INTRAPERITONEAL ROUTE (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Aceptado en Ecotoxicology and Environmental Safety) Tras confirmar la producción de estrés oxidativo como mecanismo de acción tóxica de la CYN tanto in vitro como in vivo, quisimos investigar el efecto protector de la N-acetilcisteína (NAC), precursor del GSH, frente al daño oxidativo e histopatológico que pueden inducir tanto la CYN pura como liofilizados de cianobacterias productoras de CYN (+CYN) en tilapias. Los peces fueron pretratados con 0, 22 y 45 mg NAC/pez/día durante una semana, tras la cual fueron expuestos a una dosis única de, o bien 200 ¿g/kg pc de CYN pura o bien 200 ¿g/kg pc de CYN procedente de un liofilizado de Aphanizomenon ovalisporum, mezcladas con el alimento, y se sacrificaron a las 24 horas. Al igual que en el experimento anterior, se analizaron diferentes actividades enzimáticas, niveles de LPO, oxidación de proteínas, contenido de GSH, expresión génica de las enzimas GPx y GST y los daños histopatológicos producidos en los diferentes órganos. Los resultados mostraron un papel protector de la NAC en función de la dosis y el marcador biológico analizado. Así, sobre las actividades enzimáticas mejoraba la situación de estrés inducida por la CYN, tanto en el caso de la toxina pura como en el liofilizado de las células productoras de CYN (+CYN). Con respecto a la LPO se observa una recuperación de los valores basales y en cuanto al contenido de GSH se recuperaban los niveles tras la depleción sufrida en los grupos intoxicados con CYN sin pretratamiento. Además, estudiamos las repercusiones que la NAC podía ocasionar sobre el hígado, riñón, intestino, corazón y branquias a nivel histopatológico. Los resultados mostraron como la CYN procedente del liofilizado de A. ovalisporum producía daños más severos en los diferentes órganos en comparación con la CYN pura. Además, también se comprobó que la NAC ejercía un efecto protector frente a la CYN, reduciendo los daños observados. Por tanto, puede considerarse la NAC como un agente quimioprotector útil en la prevención de los efectos tóxicos en peces expuestos a CYN. Los resultados de estos experimentos han dado lugar a una solicitud de patente, y a la siguiente publicación: PROTECTIVE ROLE OF DIERTARY N-ACETYLCYSTEINE ON THE OXIDATIVE STRESS INDUCED IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS) EXPOSED TO CYLINDROSPERMOPSIN (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Enviado a Aquatic Toxicology) Por último, consideramos fundamental el inicio de las investigaciones para conocer el impacto de la CYN sobre plantas de consumo humano, ya que tras revisar la bibliografía científica, se constata la ausencia casi total de información disponible. Para ello, se comenzó con un análisis previo enfocado desde un punto de vista molecular para, de esta forma, poder identificar genes/proteínas implicados en el proceso de producción de toxicidad. Quisimos caracterizar la expresión proteica de la planta de tomate (Solanum lycopersicum) expuesta a CYN pura y extractos de CYN procedentes de cultivos de A. ovalisporum. Se emplearon geles de dos dimensiones (2DE) para el análisis proteómico de hojas de tomate. Además, se comprobó que la toxina puede ser el principal factor responsable del estrés fisiológico observado en las plantas, aunque existen otras moléculas bioactivas sintetizadas por las células de A. ovalisporum que podrían contribuir a la toxicidad observada. Los resultados de este experimento han dado lugar a la siguiente publicación: ALTERATIONS ON PROTEIN EXPRESSION INDUCED BY CYLINDROSPERMOPSIN IN TOMATO PLANTS (SOLANUM LYCOPERSICUM) (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Pendiente de envío) Para finalizar, teniendo en cuenta los resultados derivados de los experimentos realizados en la presente Tesis Doctoral, queda demostrada la validez de las técnicas in vitro e in vivo empleadas para la evaluación toxicológica de la CYN, contribuyendo de esta forma a ampliar el conocimiento que actualmente podemos encontrar en la bibliografía científica con respecto a esta cianotoxina. Premio Extraordinario de Doctorado US

Premio Extraordinario de Doctorado US

Revisados los antecedentes bibliográficos, se manifiesta la importancia de incidir en el estudio de los efectos tóxicos de las floraciones y cultivos de cianobacterias, al igual que de MC puras, en peces debido a que: 1. Viven en el mismo medio en el que