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La «Seca» o «Fusariosis» del garbanzo (Cicer arietinum, L.)> fue señalada por algunos autores como la enfermedad más importante del cultivo en Andalucía, atribuyéndole importantes pérdidas de cosecha. Sin embargo, el conocimiento en nuestro país sobre su etiología, epidemiología y lucha era prácticamente inexistente, salvo por investigaciones preliminares que indicaron la posibilidad de que la «Fusariosis» incluyera un complejo de enfermedades, que denominamos Marchitez y Podredumbre de Raíz (MPR). Los objetivos generales de las investigaciones incluidas en este trabajo fueron determinar la importancia y distribución de la MPR en el valle del Guadalquivir y su naturaleza etiológica y sintomatológica. Durante 1979 a 1981, se realizaron prospecciones sistemáticas en 108 campos de garbanzo en la Campiña de Córdoba y Sevilla, con un total de más de 1.300 ha., en las que se efectuaron observaciones sobre la sintomatología, incidencia y severidad de los ataques de la MPR. Plantas afectadas con los síntomas característicos se muestrearon para completar las descripciones sintomatológicas de campo y aislar en cultivo puro e identificar los posibles agentes asociados. La patogenicidad de los organismos consistentemente aislados se investigó en inoculaciones con suelo infestado artificialmente, o por inmersión de raices o cultivo de plantas, en una suspensión de inoculo. En suelo infestado con aislamiento patogénicos de Fusarium oxysporum y F. solani, se investigó lá susceptibilidad a ellos de once especies de leguminosas cultivadas, así como las diferencias en patogenicidad para varios cultivos de garbanzo. Cinco complejos sintomatología», amarilleamiento, marchitez, podredumbre seca de raíz, enanismo amarillento y clorosis, se identificaron asociados con la MPR del garbanzo. Todos ellos estuvieron uniformemente distribuidos en la campiña de Córdoba y Sevilla, siendo amarilleamiento y marchitez los más importantes. Tres especies fúngicas, F. oxysporum, F. solani y Macrophomina phaseolina, se aislaron consistentemente de plantas afectadas de los diferentes complejos sintomatológicos y resultaron patogénicos sobre garbanzo en inoculaciones artificiales. Los aislamientos de F. oxysporum fueron clasificados en tres grupos por características morfofisiológicas y patogénicas, caracterizándose, principalmente, por el tipo de síntoma que causaron: marchitez vascular, amarilleamiento vascular y amarilleamiento no vascular con lesiones necróticas corticales en el cuello y raíz. Los dos primeros grupos mostraron especificidad patogénica para garbanzo, por lo que pueden ser considerados como F. oxysporum f. sp. ciceri. La patogenicidad diferencial de ambos grupos sobre cultivares de garbanzo indica que petenecen a diferentes razas fisiológicas. F. solani causó amarilleamiento y podredumbre negra de cuello y raíz, existiendo diferencias morfofisiológicas y de patogenicidad entre aislamientos. Uno de los más virulentos fue identificado como F. eumartii. Los aislamientos de F. solani y F. eumartii resultaron patogénicos sobre garbanzo, haba (Vicia faba L.), guisante (Pisum sativum L.), lenteja (Lens escuelenta Moench.), Lupinus albus, L. angustifolius, L. luteus y L. mutabilis, por lo que rigurosamente no pueden ser caracterizados como alguna de las formas especializadas conocidas, aunque por la reacción observada parecen mejor adaptados a garbanzo, haba y guisante que a las restantes especies. M. phaseolina causó amarilleamiento y podredumbre seca de cuello y raíz. Las infecciones en inoculaciones artificiales fueron mas severas a altas temperaturas y bajo contenido de agua en el suelo, confirmando asi las observaciones de campo. Nuestros resultados señalan a F. oxysporum como agente de la marchitez y del amarilleamiento vasculares, a F. solani como agente del amarilleamiento no vascular asociado con podredumbre negra de cuello y raíz y a M. phaseolina como agente de la podredumbre seca de raíz; si bien, en el complejo amarilleamiento estuvieron implicadas las tres especies fúngicas, así como factores abióticos. Nuestras observaciones indican, asimismo, que el enanismo amarillento puede ser causado por el virus del enrollado de las hojas del guisante (PLRV), aunque otros virus pueden estar implicados, y que la clorosis resulta de una deficiencia férrica Several authors have considered the «Seca or fusariosis» disease as the most important disease that causes severe losses of seed yield of chickpea (Cicer arietinum L.) in Andalucía. Nevertheless, there is little knowledge of the etiology, epidemiology and control of that disease, except for some preliminary research which indicated that «Seca» might include a disease complex hereafter named Will and Root Rot (WRR). The objetives of the present study were to determine the etiology, symptomatology, importance and distribution of WRR of chickpeas in the Guadalquivir Valley (Southern Spain). Systematic disease surveys were carried out in the Cordoba and Sevilla provinces of Andalucía, including 108 chickpea fields and 1.300 ha. Observations were made on symptomatology, incidence and severity of WRR attacks. Samples of affected plants were used for further observations and isolations. Pathogenicity of the fungi which were isolated was investigated in artificially infested soil or by dipping the roots or growing plants in a inoculum suspension. Differential pathogenicity to chickpea cultivars and pathogenicity to eleven legume species were investigated in soil artificially infested with isolates of Fusarium oxysporum and F. solani. Five symptom complexes were found associated with WRR attacks: Will, Yellowing, Dry Root Rot, Yellow Stunt and Chlorosis. All symptom complexes were widely and uniformly distributed in Cordoba and Sevilla provinces, but Will and Yellowing cxcurred with higher prevalence, incidence and severity. F. oxysporum, F. solani and Macrophomina phaseolina, were consistently isolated from plants affected by the various symptom complexes. Isolates of those fungi were found to be pathogenic to chickpea in artificial inoculation experiments. Three groups of F. oxysporum isolates were distinguished according to morphological and pathogenic characteristics. Isolates of the different groups caused either vascular will, vascular yellowing, or nonvascular yellowing along with cortical necrotic lesions of collar and root. Isolates inducing vascular wilt or yellowing showed pathogenic specialization to chickpea and may be consideres as F. oxysporum f. sp. ciceri. Those isolates also showed differential pathogenicity to chickpea cultivars, indicating that they belong to different pathogenic races. Isolates of F. solani induced foliar yellowing and black collar and root rot, but differed in morpho-physiological characteristics and virulence. One of the most virulent isolates of F. solani induced foliar yellowing and black collar and root rot, but differed in morpho-physiological characteristics and virulence. One of the most virulent isolates of F. solani was further identified as F. eumartii. Isolates of F. solani and F. eumartii were pathogenic to chickpea, faba bean (Vicia faba L.). pea (Pisum sativum L.), lentil (Lens esculenta Moench), Lupinus albus L., L. angustifolius L., L. luteus L. and L. mutabilis Sweet., and therefore cannot be considered as belonging to any of the known formae speciales of F. solani. Nevertheless, as indicated by the severity of disease reactions observed, those isolates seem to be more adapted to chickpea, faba bean and pea than to any of the other species. M. phaseolina induced yellowing and dry collar and root rot. Infections by this pathogen in artificial inoculations were most severe at high temperatures and low soil water content, thus confirming field observations on incidence and severity of the disease. Our results indicate that F. oxysporum, F. solani and M. phaseolina are, respectively, the agents of Vascular Will and Yellowing, Non-Vascular Yellowing and Black Collar and Root Rot, and Dry Root Rot, However, those three species as well as abiotic factors were involved in the etiology of the Yellowing symptom complex in the field. Also, our observations in the field indicate that the Chlorosis complex is due to an iron deficiency, and that the Yellow Stunt symptom complex might be induced by pea leaf roll virus, although other plants viruses could be involved as well.

La Verticilosis del olivo, causada por el hongo Verticillium dahliae, es una de las enfermedades más importantes del cultivo en todo el mundo. En España constituye la principal amenaza sanitaria del olivar andaluz, siendo el patotipo defoliante (D) del patógeno el que produce los mayores daños y pérdidas económicas. El objetivo general de este trabajo ha sido estudiar los mecanismos de acción que subyacen en la protección contra la infección por V. dahliae D del material biológico, vegetal (olivo y acebuche) y microbiano, seleccionado previamente, tanto a nivel de la capacidad antagonista de diferentes cepas de Trichoderma spp. como del diálogo molecular de éstas con la planta. Se evaluó in vitro el potencial antagonista de diferentes cepas de Trichoderma spp., frente a cepas D y no defoliantes (ND) de V. dahliae, en ensayos de cultivo dual y de membrana. Los resultados mostraron que Trichoderma atroviride T11 posee mayor capacidad antagonista frente a cepas de los patotipos D y ND del patógeno. En ensayos in vivo, realizados con tres cepas de Trichoderma spp. y plantones de olivo “Picual”, se observó que las tres cepas eran capaces de colonizar la rizosfera del olivo, que las poblaciones alcanzadas se mantienen estables a lo largo del tiempo cuando la inoculación del antagonista se realiza mediante riego con una suspensión de conidias, y que solo Trichoderma asperellum T25 incrementa significativamente el crecimiento de la planta. Mediante un estudio de “microarrays” se analizaron los cambios transcriptómicos en T. atroviride T11 asociados con su micoparasitismo sobre V. dahliae D V-138I. Existió una sobrerrepresentación de los procesos biológicos de metabolismo y proteolisis, las funciones moleculares de actividad catalítica y de transporte, y el componente de membrana “integral de membrana” en la cepa T11 cuando sobrecrece una colonia de V. dahliae V-138I. A su vez, la sobrerregulación de peptidasas junto con el incremento significativo de la actividad proteasa, indicaron que la proteólisis es el mayor proceso biológico implicado en el micoparasitismo de T11. También se abordó, mediante microscopía confocal, el proceso de infección y colonización de clones de acebuche y olivo susceptibles (“Picual” y “Ac-15”) y resistentes (“Ac4” y “Ac18”) por V-138I, en ausencia y en presencia de Trichoderma harzianum T34; utilizando para ello transformantes del antagonista y del patógeno que sobreexpresan una proteína verde fluorescente (GFP) y una proteína amarilla fluorescente (YFP), respectivamente. Los niveles observados de colonización del sistema radical y del tallo de los plantones por V-138I concuerdan con la susceptibilidad mostrada por “Picual” y “Ac-15” y la resistencia de “Ac-4” y “Ac-18”. Además se observó que T34 coloniza el sistema radical de dichos plantones sin acceder a los haces xilemáticos del mismo y que la infección por el antagonista dificulta el acceso del patógeno al xilema de estas plantas. Por último se analizaron mediante PCR cuantitativa los cambios de expresión de genes relacionados con mecanismos de defensa en plantones de acebuche con distinta susceptibilidad a V-138I, inoculadas o no con el antagonista T34. Los perfiles de expresión de los genes PAL, WRKY4, ACS7, IAA9 y EIN3 en las raíces y hojas de acebuche “Ac-4” (resistente) y “Ac-15” (susceptible), en respuesta a su inoculación con V-138I y/o T34 muestran que ambos hongos difieren en la señalización de respuestas de defensa contra la infección en ambos clones de acebuche y que, a su vez, el genotipo de la planta influye en la señalización de las mismas.

Las epidemias causadas por el hongo de suelo Sclerotium rolfsii en numerosos cultivos agrícolas de interés económico siguen siendo de las de más difícil manejo, constituyendo aún, por tanto, un importante reto para los fitopatólogos. La dificultad de su manejo está motivada por diversas características de este patógeno, que incluyen el inusual rango de plantas huésped, su amplia distribución en suelos agrícolas a nivel mundial, su poderoso mecanismo de patogénesis con la producción exógena de encimas degradadoras de la pared celular del huésped, su capacidad para desarrollarse en un amplio rango de condiciones ambientales y su habilidad de persistir en los suelos infestados durante largos períodos de tiempo mediante la formación de estructuras de supervivencia o esclerocios, lo que unido con la recientemente demostrada variabilidad genética de sus poblaciones hacen de este patógeno uno de los de más difícil manejo. Las epidemias causadas por S. rolfsii son especialmente severas en zonas de clima templado y subtropical donde las elevadas temperaturas unidas a la elevada humedad de suelo proporcionada por la práctica del regadío dan lugar a condiciones favorables para el desarrollo del hongo, la infección y el rápido desarrollo de la enfermedad. En España, S. rolfsii se encuentra ampliamente distribuido en los suelos agrícolas del Valle del Guadalquivir y las provincias de Cádiz y Huelva en Andalucía. En esta área, las epidemias más severas causadas por S. rolfsii se han descrito en cultivos de remolacha azucarera de siembra otoñal, cuyos rendimientos suponen hasta el 40% de la producción total a nivel mundial de este tipo de siembra y siendo en esta región donde el cultivo está más avanzado desde el punto de vista tecnológico y productivo. A pesar de esto, no se han podido implementar hasta la fecha medidas eficientes para combatirlas. La coincidencia de los últimos riegos que recibe el cultivo con las altas temperaturas que se dan en la fecha de recolección, mayo-julio, ofrecen un escenario óptimo para el crecimiento y desarrollo de S. rolfsii y las enfermedades que causa referida como Podredumbre blanca o Mal del esclerocio. En la actualidad, se dispone de un limitado conocimiento acerca de la estructura y diversidad de las poblaciones de S. rolfsii, y éste es nulo en el caso de poblaciones infectando cultivos de remolacha azucarera. Este conocimiento, sería de especial interés para el diseño y desarrollo de medidas eficientes para el control integrado de las enfermedades causadas por este patógeno. En este contexto, la presente Tesis Doctoral se centra en el estudio de dichas poblaciones procedentes de diversas áreas de cultivo de remolacha azucarera de diferentes regiones del mundo en las que se practica el mismo tipo de cultivo de siembra otoñal y bajo unas mismas condiciones climáticas de tipo Mediterráneo, con prevalencia de severas epidemias de Podredumbre blanca, y tiene como objetivo general el generar conocimiento sobre la Fitopatología de S. rolfsii en base a su diversidad molecular y patogénica, e inferir, así, la estructura de dichas poblaciones como base para el establecimiento medidas de control eficientes para el manejo de dicha enfermedad y desarrollar estudios epidemiológicos y de dispersión de sus poblaciones. Esta investigación es pionera en este importante hongo fitopatógeno al aunar la caracterización genética a diversos niveles, así como su caracterización patogénica y de virulencia en el estudio de poblaciones de S. rolfsii. En un primer nivel, la variabilidad genética de las poblaciones de S. rolfsii se evaluó mediante la ocurrencia de grupos de compatibilidad miceliar (GCMs) en una amplia colección de aislados del hongo y su distribución geográfica. Los GCM se establecen en base a las reacciones de compatibilidad-incompatibilidad entre los aislados enfrentados entre sí en un medio de cultivo apropiado. Sin embargo, se ha detectado cierta variabilidad en las características morfológicas de las reacciones incompatibles que a menudo dificulta la clara distinción de las reacciones miceliares entre aislados. Esta limitación asociada a las evidencias macroscópicas se solventó mediante el desarrollo en el transcurso de las primeras fases de esta investigación de un medio de cultivo (medio modificado de Patterson: MPM) que favorece la formación de la zona de aversión característica de las interacciones incompatibles entre aislados de S. rolfsii y permite la identificación inequívoca de las distintas reacciones miceliares. La determinación de los GCMs se considera como un método indirecto para el estudio de la variabilidad genética entre aislados de hongos fitopatógenos que carecen de fase sexual o ésta rara vez ha sido descrita y, por lo tanto, se considera irrelevante su papel en el ciclo vital. En estos hongos, entre los que se encuentra S. rolfsii, se considera que el intercambio genético se produce exclusivamente entre individuos del mismo GCM por lo que permanecen genéticamente aislados de los encuadrados en GCMs diferentes. Este aislamiento genético hace que estas poblaciones puedan diferir en características de tipo morfológico, genético o patogénico. Así, entre los 459 aislados de S. rolfsii estudiados en esta Tesis Doctoral procedentes de ocho localidades de Andalucía donde se llevaron a cabo muestreos intensos, así como de cuatro localidades de Chile, una de Italia y cinco de Portugal, se identificaron 12 GCMs. En las parcelas muestreadas intensamente en Andalucía el GCM i fue el más abundante, apareciendo en todas ellas como el único grupo presente o junto a otros representados por un menor número de aislados, excepto en una localidad (Lebrija) donde el GCM más abundante fue el iii, sugiriendo que el GCM i representa a la población original de S. rolfsii en Andalucía. Considerando a la totalidad de parcelas muestreadas, el GCM iii fue el más ampliamente distribuido geográficamente ya que fue identificado en 10 de las 18 localidades estudiadas y en todos los países muestreados excepto en Italia. Esto sugeriría que el GCM iii pudo haber sido el que ha sufrido una dispersión más amplia tanto dentro de una misma zona de cultivo como entre áreas de cultivo, por prácticas culturales como por el desplazamiento de vehículos y/o material vegetal. El resto de GCMs identificados mostraron cierta correlación con el origen geográfico de los aislados al estar localmente distribuidos en varias localidades de diferentes países (GCM v), localidades dentro de un país (GCM ii, vi y ix) o en una sola localidad (iv, vii, viii, x, xi, y xii). Una de las hipótesis de partida en esta Tesis Doctoral fue que los aislados pertenecientes a un mismo GCM serían más similares genéticamente entre sí que a aquellos de GCMs diferentes. En base a esto, se analizó la diversidad genética de los aislados de S. rolfsii dentro y entre los distintos GCMs identificados y sus relaciones filogenéticas. En una segunda aproximación, se exploró la posibilidad de encontrar marcadores moleculares para los GCMs que permitiesen su caracterización e identificación rápida y reproducible. Para ello, se realizaron análisis RFLP (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción) del gen 5.8S del ADN ribosómico (ADNr) y las regiones espaciadoras internas ITS1/ITS2 que lo flanquean, mediante la digestión de los productos amplificados de dicha región con las enzimas de restricción AluI, RsaI, HpaII y MboI. Este análisis reveló la existencia de un nivel de variabilidad reducido entre aislados de S. rolfsii pertenecientes a los diferentes GCMs ya que los pertenecientes a un mismo GCM mostraron idénticos patrones de bandas para las cuatro enzimas, mientras que los 12 GCMs identificados se agruparon en tres grupos-RFLP que incluyeron entre uno, tres y ocho GCMs sin que existiese asociación con el origen geográfico de éstos. Por otro lado, dada la escasa resolución de esta aproximación para la adecuada caracterización de los aislados de S. rolfsii a nivel de GCM, se abordó el estudio de las secuencias nucleotídicas de regiones específicas de genes codificantes de proteínas ricos en intrones a lo largo de su secuencia, una herramienta molecular apenas explorada hasta la fecha para estudios de variabilidad molecular en S. rolfsii. Estas regiones se localizaron en el gen EF1α que codifica para el factor de elongación de la transcripción 1-alfa y en el gen RPB2 que codifica para la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II. Considerando ambas secuencias por separado, los análisis de similitud mostraron que los aislados de un mismo GCM compartían idéntica información nucleotídica y que además, era posible caracterizar a los GCMs atendiendo a sus secuencias, ya que eran únicas para la mayoría de ellos. Más aún, al combinar ambas regiones génicas, los 12 GCMs de S. rolfsii identificados fueron entonces resueltos, presentando cada uno de ellos secuencias nucleotídicas únicas que permitieron su completa caracterización. Este resultado se corroboró en “test ciegos” en los que nuevos aislados de S. rolfsii no incluidos en la colección inicial, fueron asignados a alguno de los GCMs previamente identificados mediante el análisis tanto de dichas secuencias génicas, con una similitud del 100%, como de las reacciones miceliares en enfrentamientos en medios de cultivo frente a los aislados “tipo” de cada los diferentes GCMs identificados. Por tanto, en la presente Tesis Doctoral se propone un set inicial de aislados “tipo” para la identificación de GCMs en S. rolfsii basada en secuencias específicas para cada uno de ellos de los genes EF1α y RPB2 que permita la rápida y correcta caracterización y clasificación de aislados individuales en los 12 GCMs identificados. Esta herramienta será de gran utilidad para una mejor compresión de la epidemiología de las enfermedades causadas por S. rolfsii así como en el estudio de la dispersión espacial y temporal de las poblaciones de éste. Finalmente, se abordó la caracterización patogénica y de virulencia de las poblaciones de S. rolfsii evaluadas en la presente Tesis Doctoral, así como su posible asociación con la variación genética encontrada en los distintos GCMs identificados, sobre un conjunto de 11 especies vegetales seleccionadas por representar al amplio rango de plantas huésped susceptibles que presenta S. rolfsii y por incluir, además, especies monoy dicotiledóneas de interés agrícola que podrían ser alternativas a los cultivos de remolacha azucarera de siembra otoñal en las zonas de producción de regiones con clima de tipo Mediterráneo y cuyas áreas se están reduciendo de manera constante como consecuencia de diferentes procesos de reconversión del cultivo. De este modo, a la hora de diseñar una adecuada rotación de cultivos, es necesario disponer de información a nivel local sobre la prevalencia de los GCMs presentes y de su espectro de plantas huésped susceptibles. Por otro lado, la rotación de cultivos se presenta como una de las pocas medidas de control para la Podredumbre blanca al contribuir a la reducción del inóculo del patógeno en los suelos infestados y al mantenimiento del potencial productivo de los suelos agrícolas. No obstante, la eficiencia de esta medida dependerá de la reacción que los cultivos incluidos en la rotación presenten frente a las poblaciones del patógeno. En consecuencia, esta investigación respondió a la necesidad de generar conocimiento acerca de los rangos de plantas huésped susceptibles a los distintos GCMs en las regiones de estudio de clima de tipo Mediterráneo y donde esta información no está disponible en la literatura científica. Los resultados obtenidos demostraron que existe una elevada variabilidad patogénica entre los aislados representativos de los diferentes GCMs, así como en el grado de susceptibilidad entre las especies de plantas huésped evaluadas con una interacción significativa entre los grupos de GCMs x especies huésped. El análisis de agregación permitió seleccionar cinco grupos de GCMs y agrupar las especies huésped en el grupo-especies 1 (brócoli, garbanzo, girasol y tomate) y 2 (algodón, pimiento, remolacha azucarera y sandía). Los grupos-GCM 1 (GCMs i y ix), 2 (GCMs ii, iii, vi y viii) y 5 (x, xii) fueron moderadamente virulentos sobre el grupo-especies 1 y ligeramente virulentos frente al grupo-especies 2. En cambio, los grupos-GCM 3 (GCMs iv, v y xi) y 4 (GCM vii) fueron ligeramente virulentos sobre ambos grupos de especies. De la misma forma, para el conjunto de los 12 GCMs, la reacción media de las diferentes especies de plantas huésped se estimó como: altamente susceptible (garbanzo y girasol), susceptible (algodón, pimiento, tomate y sandía), moderadamente resistente (brócoli, melón y remolacha azucarera) y resistente (maíz y trigo). Además, cabe destacar que entre los aislados de S. rolfsii pertenecientes a un mismo GCM, existe un bajo nivel de variabilidad patogénica, lo cual sugiere una correlación entre los componentes de un GCM y su capacidad patogénica y de virulencia. En base a estos resultados que muestran claras diferencias en virulencia entre los diferentes aislados de S. rolfsii, asociadas además a la diversidad genética de los mismos determinada por los GCMs en los que se agrupan, junto con la ocurrencia de hasta tres GCMs diferentes en una misma parcela o localidad, dificultan la recomendación de la rotación de cultivos como única medida de control frente a la Podredumbre blanca. Esta Tesis Doctoral ha permitido explorar por vez primera el estudio y caracterización de la estructura genética y patogénica de las poblaciones de S. rolfsii infectando cultivos de remolacha azucarera de siembra otoñal en regiones de clima de tipo Mediterráneo. La información generada en la presente Tesis Doctoral ha permitido establecer las bases para: (i) la inequívoca evaluación de las distintas reacciones miceliares entre los aislados de S. rolfsii; (ii) la identificación y caracterización rápida de GCMs en base a marcadores moleculares; (iii) el establecimiento de una colección de referencia de aislados representativos de GCMs para futuros estudios sobre las poblaciones del patógeno; y (iv) la caracterización de la reacción de un conjunto de especies de plantas huésped de interés económico y agrícola frente a las poblaciones de S. rolfsii prevalentes en áreas de clima Mediterráneo. Desde un punto de vista práctico, los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral permitirán establecer medidas más eficientes de control de las enfermedades causadas por S. rolfsii tanto en remolacha azucarera como en otros alternativos que se establezcan en áreas con historia del patógeno. En base a nuestros resultados, dichas medidas deben estar basadas fundamentalmente en los principios de prevención y escape, y deberán ser implementadas mediante la utilización de cultivos no huésped del patógeno o con un nivel adecuado de resistencia a las poblaciones del mismo prevalentes en la zona de cultivo, así como la práctica de la rotación de cultivos que incluya preferentemente cultivos no huésped a S. rolfsii.

El olivo (Olea europaea L. subsp. europaea) ha sido culturalmente y económicamente el principal cultivo oleaginoso de la Cuenca Mediterránea. España es el mayor productor de aceite de oliva en el mundo, y Andalucía, la región sur del país, es el principal área de cultivo con 62% de la superficie de olivar en España, ocupando >1.5 millones ha, y un 17% de su superficie total en un monocultivo impresionante. En España, el olivo se puede encontrar en dos formas, silvestre (Olea europaea L. subsp. europaea var. sylvestris) y cultivada (Olea europaea L. subsp. europaea var. europaea). Las interacciones planta-microorganismo en la rizosfera y endosfera ha sido objeto de considerables estudios, ya que las comunidades bacterianas desempeñan un importante papel en el balance, desarrollo y funcionamiento del ecosistema suelo en diferentes sistemas agrícolas en muchas especies de plantas cultivadas. Esta Tesis Doctoral, se ha centrado en el estudio de la estructura y diversidad genética de las comunidades bacterianas de la rizosfera de olivos cultivados y silvestres en Andalucía, determinando el papel que los sistemas de manejo del suelo y los factores asociados a la planta pueden tener sobre éstas. En España, recientemente se han introducido métodos alternativos del manejo del suelo para reducir al mínimo la vulnerabilidad de los olivares a la erosión del suelo, uno de los principales problemas para la sostenibilidad del olivo en Andalucía, incluyendo el no-laboreo combinado con el control mecánico de malas hierbas, laboreo reducido con y sin control de malas hierbas y siembra de cubiertas vegetales en el otoño y eliminación de malas hierbas con herbicidas en la primavera y/o posterior desbroce o pastoreo. En este trabajo, se utilizó el análisis FT-RFLP (Análisis del Polimorfismos de Longitud del Fragmento de Restricción Terminal Fluorescente) de las secuencias amplificadas de la región 16S del ADNr para estudiar las diferencias en la estructura de las comunidades bacterianas en muestras de suelo de 46 plantaciones comerciales de olivo orgánico y 12 áreas naturales cercanas con diferentes tipos de suelo. Las fincas de olivar estudiadas han estado sometidas a los diferentes sistemas de manejo de suelo durante largo tiempo en dos de las zonas más representativas para el cultivo de olivar en Andalucía, y representan ejemplos de sistemas agroforestales y plantaciones tradicionales. Nuestros resultados demostraron que dentro de cada finca de olivar tanto el tipo de suelo como el manejo de éste contribuyeron en este orden a modificar la estructura y diversidad de las comunidades bacterianas de acuerdo a los valores de los índices de Riqueza y Shannon Weiner. Los suelos de olivar de Sierra Morena con laboreo ligero o pastoreo con ovejas durante todo el año, presentaron mayores valores de estos índices de diversidad comparados con todos los sistemas de manejo del suelo en Campiña (laboreo convencional y cobertura del suelo con desbroce). Mediante este análisis FT-RFLP algunos fragmentos de restricción terminal han sido identificados y asociados significativamente a sistemas de manejo de suelo específicos, los cuales podrían ser utilizados en el futuro como indicadores para evaluar el efecto de cambios en el manejo de suelo en la modificación de las propiedades biológicas del suelo incluyendo la calidad biológica del mismo. Entre los árboles cultivados y silvestres, el olivo es una de las especies de mayor longevidad y riqueza en variabilidad genética. En España, más de 200 variedades son actualmente cultivadas. En Andalucía ocho cultivares de olivo (Hojiblanca, Lechín de Sevilla, Manzanilla de Sevilla, Nevadillo Negro, Picual, Picudo, y Verdial de Huévar) representan >90% del área total cultivada, y nuevos cultivares (Arbequina y Frantoio) están siendo actualmente introducidos. En esta Tesis Doctoral, utilizando un enfoque tanto cultivo-dependiente e independiente (FT-RFLP de las secuencias amplificadas de la región 16S ADNr), evaluamos la influencia específica del genotipo de olivo, vivero de origen de los plantones, y el tiempo de incubación en la estructura de las comunidades bacterianas así como en las comunidades bacterianas cultivables totales (BCT) y Pseudomonas fluorescentes (Ps) en la rizosfera y endosfera de seis cultivares (Arbequina, Frantoio, Hojiblanca, Manzanilla de Sevilla, Picual, y Picudo). Nuestros resultados indicaron que en primer lugar el vivero de origen, y en segundo lugar el genotipo del olivo, tuvieron una influencia significativa en la estructura de las comunidades iniciales y densidad de población de bacterias cultivables en la rizosfera y endosfera. En general, los cultivares Arbequina y Frantoio mostraron los mayores niveles de densidad de población. Asimismo, la estructura de las comunidades bacterianas de la rizosfera de seis cultivares de olivo muestreados en distintos tiempos de crecimiento fueron diferenciados en primer lugar en función del tiempo de muestreo y en segundo lugar en función del genotipo del olivo, con densidad de poblaciones de BCT y Ps manteniéndose estables o incrementando sus niveles de densidad de población durante el tiempo de crecimiento. En esta Tesis Doctoral, nuestra hipótesis fue que ambas formas de olivo, cultivada y silvestre, pueden ser una importante fuente de variabilidad genética la cual puede contener comunidades bacterianas en la rizosfera con importantes aplicaciones en la medicina, veterinaria, agricultura o industria. Mediante un enfoque de análisis polifásico, examinamos la estructura y diversidad de las comunidades bacterianas en la rizosfera de olivos silvestres en Andalucía. Primero, utilizando la técnica de análisis FT-RFLP de la región 16S ADNr, encontramos una alta heterogeneidad en la composición de las comunidades bacterianas de la rizosfera, sugiriendo la existencia de comunidades específicas en función del genotipo de la planta y localización geográfica, siendo cada reducto de acebuche un reservorio único de diversidad. Posteriormente, investigamos el potencial antagonista de esas poblaciones bacterianas cultivables asociadas a la raíz. De un total de 675 aislados bacterianos de la rizosfera y endosfera de olivos silvestres, 94 (14%) mostraron una fuerte actividad antagonista in vitro contra V. dahliae patotipo defoliante, el cual es considerado uno de los más importantes patógenos que afectan al cultivo del olivo en el mundo. La proporción más alta de antagonistas se obtuvo de la rizosfera (59,6%) en comparación con la endosfera (40,4%). En total, la mayoría de los antagonistas (entre un 58,5 a 78,3%), mostraron actividad proteolítica, lipolítica, quitinolítica, produjeron ácido indol-acético y sideróforos. Mediante la secuenciación del gen 16S del ADNr, los antagonistas se identificaron indicando que la mayoría de las bacterias pertenecen al género Bacillus (56,4%), Pseudomonas (27,7%) y Paenibacillus (7,4%). Asimismo, varios de los aislados bacterianos que se identificaron no habían sido citados previamente en olivo incluyendo Acinetobacter sp. (3,2%), Chryseobacterium vyrstaatense (2,1%), Rhodococcus wratislaviensis (1,1%), y Rahnella sp. (1,1%). En general, varias de estas bacterias mostraron un alto y gran número de mecanismos de antagonismo, por lo que deben ser consideradas para futuros análisis como potenciales agentes de biocontrol contra V. dahliae en olivo. Finalmente, realizamos un intenso estudio centrado en nuevas bacterias pertenecientes a Duganella spp. con pigmentación morada productoras de violaceína con interés biotecnológico habitando la rizosfera de olivos silvestres y cultivados en el sur de España. Mediante una caracterización fisiológica y bioquímica, análisis filogenético de diferentes genes incluyendo 16S ADNr, gyrB y vioA (implicado en la síntesis de violaceína), aislamos e identificamos por primera vez Duganella spp. asociadas con la rizosfera de plantas leñosas en medio ambientes de clima Mediterráneos que son capaces de producir violaceína, un metabolito secundario de color azul-morado con importantes aplicaciones biológicas, médicas e industriales de alto interés biotecnológico. Las siete cepas de Duganella spp. estudiadas pudieron ser identificadas como dos potenciales especies nuevas y fueron diferenciadas de acuerdo a su huésped de origen (Duganella baetica en olivos silvestres versus Duganella olivae en olivos cultivados). Todas las cepas de Duganella spp. produjeron violaceína in vitro, con niveles de producción natural más altos (hasta X65) que los citados en la literatura para cepas de otras especies bacterianas productoras de violaceína. Este alto rendimiento, hacen de estas bacterias buenas candidatas para su explotación biotecnológica, ya que los bajos rendimientos en la producción de violaceína se consideran una de las principales limitaciones de las cepas silvestres para su producción masiva y explotación comercial. Aunque no se demostró actividad inhibidora in vitro frente a bacterias gram-negativas y hongos fitopatógenos, el filtrado crudo de violaceína si demostró actividad inhibidora contra bacterias gram positivas. También observamos que las cepas de Duganella spp. de olivos silvestres y cultivados mostraron actividad proteolítica y lipolítica y una débil producción de sideróforos lo cual merece una investigación más extensa como potenciales inoculantes de plantones de olivo para mejorar su crecimiento y el establecimiento y supresión de patógenos del suelo.

La adormidera es uno de los cultivos más importantes para la industria farmacéutica en España ya que constituye la única fuente de morfina, codeína y tebaína. Durante los últimos años, los rendimientos del cultivo de adormidera han venido disminuyendo como consecuencia de ataques de una enfermedad. El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido el obtener nuevos conocimientos sobre la etiología, biología y epidemiología del Mildiu de la adormidera, así como sobre la caracterización y detección molecular específica del agente causal, que permitan establecer las bases científicas para el desarrollo de estrategias eficientes para el control integrado de la enfermedad. Se ha determinado el agente causal del mildiu de la adormidera en España y Francia como Peronospora arborescens y su diversidad genética en los cultivos de adormidera. Además se han desarrollado tres protocolos de detección molecular mediante PCR y cebadores específicos recogidos en la patente española Nº P200603319, y extendida internacionalmente con la aplicación Nº PCT/ES2007/000781, los cuales han sido empleado para responder de forma eficiente a diferentes cuestiones sobre este patosistema: i) PCR simple: con tres parejas de cebadores que permitió detectar eficientemente P. arborescens en diferentes tejidos sintomáticos y asintomáticos de la planta y permitió demostrar que P. arborescens puede ser trasmitido por semillas; ii) PCR aninada: Con dos parejas de cebadores la cual supuso un incremento en la sensibilidad de detección y permitió amplificar P. arborescens en muestras de herbario y/o asintomáticas de Papaver spp., así como demostrar que P. arborescens puede generar infecciones sistémicas asintomáticas en adormidera; iii) PCR cuantitativa, con excelentes propiedades de reproducibilidad, eficiencia y valores de correlación. Además se desarrolló un modelo robusto y universal como control de la cuantificación que permitió cuantificar niveles de ADN de P. arborescens en diferentes tejidos de adormidera y lote de semillas. Finalmente se abordó el estudio del patosistema determinando cuestiones relaciones con naturaleza de inóculo e infecciones determinantes para el desarrollo de epidemias mediante un abordaje experimental integrador de técnicas clásicas y moleculares que ha demostrado la trasmisión del patógeno en semillas que pueden ser infectadas/infestadas debido a infecciones sistémicas primarias por oosporas así como por infecciones secundarias por esporangios, que a su vez pueden ser sistémicas o no, y sintomáticas o asintomáticas. Los esporangios desarrollados en plantas son eficientes en producir nuevas infecciones secundarias que diseminan la enfermedad a plantas asintomáticas. A su vez, estas infecciones pueden ser sistémicas o no. Las oosporas contenidas en restos de cosecha infestados o en suelo infestado son eficientes en originar infecciones en los órganos subterráneos de plántulas de adormidera durante el establecimiento del cultivo y originar infecciones sistémicas sintomáticas o asintomáticas. Esta Tesis Doctoral ha permitido por tanto desarrollar nuevas tecnologías que permitirán establecer medidas efectivas de control de la enfermedad, fundamentalmente basadas en los principios de exclusión y erradicación, aplicables fundamentalmente sobre semillas infectadas o sobre cultivos de adormidera comerciales. Además, la presente Tesis Doctoral ha establecido las bases científicas y tecnológicas para el desarrollo de (i) programas de certificación sanitaria de semilla de adormidera, (ii) evaluación de material vegetal en programas de mejora genética de variedades resistentes/tolerantes, y (iii) estudios sobre la epidemiología y dispersión del agente causal; aspectos fundamentales para el Control de la enfermedad.