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191 p.-35 fig.-11 tab.-anexos., Making use of the multiple molecular techniques available in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, we have been able to characterize a new function for the Reb1 protein, acting as a transcriptional regulator for genes involved in the stress response to nitrogen starvation. We have also found that this protein becomes essential when cells need to lengthen their G1 phase either due to a defect on the proteins required for passing through “start” or due to the need of reaching a certain size to passage through start. Reb1 is also needed for the survival upon entry into stationary phase in minimal medium. The ribosomal genes are usually organized as one or several arrays of tandemly repeated copies through the genome. In S. pombe, the rDNA consists of about 125 copies arranged in two arrays at both ends of chromosome III. A common feature observed in most organisms is that rDNA is replicated almost entirely in a unidirectional manner, with replication forks moving through the transcribed region in the direction of transcription. This is achieved by the presence of replication fork barriers (RFBs) located downstream the transcriptional units. It is believed that these RFBs serve as a mean to prevent the head on collision between replication and transcriptional machineries due to the high transcriptional rate of these genes even during DNA replication. In the fission yeast, three RFBs (RFB1-3) have been identified. A fourth replication fork pause (RFP4) can be visualized when any of the other barriers is not functional. All of S. pombe´s RFBs are dependent on the presence of the protein complex Swi1-Swi3. The RFB1, the one that gives the strongest signal and the closest one to the replication origin, is dependent on the presence of the swhitch activating protein Sap1 (Mejía-Ramírez et al., 2005). Reb1 is the protein that induces replication fork arrest at barriers RFB2 and RFB3, upon binding to two specific 17-bp sites (Sánchez-Gorostiaga et al., 2004). Binding of Reb1 to these two sites is also required for the termination of rRNA transcription by RNA polymerase I (Zhao et al., 1997). In this study we have found that Reb1 also binds in vivo and in vitro to a sequence upstream the promoter of the gene ste9+, participating in its up-regulation under nitrogen starvation (Rodríguez-Sánchez et al., 2011). Ste9 cooperates in the arrest of cells in G1 in reponse to nutritional stress. This is achieved by the anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C), which targets B-type cyclin for proteasome (Blanco et al., 2000)., G1 arrest enables cells to proceed through sexual differentiation, mating and spore formation to resist the harsh environment. Cells lacking Reb1 show a reduced arrest in G1 leading to a diminished fertility (Rodríguez-Sánchez et al., 2011) due to the inefficient expression of ste9+ during nitrogen deprivation. In addition to its function in the regulation of the G1 phase during nitrogen deprivation, we have also found that Reb1 becomes essential for viability when cells need to lengthen the G1 phase to reach the minimal size to begin replication, as in the thermosensitive wee1-50 mutant. The fission yeast shows a smart design to control the accurate size in which cells are born. This involves a mechanism based on gradients of inhibitory kinases, that in the last step regulates the activity of Cdc2, the only cyclin dependent kinase required in this yeast to drive the cell cycle. Wee1 is a kinase that phosphorilates Cdc2 (keeping the Cdc2-Cdc13 complex inactive) during G2 phase to prevent the premature entrance into mitosis if the cells have not reached the critical size for entering this phase. The combined reb1∆ wee1-50 mutants die of mitotic disaster after a couple of rounds of premature entrance into replication and mitosis. Reb1 is also essential for the viability of cells with defects in proteins required for the initiation of S-phase, as in cdc10-129 mutants. Cdc10 is a component of the transcriptional regulator complex MBF (Aligianni et al., 2009; Caetano et al., 2011), involved in controlling that the expression of the genes necessary for the entry into the S takes place only during G1 phase (McInerny et al., 1995). These data indicate that Reb1 is required to prevent the premature passage of cells through start. We have also found that during the course of the quiescent state induced upon reaching stationary phase on minimal medium, reb1∆ cells lose their viability at the early stages of stationary phase, showing a reduced chronological life span. Reb1 protein presents two Myb-type domains required for DNA binding. A protein interaction domain at its N-terminal end allows Reb1 to dimerize and interact with other proteins (Biswas y Bastia, 2008). We have found that during nitrogen starvation, Reb1 is processed through this N-terminal domain in a specific pattern, giving rise to different isoforms. The pattern of Reb1 isoforms is specific of the culture medium in which cells are growing. These different isoforms might be involved in the various cellular responses that we have attributed to Reb1. The exogenous expression of two of this isoforms is able to carry out all the Reb1 functions described above. Our latest work is centered on a high-throughput screening for other Reb1 binding sites on the fission yeast´s genome. This study has revealed that Reb1 binds upstream various genes, frequently around their transcription start sites. The gene ontology enrichment (Carmona-Saez et al., 2007; Nogales-Cadenas et al., 2009; Tabas-Madrid et al., 2012) of the genes whose promoters Reb1 binds to, shows that Reb1 might be involved in the transcriptional regulation of genes that participate in the regulation of cell cycle (e.g., ste9+, nim1+, cig2+, rbx1+, cdc18+), in the biosynthesis of secondary metabolites (e.g., fbp1+, pgk1+, gpm1+) and in the ubiquitin mediated degradation of proteins (cyp8+, ste9+ and rbx1+). Using real-time RT-PCR technique, we have been able to show that Reb1 is required for the transcriptional regulation of some of these genes in response to nitrogen starvation. The expression of genes nim1+, ste9+, cdc18+ and cig2+, is known to be up-regulated during nitrogen starvation, diminished in reb1∆ cells., stationary phase or under nitrogen starvation. Cells that lack Reb1 show no transcriptional up-regulation of ecl1+ upon entrance into stationary phase, nor upon nitrogen starvation. These results indicate that Reb1 acts as a transcriptional regulator protein for multiple genes in S. pombe. All together, the results described above lead us to propose a model in which Reb1 acts as a scaffold protein that tethers together different genomic regions (by dimerization or binding to other DNA binding proteins) (Singh et al., 2010) during non stressful conditions close to the nucleolus, where the stress response genes are silenced or expressed at baseline level. Upon sensing the absence of nitrogen, the protein interaction N-terminal domain of Reb1 is readily processed allowing the movement of the silenced chromosomal regions to a more transcription prone zone of the nucloeplasm. Processing of the N-terminal domain would not only allow the release of the Reb1-binding loci from the silenced nuclear zone, but it could also serve to activate the pro-transcriptional properties of Reb1. As the cells are kept under nitrogen starvation, Reb1 is further processed, switching off the transcription of the early Reb1-dependent nitrogen response genes. In the present work we have shown that Reb1 is a multifunctional protein acting in the regulation of several cellular processes in fission yeast, such as replication, transcription and stress response.

Fuente TESIUNAM

Tesis (Doctor en Biotecnología) Las células eucariontes tienen la capacidad de responder a la acumulación de proteínas mal plegadas en el retículo endoplásmico a través de un mecanismo conocido como respuesta a proteínas mal plegadas (UPR). Dos de los tres sensores del UPR; IREl y PERK participan activamente en las decisiones de sobrevida y muerte celular, por lo que constituyen potenciales candidatos para blancos terapéuticos. Ambos sensores son proteínas quinasa y sus regiones luminales son altamente similares e intercambiables, lo que sugiere un mecanismo de activación común. IRE 1 además contiene un dominio endoribonucleasa yuxtapuesto al dominio quinasa. El uso del inhibidor de quinasa APY29, reveló que la ocupación de sitio ATP del dominio quinasa de IREl provoca un cambio conformacional que induce su transactivación y oligomerización, permitiendo así la activación de los dominios endon·ibonucleasa adyacentes. Recientemente se encontró que inhibidores de quinasa pueden actuar como agonistas de la actividad quinasa, al promover la transactivación y oligomerización. Dada la similitud en los mecanismos de activación entre IREl y PERK en esta tesis proponemos estudiar el efecto de análogos de APY29 sobre la actividad quinasa de PERK. Nuestros resultados indican que el análogo AM9 es más potente y selectivo que APY29 en la inducción de la actividad endoribonucleasa de IREl, tanto in vitro como en líneas celulares, y funciona promoviendo su transactivación y oligomerización. Este análogo además es capaz de unirse e inhibir la actividad quinasa de PERK in vitro. Sin embargo y de manera interesante, análisis en líneas celulares muestran que AM9 puede actuar, dependiendo de la concentración, como agonista y como un inhibidor de la actividad quinasa de PERK, mostrando una curva de activación tipo campana. Esto sugiere que PERK se activa por un mecanismo dependiente de transactivación y oligomerización. Nuestros resultados muestran que un mismo inhibidor de quinasa puede modular a dos de los tres sensores del UPR. Por otra parte, estos resultados demuestran que PERK es activable por inhibidores de quinasa, lo cual es importante de considerar durante el uso y diseño de drogas que apunten a este sensor del UPR. Eukaryotic cells have the capacity to respond to the accumulation of unfolded proteins in the endoplasmic reticulum via a mechanism known as the unfolded protein response (UPR). Two of the three sensors of the UPR, IRE 1 and PERK, are actively involved in decisions of survival and cell death, which makes them important candidates as therapeutic targets. Both sensors are kinases, IRE 1 also have an endoribonuclease domain, with highly similar and interchangeable luminal segment, suggesting a common activation mechanism. Using the small molecule kinase inhibitor APY29, it was revealed that the occupancy of the IREl kinase catalytic domain causes a conformational change that induces transactivation and oligomerization of the protein thereby activating its appended endoribonuclease domains. Moreover, it has been reported that in sorne cases kinase inhibitors may act as agonists of the kinase activity by promoting transactivation and oligomerization. Since IRE 1 and PERK are very similar in activation in this thesis we propose to study the effect of APY29 analogs on kinase activity of PERK. Our results indicate that in both, in vitro and in cell lines, the analog AM9 is a more potent and selective activator of IREl endoribonuclease activity than APY29, promoting its transactivation and oligomerization. Furthermore, AM9 is capable of binds and inhibits kinase activity of PERK in vitro. Nevertheless, analysis in cell lines shows that AM9 acts as both, agonist and antagonist of the PERK kinase activity, depending in the concentration, displaying a bell-shaped activation curve. This suggests that like IRE 1, PERK is activated by a mechanism involving transactivation and oligomerization. In summary, we show that the same kinase inhibitor can modulate two of the three UPR sensors. These results also suggest that PERK can be activated by a kinase inhibitor, this will be important to consider in the design of drugs that target PERK.

Tesis (Doctor en Biotecnología) Burzio y colaboradores han descrito una familia de ARNs mitocondriales no codificantes (ARNmtnc) denominados ARNmtnc Sentido (ARNmtnc-S) y ARNmtnc Antisentido (ARNmtnc-AS) que se encuentran diferencialmente expresados en células normales y tumorales. Células normales en proliferación expresan altos niveles tanto del ARNmtnc-S como del ARNmtnc-AS. En contraste, células que no están en división expresan bajos niveles de ambos transcritos. Interesantemente, células tumorales expresan el ARNmtnc-S y disminuyen la expresión del ARNmtnc-S. Estas características son observadas tanto en células en cultivo como en biopsias de tejidos. Previamente, Burzio y colaboradores demostraron que la transfección transiente con oligonucleótidos complementarios a estos ARNmtnc induce muerte en diferentes tipos de células cancerígenas in vitro, pero no en células normales, dando la posibilidad de usar la interferencia de estos ARNs mitocondriales como un potencial tratamiento contra el cáncer. El objetivo de este estudio fue determinar si la administración in vivo de lentivirus que codifican shRNA (del inglés short hairpain RNA) dirigidos contra los ARNmtnc podría inhibir el crecimiento tumoral y la metástasis en modelos animales de melanoma de ratón. Para esto se construyeron vectores lentivirales no-replicativos que codifican un shRNA contra los ARNmtnc (Lv-ARNmtnc) y luciferasa (Lv-Control) y su efecto fue evaluado in vitro por transducción de células de melanoma de ratón B16F10. Mediciones por PCR en tiempo real indican una disminución de aproximadamente 6 veces en la expresión del ARNmtnc-S y del ARNmtnc-AS en células transducidas con Lv-ARNmtnc en comparación a células transducidas con Lv-Control. Además, la transducción de Lv-ARNmtnc induce muerte celular apoptótica determinada por exposición en la superficie celular de fosfatidilserina y fragmentación del ADN. La capacidad de estos lentivirus para inhibir el crecimiento de tumores sólidos y metástasis de células de melanoma B16F10 fue evaluada in vivo. Ratones C57BLl6 a los cuales se les indujeron tumores subcutáneos con células B16F10 fueron tratados cada dos días con cinco inyecciones intratumorales de 4 x lo7 Lv-ARNmtnc o LV-Control en un volumen de 100 VI. Los ratones tratados con Lv-ARNmtnc mostraron una significativa disminución en el volumen tumoral comparado a ratones tratados con LV-Control observado hasta el día 20 post inoculación de las células. Para el ensayo de metástasis, ratones C57BLl6 fueron inyectados por vía intravenosa con células B16F10 y cuatro días después se les administraron cada tres días 4 inyecciones intravenosas de 5 x 10' Lv-ARNmtnc o Lv-Control en un volumen de 200 pl. Los ratones fueron sacrificados dos semanas después de la inyección de las células para el análisis de metástasis pulmonar. Los ratones tratados con Lv-ARNmtnc mostraron una significativa reducción en el número de focos metastásicos comparados a los ratones tratados con Lv-Control y también una reducción en el peso pulmonar. Tinción de secciones de tejido con hematoxilina-eosina indica que los pulmones de los ratones tratados con Lv-ARNmtnc presentan solo unos pocos nódulos. En contraste, los nódulos metastásicos ocupaban la mayoría del tejido pulmonar cuando los ratones fueron tratados con Lv-Control. Estos resultados sugieren que la administración intratumoral y sistémica de shRNA dirigidos a los ARNmtnc representan una promisoria estrategia hacia el desarrollo de una potencial terapia contra el cáncer.

Burzio y colaboradores han descrito una familia de ARNs mitocondriales nocodificantes (ARNmtnc) denominados ARNmtnc Sentido (ARNmtnc-S) yARNmtnc Antisentido (ARNmtnc-AS) que se encuentran diferencialmenteexpresados en células normales y tumorales. Células Doctor en Biotecnología TERMINADA PFCHA-Becas 101p. PFCHA-Becas

Tesis (Doctor en Biotecnología) ICE1 es un factor de transcripción que es activado en respuesta a condiciones de frío en plantas. Es considerado como el componente clave dentro de la cascada de señalización de frío, activando la respuesta mediada por los factores de transcripción de unión a e-repetidos (CBFs) y gatillando la expresión de los genes localizados río debajo de esta cascada. En esta tesis aislamos un cDNA que codifica para la proteína ICE1 de Eucalyptus g/obu/us (Eg/CE1) a partir de una librería de cDNA construida bajo condiciones de frío. La secuencia de cDNA posee un marco de lectura abierto de 1683 pb y codifica para una proteína de 560 aminoácidos, con un peso molecular estimado de 60,48 kDa y un pi calculado de 5,65. La comparación de la secuencia de cDNA con la obtenida a partir de DNA genómico demostró que Eg/CE1 no posee intrones, confirmándose la presencia de todos los dominios característicos de las proteínas ICE1 descritas actualmente. Adicionalmente, encontramos un dominio de activación extra, que probablemente aumenta la actividad del factor de transcripción EglCE1. Este dominio también está presente en proteínas ICE1 de otras especies de Eucalyptus. Ensayos de expresión transientes demostraron que EglCE1 es un factor de transcripción que se une a los promotores de genes CBF, de la misma forma que AtlCE1. EglCE1 es un regulador transcripcional, activando y reprimiendo los promotores de los genes CBFs en respuesta a bajas temperaturas. Los niveles de transcritos de Eg/CE1 aumentaron en respuesta a condiciones de frío y sequía. El análisis de expresión de los genes río abajo demostró que la abundancia relativa de los mRNA de EgCBF1 aumentó sólo en respuesta a bajas temperaturas y no fue detectado en condiciones de sequía. Por otro lado, la abundancia relativa del gen EgRD29B disminuyó en respuesta a bajas temperaturas y aumentó en respuesta a sequía. Por otro lado, los niveles de proteína EgICE1 no variaron en las mismas condiciones. Sin embargo, se demostró que EglCE1 se encuentra fosforilado tanto en frío, sequía y condiciones control. Proponemos que existen eventos de desfosforilación implicados en la regulación post-traduccional en respuesta a condiciones de estrés, pero estro debe ser determinado experimentalmente

Tesis (Doctor en Biotecnología) RESUMEN: El cultivo de las vides es uno de los de mayor importancia económica para Chile, sin embargo, se ve afectado por numerosos factores, tanto bióticos como abióticos. Los virus se consideran entre los patógenos de mayor importancia para este cultivo y hasta el momento se han descrito más de 60 especies de virus que afectan vides. La mayoría de ellos se transmiten a través de vectores, como nemátodos o áfidos. Se piensa que las metodologías de propagación a través de estacas serían las responsables del incremento y amplia diseminación de estos virus en los últimos años. No existen antecedentes de resistencia natural en vides frente a la infección por virus y la búsqueda de nuevas variedades resistentes ha sido blanco de muchos esfuerzos en este campo de investigación. En este trabajo se describe el desarrollo de resistencia a virus de vides a través de la inducción de silenciamiento génico en plantas de tabaco. Consideramos de gran importancia trabajar con los virus más comunes en Chile, como son: Grapevine leafroll associated virus 2 y 3, Grapevine virus A, Grapevine fanleaf virus y Grapevine fleck virus, y utilizar secuencias de aislados chilenos para inducir el silenciamiento génico contra los virus. Se realizó un análisis de las secuencias disponibles, se utilizaron mayormente secuencias obtenidas en estudios previos en el laboratorio y se secuenciaron los virus de los que no se disponían secuencias de aislados locales. En este trabajo se presenta el caso de Grapevine fleck virus, para el cual se obtuvo la secuencia del 70% del genoma de un aislado chileno y los fragmentos codificantes para los dominios proteicos conservados de la replicasa viral para otros 3 aislados, con los que se analizó la variabilidad de este virus en Chile. En este trabajo, analizamos la capacidad de diferentes secuencias virales para gatillar el silenciamiento génico en plantas, y probamos la habilidad de algunas de ellas para inducir resistencia frente a la infección con el virus. Se eligieron fragmentos de las secuencias codificantes para proteínas esenciales para el virus, como proteínas de replicación, movimiento, cubierta y proteínas de shock térmico, de los diferentes virus. En este proceso de elección de las secuencias a utilizar para la inducción del silenciamiento génico, nos llamó particularmente la atención tres proteínas de Grapevine leafroll associated virus-3, las que no tienen función putativa asociada y basados principalmente en la similitud de la organización genómica de GLRaV-3 con virus de otra familia, planteamos la hipótesis de que pudieran actuar como supresores del silenciamiento génico. Se desarrolló análisis bioinformáticos para intentar proponer una función putativa para estas tres proteínas de GLRaV-3, los que arrojaron resultados significativos sólo para la proteína p19.6 de GLRaV-3, en la cual se identificó un putativo dominio de unión de RNA doble hebra del tipo arreglos de α-hélices, lo que sin embargo no nos permitió asociarle una putativa función por ser un dominio presente en... ABSTRACT: The grapevines are one of the most economically important crops in Chile; however, they are affected by many factors, both biotic and abiotic. Viruses are among the most important pathogens of this crop and thus far more than 60 species of viruses that affect grapevines have been described. Most of them are transmitted in the field by vectors such as nematodes or aphids, but it is thought that the propagation by cuttings would be responsible for the increase and widespread dissemination of these viruses in the last years. There are no records of natural resistance in grapevine against virus infection and the search for new resistant varieties has been the target of many efforts in this field of research. This thesis describes the development of grapevine virus resistance through induction of gene silencing in tobacco plants. We considered of great importance to work with the major viruses present in Chile, including: Grapevine leafroll associated virus 2 and 3, Grapevine virus A, Grapevine fanleaf virus and Grapevine fleck virus; and use of sequences of Chilean isolates to induce gene silencing against them. We did an analysis of the available sequences, most of the ones we used were obtained in previous studies in the laboratory and we sequenced the viruses that lack in local sequences. In this work we present the case of Grapevine fleck virus, for which we obtained the sequence of 70% of the genome of a Chilean isolate and the fragments coding for conserved protein domains of the viral replicase for other three isolates. In this work, we analyzed the ability of different viral sequences to trigger gene silencing in plants, and tested the ability of some of them to induce resistance against infection with the corresponding virus. We selected fragments of the coding sequences for proteins essential for the virus, such as replication, movement, coat proteins and heat shock proteins of the different viruses. In the comparison of the available sequences for the different viruses, and the choosing of the sequences to be used to induce gene silencing, we realized that the genomic organization of Grapevine leafroll associated virus-3, was quite conserved in the family Closteroviridae; most of the viruses of this family encodes for silencing suppressor proteins, and GLRaV-3 has three proteins with no putative function. We performed bioinformatic analyses trying to propose a putative function for these three proteins of GLRaV-3, which yielded significant results only for the p19.6 protein of GLRaV-3. A putative double stranded RNA binding domain was identified, which however did not allow us to associate a putative function because it is a very promiscuous domain that can be found in proteins of various functions. We analyzed the possible activity as a suppressor of gene silencing for the three proteins under study. The results indicate that none of them act as suppressors of gene silencing in our assays, but revealed that they may be able to interact with each other...

Tesis (Doctor en Biotecnología) Streptococcus phocae es un patógeno emergente en la industria de la salmonicultura chilena. Este patógeno es el principal responsable del síndrome por cocáceas Gram positivas que afecta al salmón del Atlántico, causando importantes pérdidas económicas a las empresas. El control de esta enfermedad se basa actualmente en el uso de antibióticos, lo cual tiene un fuerte impacto ecológico, además de la problemática de comercializar salmones con trazas de antibióticos. Por lo tanto, en este trabajo se desarrolló como un método preventivo una vacuna experimental para salmones basada en una mezcla de antígenos recombinantes contra S. phocae. A partir de un salmón infectado se obtuvo un aislado bacteriano (Spl), identificado como S. phocae a través de la secuencia del gen de RNA ribosomal de 16s. En esta tesis se demostró que el patógeno es capaz de infectar salmones pre-smolt y smolt en agua temperada dulce o salobre a una temperatura óptima de 16OC. Además se obtuvo un segundo aislado (2868) a partir de un pez infectado con el aislado Spl, el cual fue más virulento, provocando tres veces más mortalidad en los peces que Spl en las mismas condiciones. Proteínas de S. phocae, cuyos ortólogos se localizan en la pared de especies de Streptococcus relacionados filogenéticamente con S. phocae, y confieren una determinada protección contra el correspondiente patógeno, fueron seleccionadas como potenciales candidatos para la vacuna experimental. Basándose en los dominios conservados de éstas, fueron diseñados partidores degenerados para amplificar las regiones codificantes de las chaperonas Hsp6O y Hsp70, Soda, los receptores de transportadores ABC de metales FebP y PsaA y las proteínas de superficie Sip y PrtS de S. phocae mediante PCR. Las regiones codificantes fueron clonadas en el vector de expresión bacteriano pET2la, lográndose una abundante expresión de las proteínas recombinantes en E. coli. El potencial antigénico de las proteínas fue evaluado in silico. Como resultado, Hsp70, PsaA, Sip y PrtS presentaron los más altos índices de antigenicidad. Esto fue confirmado experimentalmente. Salmones inmunizados con una mezcla de estas mismas proteínas mostraron una respuesta inmune humoral potenciada. Por lo tanto, la vacuna fue formulada con una mezcla de estas cuatro proteínas, extracto de E. coli y adyuvante de Freund incompleto. Alevines de salmón del Atlántico fueron vacunados con la preparación y desafiados en las condiciones óptimas de infección del patógeno, el desafío mostró una efectiva protección en salmón del Atlántico contra S. phocae, con un porcentaje relativo de sobrevivencia (RPS) de un 81%. Además, se demostró que el extracto de E. coli y el adyuvante de Freund incompleto presentes en la formulación multicomponente tienen un importante rol en la protección.

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 01-12-2006