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A resistência aos antibióticos por estirpes de bactérias multirresistentes tem aumentado drasticamente. A família Enterobacteriaceae é a responsável pela maior parte das infeções tanto a nível hospitalar como na comunidade, onde os géneros Escherichia spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Enterobacter spp., Serratia spp., Salmonella spp. e Shigella spp. são os de maior relevância para o Homem. Os antibióticos β-lactâmicos representam a classe de eleição no tratamento de infeções causadas por estas bactérias, atuando na fase parietal da síntese do peptidoglicano levando à lise celular. A produção de β-lactamases (ESBLs, β-lactamases do tipo AmpC e carbapenemases) representa o mecanismo de resistência de maior prevalência no combate a infeções causadas por este tipo de microrganismos, uma vez que inativa a ação dos antibióticos β-lactâmicos por hidrólise do anel β-lactâmico. Os inibidores das β-lactamases têm sido utilizados como alternativa à resistência bacteriana por produção de β-lactamases, com o desenvolvimento de moléculas cada vez mais inovadoras. O uso incorreto e excessivo de antibióticos pela população é um fator que conduz igualmente ao surgimento de bactérias multirresistentes, devido à pressão seletiva exercida sobre as bactérias. Na realidade as estirpes que exibem este tipo de resistências acumulam genes de resistências aos outros grupos de antibióticos, sendo diminutas as opções terapêuticas. A morbilidade e a mortalidade associadas a infeções por bactérias multirresistentes, bem como o impacto negativo quer nos doentes, quer na sociedade e na economia, fazem com que o problema da multirresistência a antibióticos seja apontado como um enorme desafio para a Saúde Pública Mundial. Existe portanto, uma necessidade eminente de se adotarem medidas de controlo da prescrição, consumo e utilização de antibióticos pela população, sobretudo na área hospitalar. Torna-se urgente fazer o despite dos doentes portadores de estirpes produtoras destas resistências no ato do internamento hospitalar e o seu isolamento, a fim de dificultar a disseminação dessas resistências. Para atingir este desiderato os laboratórios hospitalares devem utilizar técnicas expeditas para a detecção das estirpes bacterianas MDR, utilizando técnicas convencionais e de biologia molecular. The antibiotic resistance by strains of multiresistant bacteria has increased dramatically. The Enterobacteriaceae family is responsible for most infections both in hospital and in the community where Escherichia spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Enterobacter spp., Serratia spp., Salmonella spp. and Shigella spp. are the most relevant to humans. The β-lactam antibiotics are the most chosen in the treatment of infections caused by these bacteria, acting in the parietal layer of peptidoglycan synthesis leading to cell lysis. The production of β-lactamases (ESBLs, β-lactamase AmpC type and carbapenemases) is the most prevalent resistance mechanism to combat infections caused by such microorganisms since that inactivates the action of β-lactams by hydrolysis of the β-lactam ring. Inhibitors of β-lactamases have been used as alternative to bacterial resistance to β-lactamases production with the development of increasingly innovative molecules. Incorrect and overuse of antibiotics by the population is a factor that also leads to the emergence of multi-resistant bacteria, due to selective pressure on bacteria. The strains that exhibit such resistance genes accumulate resistance to other groups of antibiotics, being the therapeutic options diminished. The morbidity and mortality associated with infections by multidrug-resistant bacteria as well as the negative impact either in patients or in the society and the economy, make the problem of multidrug resistance to antibiotics is a huge challenge for the World Public Health. There is an urgent need to adopt measures to control prescription, consumption and use of antibiotics by the population, especially in the hospital area. It is urgent to identify the holders producing these resistances in the hospital and isolate them in order to hinder the spread of these resistances. To achieve this goal hospital laboratories must use efficient techniques for detection of MDR bacterial strains, using standard techniques of molecular biology.

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas As estirpes de E. coli podem ser agrupadas em estirpes comensais, patogénios extraintestinais e patogénios intestinais. É um relevante patogénio intestinal que causa infeções entéricas com grandes taxas de morbilidade e mortalidade em todo o mundo. O desenvolvimento da infeção depende da dose infeciosa ingerida pelo indivíduo, da sua susceptibilidade à doença, da interação entre o patogénio e os enterócitos e virulência do patogénio. E. coli induz diarreia através de diversos mecanismos, entre os quais a produção de adesinas, produção de toxinas, indução de alterações celulares nas células do hospedeiro e invasão da mucosa intestinal. As estirpes diarreiogénicas foram agrupadas em seis principais categorias, baseadas nos seus factores de virulência e mecanismos através dos quais provocam doença: E. coli enteropatogénicas (EPEC), enterohemorrágicas (EHEC), E. coli enterotoxicogénicas (ETEC), E. coli enteroagregativas (EAEC), E. coli enteroinvasivas (EIEC) e E. coli de adesão difusa (DAEC). As EPEC são caracterizadas pela formação de lesões histopatológicas nos enterócitos com posterior secreção de proteínas que causam alterações celulares. As EHEC têm um mecanismo semelhante, além disso, produzem toxinas Shiga, responsáveis por casos severos como diarreia sanguinolenta, colite hemorrágica (HC), síndrome hemolítico-urémico (HUS) e púrpura trombocitopénica trombótica (TTP). Quanto a estirpes de ETEC, podem produzir e libertar duas toxinas diferentes: LT e ST, que causam o desequilíbrio da homeostase intestinal por aumento do AMPc e GMPc, respetivamente. EAEC formam um biofilme e libertam toxinas como EAST1 e Pet que estimulam a secreção de fluídos e eletrólitos. EIEC são capazes de invadir enterócitos e replicarem-se. Em relação às DAEC, a infeção é caracterizada pelo crescimento de projeções em forma de “dedo” da superfície dos enterócitos. Para reduzir as taxas de morbilidade e de mortalidade, ter acesso a informação sobre as infeções entéricas causadas por E. coli e aplicar a prevenção primária são essenciais. Escherichia coli (E. coli) strains can be grouped as commensal strains, extraintestinal pathogens and intestinal pathogens. It is a relevant intestinal pathogen which causes enteric infections with high morbidity and mortality rates around the world. The development of the infection depends on the infectious dose ingested by an individual, his susceptibility to the disease, enterocytes and pathogens interaction and pathogen’s virulence. E. coli induces diarrhea through several mechanisms, among them are production of adhesins, production of toxins, induction of cellular alterations in host cells and invasion of intestinal mucosa. Diarrheagenic strains were grouped into six main categories, based on their virulence factors and mechanisms by which they provoke disease: enteropathogenic E. coli (EPEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteroaggregative E. coli (EAEC), enteroinvasive E. coli (EIEC) and diffusely adherent E. coli (DAEC). EPEC are characterized by the formation of histopathological lesions in the enterocytes with posterior secretion of proteins that cause cellular alterations. EHEC have a similar mechanism, besides, they produce Shiga toxins, responsible for severe cases as bloody diarrhea, hemorrhagic colitis (HC), hemolytic uremic syndrome (HUS) and thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP). As for ETEC strains, they can produce and release two different toxins: LT and ST, which cause intestinal homeostatic disequilibrium by increasing AMPc and GMPc levels, respectively. EAEC form a biofilm and release toxins as EAST1 and Pet that stimulate fluid and electrolyte secretion. EIEC are capable of invading enterocytes and replicate. Regarding to DAEC strains, the infection is characterized by the growth of finger-like projections of the enterocytes’ surface that wrap around the bacteria. To reduce morbidity and mortality rates, having access to information about enteric infections caused by E. coli and applying primary prevention are essential.

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas Os beta-lactâmicos, que atuam inibindo a última etapa da biosíntese da parede celular bacteriana, constituem a família mais numerosa de antibióticos e a mais utilizada na antibioterapia. Todos os compostos, naturais ou sintéticos, deste grupo (penicilinas, cefalosporinas, carbapenemos e monobactamos) são caracterizados por possuírem um anel beta-lactâmico com uma cadeia lateral variada, que explica as características, espetros de ação e resistências às beta-lactamases de cada antibiótico. Trata-se de compostos de ação bactericida lenta que interferem na síntese do peptidoglicano. São dependentes da concentração plasmática, apresentam escassa toxicidade devido ao elevado tropismo para as células bacterianas, possuindo uma ampla margem terapêutica. O seu espetro de ação tem ampliado ao longo dos anos devido à incorporação de novas moléculas com maior atividade principalmente frente a bactérias Gram-positivo, mas o aparecimento progressivo de resistências tem limitado o seu uso e a sua eficácia em determinadas situações. É urgente desenvolver novas moléculas e técnicas para ultrapassar estas vantagens das bactérias, de forma a não perder a eficácia desta família de antibióticos de extrema importância para a Saúde Pública. The beta-lactam antibiotics, which act by inhibiting the last step of the biosynthesis of the bacterial cell wall, constitute the largest family of antibiotics and the most used in antibiotic therapy. All the compounds, natural or synthetic, from this group (penicillins, cephalosporins, monobactams and carbapenems) are characterized by having a beta-lactam ring with a wide side chain, which explains the characteristics, spectrum of action and resistance to beta-lactamases of each antibiotic. They are compound of slow bactericidal action that interferes with the synthesis of peptidoglycan. They are dependent on the plasma concentration, exhibit little toxicity due to the high tropism for bacterial cells having a wide therapeutic margin. Its spectrum of action has expanded over the years due to the incorporation of new molecules with increased activity, mainly against Gram-positive bacteria, but the gradual emergence of resistance has limited its use and its effectiveness in certain situations. It is urgent to develop new molecules and techniques to overcome these advantages of bacteria, so as not to lose the effectiveness of this family of antibiotics which is extremely important to public health.

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas A introdução de agentes antimicrobianos na terapêutica representou um grande progresso para a Saúde Pública, possibilitando uma evidente redução das taxas de morbilidade e mortalidade associadas a doenças infeciosas. No entanto, a emergência e disseminação de resistência bacteriana face à ação dos antibióticos tem, nos últimos anos, vindo a constituir um fenómeno preocupante, representando um desafio constante à escala mundial. Diversos são os fatores que contribuem para a manifestação e disseminação de resistência, estando entre eles o uso irracional de antibióticos, a eliminação descontrolada de resíduos para o ambiente e a transmissão de genes de resistência intra e inter-espécie. O ambiente hospitalar representa o nicho ecológico mais importante, promotor do crescimento de elevados níveis de resistência, devido à pressão seletiva exercida pelo uso constante de antibióticos durante o tratamento de doenças infeciosas. Ainda que com menos frequência, mas com igual importância, a agricultura, a produção intensiva, a aquacultura, a veterinária e as zonas urbanas constituem exemplo de ambientes onde a utilização descontrolada de antibióticos parece favorecer a seleção de estirpes resistentes. Permanece, contudo, pouco esclarecida a origem de alguns dos mecanismos de resistência adquiridos, com maior relevância clínica, bem como a sua associação a bactérias de nichos ecológicos extra-hospitalares. Recentemente, tem sido dada atenção ao papel de outros ambientes não-clínicos, como áreas remotas do Globo, afastadas da elevada pressão antropogénica, como fonte e/ou reservatório de bactérias resistentes. O aparecimento de características de multirresistência a antibióticos, na ausência de exposição a estas moléculas, em isolados de animais selvagens provenientes de áreas remotas, levanta importantes questões sobre o papel deste nicho ecológico como reservatório e fonte de bactérias resistentes fora do ambiente hospitalar conduzindo à necessidade de esclarecimento da dinâmica deste preocupante fenómeno, bem como das implicações para as estratégias de controlo da resistência. The introduction of antimicrobial agents in the therapy represented a major step forward for public health, enabling a clear reduction in morbidity and mortality rates associated with infectious diseases. However, the emergence and spread of bacterial resistance to antibiotics has been, in recent years, a serious concern representing a constant worldwide challenge. There are several factors that contribute to the manifestation and dissemination of resistance, among them being the irrational use of antibiotics, uncontrolled waste disposal on the environment and the transmission of resistance genes intra and inter-species. The hospital environment is the most important ecological niche, promoting growth of high levels of resistance, due to selective pressure by the constant use of antibiotics for the treatment of infectious diseases. Although less frequently, but with equal importance, agriculture, intensive farming, aquaculture, veterinary and urban areas constitute environments where uncontrolled use of antibiotics seems to favor the selection of resistant strains. Remains, however, poorly understood the origin of some of the mechanisms of acquired resistance, with clinical relevance, as well as their association with bacteria outside hospitals ecological niches. Recently, attention has been given to the role of other non-clinical settings, such as remote areas of the globe, away from high anthropogenic pressure, as source and /or reservoir of resistant bacteria. The emergence of multidrug resistance characteristics of the antibiotics in the absence of exposure to these molecules in isolated wildlife from remote areas, raises important questions about the role of this ecological niche as a reservoir and source of resistant bacteria outside the hospital leading to the need of clarification about the dynamics of this worrying phenomenon and the implications for control strategies of resistance.

Tese de doutoramento Ciências da Saúde, Neudesin, also known as neuron derived neurotrophic factor (NENF), is a non-canonical neurotrophic factor. Since it presents a heme/steroid binding domain in its structure, NENF is also a member of the membrane associated progesterone receptor (MAPR) family. In vitro studies have shown that recombinant NENF per se is able to induce proliferation and differentiation of embryonic cortical neurons and respective precursor cells. Of note, the addition of hemin to the media significantly increased the neurotrophic capacity of NENF in vitro, showing that heme successfully binds to NENF primary structure and indicating that heme is a prosthetic group needed for NENF activity, at least in vitro. Nevertheless, still much is unknown on the mechanism of action of NENF. Furthermore in vivo studies on NENF function are yet scarce. In this thesis, we have evaluated the importance of NENF for central nervous system (CNS) postnatal development and in adulthood, specifically at the behavioral, neurochemical and structural levels. Furthermore we characterized the adult neurogenic niches in the absence of NENF. For that, we have taken advantage of a unique mouse model with a target deletion of the entire neudesin gene, from now on designated as neudesin-null mice. We observed that in the absence of NENF, adult males have an anxious-like behavior, as it was assessed in the elevated plus maze (EPM), light/dark box (LDB) and novelty suppressed feeding (NSF) tests; surprisingly we have not seen the same anxious phenotype in the acoustic startle (AS) test. These results reveal a role for NENF in the regulation of state anxiety but not in generalized anxiety, at least in males. On the other hand, neudesin-null males do not show any motor, exploratory, depressive or cognitive alterations. This anxious phenotype was accompanied by impoverished dendritic arborization of ventral hippocampal granular cells as well as impaired dopaminergic activity, and shorter dendrites at the anterior medial division of the bed nucleus of the stria terminals (amBNST). These observations reveal a critical role for NENF in the maintenance of the anxiety circuitry, especially at the ventral hippocampus. Since neurodevelopment is highly regulated by neurotrophic factors, and might impact on adult behavior we have studied the postnatal acquisition of developmental milestones of neudesin-null animals during the first 21 days of postnatal life. We observed sex-differences regarding specific neurological reflexes dependent on the vestibular area maturation, with a mild delay on neurodevelopment observed only in neudesin-null males. This was followed by a neurochemical imbalance, evaluated in postnatal day 21, in body righting and position regulating brain regions. Specifically we observed that the brain stem of neudesin-null males showed increased serotonin and norepinephrine, a decreased serotonergic and dopaminergic activity in the cerebellum, diminished norepinephrine in the motor cortex and the vestibular area revealed less dopaminergic activity. Lastly we have characterized the proliferative capacity of neudesin-null mice neurogenic niches, in vivo and in vitro. We observed a sex difference in proliferation occurring in the sub granular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. Neudesin-null male mice showed less labeling of BrdU cells than littermate controls, which was not observed in females. Assessing neurogenesis ratio by doublecortin (DCX) and BrdU positive cells, we have observed that neudesin-null males showed less neurogenesis only in the ventral division of the hippocampus. Furthermore, in vitro we observed that neurospheres formed by neural stem cells derived from the hippocampus of neudesin-null mice had an inferior clonal expansion capacity. All these evidences prompt us to propose that NENF might also have neurotrophic capacity in vivo, specifically at the ventral division of the hippocampus, but interestingly its importance is primordial in males. With this work we contributed to further unravel the biological role of NENF in the CNS., A neudesina, também designada por factor neurotrófico derivado de neurónios (NENF), é uma proteína com atividade neurotrófica. Esta tem na sua estrutura primária um domínio de ligação a grupos heme e esteroides que a classifica como um membro da família de proteínas dos receptores de progesterona associados à membrana (MAPR). Estudos in vitro demonstraram que a NENF per se é capaz de induzir proliferação e diferenciação de neurónios derivados do córtex embrionário e também das respetivas células precursoras desses neurónios. De salientar que a adição de hemina ao meio de cultura aumentou significativamente a capacidade neurotrófica da NENF, demonstrando que in vitro, a hemina se liga ao domínio da NENF e que atua como um grupo protético necessário para a atividade da NENF. No entanto, ainda muito pouco se sabe sobre o mecanismo de ação da NENF in vivo. Neste estudo, avaliamos a importância da NENF no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC) adulto e pós-natal, especificamente ao nível do comportamento, neuroquímica e estrutura. Adicionalmente caracterizamos os nichos neurogénicos adultos na ausência de NENF. Para tal, utilizamos um modelo animal de murganho sem o gene da neudesina, que daqui em diante designaremos de NENF-/-. Observamos que na ausência de NENF, os machos adultos têm um comportamento ansioso, observado em 3 diferentes testes que aferem os níveis de ansiedade contextualizada mas não num outro teste que afere a ansiedade generalizada. Isto sugere um papel para a NENF como modelador do comportamento ansioso contextualizado, o que envolve circuitos cerebrais específicos. Por outro lado, animais sem NENF não mostraram qualquer problema motor/exploratório, depressivo ou cognitivo. O fenótipo ansioso foi acompanhado por uma atrofia da arborização dos neurónios granulares do girus denteado do hipocampo ventral e também por uma desregulação da atividade dopaminérgica nesta região e assim como por dendrites mais curtas dos neurónios da divisão anterior medial do núcleo da estria terminal. Estas alterações revelam um papel crítico para a NENF na manutenção do circuito da ansiedade, especialmente no hipocampo ventral. Como o neurodesenvolvimento é regulado por fatores neurotróficos, estudamos a aquisição de marcos específicos do desenvolvimento pós-natal dos murganhos NENF-/- durante os primeiros 21 dias de vida. Observamos uma diferença dependente do género em alguns reflexos neurológicos dependentes da maturação da área vestibular. Apenas os machos apresentam um atraso na aquisição destes reflexos. Este atraso foi acompanhado por uma desregulação neuroquímica avaliada no dia pós-natal 21, em áreas do cérebro envolvidas em mecanismos de equilíbrio e posição do corpo. Especificamente, observamos um aumento de serotonina e norepinefrina no tronco cerebral de animais NENF-/-, assim como um aumento da atividade serotonérgica e dopaminérgica no cerebelo, diminuição de norepinefrina no córtex motor e uma diminuição da atividade dopaminérgica na área vestibular. Por fim, caracterizamos a capacidade proliferativa dos nichos neurogénicos de animais NENF-/-, in vivo e in vitro. Observamos uma diferença dependente do género na proliferação na zona sub granular do girus denteado do hipocampo. Os machos NENF-/- apresentam menos células BrdU positivas do que os controlos, o que não se observa nas fêmeas. Na avaliação da neurogénese pela contagem de neuroblastos em proliferação, observamos que os machos NENF-/- apresentam menos neurogenese a ocorrer apenas na divisão ventral do hipocampo. Adicionalmente, in vitro observamos que neuroesferas formadas a partir de células estaminais do hipocampo de animais NENF-/- apresentam uma capacidade clonal inferior. Este conjunto de evidências, leva-nos a propor que a NENF possui também capacidade neurotrofica in vivo, especificamente na divisão ventral do hipocampo apenas em machos. Com este trabalho contribuímos para clarificar um pouco mais o papel da neudesina no sistema nervoso central.

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas S. aureus é responsável por infeções graves adquiridas na comunidade e no hospital no Homem, devido à sua virulência. O tratamento destas infeções com penicilinas foi eficaz até surgir resistência a através da hiperprodução de β-lactamases, o que levou ao uso de oxazolilpenicilinas. Contudo, estirpes tornam-se resistentes a esta nova classe (MRSA), pela aquisição do gene mecA, que codifica a formação de um quinto PBP (PBP2a), com afinidade reduzida para os referidos antibióticos β-lactâmicos. A perda de eficácia destes antibióticos conduziu à utilização terapêutica da vancomicina. O número crescente de quadros infeciosos provocados por MRSA e o surgimento de estirpes VRSA suscitou o recurso a novos antibióticos com mecanismos de acção distintos e eficácia clínica e microbiológica comprovadas: linezolide, tigeciclina, daptomicina, novos glicopéptidos, cefalosporinas de 5ª geração e iclaprim. S. aureus is responsible for severe infections acquired in the community and in hospital in humans due to its virulence. Treatment of these infections with penicillin was effective resistance to arise through overproduction of β-lactamases, which led to the use of oxazolilpenicilinas. However, strains become resistant to this new class (MRSA), the acquisition of the mecA gene, which encodes the formation of a fifth PBP (PBP2a) with reduced affinity for said β-lactam antibiotics. The loss of efficacy of these antibiotics has led to therapeutic use of vancomycin. The growing number of infections caused by MRSA and the emerging VRSA strains raised the use of new antibiotics with distinct mechanisms of action and proven clinical and microbiological efficacy: linezolid, tigecycline, daptomycin, new glycopeptides, 5th generation cephalosporins and iclaprim.

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas Os antibióticos antibacterianos têm um tropismo para as células procariotas, exercendo a sua ação bactericida ou bacteriostática sobre estas. No entanto, apesar da sua especificidade, os antibióticos podem ter efeitos tóxicos nas células humanas, dando origem às reações adversas. A colite pseudomembranosa foi descrita pela primeira vez em 1893 por Finney, sendo uma doença infeciosa que surge geralmente na sequência de antibioterapia prévia, tendo como principal agente etiológico o Clostridium difficile. Esta trata-se de uma entidade com taxa de mortalidade elevada, rondando os 20 a 30% e onde as recorrências são comuns. A infeção por C.difficile é das mais incidentes adquiridas em indivíduos hospitalizados. Os antibióticos provocam a alteração da flora intestinal normal permitindo a colonização pelo C.difficile, que em condições apropriadas leva à ocorrência de sintomatologia. Os antibióticos mais implicados são os de largo espetro, tendo-se como exemplo as penicilinas associadas a beta lactamases e a clindamicina, possuindo estes um largo impacto na microbiota intestinal. Existem vários métodos de diagnóstico laboratorial para testar amostras fecais à procura dos bacilos e/ou suas toxinas para confirmação deste tipo de infeção, bem como métodos de visualização direta e estudos de imagem abdominal (diagnóstico clínico). No que respeita ao tratamento, a vancomicina e o metronidazol são os fármacos mais utilizados na infeção por C.difficile, havendo variações conforme a gravidade da doença. Embora a maioria das infeções respondam à terapêutica disponível, a infeção pode aumentar a morbilidade, prolongar a hospitalização, e mesmo colocar a vida do doente em risco, pelo que o uso racional dos antibacterianos é de extrema importância, bem como as restantes medidas de prevenção. Antibacterial antibiotics have a tropism for prokaryotic cells, exerting its bactericidal or bacteriostatic on these. However, despite of their specificity, antibiotics can have toxic effects on human cells, giving rise to adverse reactions. Pseudomembranous colitis was described in 1893 by Finney, being an infectious disease that usually appears as a result of antibiotic treatment, the main etiological agent Clostridium difficile. This is an illness with a high mortality rate, around 20-30% and where recurrences are common. Infection with C. difficile is the most incident acquired in hospitalized individuals. Antibiotics cause alteration of the normal intestinal flora allowing colonization by C. difficile, which under appropriate conditions leads to the occurrence of symptoms. The antibiotics most commonly involved are broad spectrum, for example penicillins associated with beta lactamases and clindamycin, possessing such a large impact on the intestinal microbiota. There are several methods of laboratory diagnosis to test fecal samples in search of bacilli and / or their toxins to confirm this type of infection, as well as methods of direct visualization and abdominal imaging studies (clinical diagnosis). With regard to treatment, vancomycin and metronidazole are the most commonly drugs used for the C. difficile infection, with variations depending on the severity of the disease. Although the majority of infections respond to therapy available, the infection can increase morbidity, prolonged hospitalization, and even life-threatening patient, whereby the rational use of antibacterial agents is extremely important as well as preventive measures remaining.

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas A meningite corresponde a uma inflamação das meninges causada, principalmente, por microrganismos patogénicos, tais como bactérias, vírus, fungos e parasitas. O risco de contrair a doença é elevado nos primeiros anos de vida, baixo na idade escolar, voltando a aumentar na adolescência e início da idade adulta. Este risco também aumenta em indivíduos imunodeprimidos. No passado, esta doença causava a morte da maioria dos pacientes ou deixava sequelas neurológicas nos pacientes que sobreviviam. Com o conhecimento mais profundo desta patologia, a evolução das técnicas de diagnóstico e o desenvolvimento dos antibióticos e vacinas, a taxa de mortalidade e as sequelas diminuíram, permitindo aos pacientes uma melhor qualidade de vida. Meningitis corresponds to an inflammation of the meninges, mainly caused by pathogenic microorganisms, such as bacteria, viruses, fungi and parasites. The risk of contracting the disease is high in the early years of life, low at school age, increasing again in adolescence and early adulthood. This risk also increases in immunocompromised individuals. In the past, this disease caused death of most patients or left neurological sequelae in patients who survived. With the deeper understanding of this pathology, the development of diagnostic techniques and the development of antibiotics and vaccines, the rate of mortality and sequelae decreased, allowing patients to a better quality of life.

Apesar dos progressos alcançados em todo o Mundo, a tuberculose continua a ser um problema de saúde pública muito sensível. Com 22 casos/100 mil habitantes registados em 2010, Portugal ainda não conseguiu atingir a categoria de país de baixa incidência. Com o aparecimento de cada vez mais casos de tuberculose multirresistente, os fármacos de primeira e segunda linha têm-se relevado ineficazes. Os novos desafios para a travagem deste fenómeno passam pela utilização de métodos mais rápidos e sensíveis para um diagnóstico precoce e também pela pesquisa de novas moléculas e de novos locais alvo. Despite progress made around the world, TB remains a very sensitive public health problem. With 22 cases/100 thousand inhabitants recorded in 2010, Portugal still failed to reach the country category of low incidence. With the increasing numbers of multidrug-resistant tuberculosis cases, drugs of first and second line have shown to be ineffective. New challenges for stopping this phenomenon are the use of rapid and sensitive methods for early diagnosis and also for researching new molecules and new target sites. Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Tese de doutoramento em Ciências da Saúde, In the mammalian brain adult neurogenesis occurs in two restricted sites: the subependymal zone (SEZ) and the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus. The SEZ comprises neural stem and progenitor cells that lie adjacent to the ependyma layer of the lateral ventricles. SEZ born neuroblasts migrate anteriorly in the rostral migratory stream towards the olfactory bulbs where they differentiate and integrate into neuronal circuitries. Because cells in the SEZ niche sense alterations in brain homeostasis and are able to alter their proliferative, migratory and differentiation profiles in response to injury, it is of particular interest to completely understand this dynamics both in physiological and pathological conditions. In this context, the present thesis addresses three main aspects in regard to SEZ niche complexity and modulation. First, in regard to SEZ heterogeneity, we performed a topographic analysis of the rat SEZ niche along the anterior-posterior and dorsal-ventral axes. We found that the SEZ cell proliferation decreases along the anterior-posterior axis and varies considerably according to the position in the dorsal-ventral axis. Furthermore, these differences were associated with relevant gradients in the neuroblasts population and in the neural stem cell (NSC) population throughout the dorsalventral axis. Next, we performed the same analysis on the proliferative and progenitor population profile in the mouse adult neurogenic niche, and found relevant species-specific differences between rat and mouse models, two closely related species. The proliferation gradients and the neuroblasts distribution observed in rat were absent in mice. Finally, in regard to SEZ modulation/modulators in disease, we report the impact of a peripheral inflammatory stimulus, triggered by lipopolysaccharide (LPS), on the SEZ, choroid plexus (CP) and cerebrospinal fluid (CSF). The CP is the structure of the brain that produces and secretes most of the CSF that is in direct contact with the NSCs of the SEZ. In response to an acute peripheral inflammatory stimulus CP gene expression of modulators of the SEZ is altered and this is partially reflected on the CSF composition. The same inflammatory stimulus triggered a rapid and transient increase on SEZ cell proliferation. The peak of CP response to the inflammatory trigger was at 6h and 12h upon LPS administration and the induction of SEZ cell proliferation occurred specifically after 12h of LPS stimulus. In summary, the data presented here reveals relevant topographical specificities of the rat and mouse SEZ and highlights species-specific differences. Moreover, it gives further insights on the SEZ response to acute peripheral inflammatory stimulus and pinpoints relevant CP synthetized molecules that when secreted towards the CSF can modulate the SEZ dynamics., No cérebro adulto dos mamíferos existem dois locais onde ocorre neurogénese: a zona subependimal (SEZ) e a zona subgranular que constitui a circunvolução denteada do hipocampo. A SEZ compreende células estaminais neurais e células progenitoras que se encontram adjacentes à camada do epêndima dos ventrículos laterais. Os progenitores de neurónios (também designados por neuroblastos) provenientes da SEZ migram anteriormente na via rostral de migração para os bolbos olfativos onde se diferenciam e integram nos circuitos neuronais. Como as células da SEZ percecionam alterações na homeostasia do cérebro e são capazes de alterar os seus perfis de proliferação, migração e diferenciação, em resposta a uma lesão, tornase particularmente interessante entender completamente esta dinâmica, tanto em condições fisiológicas como patológicas. Neste contexto, esta tese aborda três aspetos principais em relação à complexidade e modulação da SEZ. Em primeiro lugar, no que diz respeito à heterogeneidade da SEZ, foi realizada uma análise topográfica deste nicho neurogénico no rato ao longo dos eixos anterior-posterior e dorsal-ventral. Os resultados obtidos demonstraram que a proliferação das células da SEZ diminui ao longo do eixo anterior-posterior e varia consideravelmente de acordo com a posição no eixo dorsal-ventral. Para além disso, estas diferenças estão associadas a uma distribuição diferencial na população dos neuroblastos e na população das células estaminais neurais (NSCs) ao longo do eixo dorsalventral. Em seguida, foi realizada a mesma análise na SEZ do murganho adulto. A análise destes resultados revelou diferenças relevantes entre estas duas espécies filogeneticamente muito próximas. A proliferação e a distribuição diferencial das NSCs e dos neuroblastos observada em ratos não ocorrem em murganhos. Finalmente, no que diz respeito à modulação da SEZ em resposta a insultos ao cérebro, foi estudado o impacto de um estímulo inflamatório periférico, desencadeada por um lipopolissacarídeo (LPS), componente da parede das bactérias gram negativas, sobre a SEZ, o plexus coroideus (CP) e o líquido cefalorraquidiano (CSF). O CP é a estrutura do cérebro que produz e segrega a maioria do CSF que por sua vez está em contacto direto com as NSCs da SEZ. Em resposta a um estímulo periférico inflamatório, a expressão genética no CP de moduladores da SEZ é alterada, sendo esta alteração parcialmente refletida na composição proteica do CSF. O mesmo estímulo inflamatório desencadeou um aumento rápido e transitório na proliferação celular na SEZ. O pico da resposta do CP ao estímulo inflamatório desencadeado pelo LPS foi às 6h e 12h após a administração de LPS e a indução da proliferação celular na SEZ ocorreu especificamente após 12h de estímulo com LPS. Em resumo, os resultados apresentados nesta tese revelam especificidades topográficas da SEZ no rato e no murganho, destacando ainda diferenças específicas entre estas duas espécies. Além disso, revela também a resposta da SEZ a um estímulo periférico inflamatório agudo e realça algumas moléculas sintetizadas no CP que quando segregadas para o CSF podem modular as células da SEZ.

Trabalho apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas A infeção do trato urinário (ITU) ocorre frequentemente no humano. É mais prevalente no sexo feminino, mas também acomete pacientes do sexo masculino principalmente quando associada à manipulação do trato urinário e à disfunção prostática. A ITU pode ser classificada quanto à localização em ITU baixa (cistite) e ITU alta (pielonefrite) e quanto à presença de fatores de risco em ITU não complicada e ITU complicada. Os agentes etiológicos mais frequentemente envolvidos com ITU adquirida na comunidade são, em ordem de frequência: a Escherichia coli, o Staphilococcus saprophyticus, espécies de Proteus e de Klebsiella e o Enterococcus faecalis. A presença de infeção, bem como a sua extensão, depende da interação entre fatores de virulência do microrganismo, defesas do hospedeiro e tamanho do inóculo. Os sinais e sintomas associados à ITU incluem polaciúria, urgência miccional, disúria, hematúria e piúria. A escolha de terapia antimicrobiana para a ITU varia de acordo com a apresentação da infeção, hospedeiro e agente. Estratégias envolvendo diferentes esquemas terapêuticos de acordo com grupos específicos de pacientes maximizam os benefícios terapêuticos além de reduzir os custos, as incidências de efeitos adversos e o surgimento de microrganismos resistentes. A urinary tract infection (UTI) occurs frequently in human. It is more prevalent in females but affects males especially when associated with manipulation of the urinary tract and prostate dysfunction.The UTI can be classified according to location in lower UTI (cystitis) and high UTI (pielonephritis) and according the presence of complicating factors in uncomplicated UTI and complicated UTI. The etiologic agents most frequently involved with community-acquired UTI are in order of frequency: Escherichia coli, Staphilococcus saprophyticus, Proteus species and Klebsiella and Enterococcus faecalis. The presence of infection and their extent depends on the interaction between factors of virulence of the microorganism host defenses and inoculums size. The signs and symptoms associated with UTI include urinary frequency, urinary urgency, dysuria, hematuria and pyuria. The choice of antimicrobial therapy for the ITU varies with the introduction of infection, host and agent. Strategies involving different treatment regimens according to specific patient groups maximize the therapeutic benefits and reduce costs, the incidence of adverse effects and the emergence of resistant microorganisms.

Trabalho apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas Os antibióticos são medicamentos etiotrópicos sem ação farmacológica sobre as células eucarióticas do Homem, tendo como alvo os locais específicos da célula procariótica. Contudo, apesar desta especificidade de ação, os antibióticos podem exibir efeitos tóxicos nas células humanas, muito embora o risco potencial é baixo tendo em conta o seu elevado número de prescrições. Assim, a nível hepático a lesão induzida pelas penicilinas (ampicilina, benzilpenicilina, fenoximetilpenicilina, amoxicilina) é rara, mas no caso da flucloxacilina e da associação de amoxicilina com ácido clavulânico há um aumento da sua incidência. As cefalosporinas raramente causam reações hepatotóxicas, sendo o efeito mais relatado a colestase. A administração de elevadas doses de tetraciclinas por via intravenosa pode causar esteatose microvesicular e elevação das enzimas hepáticas, podendo mesmo conduzir, em casos mais graves a falha hepática fulminante. Nas quinolonas, a trovafloxacina tem maior potencial hepatotóxico. A telitromicina, um macrólido de nova geração, é o mais preocupante dentro dos macrólidos, devido ao número de casos descritos num curto período de tempo. Nos fármacos para o tratamento da tuberculose, os efeitos adversos variam desde aumentos assintomáticos das enzimas hepáticas a hepatite aguda ou falha hepática fulminante. Relativamente à nefrotoxicidade, os aminoglicosídeos podem causar necrose tubular aguda, uma vez que têm capacidade para interagir com muitos alvos intracelulares. A vancomicina, que é quase exclusivamente eliminada por via renal, também tem a capacidade de causar necrose das células do túbulo renal proximal. Das cefalosporinas, a cefaloridina e a cefaloglicina são as únicas capazes de causar danos renais quando administradas em doses terapêuticas. Também existem alguns casos de toxicidade renal com as polimixinas B e E, observando-se necrose tubular aguda e nefrite intersticial aguda. Nas penicilinas, a meticilina é a mais tóxica causando nefrite intersticial aguda. Por fim, nos carbapenemos, o imipenem e o panipenem apenas são comercializados em combinação com agentes nefroprotectores, uma vez que são hidrolisados a nível renal originando metabolitos tóxicos. Antibiotics are etiotropic drugs without pharmacologic action in human eucaryotic cells, and so their targets are specific sites of prokaryote cell. However, in spite of this specific action, antibiotics can exhibit toxic effects in human cells, but this potential risk is low considering count their high number of prescriptions. Thus, in hepatic level the lesion induced by penicillins (ampicillin, benzylpenicillin, phenoxymethylpenicillin and amoxicillin) is rare, but in the case of flucloxacillin and the association of amoxicillin with clavulanic acid there is an increase of this incidence. Cephalosporins rarely cause hepatotoxic reactions, and thus the must related effect is cholestasis. Administration of high doses of tetracyclines via intravenous route can cause microvesicular steatosis and elevation of hepatic enzymes, and can even lead, in more severe cases, to fulminant liver failure. In quinolones, trovafloxacin has more potential to induce hepatotoxic effects. Telithromycin, a macrolide of second generation, is the most worring of all macrolides, due to the number of cases related in a short time. In drugs for tuberculosis treatment, the adverse effects vary from assintomatic hepatic enzymes elevation to acute hepatitis or fulminant liver failure. In the case of nephrotoxicity, aminoglycosides can cause tubular acute necrosis, because they have the capacity to interact with many intracellular targets. Vancomycin, which is almost exclusively eliminated by the kidneys, also has the capacity to cause necrosis of proximal renal tubule cells. In all cephalosporins, cephaloridine and cephaloglycine are the ones capable of causing renal damage when administered in therapeutic doses. There are some cases of renal toxicity with polymyxins B and E, noting acute tubular necrosis and acute interstitial nephritis. In penicillins, methicillin is the most toxic drug causing acute interstitial nephritis. Lastly, in carbapenems the imipenem and panipenem are only marketed in combination with nephroprotectors agents, because they are hydrolyzed in kidneys originating toxic metabolites.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular O ferro é essencial para processos metabólicos fundamentais. Dada a sua natureza reactiva, a homeostasia do ferro é um processo altamente regulado em mamíferos. Um desequilíbrio no metabolismo do ferro tem sido associado a patologias como anemia, hemocromatose e doença de Alzheimer. Ferritina, hepcidina e transferrina são algumas das principais proteínas envolvidas na manutenção dos níveis de ferro no organismo. A Lipocalina 2 (LCN2) é uma proteína de 25 kDa pertencente à família das lipocalinas que tem sido descrita como participante em vários eventos biológicos, tais como diferenciação do rim, protecção de falha renal, apoptose, sobrevivência celular e resposta de fase aguda no fígado, baço, sangue e alguns tecidos epiteliais. Muito relevante é o facto de a LCN2 ser capaz de se ligar a sideróforos bacterianos carregados com ferro. Durante infecções bacterianas, a LCN2 compete com as bactérias pelo ferro disponível, limitando assim a proliferação bacteriana. Este efeito bacteriostático enaltece o papel de LCN2 na resposta imune inata. Dada a capacidade de LCN2 para se ligar a sideróforos carregados com ferro e o facto de existirem células que conseguem capturar este complexo, a LCN2 tem sido proposta como proteína central num putativo mecanismo de entrega de ferro alternativo ao da transferrina. De maneira a compreender melhor o papel de LCN2 no metabolismo do ferro bem como na resposta imune inata, caracterizamos por análise immunohistoquimica o padrão de expressão da proteína em ratinho, do desenvolvimento fetal até um ano de idade, em condições controlo/fisiológicas (injecção com salino) e após estímulo inflamatório agudo (injecção com LPS). A expressão de LCN2 durante o desenvolvimento embrionário foi predominante no fígado e rim. O sinal da proteína persistiu em ambos os órgãos na primeira semana de vida de animais controlo, sugerindo uma ligação da proteína a processos de diferenciação e/ou desenvolvimento. No período pós natal, nos animais injectados com salino a imunoreactividade de LCN2 foi detectada no baço, timo e rim. A injecção com LPS induziu expressão de LCN2 no baço, rim, fígado e barreiras do cérebro. Os dados aqui apresentados indicam que a presença e o perfil de distribuição de LCN2 em alguns tecidos de ratinho são dependentes da idade e estado fisiológico. Iron is essential for key metabolic mechanisms. Given its reactive nature, iron homeostasis is a highly regulated process in mammals. Iron imbalance as been associated to pathologies such as anemia, hemochromatosis and Alzheimer's disease.Ferritin, hepcidin and transferrin are some of the key proteins involved in the maintenance of organism iron levels. Lipocalin 2 (LCN2) is a 25 kDa protein from the lipocalin family that has been reported to participate in a broad range of biological events, such as kidney differentiation, protection from renal failure, apoptosis, cell survival and acute phase response in the liver, spleen, blood cells and some epithelial tissues. Importantly, LCN2 is capable of binding to bacterial siderophores loaded with iron. During bacterial infection scenarios, LCN2 competes with bacteria for iron resources, thus limiting bacterial proliferation. This bacteriostatic effect highlights the role of LCN2 in the innate immune system response. Given the ability of LCN2 to bind iron loaded siderophores and the finding that cells can uptake this complex, LCN2 has been proposed as a central participant in a putative transferrin-alternative pathway for iron delivery. In order to further understand the role of LCN2 in iron metabolism as well in the innate immune system response, we characterized through immunohistochemical analysis the protein expression pattern in mice, from fetal development to one year of age, both in control/physiological conditions (saline injection) and after an acute inflammatory stimulus (LPS injection). LCN2 expression during embryonic development was predominant in the liver and kidney. The protein signal persisted in both organs in the first week of life of control animals, thus suggesting that the protein may be linked to differentiation and/or development processes. In control post-natal animals LCN2 immunoreactivity was detected in the spleen, thymus and kidney. LPS injection induced increased LCN2 expression in the spleen, kidney, liver and barriers of the brain. The present data indicates that LCN2 presence and distribution pattern in some mice tissues is dependent of age and physiological state.

Monografia apresentada à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Licenciada em Medicina Dentária A cavidade oral constitui a primeira parte do tracto gastrointestinal, e apresenta uma série de características que a converte num habitat microbiologicamente distinto. As características ecológicas das diferentes superfícies encontradas na cavidade bucal, tornam-na um habitat microbiano único no corpo humano (Ellen e Kuramitsu, 2000). A placa bacteriana pode ser definida como uma película não calcificada, apresentando uma forte adesão às superfícies dentárias, sendo predominantemente constituída por reservatórios bacterianos e componentes salivares, com crescimento contínuo. Esta placa bacteriana é hoje em dia considerada como das principais causas de doenças como a cárie e peridontite. O objectivo deste trabalho foi avaliar através da revisão da literatura, a participação bacteriana em diferentes condições peridontais e veículos de combate a essas mesmas bactérias, incluindo as formas resistentes. A microflora oral é composta predominantemente por bactérias, incluindo as formas resistentes. A microflora oral é composta predominantemente por bactérias, no entanto podem também encontrar-se fungos, vírus, protozoários e até mesmo archaea. É estimado que mais de 700 espécies cultiváveis e não cultiváveis estejam presentes nesta cavidade (Pennisi, 2005). O predomínio bacteriano no que respeita a este âmbito foca-se em espécies Gram positivo, do Género Streptococcus e Actinomyces, e de Gram negativo como Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Capnocytophaga, Neisseria e Veillonella spp. Na gengivite, destaca-se a presença de microrganismos Gram positivo como Streptococcus mitis, Streptococcus sanguis, Actinomyces viscosus, Actinomyces naeslundii, Peptostreptococcus micros e Gram-negativo como Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Veilonella parvula, Haemophilus e Campylobacter spp. Na periodontite evidenciam-se elevadas proporções de Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus, Prevotella intermedia, Campylobacter rectus, Eikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Treponema e Eubacterium spp. Pode concluir-se que a microbiota presenta na cavidade bucal é variável e reflecte a condição peridontal. Várias são as técnicas microbiológicas de diagnóstico (cultura bacteriana, ensaios imunológicos e enzimáticos, microscopia de campo escuro e contraste de fase e marcadores bioquímicos) utilizadas para a detecção dos patogénicos citados, no entanto os resultados encontrados apontam para a necessidade de uma análise criteriosa na selecção do teste a ser empregue. Mundialmente a resistência aos antibióticos entre a microbiota oral é um problema crescente e as informações relativas a tal resistência são escassas. Existe assim uma necessidade urgente de formular uma estratégia de acção para aliviar o desenvolvimento de resistências, conservando a eficácia dos antimicrobianos, plano este baseado na prevenção de doenças transmissíveis e no controlo das infecções. O diagnóstico laboratorial das infecções da cavidade oral por métodos clássicos é moroso e não permite dar respostas atempadas. Estes métodos não constituem uma alternativa viável e por isso o diagnóstico clínico e respectivo tratamento é feito empiricamente. Os métodos de Biologia Molecular nomeadamente a sequenciação do gene 16S rRNA e a detecção de genes de resistência aos diferentes grupos de antibióticos, permitem agilizar o diagnóstico clínico das infecções da cavidade oral e modificar o comportamento clínico face a estas infecções. Na nossa opinião é este o caminho a adoptar para o tratamento das periodontites.

Monografia apresentada à Universidade Fernando Pessoa para obtenção do grau Licenciada em Análises Clínicas e Saúde Pública Pretende-se investigar e descrever o Diagnóstico Laboratorial da infecção por Helicobacter pylori, métodos de diagnóstico invasivos e não invasivos, seu valor de diagnóstico e aplicações. Este trabalho é o resultado de uma pesquisa bibliográfica intensa e está exposto num texto que pretende dar ao leitor a ideia de todos os pontos que se consideram fundamentais para a compreensão da problemática estudada. O conhecimento dos métodos e técnicas de investigação irá concerteza permitir a realização futura de outros trabalhos neste âmbito.

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