Kourdova, Lucille Tihomirova, Panzetta de Dutari, Graciela María Del Valle, Degano, Alicia Laura, Guido, Mario Eduardo, Bocco, José Luis, and Ramhorst, Rosanna Elizabeth
Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2022 El desarrollo de un embarazo saludable depende en gran medida de la funcionalidad de las células trofoblásticas que constituyen la placenta. Durante su desarrollo, los trofoblastos extravellosos adquieren un fenotipo invasivo y migratorio para anclar la placenta al útero y remodelar las arterias espirales uterinas. Una diferenciación anómala o pérdida de la homeostasis de los trofoblastos producen un deterioro de la función placentaria impactando en la salud de la madre y del feto. Si bien las células tumorales son muy diversas en sus fenotipos y en muchas de las respuestas a señales externas e internas, la mayoría comparte con las células trofoblásticas su gran actividad biosintética, escasa inhibición por contacto, elevado índice de proliferación, capacidad para escapar a efectores del sistema inmune y propiedades migratorias e invasivas. Ambos tipos celulares se enfrentan a variaciones en la tensión de oxígeno y el aporte de nutrientes, y una demanda incrementada en la síntesis proteica por lo que requieren de una adecuada función del retículo endoplásmico (RE) y de un sistema que mantenga el balance redox evitando el daño oxidativo o reductivo. Históricamente el aumento en las especies reactivas del oxígeno (ROS) ha sido asociado a daño y muerte celular, pero actualmente se sabe que bajos niveles de ROS y/o la exposición pasajera a éstos son necesarios para la regulación de numerosos procesos celulares. El microambiente oxidante del RE es necesario para la correcta maduración proteica. Diversas situaciones pueden alterar su homeostasis, conducir a una acumulación de proteínas mal plegadas y activar la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) a través de tres vías principales dependientes de tres proteínas transmembrana: Ire1α, PERK y ATF6. En células en reposo, los tres sensores se mantienen en un estado inactivo a través de su asociación con BiP, que es considerado el regulador maestro de la UPR. La UPR normalmente tiene funciones de supervivencia y protege a las células restableciendo el procesamiento proteico y la homeostasis celular, mientras que una disfunción de la UPR o el estrés prolongado y severo puede conducir a la muerte celular. Numerosos antecedentes dan cuenta de la importancia tanto de las ROS como de efectores de alguna o varias vías de la UPR en la fisiopatología de la placenta y de diversos tumores. El factor de transcripción tipo Krüppel-6 (KLF6) es un factor de transcripción ubicuo altamente expresado en la placenta y necesario para su correcto desarrollo. Participa en múltiples procesos como la progresión del ciclo celular, apoptosis, angiogénesis, remodelado vascular, migración y diferenciación, pudiendo desempeñar funciones antagónicas dependiendo del contexto celular. Además, se lo ha descrito como un gen de respuesta al estrés ya que su expresión se incrementa bajo condiciones asociadas a un aumento de ROS. En la placenta su expresión es inducida tempranamente por hipoxia y por la presencia del organofosforado clorpirifos, que además de incrementar el estrés oxidativo genera estrés del RE. Sin embargo, se desconocía si KLF6 participa en la homeostasis celular modulando los niveles de ROS y de los componentes de la UPR en el contexto de células trofoblásticas y tumorales. Este fue el objetivo abordado en esta tesis. Los estudios realizados revelaron que la disminución en la expresión de KLF6 mediante siRNA en células trofoblásticas HTR-8/SVneo indujo un aumento en las ROS. Este incremento en las ROS no fue de origen mitocondrial, si no que podría deberse a un rol de KLF6 como regulador transcripcional de NOX4. Considerando que el aumento de ROS puede conducir a un estado de estrés oxidativo, se estudiaron el potencial de membrana mitocondrial, el índice de apoptosis y la viabilidad celular frente al silenciamiento de KLF6, como así también la respuesta antioxidante a través de la medición de moléculas clave como catalasa, 2-cys-peroxiredoxinas y la vía de Nrf2. No se observaron modificaciones en ninguno de estos parámetros debido al silenciamiento de KLF6. En cambio, el silenciamiento de KLF6 disminuyó la proliferación celular e incrementó los niveles de p21 de manera independiente de p53. Además, se observó un cambio morfológico en las células silenciadas volviéndose más fibroblastoides y aumentando su capacidad migratoria de manera ROS - dependiente. Estos resultados indican que las ROS generadas no incrementan la muerte celular ni la respuesta antioxidante de las células HTR-8/SVneo, y sugieren que los niveles de ROS inducidos no serían dañinos y podrían actuar como una señal reguladora de la función o diferenciación celular del trofoblasto extravelloso. El silenciamiento de KLF6 en las líneas celulares tumorales HepG2, T98G y MDA-MB 231 también condujo a un aumento de ROS total de origen no mitocondrial. Similar a lo observado en la línea trofoblástica, no se modificó la viabilidad celular ni hubo cambios en los niveles de catalasa o 2-cys-peroxiredoxinas. Sin embargo, en contraste con las HTR-8/SVneo, en HepG2 y MDA-MB 231 no se observó un cambio morfológico ni tampoco un incremento en los niveles de p21. Si bien, no se pudo determinar la consecuencia del aumento de ROS en estas líneas, los resultados indican que KLF6 también modula los niveles de ROS en ellas y sugieren que este podría ser uno de los mecanismos por los cuales KLF6 ejerce efectos diferenciales en contextos tumorales. En cuanto a la modulación de componentes de la UPR los estudios realizados revelaron que la disminución en la expresión de KLF6 disminuyó los niveles de factores claves en la UPR tales como BiP, Ire1α, calnexina y el procesamiento del ARNm de Xbp1 (Xbp1s). Al someter las células a un tratamiento con tapsigargina, conocido inductor de la UPR, las células silenciadas para KLF6 no aumentaron los niveles de BiP, sugiriendo que KLF6 es requerido para activar la expresión de BiP. Además, en presencia de tapsigargina se observó una activación en la vía de PERK evidenciada por el incremento en la fosforilación de eIF2α en las células con expresión disminuida de KLF6. Por otra parte, se demostró mediante diferentes estrategias experimentales que el silenciamiento de KLF6 no indujo la autofagia ni tampoco impidió el tráfico intracelular de proteínas en condiciones basales. El silenciamiento de KLF6 en las líneas celulares tumorales no se acompañó de los mismos cambios en la expresión de los componentes de la UPR. De hecho, los cambios fueron dependientes de la línea celular. Mientras que en las células MDA-MB231 se observó un aumento basal de BiP y una disminución de Xbp1s, en la línea HepG2 no se detectaron cambios. En cambio, en la línea T98G se observó un incremento significativo en la expresión de BiP en células silenciadas para KLF6 sólo cuando fueron tratadas con tapsigargina; mientras que basalmente sólo se observó una disminución en la fosforilación de eIF2α al silenciar KLF6. Estos resultados están en concordancia con el rol multifacético que presenta KLF6 dependiendo del contexto celular, como se ha reportado previamente. Los resultados de esta tesis son la primera evidencia de una función de KLF6 como modulador de los niveles de ROS y de componentes de la UPR en células trofoblásticas y tumorales, de manera dependiente del contexto celular. Además, demostraron que en células trofoblásticas el aumento de ROS, posiblemente como consecuencia de un aumento en la expresión de NOX4, incrementa su fenotipo migratorio 2024-09-30 Fil: Kourdova, Lucille Tihomirova. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.