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Los seepage mounds son depósitos de geometría dómica debidos a flujo y descarga de aguas subterráneas, estando su posición relacionada con zonas lineales de fractura. Describimos en este trabajo dos ejemplos de este tipo de estructura, reconocida por primera vez en nuestro país en formaciones continentales de edad Mioceno (cuencas de Madrid y Las Minas de Hellín). Sus rasgos son comparados con los observados en seepage mounds del Desierto de Amargosa, Plioceno, oeste de Estados Unidos. El modelo de formación propuesto para estas estructuras tiene en cuenta el efecto de deformación sobre sedimentos lacustres suprayacentes debido a la presión de crecimiento hacia arriba de los montículos Seepage mounds are dom ic-like structures formed by seepage and discharge of groundwater that occur associated with linear fault zones. Two seepage mound occurrences are described from Miocene continental formations in Spain and their features are compared with previously described deposits in Amargosa Desert, western USA. Emphasis is made on the deformation of overlying lacustrine sediments due to the upward growth pressure of the mounds which provides evidence of the mechanism of mound formation

Los seepage mounds son depósitos de geometría dómica debidos a flujo y descarga de aguas subterráneas, estando su posición relacionada con zonas lineales de fractura. Describimos en este trabajo dos ejemplos de este tipo de estructura, reconocida por primera vez en nuestro país en formaciones continentales de edad Mioceno (cuencas de Madrid y Las Minas de Hellín). Sus rasgos son comparados con los observados en seepage mounds del Desierto de Amargosa, Plioceno, oeste de Estados Unidos. El modelo de formación propuesto para estas estructuras tiene en cuenta el efecto de deformación sobre sedimentos lacustres suprayacentes debido a la presión de crecimiento hacia arriba de los montículos, Seepage mounds are dom ic-like structures formed by seepage and discharge of groundwater that occur associated with linear fault zones. Two seepage mound occurrences are described from Miocene continental formations in Spain and their features are compared with previously described deposits in Amargosa Desert, western USA. Emphasis is made on the deformation of overlying lacustrine sediments due to the upward growth pressure of the mounds which provides evidence of the mechanism of mound formation

[spa] Se han localizado tres clones genómicos de una genoteca de DNA DE endospermo de maíz construida por restricción parcial SAU3AI y clonaje en la diana BAMHI del vector lambda CHARON-35 positivos a un clon CDNA PME119 que codifica para una glutelina-2 de 28 KD, proteína de reserva del maíz. Los tres Insertor solapan cubriendo una región de genoma de 18.5 KBP. Cuando se alinean con un clon genómico previamente aislado en el laboratorio (ZG1), esta región genómica cubre 20 KBP. La región codificante se localiza centrada, incluida en un fragmento de restricción HINDIII-HIND III de 3.O KBP. Subclonado este en plásmidos de elevado numero de copias como PUC18 se estableció un mapa de restricción. En los tres aislamientos este era plenamente coincidente. La secuencia completa de uno de los fragmentos, clonado en el plásmido P268C, de 2975 BP permitió conocer 1709 BP de región flanqueante a 5', la totalidad de la región codificante y unos 600 BP de la región 3' flanqueante. La comparación de esta secuencia con otras obtenidas en el laboratorio, especialmente con los clones CDNA descritos en la variedad E10 muestran identidad con la excepción de pocas mutaciones puntuales que no producen, con una única excepción, cambios del aminoácido codificado. Se construyó una genoteca parcial de DNA de endospermo de maíz de la variedad W64A a partir de los fragmentos de DNA HINDIII-HINDIII de tamaños comprendidos entre 3.5 Y 4.5 KBP con la finalidad de aislar clones genomicos codificantes para una ZEINA-II de 16 KD (ZC1). A partir de esta, empleando la sonda PSTI-BAMHI de 300 BP de PME177 se aislaron 5 señales positivas, cuyos insertos resultaron idénticos. La secuenciación de la totalidad del inserto (3870 BP) permitió conocer 1238 BP de secuencia flanqueante 5' y 2038 BP de región flanqueante 3'. Se trata del primer aislamiento genómico de proteínas de reserva de cereales en que se observa una coincidencia completa entre la secuencia del gen y del CDNA.

The validation process of an affinity chromatography on heparine-Sepharose method is described.

La parte superior de la Unidad Intermedia del Mioceno en el sector occidental de la Cuenca de Madrid contiene varios niveles diatomíticos, que consisten tanto en diatomitas casi puras como en calizas y margas con contenido variable en diatomeas. Estos niveles fueron depositados en un ambiente lacustre somero caracterizado por condiciones de salinidad moderada y alcalinidad variable, tal como atestiguan la mineralogía de los depósitos y las asociaciones de diatomeas reconocidas. Dentro de éstas se ha distinguido dos asociaciones características, una con predominio de Fragilaria bituminosa y otra constituida por varias especies de Cymbella. Ambas asociaciones se sustituyen entre sí en la vertical de las secciones, indicando fluctuaciones en las condiciones de depósito, The upper part of the intermediate unit of the Miocene in the eastern sector of the Madrid Basin contains several diatomic levels, which consist of either almost pure diatomites or limestones and loams with variable diatom content. These levels were deposited in a lacustrine shallow environment characterised by moderate salinity conditions and variable alkalinity, just as mineralogy of deposits and recognised diatom associations prove. Two characteristic associations have been distinguished within them, one of them with bituminous Fragilaria prominence, and the other one constituted by several species of Cymbella. Both associations are replaced with each other in the vertical section, pointing out fluctuations in the deposit conditions.

1. Instruccón opara el régimen de las sucursales --2. Reglamento especial para la organización y orden de ascensos del perspnal del Banco de España -- 3. Reglamento especial para el régimen interior de las Oficinas y demás dependencias -- 4. Apéndices

La progesiva importancia de la atención de las heridas crónicas y los continuos avances en el conocimiento del proceso de cicatrización han facilitado el desarrollo de nuevos productos con capacidad de incrementar la velocidad de la cicatrización de las heridas. La investigación de nuevos materiales biocompatibles, las técnicas de cura en ambiente húmedo, o el desarrollo de productos basados en la ingeniería de tejidos, son los ejemplos más recientes [...].

These reply comments were focused on the different affirmations made by Rodríguez Ramírez (2008, this volume) about our previous paper., Rivista italiana di Paleontologia e Stratigrafia, Vol 115, No 1

La regulación europea que define el desarrollo y comercialización de los productos cosméticos hace un énfasis especial en la necesidad de demostrar la efectividad de los productos cosméticos, en un entorno en el que, debido a la prohibición de uso de modelos experimentales animales, sólo es posible el estudio en modelos alternativos (in silico, in vitro, en cultivo, etc.) o en voluntarios sanos. Dentro de los métodos alternativos, la utilización de los modelos celulares adquiere cada vez más importancia por los grandes avances que se producen en la comprensión de los complejos procesos moleculares que regulan y controlan el devenir de la célula, individualmente y dentro de los tejidos.

La cicatrización de las heridas es un proceso complejo que implica diferentes fases que se solapan entre sí, incluyendo la inflamación, la epitelización, la angiognesis y la síntesis y deposición de matriz extracelular. Los fibroblastos dérmicos tienen una función esencial en la formación del tejido de granulación. Migran hasta la lesión en respuesta a citoquinas, proliferan y sintetizan las proteínas de la matriz extracelular, las cuales son la base del proceso de reparación futuro. Los oligoelementos tales como el zinc y el manganeso son necesarios para muchas funciones celulares y, por consiguiente, pueden potencialmente estimular los procesos de reparación de las heridas. En el presente estudio hemos investigado el efecto de un aposito que contiene zinc, calcio y manganeso (Trionic®) sobre la proliferación, el crecimiento, la síntesis de colágeno I y III y la migración de los fibroblastos. Los resultados obtenidos indican que los oligoelementos solubles presentes en Trionic® actúan estimulando la proliferación, el crecimiento, la biosíntesis de colágeno y la migración de los fibroblastos. Dada la participación crucial que estas funciones celulares tienen sobre el comportamiento de los fibroblastos durante el proceso de formación del tejido de granulación, concluimos que los iones Ca2+, Zn2+, y Mn2+ contenidos en Trionic® pueden proporcionar potenciales beneficios en el tratamiento de las heridas crónicas y durante la fase reparativa del proceso de cicatrización.

En los últimos años se han desarrollado nuevos métodos para el estudio de la topografia de la superficie de la piel que permiten el análisis cuantitativo del relieve cutáneo incluyendo también la cuantificación de la severidad de las arrugas presentes en la piel.

An important ovarian function is the synthesis of steroid hormones for menstrual cycle regulation. Blood substrate for these hormones are large lipoprotein complex, unable to cross the cellular membrane without previous hydrolysis to fatty acids. [...]

[eng] The pleiotropic WT1 transcription factor (WT1) was first discovered in renal tumours. It contains four zinc-finger motifs at the C-terminus which are important for DNA binding to activate gene expression and is also involved in post-transcriptional processes. The expression of WT1 is essential during development of multiple organs, among them the cardiovascular structures. In the developing heart, WT1 is strongly expressed in the epicardium, and in cardiac endothelial cells. After cardiac injury, WT1 is temporally upregulated in both lineages in the infarcted area and border zone, which points to a potential role for WT1 in cardiac repair and regeneration. In this thesis, we focused on the role of Wt1 in endothelial cells, particularly in cardiac endothelial cells during coronary vessel formation, and in the adult heart after myocardial infarction. To support some of these findings, the mouse retinal vasculature was used as a model for two-dimensional angiogenic studies. We have demonstrated that Wt1 is present in CECs during coronary development, and that Wt1 deletion abrogates for endothelial proliferation, migration, and maturation during both retinal and coronary vasculature formation in vivo. Also, RNAseq analysis of embryonic Wt1-KOΔEC CECs suggests that Wt1 controls several downstream pathways. However, the importance of Wt1 functions in neovascularization in the adult heart after injury, specifically after 14 days of MI, has proven to be limited. The so-called recapitulation of embryonic programs in the neovascularization processes arising after injury was not sufficient for Wt1 to exert a differential effect on the adult heart after myocardial infarction. We observed no significant functional changes in cardiac output, assessed by ECG imaging, nor in tissue remodelling, visualized by analysis of the fibrotic scar in the infarcted region. However, we did observe changes in Wt1-KOΔEC CECs at the molecular and transcriptomic level, suggesting that WT1 may activate some genetic programmes in these cells, even if its effects are not able to alter evident cardiac functions.

[spa] Las mitofusinas 1 y 2 son unas GTPasas que se encuentran en la membrana mitocondrial externa, donde llevan a cabo el proceso de fusión mitocondrial. La existencia de mutaciones en Mfn2 es la principal causa de la enfermedad de Charcot- Marie-Tooth tipo 2A, un grupo de distintas neuropatías caracterizadas por degeneración axonal. Por otro lado, otras alteraciones en Mfn2 también han sido descritas en múltiples enfermedades neurodegenerativas crónicas, en episodios traumáticos agudos como accidentes cerebrovasculares e incluso otras enfermedades no neurológicas como las cardiometabólicas. Un gran número de estudios han demostrado que Mfn2 está relacionada con la regulación del metabolismo y la bioenergética mitocondrial, ya que su supresión afecta negativamente ambos procesos y su sobreexpresión los estimula. Dado el papel del metabolismo mitocondrial en la fisiopatología de estas enfermedades, entender el mecanismo por el que Mfn2 regula la bioenergética mitocondrial resulta de gran importancia. En esta tesis se demostró que la activación de la bioenergética mitocondrial por parte de Mfn2 requiere su localización en el retículo endoplasmático (RE) y es independiente a su función como proteína de fusión mitocondrial. A diferencia de Mfn1, Mfn2 se encuentra presente en el RE, concretamente en las membranas asociadas con las mitocondrias. Los contactos entre ambos orgánulos son de vital importancia en las células, ya que, entre otras funciones esenciales, crean micro-dominios que permiten la transferencia de Ca2+ del RE hacia las mitocondrias. Por su parte, el Ca2+ captado por las mitocondrias estimula diferentes enzimas del metabolismo mitocondrial y complejos encargados de mantener la bioenergética mitocondrial. En esta tesis, se observó que células carentes de Mfn2 también manifiestan defectos en la homeostasis del Ca2+ y en el mantenimiento de los contactos RE-mitocondrias. Mediante el uso de un enlazador artificial que mimetiza la función enlazadora de Mfn2 o diferentes formas de Mfn2 dirigidas a ambos orgánulos, se determinó que Mfn2 actúa como complejo enlazador de RE y mitocondrias, propiciando la formación de contactos óptimos para la transferencia de Ca2+ del RE a las mitocondrias. A su vez, el restablecimiento de la captación de Ca2+ por las mitocondrias gracias a la función enlazadora de Mfn2 fue capaz de estimular la bioenergética mitocondrial, definiendo de este modo un mecanismo por el cual Mfn2 regula la bioenergética mitocondrial a través de los contactos RE-mitocondria. La relevancia fisiológica de estos resultados se mostró en dos procesos neuronales. Por un lado, la falta de Mfn2 provocó alteraciones en el crecimiento neurítico y la formación de espinas dendríticas durante el periodo de desarrollo neuronal en modelos in vivo de ratón knockout para Mfn2. Estas alteraciones, fueron rescatadas in vitro mediante el enlazador artificial de RE-mitocondrias. Usando distintas formas de Mfn2 dirigidas específicamente a RE o mitocondria, se determinó que el mecanismo por el cual Mfn2 regula la bioenergética a través de los contactos RE-mitocondrias podría ser esencial durante el desarrollo neuronal para un correcto crecimiento y ramificación de sus neuritas. Por otro lado, el restablecimiento de los contactos RE-mitocondria protegió contra la excitotoxicidad. Mfn2 destaca también por su capacidad neuroprotectora frente diferentes tipos de lesiones como daño al ADN, estrés oxidativo o privación de iones K+. Frente a una sobreactivación persistente de los receptores de NMDA, acontece un aumento continuo y acusado de Ca2+ intracelular que desencadena en muerte neuronal. Durante este proceso, los niveles de Mfn2 decrecen, hecho que correlaciona con una mayor predisposición neuronal a la apoptosis. En este estudio, se determinó que la función enlazadora de Mfn2 podría estar relacionada con el reclutamiento de Bax hacia las mitocondrias, hecho típicamente definitorio de un proceso apoptótico. De este modo, se propone este mecanismo como una potencial diana terapéutica en procesos patológicos como los accidentes cerebrovasculares isquémicos, en los cuales aparecen eventos excitotóxicos y los niveles de Mfn2 se ven reducidos.

[eng] Wt1 is a complex gene that encodes a protein whose best described function is to act as a transcription factor. Wt1 plays a crucial role in several organ developments, including kidneys, liver, heart or gonads. Moreover, Wt1 is implicated in the etiology of a set of syndromes and diseases ranging from cancer to disorders of sex development (DSD). Additionally, Wt1 has been described to play a role in adult homeostasis. In this thesis, I focused on Wt1 role in development, specifically in gonad and heart morphogenesis. For this purpose, I used two previously described Cre mouse models to generate two different Wt1KOs. The heart is the first organ being formed and it is primarily composed of three layers: the endocardium, the myocardium and the epicardium. The epicardium is a mesothelial layer of cells covering the vertebrate heart surface. Epicardial cells give rise to epicardial derived cells (EPDCs), progenitors of crucial cell types in heart development like vascular smooth muscle cells and cardiac fibroblasts. Moreover, the epicardium contributes to heart morphogenesis by secreting paracrine factors. After myocardial infarction, the epicardium embryonic genetic signature is reactivated. Thus, understanding the mechanisms behind epicardial development constitutes a topic of general interest. The epicardial genetic program has been previously characterized and the Wt1 role in the regulation of this program has been established. One of the pathways modulated during epicardium development is the BMP4 pathway. The results of this thesis demonstrate that WT1 directly regulates Bmp4 expression. Additionally, exposed results demonstrate how the BMP4 pathway is crucial for epicardial cell maturation, through the regulation of cell morphology, from a cuboidal to a squamous cell shape, epicardial proliferation, and transcriptomic changes. Finally, the data shown in this work indicated that changes and mechanisms described for epicardium may be a phenomenon extrapolated to other mesotheliums like the lung mesothelium. To better study Wt1 role in the development of other organs, we have characterized the recombination activity of a Wt1Cre mouse model using two different reporter mouse models, the R26RmTmG and the R26RtdRFP. Results demonstrated that Wt1Cre is efficiently activated in hearts and gonads but not in other organs generated from the genital ridge, like the kidney or the adrenal gland. Taking advantage of this, the Wt1Cre mouse model was used to generate a new Wt1KO: the Wt1Cre; Wt1Loxp/GFP. Wt1Cre; Wt1Loxp/GFP mice show a partial embryonic lethality, potentially caused by defects in heart development, but some of them reach adulthood, becoming an ideal model to investigate Wt1 role from embryonic to adult stages. Therefore, we decided to study Wt1role in gonad development in Wt1Cre; Wt1Loxp/GFP mice. Sex development is a complex and coordinated process that starts with the differentiation of the bipotential gonads. WT1 mutations or haploinsufficiency have been reported in different syndromes and conditions linked to DSD. The study of WT1 role in embryonic development and the impact on adult sex development has been hampered by the complete gonadal agenesis or embryonic lethality presented by other Wt1KO mouse models. The results presented demonstrate a sharp reduction in Wt1 levels in Wt1Cre; Wt1Loxp/GFP gonads since the bipotential stage. This causes, in the adult, the formation of small, atrophic gonads, a hermaphroditism of the genital tract and external ambiguous genitalia. Besides, the data reported in this thesis demonstrates that Wt1Cre; Wt1Loxp/GFP mice present an impaired gonad embryonic development due to the lack of differentiation of the main cell lineages responsible for gonad development and function: supportive cells, steroidogenic cells and primordial germ cells (PGCs). Finally, the observed sub-lethality in Wt1Cre; Wt1Loxp/GFP mice is explained by the observation of a severe heart developmental impairment in a portion of Wt1Cre; Wt1Loxp/GFP embryos, whereas others show no apparent heart defects at embryonic stages. Equally, an histological study performed on Wt1Cre; Wt1Loxp/GFP mice also described changes in the spleen and brown adipose tissue. In summary, our results indicate the importance of morphological changes epicardial cells undergo during development, a process regulated by Wt1 modulation of the BMP4 pathway. In addition, the generation and characterization of the Wt1Cre; Wt1Loxp/GFP mouse renders an informative and useful tool to study Wt1 role beyond embryonic stages and provide a more accurate frame for the understanding of results previously obtained when using the Wt1Cre mouse model.

[spa] La actividad sináptica regula una larga lista de procesos esenciales para el desarrollo y la supervivencia neuronal mediante cambios en los niveles de Ca2+ citoplasmático. Modula desde la morfología del árbol dendrítico neuronal hasta la plasticidad neuronal o los mecanismos de protección contra el daño oxidativo. La entrada de Ca2+ a través de los receptores sinápticos promueve diferentes cambios a nivel celular que van desde la remodelación del citoesqueleto a la estimulación de diferentes cascadas de señalización que finalmente activan diferentes factores de transcripción implicados en la regulación de toda una serie de programas de transcripción. Durante las primeras semanas tras el nacimiento tiene lugar el período, enmarcado dentro del desarrollo del sistema nervioso, en que se da una mayor tasa de crecimiento de dendritas y axones. El crecimiento neuronal debe ir acompañado de la síntesis de nuevos lípidos, necesarios para la generación de nuevas membranas. A pesar de que los mecanismos implicados en la regulación del crecimiento de dendritas y axones han sido ampliamente estudiados, se conoce muy poco con respecto a los cambios a nivel metabólico destinados a la síntesis de las biomoléculas necesarias para abastecer la generación de nuevas membranas. El principal objetivo de este trabajo ha sido estudiar el mecanismo por el que la actividad sináptica es capaz de regular el metabolismo neuronal para promover la síntesis de diferentes metabolitos precursores para la síntesis de los lípidos necesarios para el crecimiento neurítico. El principal modelo utilizado en este estudio ha sido los cultivos primarios de neuronas corticales de embriones de rata. La actividad sináptica se ha estimulado mediante un protocolo basado en la desinhibición de la red neuronal, que consiste en el tratamiento combinado con Bicuculina y 4-aminopiridina. Los resultados de esta tesis demuestran que la actividad sináptica estimula la captación y el metabolismo de la glucosa incrementando la transcripción del principal transportador de glucosa en neuronas (Glut3) y de diferentes enzimas implicadas en la glucólisis (HK2, PKM1/2 y PFKFB3). Todo el proceso está regulado por un mecanismo caracterizado por la activación de dos factores de transcripción: CREB y HIF-1α. La activación de CREB, uno de los principales factores de transcripción regulados por la actividad sináptica, promueve la expresión de Glut3 y de la enzima ubiquitina ligasa, Siah2. La actividad de esta última es necesaria para promover la estabilización y, en consecuencia, la activación de HIF-1α, que finalmente promueve la expresión de las enzimas implicadas en la glucólisis. La inhibición de la glucólisis o el bloqueo de la actividad de HIF-1α son suficientes para inhibir la estimulación del crecimiento neuronal por la actividad sináptica. De acuerdo con estos resultados en cultivos celulares, la inhibición de esta vía o la eliminación de este factor de transcripción durante las primeras semanas de desarrollo postnatal en roedores tiene como consecuencia una reducción de la complejidad del árbol dendrítico. Tal como se muestra en el presente trabajo, la actividad sináptica también podría estar implicada en la regulación de diferentes orgánulos como son los peroxisomas y las mitocondrias. En el primer caso se ha observado que la actividad sináptica promueve la síntesis de diferentes implicados tanto el desarrollo y el mantenimiento de los peroxisomas (Pex5, Pex11b y Pex13) como en el metabolismo lipídico peroxisomal (ABCD2 y ACOT8). Cuanto a las mitocondrias se ha comprobado que las neuronas estimuladas sinápticamente activas presentan un incremento en el transporte anterógrado mitocondrial a lo largo del axón que depende de la actividad de HIF-1α., [eng] During the first weeks after birth occurs the period of the nervous system development in which takes place the highest dendritic and axonal growth ratio. Neuronal growth must be accompanied by the synthesis of new lipids, which are necessary for the formation of new membranes. Although the mechanisms involved in the regulation of dendrites and axons growth have been widely studied, there is very little known about the changes at the metabolic level involved in the synthesis of the biomolecules necessary to supply the formation of new membranes. The main goal of this doctoral thesis has been studying the mechanism by which synaptic activity, one of the most important inducers of neurite growth, regulates neuronal metabolism to promote the synthesis of different precursor metabolites involved in the synthesis of lipids required for neuritic growth. The results of this thesis show that synaptic activity stimulates glucose uptake and metabolism by increasing the transcription of the main glucose transporter in neurons, Glut3 and different enzymes involved in glycolysis. The whole process is regulated by a mechanism characterized by the activation of two transcription factors: CREB and HIF-1α. The activation of CREB, one of the main transcription factors regulated by synaptic activity, promotes the expression of Glut3 and the ubiquitin-protein ligase, Siah2. The activity of the latter is necessary to promote the stabilization and, consequently, the activation of HIF-1α, which finally promotes the expression of enzymes involved in glycolysis. Glycolysis inhibition or blocking of HIF-1α activity are sufficient to inhibit stimulation of neuronal growth by synaptic activity. A shown in this thesis, synaptic activity may also be involved in the regulation of peroxisomes and mitochondria. In the first case, it has been observed that synaptic activity promotes the synthesis of different agents involved in the development and maintenance of peroxisomes and in peroxisomal lipid metabolism. In regard to mitochondria, it has been proven that synaptically active neurons exhibit an increase in mitochondrial anterograde transport along the axon which requires HIF-1α activity.

[cat] Una provisió adequada de nucleòtids és essencial per una replicació acurada del DNA, i concentracions inapropiades de dNTPs poden conduir a situacions d’estrès de replicació, una font de dany al DNA, inestabilitat genòmica i tumorigènesi. El metabolisme de dNTP és controlat per per dues vies: la via de novo i la via de salvament. Mitjançant la incorporació de deoxinucleòsids la via de salvament és necessària per al correcte desenvolupament hematopoètic. Els teixits hematopoètics contenen elevades concentracions de timidina, que induirà un increment en els nivells intracel·lulars de dTTP. Uns nivells elevats de dTTP inhibeixen la incorporació de dUTP durant la replicació, limitant així l’estrès de replicació en els precursors hematopoètics. Alteracions en l’activitat dels enzims encarregats del metabolisme de dNTP poden conduir a un increment en la mutagènesi i la tumorigènesi in vitro i in vivo, així produir defectes en el desenvolupament del llinatge eritroide i limfoide. ERK5 és un membre de la família de les Map quinases, coneguda per la seva implicació en el cicle cel·lular i la progressió del càncer. Durant la mitosi, ERK5 és fosforilada per CDK1 i també participa en la transició G1/S mitjançant la inhibició de p27 i p21. L’activitat de la via MEK5/ERK5 correlaciona amb un elevat potencial metastàtic en cèl·lules tumorals de pròstata i ronyó. D’altre banda, l’activitat tumorigenica d’ERK5 s’ha relacionat amb la seva capacitat d’interactuar amb PML i MDM2, on ERK5 promou la degradació constitutiva de p53. En aquest treball es presenten evidències de que ERK5 és necessària per a un subministrament correcte de nucleòtids durant el desenvolupament eritroide. Els ratolins deficients per a ERK5 en el llinatge hematopoètic mostren un desenvolupament eritroide alterat en el moll de l’os, acompanyat per una alteració en els nivells intracel·lulars de dNTP i un increment en la taxa de mutació en les poblacions progenitores d’eritròcits. D’altre banda, la disminució dels nivells d’ERK5 en la línia tumoral Jurkat indueix una sensibilització d’aquestes cèl·lules en front al tractament amb timidina, evidenciat per un increment en la fosforilació de la histona H2AX i l’apoptosi. L’increment en la sensibilitat a la timidina correlaciona amb un increment en la rati dTTP/dCTP. Aquests resultats indiquen que ERK5 és necessari per a mantenir el balanç de dNTP i prevenir així la incorporació errònia de dNTP i dany al DNA en progenitors d’eritròcits altament proliferatius i la línia leucèmica Jurkat., [eng] An adequate supply of nucleotides is essential for accurate DNA replication, and inappropriate deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) concentrations can lead to replication stress, a common source of DNA damage, genomic instability and tumourigenesis. Here, we provide evidence that Erk5 is necessary for correct nucleotide supply during erythroid development. Erk5 is a member of the mammalian mitogen-activated kinase family protein that has been related to cell cycle regulation as well as càncer progression. During mitosis, Erk5 is phosphorylated in a cdk-dependent manner and translocates to the nuclei. Erk5 is necessary for proliferation of breast carcinoma cells, where it contributes to G1/S transition by inhibiting the p21 and p27 cdk inhibitors. The tumourigenicity of Erk5 has been related to its capacity to interact with promyelocytic leukemia protein and inhibit its tumor suppressor activity. By blocking the interaction of promyelocytic leukemia protein and MDM2 Erk5 allows the inhibition of tumor suppressor p53 by MDM2. Mice with Erk5 knockout in the haematopoietic lineage showed impaired erythroid development in bone marrow, accompanied by altered dNTP levels and increased DNA mutagenesis in erythroid progenitors as detected by exome sequencing. Moreover, Erk5-depleted leukemic Jurkat cells presented a marked sensitivity to thymidine-induced S phase stalling, as evidenced by increased H2AX phosphorylation and apoptosis. The increase in thymidine sensitivity correlated with a higher dTTP/dCTP ratio. These results indicate that Erk5 is necessary to maintain the balance of nucleotide levels, thus preventing dNTP misincorporation and DNA damage in proliferative erythroid progenitors and leukemic Jurkat T cells. In this study, we uncovered important alterations in the nucleotide metabolism of Erk5-deficient cells, which were associated to impaired erythropoiesis in mice and to hypersensitivity of leukemic Jurkat cells to exogenous thymidine as evidenced by DNA damage and apoptosis.

Durante el ictus, los niveles elevados de glutamato extracelular, el principal neurotransmisor excitador en el sistema nervioso central, aumentan y se unen al receptor de NMDA promoviendo la excitotoxicidad. Esta situación genera que un flujo excesivo de Ca2+ pase a través del receptor de NMDA aumentando sus concentraciones intracelulares activando toda una serie de cascadas de señalización que pueden actuar directamente sobre las mitocondrias, promoviendo varios programas de muerte celular. Las mitocondrias son orgánulos muy dinámicos que constantemente se fusionan y dividen, cambiando de forma y localización. El equilibrio entre la fisión y la fusión es importante para la función mitocondrial y es un regulador clave de la progresión de la muerte celular. Las proteínas que conforman el proceso de fusión mitocondrial y de fisión están formadas por un grupo de GTPasas. La fusión de la membrana mitocondrial interna está mediada por OPA1. Dos mitofusinas (Mfn1 y 2) median la fusión de la membrana externa mitocondrial. Por otro lado, la fisión mitocondrial está mediada por Drp1, una proteína citoplasmática que es reclutada a la superficie mitocondrial después de ser modificada a nivel post-traduccional. Los problemas relacionados con la dinámica mitocondrial se han descrito en múltiples enfermedades neurodegenrativas así como también en cáncer y sida. En esta Tesis hemos demostrado que Mfn2 juega un papel muy importante en el mantenimiento de la funcionalidad mitocondrial y la supervivencia neuronal. En excitotoxicidad es la única proteína de la maquinaria de fusión/fisión que disminuye su expresión en dos modelos in vitro distintos y también en un modelo in vivo. Hemos identificado dos fases de fragmentación mitocondrial en excitotoxicidad. La primera y que cursa en poco tiempo depende de la activación y reclutamiento de Drp1 mientras que la fase tardana que se inicia 4 horas después del insulto, parece depender de la reducción de los niveles proteicos de Mfn2. Esta fase tardía es irreversible y parece condenar a la neurona. La disminución de Mfn2 genera alteraciones en la homeóstasis del Ca2+, disminuye el potencial de membrana mitocondrial, empeora la comunicación entre las mitocondrias y el retículo endoplasmático, aumenta la traslocación de Bax a las mitocondrias y favorece la liberación del citocromo c. Hemos encontrado que la reducción en la expresión de Mfn2 durante la excitotoxicidad se da a nivel transcripcional y depende del factor de transcripción MEF2 que regula a Mfn2 a nivel basal en neuronas. En excitotoxicidad, MEF2 es degradado y causa la disminución de Mfn2. Este contexto hace pensar que Mfn2 podría ser una diana a tener en cuenta para futuros desarrollos de drogas y poder, de este modo, incrementar la pequeña ventana terapéutica que existe actualmente para el ictus., Mitochondrial fusion and fission is a dynamic process critical for the maintenance of mitochondrial function and cell viability. During excitotoxicity neuronal mitochondria are fragmented, but the mechanism underlying this process is poorly understood. Here, we show that Mfn2 is the only member of the mitochondrial fusion/fission machinery whose expression is reduced in in vitro and in vivo models of excitotoxicity. Whereas in cortical primary cultures, Drp1 recruitment to mitochondria plays a primordial role in mitochondrial fragmentation in an early phase that can be reversed once the insult has ceased, Mfn2 downregulation intervenes in a delayed mitochondrial fragmentation phase that progresses even when the insult has ceased. Downregulation of Mfn2 causes mitochondrial dysfunction, altered calcium homeo- stasis, and enhanced Bax translocation to mitochondria, resulting in delayed neuronal death. We found that transcription factor MEF2 regulates basal Mfn2 expression in neurons and that excitotoxicity- dependent degradation of MEF2 causes Mfn2 downregulation. Thus, Mfn2 reduction is a late event in excitotoxicity and its targeting may help to reduce excitotoxic damage and increase the currently short therapeutic window in stroke.

Els sindecans s'uneixen a molècules d'adhesió cel·lular, factors de creixement i poden actuar com a correceptors, i d'aquesta manera poden modular la funció leucocitària. En la present tesi s'ha analitzat l'expressió de sindecans en cèl·lules T CD4 primàries humanes. Per l'esmentat estudi s'han produït anticossos monoclonals contra sindecà-2.S'ha demostrat que, en cèl·lules T CD4 humanes, l'estimulació cel·lular incrementa notablement la quantitat de sindecà-4, i de manera menys notòria també la de sindecà-2. L'expressió de sindecà-2 i sindecà-4 segueix diferents cinètiques d'inducció. Mentre que l'expressió de sindecà-4 és més ràpida i significant, la de sindecà-2 és més tardana i de vida més curta de manera que disminueix la seva expressió d'mRNA a dia 4 d'activació. Aquesta expressió de sindecà-2 i sindecà-4 és aparent tant a nivell d'mRNA com a nivell de proteïna. Els sindecans -2 i -4 s'expressen tant en cèl·lules T CD4 verges (CD45RA+) com en cèl·lules T CD4 memòria (CD45RA-). A nivell funcional, els sindecans -2 i -4 són capaços d'aturar l'activació de la cèl·lula T tant a nivell de proliferació com a nivell de producció de citocines. S'ha demostrat experimentalment que quan s'incuben limfòcits de sang perifèrica amb anticòs anti-sindecà-4 en una reacció limfocitària mixta, decreix la proliferació de les cèl·lules T, però aquest fenomen no s'ha observat al incubar les cèl·lules amb anticòs anti-sindecà-2. Tanmateix, l'entrecreuament de sindecà-2 o sindecà-4 en T CD4 mitjançant anticossos, bloqueja la proliferació cel·lular i redueix la producció de TNF de les cèl·lules T en presència de concentracions òptimes d'anticòs contra CD3. Aquests resultats suggereixen que sindecà-2 i sindecà-4 podrien actuar com a inhibidors de l'activació de la cèl·lula T. La disminució de la proliferació està causada per un bloqueig en el cicle cel·lular. L'entrecreuament de l'anticòs contra sindecà-2 amb les cèl·lules T en presència d'anticòs anti-CD3 causa també una inhibició de la producció de les citocines IL-2, IL-10, TNF i TGFbeta. De manera que es veuen compromesos els dos principals fenòmens que desencadenen l'activació de la cèl·lula T: la proliferació i la producció de citocines.Aquesta inhibició també s'ha observat en cèl·lules Jurkat que sobreexpressen sindecà-2.També s'ha investigat el paper que juguen les vies de senyalització de les MAPK en el control de l'expressió de sindecà-2 en cèl·lules T. S'ha demostrat que la producció de sindecà-2, però no la de sindecà-4, requereix la senyalització de la MAPK p38 alfa/beta en cèl·lules T CD4.D'altra banda, s'ha estudiat la senyalització induïda per sindecà-2 en cèl·lules T i s'ha observat que l'entrecreuament de les cèl·lules T CD4 amb anticòs anti-sindecà-2 promou la fosforilació d'una proteïna que presumptament correspon a la MAPK ERK5. La fosforilació d'aquesta proteïna podria estar directament relacionada amb la inhibició de la producció de IL-2 i per tant podria ser la via de senyalització mitjançant la qual sindecà-2 estaria exercint la seva acció inhibidora., Syndecans bind cell adhesion molecules and growth factors and can act as correceptors, and in this way they can modulate leukocyte cell function. In the present thesis the expression of syndecans in primary human CD4 T cells has been analyzed. For this study monoclonal antibodies against syndecan-2 have been produced.We show that, the stimulation of human CD4 T cells increases the amount of syndecan-4 remarkably, and in a lower extent that of syndecan-2. Expression of syndecan-2 and -4 show different induction kinetics. Whereas syndecan-4 expression is fast and significant, that of syndecan-2 is more delayed and short-lived decreasing its mRNA expression at day 4. Both CD45RA+ naïve and CD45RA- memory CD4 T cells express syndecan-2 and -4 upon activation.When incubated with human peripheral blood lymphocytes in a mixed leukocyte reaction, anti-syndecan-4 but not anti-syndecan-2 antibodies, decreased T cell proliferation. However, cross-linking of cell-bound syndecan-2 or syndecan-4 via immobilized antibodies blocked proliferation and decreased TNF production of T cells in the presence of optimal levels of anti-CD3. These findings suggest that syndecan-2 and -4 acts as inhibitors of T cell activation. We also investigated the role that MAPK signaling pathways play in control of syndecan expression in T cells. We show that production of syndecan-2 but not syndecan-4 requires signaling via p38 MAP kinase alpha/beta in T CD4 cells. These studies provide evidence for the up-regulation of syndecan-2 and -4 in human primary CD4 T cells during in vitro activation and suggest an inhibitory role or these syndecans in CD4 T cells. We also investigated the signaling pathways induced by syndecan-2 in T cells. We show that the triggering of syndecan-2 with antibodies promotes the phosphorylation of ERK5 MAP kinase. The phosphorylation of this protein could be directly related to inhibition of IL-2 production and therefore could be the signaling pathway that syndecan-2 uses to exert its inhibitory action.