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Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_vinicius_campos.pdf: 483644 bytes, checksum: 9caf292597102dea88bfa2da68dc9158 (MD5) Previous issue date: 2009-03-03 Food intake in vertebrates is a complex process involving several endocrine and neural pathways. Among the orexigenic factors, the most notably are the neuropetides as the neuropeptide Y (NPY) that is a 36 amino acid peptide which plays a key role in food intake. Studies evaluating fish NPY expression showed that this peptide is involved in appetite stimulation. However, despite the recent advances, our present knowledge of the regulation of feeding behavior in fish is limited and based in a few fish species, and there is increasing evidence of speciesspecific differences. The Brazilian flounder Paralichthys orbignyanus is being considered for aquaculture, and it is important to understand the mechanisms regulating feeding in order to improve its performance in captivity. The objectives of this study were to clone NPY cDNA, evaluate the mRNA levels in different tissues of flounder, and also evaluate brain NPY expression during 24 h by real-time RT-PCR. A 597 bp NPY cDNA was cloned from Brazilian flounder brain by 3´RACE method. NPY expression was detected in all peripheral tissues analyzed, but with predominant expression in the brain. No significant differences were observed in brain NPY gene expression over a 24 h evaluation period. No correlation was observed among plasma glucose, total protein, cholesterol, triglycerides and NPY expression levels during 24 hours. These results indicated that NPY may play roles in flounder peripheral tissues and may be not involved short-term regulation of food intake at low-temperatures in Brazilian flounder. O apetite e a ingestão de alimentos em vertebrados é um processo complexo que envolve várias rotas neurais e endócrinas. Dentre os fatores orexigênicos, destacamse os neuropeptídeos, como o neuropeptídeo Y (NPY), o qual é constituído de 36 aminoácidos e desempenha papel chave na regulação do apetite. Estudos avaliando a expressão do NPY em peixes demonstraram que este peptídeo está envolvido no estímulo da ingestão. Entretanto, apesar dos avanços recentes, o atual conhecimento sobre a regulação fisiológica do apetite é limitado e baseado em poucas espécies de peixes com evidencias de diferenças interespecíficas. O linguado Paralichthys orbignyanus tem sido considerado para a aqüicultura e com isso, torna-se importante compreender os mecanismos de regulação do apetite para incrementar o seu desempenho em cativeiro. Os objetivos deste trabalho compreenderam clonar o gene do NPY, avaliar os níveis de RNA mensageiro nos diferentes tecidos do linguado e também avaliar a expressão do NPY no cérebro durante 24 h por RT-PCR em tempo real. Um fragmento de 597 pb do cDNA do NPY foi clonado a partir do RNAm do cérebro do linguado através do método RACE 3 . A expressão do NPY foi detectada em todos os tecidos analisados (cérebro, baço, coração, intestino, estômago, brânquia, fígado, rim, músculo e testículo), mas com predominante expressão no cérebro. A expressão do NPY não cérebro demonstrou variações durante 24 horas de avaliação. Nenhuma correlação foi observada entre glicose, proteínas totais, colesterol e triglicerídeos plasmáticos. Estes resultados indicam que o NPY pode desenvolver funções em outros tecidos além do cérebro e também pode não estar associado na regulação da alimentação em curto prazo em baixas temperaturas.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-20Bitstream added on 2014-06-13T18:44:31Z : No. of bitstreams: 1 gibertoni_am_dr_jabo.pdf: 1047291 bytes, checksum: 9be7492afd065b969b043d3a6d16e4be (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Foram realizadas a clonagem e expressão do gene da nucleoproteína (N) de uma estirpe vacinal de referência M41 do vírus da bronquite infecciosa (VBI), como proteína recombinante de fusão, contendo uma cauda de poli-histidina na extremidade carboxi-terminal, em 2 sistemas hospedeiros; na levedura metilotrófica, Pichia pastoris e na bactéria Escherichia coli. A proteína N derivada de um isolado variante do VBI de surtos a campo no Brasil, também foi expressa em E. coli. As características bioquímicas e imunoquímicas de tais proteínas recombinantes, foram determinadas, tendo sido evidenciado maior eficiência de produção no sistema hospedeiro constituído por E. coli, comparativamente ao sistema composto por P. pastoris. Uma vez obtidas, caracterizadas e purificadas, através da técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel-sepharose, as preparações de proteína N recombinante expressas em E. coli e derivadas ou da estirpe de referência M41 ou do novo isolado de campo no Brasil, foram utilizadas de forma bem sucedida, como antígenos alvo de ensaios indiretos de ELISA, que foram aplicados na detecção e mensuração de anticorpos dos isótipos IgG e IgM em aves infectadas com estirpes homóloga ou variantes do VBI. Foi, também, investigada a atividade imunogênica da proteína N recombinante em aves, que depois de imunizadas e re-imunizadas com essas proteínas recombinantes, produziram no soro sanguíneo e na secreção lacrimal quantidades elevadas de anticorpos anti-VBI específicos, mas não desenvolveram proteção efetiva contra o desafio com a estirpe homóloga desse vírus. Concluindo, a proteína N recombinante do VBI expressa pela E. coli possui elevada imunogenicidade, no sentido de induzir altos níveis de anticorpos específicos, e reatividade cruzada com proteínas N de outras variantes desse vírus, tendo um grande potencial de ser aplicada em... Two host systems, represented by Escherichia coli and Pichia pastoris were used for cloning and protein expression of the nucleoprotein (N) gene of M41 strain of infectious bronchitis virus (IBV) as a fusion recombinant protein containing a poli-histidine tag. The N protein from a new variant Brazilian field isolate was also cloned and expressed by E. coli system. The biochemical and immunochemical properties of these recombinant N proteins were determined and higher efficiency on protein production was achieved by using the E. coli expression system. Both recombinant N proteins expressed by E. coli were purified in nickel-sepharose resin and used as antigen in indirect ELISA methods for the detection of IgG and IgM antibodies in birds infected with homologous and variant IBVs. The immunogenicity of N recombinant protein was also evaluated by immunizing and re-immunizing birds and high antibody levels were generated in lachrymal secretion and serum, but no effective protection against challenge with homologous virulent stain of IBV was induced. Concluding, the recombinant N IBV protein expressed by E. coli is highly immunogenic for inducing specific and crossreactive antibodies, and can be applied in the immuno-diagnosis of IB

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-19Bitstream added on 2014-06-13T20:52:31Z : No. of bitstreams: 1 moroz_a_me_botfm.pdf: 608341 bytes, checksum: 715f3ed5332daf7487462c8fa4111838 (MD5) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Levando-se em consideração avanços tecnológicos na área médica e o impacto dos programas de saúde que determinaram curvas de longevidade cada vez maiores e taxas de natalidade cada vez menores, o novo desafio do gestor público são as conseqüências: o envelhecimento e a vida como uma “doença crônica”. Entre os principais desafios está a abordagem das doenças crônico-degenerativas que determinam o aumento de lesões cartilaginosas articulares. A débil capacidade de regeneração e as limitações das alternativas de tratamento fazem as técnicas derivadas da biotecnologia, como o transplante autólogo de condrócitos (TAC) e o uso de células-tronco, o foco das investigações. O TAC requer coleta de material cartilaginoso de área sadia, podendo causar nova lesão; no entanto, pode-se evitar este perigo com o uso de células-tronco. As células-tronco mesenquimais, adultas, podem se diferenciar em condrócitos mediante o uso de meio de cultura específico em consonância a um arcabouço 3D, mas muitos problemas como evitar a calcificação e estimular a condrogênese em meio favorável constituem o desafio para os pesquisadores na atualidade. 1) produzir anticorpo monoclonal específico a CTMs de coelho para monitorá-las, 2) determinar o volume ideal de coleta de medula óssea para microencapsulação e condrogênese, 3) realizar a microencapsulação das CTMs em novos arcabouços: BIOGEL3D e BACTCELL3D, comparando seu desempenho com o modelo clássico em alginato. Foram utilizados 25 coelhos Nova Zelândia sendo divididos em diferentes grupos em função do volume de MO coletado: G1 = 6mL, G2 = 9mL, G3 = 12mL, G4 = 15mL e G5 = volume ideal de coleta determinado pelos indicadores dos outros grupos. O material coletado foi diluído 1:2 em RPMI 1640 com 3.000U de heparina sódica. Após a contagem celular, as amostras foram submetidas a separação em gradiente... Technological advances in the medical area combined with the impact of health programs that enhance longevity, together with lower natality rates created new challenges to the public manager such as aging and life as a “chronic disease”. Among the major problems are the chronic degenerative diseases that increase articular lesions. The limited regeneration capabilities and the limitations of actual treatment alternatives made biotechnology derived techniques the focus of investigations. The autologous chondrocyte transplantation (ACT) requires a small biopsy of health cartilage, which can lead to a new lesion. However, the use of stem cells can avoid this possibility. Mesenchymal stem cells (MSCs) can differentiate into chondrocytes by using a specific culture medium together with a 3D scaffold, but some questions such as the risks of calcification remain as key factors to researchers. 1) to produce a monoclonal antibody that recognizes MSCs in order to characterize them, 2) to determine the optimal bone marrow collection volume for cell microencapsulation and chondrogenesis and 3) to microencapsulate MSCs in two novel scaffolds: BIOGEL3D and BACTCELL3D, comparing them with sodium alginate. 25 New Zealand rabbits were divided into 5 groups related to bone marrow collection volume: G1 = 6mL, G2 = 9mL, G3 = 12mL, G4 = 15mL and G5 = optimal volume determined by the study. The collected material was diluted in RPMI1640 medium 1:2, with 3000U sodium heparin. After cell count and viability assessment the samples were submitted to density gradient centrifugation in order to isolate the lymphomononuclear (LMN) fraction. These cells were seeded to obtain and expand the MSCs in DMEM Knockout® (InvitrogenTM) supplemented with antibiotic/antimycotic, Lglutamine, essential aminoacids, non essential aminoacids and fetal bovine serum (all from InvitrogenTM). The cells were cultivated in 5% CO2 ...(Complete abstract click electronic access below)

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico The present study aimed to determine the time for the rooting of minicuttings in a climatized greenhouse; to assess the influence of the time interval between collection/preparation and plantation, and; to evaluate the use of antioxidants in minicutting rooting of Eucalyptus clones. Minicuttings of five Eucalyptus spp. clones (C1, C2, C3 and C4 = Eucalyptus urophylla x E. grandis and C5 = natural hybrid Eucalyptus grandis), collected in ministumps located at a clonal minigarden, were used. The ministumps were obtained by minicutting rooting in channels of masonry filled with washed sand. By the monitoring of the rooting process of five clones (C1, C2, C3, C4 and C5), peculiarities related to the behavior of each genetic material during the rooting process were verified. It was possible to observe that the necessary time for this process differs among the clones, allowing the identification of the best rooting point for each genetic material. As regards the influence of time interval between collection/preparation and plantation of minicuttings, it was noticed that, in general, time intervals longer than two hours cause a decrease in the rooting and growth of plants. However, the studied clones responded differently to the imposition of the factor, indicating genotypic effect. With regards to the use of antioxidants in the minicuttings, varied responses were observed in the clones, due to the application of ascorbic acid and polyvinylpyrrolidone (PVP). The first one was favorable to the minicuttings from the clone with the lowest rooting percentage (C3); the second one, however, was unfavorable to the studied clones. O presente trabalho teve como objetivos determinar o tempo de enraizamento de miniestacas em casa de vegetação climatizada; verificar a influência do intervalo de tempo entre coleta/preparo e estaqueamento, e; avaliar a utilização de antioxidantes no enraizamento das miniestacas de clones de Eucalyptus. Foram utilizadas miniestacas de cinco clones de Eucalyptus spp. (C1, C2, C3 e C4 = Eucalyptus urophylla x E. grandis e C5 = híbrido natural de Eucalyptus grandis), as quais foram coletadas em minicepas localizadas em minijardim clonal, obtidas pelo enraizamento de miniestacas, implantadas em canaletas de alvenaria, preenchidas com areia lavada. A partir do acompanhamento do processo rizogênico dos cinco clones (C1, C2, C3, C4 e C5), verificou-se peculiaridades em relação ao comportamento de cada material genético durante o enraizamento e foi possível constatar que o tempo necessário para o processo rizogênico difere entre os clones, permitindo a identificação do ponto ótimo de enraizamento para cada material genético. Quanto à influência do intervalo de tempo entre coleta/preparo e estaqueamento de miniestacas, observou-se que, de maneira geral, intervalos de tempo superiores ao período de duas horas causam diminuição no porcentual de enraizamento e no posterior crescimento das mudas, porém os clones estudados responderam de forma diferente à imposição do fator, indicando efeito genotípico. Com relação ao uso de antioxidantes nas miniestacas, foram observadas respostas variadas dos clones com a aplicação do ácido ascórbico e polivinilpirrolidona (PVP), sendo que a utilização do primeiro foi favorável para as miniestacas do clone com menor porcentual de enraizamento (C3), porém, a utilização do PVP mostrou-se desfavorável para os clones trabalhados.

The present study aimed to evaluate Eucalyptus urophylla x E. globulus and Eucalyptus grandis x E. globulus clones in relation to micropropagation by axillary shoot proliferation in the in vitro establishment and multiplication phases, and the rooting of mini-cuttings in the clonal propagation of these hybrids. In the in vitro establishment phase, contamination by fungi and bacteria, browning and nodal segment shoot inductions of 21 Eucalyptus urophylla x E. globulus clones and eight Eucalyptus grandis x E. globulus clones were evaluated in different in vitro introductions. In the in vitro multiplication phase, the multiplication rate of 21 Eucalyptus urophylla x E. globulus clones and six Eucalyptus grandis x E. globulus clones was evaluated in successive subcultures using MS and JADS culture media in different in vitro introductions. In the mini- cuttings, the survival and emission of roots at the bottom of the dibble tube in the green house and shade house was evaluated, and the rooting and number of roots of apical and intermediary mini-cuttings in the shade house, treated with IBA, in nine Eucalyptus urophylla x E. globulus clones and two Eucalyptus grandis x E. globulus clones. In the in vitro establishment phase, shoot induction varied among clones, being satisfactory for most of the genotypes, while the browning rate and bacterial and fungal contamination did not compromise the establishment of the cultures. In the in vitro multiplication phase, a differentiated response for the multiplication rate was noted, with clones presenting good in vitro multiplication rates and recalcitrant others for micropropagation. The MS and JADS culture media had positive effects, with greater multiplication rate tendencies for the MS media, where the multiplication rate of the subcultures varied with the tendency of an initial increase and subsequent fall in most of the clones and in vitro introductions. As for the mini-cuttings, there was no significant effect of IBA in any of the studied characteristics. The survival rate of the mini-cuttings was high for most of the clones and the rooting rate varied among clones and the types of mini-cuttings with superior results for apical mini- cuttings. A high variability of responses to rooting was observed among the studied clones, with clones presenting a high rate of rooting and number of roots for minicuttings, while some clones still lacked adjustments to the mini- cuttings propagation process. O presente estudo teve como objetivos avaliar clones de Eucalyptus urophylla x E. globulus e Eucalyptus grandis x E. globulus em relação à micropropagação pela proliferação de gemas axilares nas fases de estabelecimento e multiplicação in vitro, e o enraizamento de miniestacas na propagação clonal desses híbridos. Na fase de estabelecimento in vitro, foram avaliadas a contaminação por fungos e bactérias, oxidação e a indução de brotações em segmentos nodais de 21 clones de Eucalyptus urophylla x E. globulus e oito clones de Eucalyptus grandis x E. globulus em diferentes introduções in vitro. Na multiplicação in vitro, avaliou-se a taxa de multiplicação de 21 clones de Eucalyptus urophylla x E. globulus e seis clones de Eucalyptus grandis x E. globulus em sucessivos subcultivos nos meios de cultura MS e JADS, em diferentes introduções in vitro. Na miniestaquia, avaliou-se a sobrevivência e a emissão de raízes no fundo do tubete na casa de vegetação e de sombra, e o enraizamento e número de raízes na casa de sombra de miniestacas apicais e intermediárias, tratadas com AIB, em nove clones de Eucalyptus urophylla x E. globulus e dois clones de Eucalyptus grandis x E. globulus. No estabelecimento in vitro, a indução de brotações foi variável entre clones, sendo satisfatória para a maioria dos genótipos, enquanto a ocorrência de oxidação e contaminação por bactérias e fungos não comprometeu o estabelecimento das culturas. Na fase de multiplicação in vitro, houve resposta diferenciada quanto à taxa de multiplicação, com clones apresentando boas taxas de multiplicação in vitro e outros recalcitrantes à micropropagação. Os meios de cultura MS e JADS tiveram efeitos positivos, com tendência de maiores taxas de multiplicação para o meio MS, sendo que ao longo dos subcultivos a taxa de multiplicação variou com tendência de aumento inicial e posterior queda na maioria dos clones e introduções in vitro. Quanto à miniestaquia, não houve efeito significativo do AIB em nenhuma das características estudadas. A sobrevivência das miniestacas foi alta para a maioria dos clones e as taxas de enraizamento variaram entre clones e entre os tipos de miniestacas, com resultados superiores para miniestacas apicais. Foi observado entre os clones estudados alta variabilidade de resposta ao enraizamento, com clones apresentando alto índice de enraizamento e número de raízes por miniestaca, enquanto alguns clones ainda carecem de ajustes no processo de propagação por miniestaquia.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. Atualmente, o mercado tornou-se favorável para a produção de etanol a partir de biomassa. E o Brasil já tem considerável experiência na produção de bioetanol a partir de cana-de-açúcar, no entanto ela é uma planta sazonal e requer terra de plantio de alta qualidade para seu crescimento. Como substrato alternativo para produção de etanol no Brasil a baixo custo, temos a mandioca. O grupo de biotecnologia molecular da UnB possui uma linha de pesquisa que visa diminuir os custos da produção de etanol a partir de amido de mandioca. Em 1995, Moraes et al. construiu oito linhagens de Saccharomyces cerevisiae capazes de converter amido a etanol, no entanto o vetor utilizado nas construções é epissomal e por não ser estável pode ser facilmente perdido durante o processo industrial onde há o stress ambiental e competição entre as linhagens. Para reverter este quadro, este trabalho visou a construção de um vetor integrativo baseado na seqüência δ do transposon Ty de Saccharomyces cerevisiae no qual foram inseridos os cassetes de expressão de α-amilase de Bacillus subtilis e glicoamilase de Aspergillus awamori, gerando três diferentes vetores: pTA (contendo o cassete da α-amilase), pTGA (contendo o cassete da glicoamilase) e pTAGA (contendo ambos os cassetes). A linhagem semi-industrial MFL e a linhagem industrial JP1 foram transformadas com os vetores construídos. Foram encontrados cinco clones positivos para atividade amilolítica nas transformações da MFL e dois na JP1, a baixa eficiência de seleção de transformantes deve-se ao fato de a marca de seleção não estar inserida no vetor integrativo. As curvas de crescimento dos clones positivos mostraram que não houve alterações no crescimento das linhagens após integração dos vetores e os testes de atividade enzimática mostraram que os clones estão produzindo as enzimas de interesse. Além disso, os testes de estabilidade mitótica mostraram alta estabilidade do vetor nos clones positivos da linhagem JP1, o que torna este sistema de expressão atrativo para produção industrial. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT At present, the market became favorable for ethanol production from biomass. And Brazil already has considerable experience in the bioethanol production from sugar-cane, however it is a seasonal plant and it requires land of planting of high quality for his growth. As alternative substrate for low cost ethanol production in Brazil, we have the cassava. The molecular biotechnology group of UnB has a line of research that aims to reduce the costs of ethanol production from cassava starch . In 1995, Moraes et al. built eight Saccharomyces cerevisiae strains able to convert starch to ethanol, however the vector used in this constructions is epissomal and because of not being stable it can be easily lost during the industrial process where there is the environmental stress and competition between strains. To revert this picture, this work aimed the construction of an integrative vector based on sequence δ of the Saccharomyces cerevisiae transposon Ty in which the cassettes of expression of Bacillus subtilis α-amilase and Aspergillus awamori glicoamilase were inserted, resulting three different vectors: pTA (containing the cassette of α-amilase), pTGA (containing the cassette of the glicoamilase) and pTAGA (containing both cassettes). The semi-industrial strain MFL and the industrial strain JP1 were transformed by these vectors. Five positive clones were found with amylolytic activity in the MFL transformations and two in the JP1, the low selection efficiency of positive clones is due to the fact that the selection mark wasnt inserted in the integrative vector. The positive clones growth curves showed that there were no alterations in the strains growth after vectors integration and the tests of enzymatic activity showed that the clones are producing the enzymes of interest. Moreover, the mitotic stabilitys tests showed high stability of the vector in the positive clones of the strain JP1, which makes this system of expression attractive for industrial production.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-06Bitstream added on 2014-06-13T20:21:24Z : No. of bitstreams: 1 arnoldi_fgc_dr_rcla.pdf: 2897071 bytes, checksum: fa1429945e5319eef834777ced11123a (MD5) A partir dos coleópteros luminescentes, mais de 20 luciferases já foram clonadas e seqüenciadas. Dessas, a maioria é de lampirídeos das regiões Neártica e Paleártica, quatro de elaterídeos jamaicanos e uma de um fengodídeo asiático. Apenas outras cinco são oriundas da América do Sul, o continente mais rico em espécies de coleópteros luminescentes e o provável berço evolutivo de Lampyridae, a família com maior número de coleópteros luminescentes. Espécies desta região apresentam a maior variedade de cores de bioluminescência. No presente trabalho clonamos e seqüenciamos luciferases dos gêneros Brasilocerus sp., Phrixothrix sp. e Taximastinocerus sp., da família Phengodidae. Com base na análise filogenética dessas luciferases e outras já publicadas, concluímos que as luciferases das lanternas laterais e cefálicas são codificadas por genes parálogos, e propusemos um modelo para a evolução das cores da bioluminescência nessa família. Também determinamos o genoma mitocondrial de Pyrophorus divergens, membro da família Elateridae. A partir desse genoma e outros já publicados, analisamos a evolução da bioluminescência na superfamília Elateroidea sensu Lawrence e Newton (1995) e concluímos que essa pode ter surgido três vezes independentemente nesse grupo. From luminescent Coleopteran's, more than 20 luciferases have already been cloned and sequenced. Among them, most part is from lampyrids of Neartic and Paleartic regions, four are from Jamaican elaterids and one is from Asiatic phengodids. Just five are from South American species, the richest continent in luminescent Coleopteran's and, probably, the evolutionary cradle of Lampyridae. Species from this region display the greatest range of bioluminescence colors. At the present work, we cloned and sequenced luciferases from the genera Brasilocerus sp., Phrixothrix sp. and Taximastinocerus sp., from Phengodidae family. Based on the phylogenetic analysis of these genes and other already published, we concluded that head and lateral lantern luciferases are coded by paralogous genes, and we also proposed a model for bioluminescence color evolution in this family. We also sequenced the mitochondrial genome of Pyrophorus divergens, an Elateridae member. Based on this genome and other already published, we analysed the evolutionary history of bioluminescence in Elateroidea superfamily sensu Lawrence e Newton (1995) and concluded that it could have appeared three times independently in this group.

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular Humana). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009 Submitted by Lurdes Saramago (lurdes.saramago@fc.ul.pt) on 2013-05-10T14:48:30Z No. of bitstreams: 1 ulfc080711_tm_dina_coelho.pdf: 2446113 bytes, checksum: 5dfeff5fa4094bcb4fbc3169328c4ea7 (MD5) Made available in DSpace on 2013-05-10T14:48:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc080711_tm_dina_coelho.pdf: 2446113 bytes, checksum: 5dfeff5fa4094bcb4fbc3169328c4ea7 (MD5) Previous issue date: 2009

Devido à carência de informações a respeito da propagação vegetativa de erva-mate, conduziu-se um experimento com o objetivo de avaliar o ambiente de enraizamento e composições de substrato na sobrevivência, enraizamento e vigor de estacas de Ilex paraguariensis de plantas de 12 anos de idade. Testou-se o efeito de três clones (A32, A34 e A36), seis substratos (S1 - substrato para enraizamento à base de casca de pinus; S2 - substrato para enraizamento à base de casca de pinus e vermiculita; S3 - casca de arroz carbonizada + vermiculita fina + substrato para enraizamento à base de casca de pinus e vermiculita (1:1:1 v/v); S4 - casca de arroz carbonizada + substrato para enraizamento à base de casca de pinus e vermiculita (1:1 v/v); S5 - casca de arroz carbonizada + vermiculita fina (1:1 v/v); S6 - fibra de coco) e dois ambientes de enraizamento (casa de vegetação automatizada e simples). Embora não tenham ocorrido grandes variações entre os ambientes testados, o enraizamento das estacas mostrou-se baixo. O uso da mistura de casca de arroz carbonizada + substrato para enraizamento à base de casca de pinus e vermiculita na proporção 1:1 (v/v) é aconselhado para estaquia de erva-mate. Made available in DSpace on 2019-03-01T00:55:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 COMPOSICOESDESUBSTRATOSEAMBIENTESDE.pdf: 138547 bytes, checksum: 0c0eef105d189cd0ce7f0f68ef6d100a (MD5) Previous issue date: 2009-04-29

Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. Após um século da descoberta da Doença de Chagas, ainda não existe medicamento efetivo para o seu tratamento, e os chagásicos continuam sucumbindo às manifestações crônicas dessa grave enfermidade. A possibilidade de descobrir uma enzima ou uma via metabólica crucial para o ciclo de vida do parasita não se resume apenas à satisfação da curiosidade humana, mas também é fundamental para o desenvolvimento de fármacos que sirvam para combater as mais diferentes doenças, entre elas, a Doença de Chagas. Essa dissertação de mestrado descreve o estudo de três proteínas de Trypanosoma cruzi: duas proteases classificadas como serino-protease com domínio α/β hidrolase, pertencente ao clan SC e família S9 e S15, respectivamente - Oligopeptidase B símile (OPBsTc) e X-prolil dipeptidil aminopeptidase (X-PDAPTc) e uma proteína da via metabólica redox - a Glutationa sintetase (GSTc). A OPBsTc é uma enzima putativa de 903 aminoácidos com massa molecular esperada de 103,4 kDa sendo altamente conservada entre os cinetoplastídeos e ausente em humanos. A proteína recombinante foi expressa em E. coli BL21 Star (DE3) One Shot e purificada da fração insolúvel para produção de anticorpos em camundongo. Os soros foram utilizados em técnicas de Immunoblotting e imunocitolocalização na tentativa de confirmar a expressão da protease. Infelizmente, não foi possível confirmar a expressão da OPBsTc em nenhuma das três formas do parasita: epimastigota, tripomastigota e amastigosta. Também realizamos uma RT-PCR a partir do RNA da forma epimastigota, mas o resultado foi negativo. A segunda protease foi a X-PDAPTc, esta serino-protease é largamente estudada em Lactococcus lactis e parece ser um fator de virulência em Streptococci. Análises em bancos de dados mostraram que a distribuição da X-PDAPTc é restrita e não apresenta ortólogos em mamífero, além disso, a enzima tem 677 aminoácidos com massa molecular esperada de 76,8 kDa. A enzima foi produzida em E. coli BL21 Star (DE3) One Shot e purificada da fração insolúvel para produção de anticorpos em camundongo. X-PDAPTc é expressa na forma epimatigosta do parasito. A GSTc tem importante participação na biossíntese da glutationa para manutenção do ambiente redox no parasito. Em relação ao seu ortólogo em humanos, foi observada homologia reduzida, o que pode torná-la um alvo promissor para desenvolvimento de drogas, assim como as duas proteases citadas acima. Essa enzima tem 535 resíduos de aminoácidos e massa molecular predita de 58,6 kDa. A GSTc foi expressa e utilizada para testes de imunização. After a century of the discovery of Chagas’ disease, there is still no effective medicine for its treatment, and patients still succumb to severe manifestations of the chronic disease. The possibility of discovering an enzyme or metabolic pathway crucial to the parasite life cycle is not only to satisfy the human curiosity, but it is also fundamental to the development of drugs used to combat many different diseases, including Chagas’ disease. This master's thesis describes the study of three proteins of Trypanosoma cruzi: two proteases classified as serine-protease with α / β hydrolase domain that belong to SC clan and family S9 and S15, respectively - Oligopeptidase B like (OPBsTc) and X-prolil dipeptidil aminopeptidase (X-PDAPTc) and a redox metabolic pathway enzyme - Glutathione synthetase (GSTc). The OPBsTc is a putative enzyme of 903 amino acids and molecular mass of 103.4 kDa. It is highly conserved among kinetoplastids and it is absent in humans. The recombinant protein was expressed in E. coli BL21 Star (DE3) One Shot and purified from the insoluble fraction for production of antibodies in mice. The sera were used in immunoblotting and immunocytology techniques in an attempt to confirm the expression of the protease. Unfortunately, we could not confirm the expression of OPBsTc in any of the three forms of the parasite: epimastigote, trypomastigote and amastigoste. We also performed a RT-PCR from total epimastigote RNA, but the result was negative. The second protease was X-PDAPTc, this serine-protease is extensively studied in Lactococcus lactis and it seems to be a factor of virulence in Streptococci. Analysis in databases showed that the distribution of X-PDAPTc is limited and it does not have any orthologs in mammalian. In addition, the enzyme has 677 amino acids with molecular mass of 76.8 kDa. The enzyme was produced in E. coli BL21 Star (DE3) One Shot and purified from the insoluble fraction for production of antibodies in mice. X-PDAPTc is expressed in the epimastigote form of the parasite. The GSTc has an important participation in the biosynthesis of glutathione in order to maintain redox environment of the parasite. The human ortholog shows low homology which may make it a promising target for drug development like the two proteases mentioned above. This enzyme has 535 amino acid residues and a predicted molecular mass of 58.6 kDa. The GSTc was expressed and used for immunization tests.

A importância de áreas científicas, como biologia e biotecnologia na vida humana é cada vez mais reconhecida. Assim, é necessário que professores, actuais e futuros, e investigadores desenvolvam programas de formação/investigação orientados para a compreensão de conteúdos científicos e questionamento da natureza destas áreas e, simultaneamente, para utilizações conscienciosas de conhecimento científico na vida prática. É neste quadro que se insere a investigação realizada e apresentada na presente dissertação. Para responder à questão central:”Como proporcionar formação em biologia e biotecnologia para o mundo contemporâneo a alunos futuros professores de ciências?”, a investigação envolveu dois percursos gerais de trabalho: i) Autoformação em biologia e biotecnologia vegetal numa perspectiva investigativa e ii) Desenvolvimento de percursos investigativos em formação inicial de professores de ciências para o Ensino Básico, envolvendo temáticas actuais relacionadas com biologia e biotecnologia. Globalmente, a investigação baseou-se em três pressupostos: 1º) É oportuno e necessário mobilizar conhecimentos oriundos da investigação científica actual em biologia e biotecnologia para conceber, planear e desenvolver actividades de formação inicial de professores de ciências, 2º) O perfil profissional de professores envolvidos em formação inicial de professores de ciências deve integrar competências científicas, desenvolvidas em trabalho investigativo e 3º). Aos alunos-futuros professores de ciências devem proporcionar-se oportunidades para desenvolverem reflexão epistemológica e trabalho investigativo, para mobilizarem adequadamente conhecimento oriundo de investigação científica actual e desenvolverem competências na tripla perspectiva de educação sobre ciências, pelas ciências e em ciências. A autoformação desenvolveu-se no âmbito de dois projectos em biologia e biotecnologia vegetal, designadamente, Toxicidade do chumbo em alface, onde se testou o efeito do chumbo em alface (Lactuca sativa), e Micropropagação de zimbro, onde se implementaram metodologias de micropropagação/clonagem de uma espécie em risco em Porto Santo, Juniperus Phoenicea. O desenvolvimento de percursos investigativos, com e por alunos-futuros professores de ciências, efectuou-se no âmbito de uma disciplina de um curso de licenciatura em Ciências da Natureza e Matemática para o 2º ciclo do Ensino Básico. Estes percursos compreenderam reflexão epistemológica e o desenvolvimento de trabalho investigativo que envolveu um conjunto de estratégias e recursos, incorporando conteúdos de toxicologia ambiental e de biotecnologia vegetal numa perspectiva de inter-relações ciência, tecnologia e sociedade. Os resultados relativos ao desenvolvimento destes percursos investigativos evidenciaram o interesse e importância de se desenvolverem em temáticas científicas actuais e relevantes para o mundo contemporâneo, como via de autoformação, por um lado, e como estratégia de formação de alunos-futuros professores de ciências, orientada por preocupações de educação para o desenvolvimento sustentável, por outro. Simultaneamente, permitiram que todos os intervenientes, em particular os alunos-futuros professores de ciências, aprofundassem conhecimentos sobre contextos e processos envolvidos em formação em biologia e biotecnologia para o mundo contemporâneo e identificassem implicações para a formação de professores. Permitiram, ainda, apontar sugestões para investigação futura neste domínio. The importance of scientific areas, such as biology and biotechnology, in human life is more and more acknowledged. Therefore it is necessary that today and future teachers, as well as researchers, develop investigation and formation programs built towards the understanding of scientific matters and the questioning of its nature and, simultaneously, towards thoughtful uses of scientific knowledge in everyday's life. It is in this scenario that we can inscribe the research presented in this dissertation thesis. In order to answer the main question: “How can we give future science teachers a proper formation in biology and biotechnology to the contemporary world?”, the research took two general main working and leading ways: i) Self formation in biology and biotechnology from an investigation perspective and ii) Development of ways of research in training of future science teachers for basic education, involving nowadays themes related to biology and biotechnology. On the whole, this research was based in three main ideas: 1st) It is seasonable and necessary to convey Knowledge coming from scientific investigation in biology and biotechnology to design, plan and develop activities to the initial formation of science teachers; 2nd) The professional profile of the teachers involved in the initial formation of science teachers must include scientific skills, developed in research work and 3rd) Opportunities to develop epistemological reflection and research work should be given to the students, future teachers of science, in order they can properly transfer Knowledge coming from update scientific investigation and develop skills in the threefold perspective of the education about science, through science and in science. Self formation was developed through two projects in plant biology and biotechnology, as follows: Lead toxicity in lettuce, where the led effect in lettuce was tested (Lactuca sativa), and Micropropagation of Juniperus, where metodologies of micropropagation and cloning of a species at risk of Porto Santo, Juniperus phoenicea, were performed. The development of ways of research, with and by students, future teachers of science, was done in the course of a college degree in Nature Science and Mathematics, designed to teach young children (from 11 to 12) of the 2nd cycle of school. These ways included epistemological reflection and the development of research work, which involved a cluster of strategies and resources, embodying contents from environmental toxicology and from plant biotechnology in a perspective of interrelationship among science, technology and society. The results related to the development of these research ways showed both the interest and importance of developing update and relevant scientific themes to the contemporary world, as a way of self formation, on the one hand; and as strategy of formation of students, future teachers of science, guided by concerns towards the education to a sustainable future, on the other hand. At the same time, they allowed that all the participants, specially the students, future teachers of science, could deepen their knowledge about contexts and proceedings involved in the formation in biology and biotechnology to the modern world and could identify the implications towards the formation of teachers. They allowed still to point out suggestions to future investigation in this field.

Submitted by Guilherme Lemeszenski (guilherme@nead.unesp.br) on 2013-08-22T18:47:57Z No. of bitstreams: 1 S0100-29452008000400053.pdf: 164116 bytes, checksum: 18edb5e6e2c47ba0095140b1c463f32e (MD5) Made available in DSpace on 2013-08-22T18:47:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 S0100-29452008000400053.pdf: 164116 bytes, checksum: 18edb5e6e2c47ba0095140b1c463f32e (MD5) Previous issue date: 2008-12-01 Made available in DSpace on 2013-09-30T17:57:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0100-29452008000400053.pdf: 164116 bytes, checksum: 18edb5e6e2c47ba0095140b1c463f32e (MD5) S0100-29452008000400053.pdf.txt: 18663 bytes, checksum: 9e52764265871051fbaf7f9295c40160 (MD5) Previous issue date: 2008-12-01 Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T13:16:45Z No. of bitstreams: 2 S0100-29452008000400053.pdf: 164116 bytes, checksum: 18edb5e6e2c47ba0095140b1c463f32e (MD5) S0100-29452008000400053.pdf.txt: 18663 bytes, checksum: 9e52764265871051fbaf7f9295c40160 (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-20T13:16:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0100-29452008000400053.pdf: 164116 bytes, checksum: 18edb5e6e2c47ba0095140b1c463f32e (MD5) S0100-29452008000400053.pdf.txt: 18663 bytes, checksum: 9e52764265871051fbaf7f9295c40160 (MD5) Previous issue date: 2008-12-01 O objetivo do trabalho foi avaliar a influência da época no pegamento da enxertia em abacateiro das variedades Hass e Fortuna, mensalmente, no período de doze meses. As plantas utilizadas pertencem ao Banco de Germoplasma do Departamento de Produção Vegetal da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP, Câmpus de Jaboticabal-SP. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2 x 12 ('Hass' e 'Fortuna' e os períodos de enxertia), no intervalo de março de 2005 a fevereiro de 2006, com 10 unidades por parcela, repetidas por quatro vezes. O método utilizado foi a enxertia por garfagem de topo em fenda cheia. As avaliações, 90 dias após a instalação do experimento, foram quanto à porcentagem de pegamento, desenvolvimento total das combinações (porta-enxerto/ enxerto), número de brotações do enxerto, diâmetros acima, abaixo e no local de união do enxerto. O período mais indicado para o sucesso da enxertia está compreendido entre os meses de novembro e dezembro para ambas as variedades de abacateiro. This work aimed to monthly evaluate the influence of seasons of the year on 'Hass' and 'Fortuna' avocado grafting, during twelve months. Plants from the Active Germplasm Bank of Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal (SP), Brazil were studied. The experimental design used was completely randomized, in a factorial arrangement 2 x 12 ('Hass' and 'Fortuna' and the months) between March 2005 and February 2006, with 10 unities per plat, repeated four times. The evaluations, 90 days after the beginning of the experiment, were realated to the percentage, total development of the combinations (graft-scion), number of buds, diameters above, below and at the grafting. The most indicated season for grafting is, in general, between November and December for both avocado cultivars. Universidade Federal do Piauí (FUFPI) UNESP FCAV UNESP FCAV Depto de Produção Vegetal UNESP FCAV UNESP FCAV Depto de Produção Vegetal

Submitted by Guilherme Lemeszenski (guilherme@nead.unesp.br) on 2013-08-22T18:47:55Z No. of bitstreams: 1 S0100-29452008000300052.pdf: 85301 bytes, checksum: befcfcbf7780b5d0e58658296b1fa059 (MD5) Made available in DSpace on 2013-08-22T18:47:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 S0100-29452008000300052.pdf: 85301 bytes, checksum: befcfcbf7780b5d0e58658296b1fa059 (MD5) Previous issue date: 2008-09-01 Made available in DSpace on 2013-09-30T17:48:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0100-29452008000300052.pdf: 85301 bytes, checksum: befcfcbf7780b5d0e58658296b1fa059 (MD5) S0100-29452008000300052.pdf.txt: 20749 bytes, checksum: fa794fc3e05a48066d123c5d2e17758f (MD5) Previous issue date: 2008-09-01 Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T13:20:02Z No. of bitstreams: 2 S0100-29452008000300052.pdf: 85301 bytes, checksum: befcfcbf7780b5d0e58658296b1fa059 (MD5) S0100-29452008000300052.pdf.txt: 20749 bytes, checksum: fa794fc3e05a48066d123c5d2e17758f (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-20T13:20:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0100-29452008000300052.pdf: 85301 bytes, checksum: befcfcbf7780b5d0e58658296b1fa059 (MD5) S0100-29452008000300052.pdf.txt: 20749 bytes, checksum: fa794fc3e05a48066d123c5d2e17758f (MD5) Previous issue date: 2008-09-01 Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar os melhores métodos e épocas de realização da enxertia, sobre o pegamento de enxertos de aroeira-pimenteira (Schinus terebinthifolius Raddi). Foram conduzidos dois experimentos, instalados na Faculdade de Ciências Agronômicas, da Universidade Estadual Paulista - Câmpus de Botucatu-SP, nos períodos de 16 de dezembro de 2005 a 30 de janeiro 2006 e de 03 de junho a 17 de julho de 2006. O delineamento utilizado foi de blocos casualizados, com cinco tratamentos, três repetições cada e dez plantas por parcela. Os tratamentos foram: garfagem no topo em fenda cheia, inglês simples, inglês complicado; borbulhia em T normal e T invertido. As diferentes épocas do ano alteraram o índice de pegamento, o que restringe o período de coleta de garfos. A maior porcentagem de pegamento ocorreu no mês de dezembro, com a enxertia em fenda cheia (40%). No mês de junho, não houve pegamento significativo, mostrando então que o mês de dezembro é o mês ideal, entre os estudados, para a realização da enxertia em aroeira. As garfagens em geral foram superiores à borbulhia. Houve baixo índice de pegamento, quando não foi nulo, e, além disso, suas borbulhas não apresentaram brotos dentro de 45 dias. A maior porcentagem de plantas com brotos, aos 45 dias, foi pelo método inglês simples, com 92%. The research was carried out aiming to evaluate the best grafting procedure and period for grafting healing of Brazilian Peppertree (Schinus terebinthifolius Raddi). Two experiments were set up at School of Agronomical Science (FCA) of São Paulo State University - UNESP - Botucatu, São Paulo State, Brazil, through the periods from December 16th, 2005 to January 30th, 2006 and from June 3rd to July 17th, 2006. The experimental design used was the randomized blocks with five treatments, three replications, and ten plants per plot. The treatments were: cleft grafting, splice grafting, whip grafting, normal T-budding, and inverted T-budding. The index of healing is different depending upon the time of the year which limited the period of scion harvest. The highest percentage of healing occurred in December, by cleft grafting (40%). In July there was no significant healing showing that December is the ideal epoch for grafting in Brazilian pepper tree. In general, the grafting was better than budding. There was a low index of healing on budding, when it was not null, and there were not presence of sprouts during the first 45 days. The highest percentage of plants with sprouts, in 45 days, was by the splice grafting procedure (92%). UNESP Faculdade de Ciências Agronômicas UNESP Faculdade de Ciências Agronômicas Departamento de Produção Vegetal UNESP Faculdade de Ciências Agronômicas Departamento de Recursos Naturais UNESP Faculdade de Ciências Agronômicas UNESP Faculdade de Ciências Agronômicas Departamento de Produção Vegetal UNESP Faculdade de Ciências Agronômicas Departamento de Recursos Naturais

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-08-14Bitstream added on 2014-06-13T20:35:46Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_ap_me_jabo.pdf: 460448 bytes, checksum: eeb8cefed995b5624ebdb1b544ded04b (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) A glicoproteína de superfície (8) do vírus da bronquite infecciosa (VBI) em aves; é um alvo antigênico importante para a indução de imunidade e como antígeno utilizado no imunodiagnóstico da infecção causada por este vírus. Nesse estudo, a forma recombinante da subunidade 81 da glicoproteína 8 da estirpe M41 do VBI foi clonada e expressa como proteína de fusão contendo uma cauda de poli-histidina e o epítopo V-5 em células da levedura Saccharomyces cerevisiae. O gene codificador dessa proteína foi amplificado a partir do RNA genômico da estirpe M41 do VBI, por meio das técnicas da reação de transcrição reversa (RT) e da reação da polimerase em cadeia (PCR). Foi amplificada toda a seqüência codificadora de interesse e fossem geradas extremidades compatíveis com a inserção no vetor pYE82.1N5-His-TOPO. Este vetor foi usado na transformação de leveduras, tendo sido obtidos os clones transformantes específicos portadores do inserto gênico. A expressão da proteína de fusão foi então induzida, em células de S. cerevisiae, sendo produzida a proteína recombinante 81 de fusão com peso molecular 95 kDa. Essa proteína apresentou com uma elevada reatividade cruzada para a proteína 8 do próprio vírus, tal como demonstraram os resultados das análises pelo Western blotting e ELl8A. Essa proteína de fusão foi, devido à presença da cauda de poli¬histidina, prontamente purificada por cromatografia de afinidade em coluna de níquel ¬agarose e, posteriormente utilizada com sucesso no desenvolvimento de um método indireto de ELl8A para a detecção de anticorpos específicos de galinhas infectadas com o VBI. The surface glycoprotein of infectious bronchitis virus (IBV) is a important antigenic target for the induction of immunity and as antigen in the immunodiagnosis of infection caused by this virus. In this study, the gene of 51 glycoprotein of M41 strain of the IBV was cloned and expressed as a fusion protein containing a poly-histidine and epitope V-5 tags in the yeast cells of Saccharomyces cerevisiae. The 51 gene was amplified from genomic RNA of the M41 strain of VBI, by reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR). The entire coding sequence of 51 gene was amplified and inserted in the vector pYE52.1N5-His-TOPO. This construct was used for transforming yeast cells, and to obtain specific clones carrying the inserted gene. The expression of the fusion protein was induced in transformed cells of S. cerevisiae, and a recombinant 51 protein was produced with a molecular weight of 95 kDa. A high cross¬reactivity with the original 51 protein from the virus was detected by Western blotting and ELl5A. The presence of the poly-histidine tail in the fusion recombinant protein favored their prompt purification by affinity chromatography in a column of nickel¬sepharose. This recombinant 51 protein was successfully used in the development of an indirect method of ELl5A for the detection of specific anti-IBV antibodies in chickens experimentally infected or vaccinated with this virus.

Entomopathogenic fungus Verticillium lecanii is a promising whitefly and aphid control agent. Chitinases secreted by this insect pathogen have considerable importance in the biological control of some insect pests. An endochitinase gene Vlchit1 from the fungus was cloned and overexpressed in Escherichia coli. The Vlchit1 gene not only contains an open reading frame (ORF) which encodes a protein of 423 amino acids (aa), but also is interrupted by three short introns. A homology modelling of Vlchit1 protein showed that the chitinase Vlchit1 has a (α/β)8 TIM barrel structure. Overexpression test and Enzymatic activity assay indicated that the Vlchit1 is a functional enzyme that can hydrolyze the chitin substrate, so the Vlchit1 gene can service as a useful gene source for genetic manipulation leading to strain improvement of entomopathogenic fungi or constructing new transgenic plants with resistance to various fungal and insects pests. O fungo entomopatogênico Verticillium lecanii é um agente promissor no controle da mosca-branca e do pulgão. As quitinases secretadas por esse patógeno de insetos têm uma grande importância no controle biológico de doenças causadas por insetos. Um gene de endoquitinase Vlchit1 desse fungo foi clonado e expresso em Escherichia coli. O gene Vlchit contém não apenas um ORF que codifica uma proteína de 423 aminoácidos, mas também é interrompido por três pequenos introns. A modelagem de homologia da proteína Vlchit1indicou que a quitinase Vlchit1 tem uma estrutura (α/β) 8 TIM barrel. Testes de expressão e de atividade enzimática indicaram que Vlchit1 é uma enzima funcional que hidroliza quitina, portanto o gene Vlchit pode ser um gene útil para manipulação genética para melhoramento de cepas de fungos entomopatogênicos ou para a construção de novas plantas transgênicas com resistência a várias doenças causadas por fungos e insetos.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-24Bitstream added on 2014-06-13T18:06:52Z : No. of bitstreams: 1 nakaghi_ach_dr_jabo.pdf: 627442 bytes, checksum: 53f339a01b25f98c06e48eed8f59cc13 (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O presente estudo objetivou clonar e analisar a expressão do gene p28 da amostra Jaboticabal de Ehrlichia canis e avaliar sua utilização no diagnóstico molecular e sorológico da erliquiose canina. A PCR, baseada no gene p28 de E. canis, foi capaz de detectar o DNA de um único parasita entre um bilhão de células. Amostras sangüíneas de cães com suspeita clínica de erliquiose foram testadas pela PCR, baseada no gene p28 e pela nested PCR para detecção do gene 16S rRNA. O fragmento amplificado do gene p28 foi observado em 51,25% (n=41) das 80 amostras examinadas, e todas elas foram positivas para o gene 16S rRNA de E. canis, entretanto, em outros 21,25% (n=17) das amostras apenas o gene 16S rRNA foi detectado. A caracterização molecular do gene p28 mostrou similaridade com outras amostras de E. canis. Para a expressão da proteína recombinante P28, foram testados dois sistemas diferentes com linhagens de Escherichia coli BL21(DE3), BL21 Star(DE3)pLysS, BL21(DE3) pLysS e BL21-CodonPlus(DE3)-RIL. A análise pelo Western-blotting revelou reatividade de várias frações protéicas com anticorpo policlonal anti-E. canis. Porém, quando a membrana foi incubada com anticorpo monoclonal para detecção de moléculas de histidina, não houve reatividade, mostrando a ausência de expressão da proteína P28. The aim of this study was to clone and express the p28 gene of Ehrlichia canis Jaboticabal strain and evaluate its application in molecular and serological diagnosis of canine ehrlichiosis. The p28-based PCR was able to detect E. canis DNA of one parasite among one billion cells. Blood samples from dogs for which a diagnosis of canine ehrlichiosis was suspected were tested by p28-based PCR and by 16S rRNA-based nested PCR. Amplified fragment from p28 gene were observed in 51.25% (n=41) among 80 assayed samples and all of this positive samples were also positives for 16S rRNA gene of E. canis, however in 21.25% (n=17) only 16S rRNA gene was detected. The molecular characterization of p28 gene showed similarity with others strains of E. canis. Expression of P28 recombinant protein was tested with two different systems and in Escherichia coli BL21(DE3), BL21 Star(DE3)pLysS, BL21(DE3) pLysS and BL21-CodonPlus(DE3)-RIL strains. After expression induction, Westernblotting showed reactivity of some protein fractions against anti-E. canis antibodies. However, when samples were incubated with anti-histidine monoclonal antibodies, they did not react, demonstrating non-expression of P28 protein.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. α-Amilases têm aplicações nas indústrias de processamento do amido, produção de álcool, têxtil e outras. Na busca por fontes de amilases na biodiversidade do cerrado, uma levedura foi isolada e classificada como Cryptococcus flavus. Embora esta levedura seja capaz de metabolizar amido, ela não pode ser usada na indústria por não possuir status GRAS. Por outro lado, S. cerevisiae, amplamente utilizada na indústria de etanol, não é capaz de degradar amido para produzir açúcares fermentescíveis, sendo necessária a clonagem e expressão heteróloga de enzimas amilolíticas nesse microrganismo. Neste trabalho, o gene da amilase de C. flavus (AMY1) codificando uma amilase extracelular foi clonado e expresso com sucesso em S. cerevisiae. A seqüência de nucleotídeos do cDNA revelou uma ORF de 1896 pb codificando uma cadeia polipeptídica de 631 aminoácidos apresentando uma homologia (97%) com a amilase da levedura Cryptococcus sp S-2. A presença das quatro regiões conservadas, (I) 144DVVVNH149, (II) 235GLRIDSLQQ243, (III) 263GEVFN267 e (IV) 327FLENQD332 classificou essa enzima na família 13 das glicosil hidrolases (G13). A cinética de produção da amilase recombinante alcançou a atividade amilolítica máxima (3,93 U/mL) em 60 horas de cultivo. A proteína recombinante apresentou uma massa molecular similar a amilase nativa (~ 67 kDa), parte devido à N-glicosilação. Além disso, a amilase recombinante foi caracterizada bioquimicamente apresentando um pH ótimo de 5,5, temperatura ótima de 60 °C e Km= 0,37 mg/mL para o amido. Com o objetivo de desenvolver uma cepa de S. cerevisiae capaz de degradar o amido de forma mais eficiente, o gene da glicoamilase de Aspergillus awamori foi clonado no vetor YEp352-PGK para co-expressão com o gene da amilase de C. flavus, clonado previamente no vetor YEp351-PGK. O clone de S. cerevisiae expressando as duas enzimas foi capaz de crescer em meio contendo amido como única fonte de carbono. Dados preliminares de fermentação em frasco mostraram que esse clone é capaz de produzir 116 g de ethanol/L durante 120 horas de cultivo. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT α-Amylases have applications in starch processing, alcohol production, textile and others industries. On screening for amylolytic yeasts in the Brazilian Cearrado, a yeast was isolated and classified as Cryptococcus flavus. Although C. flavus is able to metabolize starch, it cannot be used in industry because it does not possess GRAS status. On the other hand, S. cerevisiae, which is widely used in ethanol industry, cannot degrade starch to fermentable sugars, requiring for that the cloning and heterologous expression of amylolytic enzymes from other microrganisms. In this work, a C. flavus α-amylase gene (AMY1) encoding an extracelullar α-amylase has been cloned and successfully expressed in S. cerevisiae. The nucleotide sequence of the cDNA revealed an ORF of 1896 pb coding for a 631 amino acid polypeptide with high identity (97%) to a homologous protein isolated from Cryptococcus sp S-2. The presence of four conserved regions, (I) 144DVVVNH149, (II) 235GLRIDSLQQ243, (III) 263GEVFN267 and (IV) 327FLENQD332, places the enzyme in the GH13 α-amylase family. The assessment of the time course of amylase secretion in S. cerevisiae revealed a maximal extracellular amylolytic activity (3.93 U/mL) at 60 hours of incubation. The recombinant protein had an apparent molecular mass similar to the native enzyme (~67 kDa), part of which was due to N-glycosylation. On further characterization it was found that the recombinant amylase has optimal activity on pH 5.5 at 60 °C. Its for starch is Km= 0.37 mg/mL . In order to develop a S. cerevisiae strain able to degrade starch more efficiently, the Aspergillus awamori glucoamylase gene was cloned into the YEp352-PGK vector with a view to co-expression with the C. flavus α-amylase gene, previously cloned into YEp351-PGK. This new strain expressing both enzymes was able to grow in medium containg starch as sole carbon source. Preliminary data of flask fermentation suggest that this strain is able to produce 116g ethanol/L in 120 h of incubation.

Pouco se conhece a respeito da propagação vegetativa da erva-mate, principalmente em relação à miniestaquia e aos aspectos relacionados ao ambiente de enraizamento. O estudo objetivou avaliar o efeito do ambiente inicial de enraizamento sobre a sobrevivência, vigor da parte aérea e enraizamento de miniestacas da espécie. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado em arranjo fatorial (3x2), sendo três clones (A7, A21 e A35) e dois ambientes de enraizamento (casa-de-vegetação simples, sem controle de temperatura e umidade e casa-de-vegetação automatizada). A sobrevivência das miniestacas na saída das casas de enraizamento e na casa-de-sombra não foram influenciadas pelo ambiente testado, com variação de 51,8 % a 71,9 %. Os clones A7 e A21 não diferiram significativamente quanto ao enraizamento, com médias de 49,1 % e 46,4 %, respectivamente. Contudo, o clone A35 mostrou-se superior quando proveniente da casa-de-vegetação automatizada, com 62,5 % de enraizamento. A casa-de-vegetação automatizada favoreceu tanto o número de folhas quanto o número e comprimento das brotações emitidas. A miniestaquia de erva-mate pode ser considerada tecnicamente viável em ambos os ambientes de enraizamento testados, apresentando resultados semelhantes.

Orientador : Marco Aurélio Krieger Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 18/07/2008 Inclui bibliografia Em Trypanosoma cruzi, as informações provenientes do projeto genoma, o grande número de proteínas hipotéticas, as limitações da expressão protéica heteróloga em bactérias e a baixa quantidade de genes caracterizados constituem o cenário atual deste organismo. Esses fatores demonstram a necessidade da obtenção de ferramentas que permitam a caracterização em larga escala de genes deste organismo. Entre estas ferramentas, estão os vetores para expressão de proteínas em tripanossomatídeos, que, através da genética reversa, combinada com eficiência, plasticidade e compatibilidade permitem a caracterização de genes de forma rápida. Diante desta necessidade, foram construídos vetores para expressão de proteínas em Trypanosoma cruzi e Crithidia fasciculata que permitem a rápida clonagem de genes através do sistema Gateway® (Invitrogen). As construções para T. cruzi possuem a região 35.1 como intergênica, além de diferentes etiquetas (hexâmero de histidinas, c-myc, GFP, CFP, YFP e TAP), promotores (ribossomal de T. cruzi Dm28c e do bacteriófago T7) e resistências a antibióticos (higromicina e G418), permitindo a caracterização de genes por diversas abordagens. Além disso, a utilização de C. fasciculata como sistema de expressão protéica heteróloga tem como vantagens a sua proximidade evolutiva com T. cruzi e o fato de não parasitar seres humanos. Tal sistema é baseado nos vetores pNUS, com a adição do promotor do bacteriófago T7 e região operadora de tetraciclina. A validação desta plataforma foi realizada com 3 genes de T. cruzi, utilizando anticorpos contra as proteínas recombinantes para a confirmação da expressão, localização e obtenção de complexos protéicos. Os resultados obtidos demonstraram a funcionalidade e plasticidade dos vetores gerados, tornando factíveis as caracterizações gênicas em larga escala. The availability of the Trypanosoma cruzi genome is only a small piece of the puzzle of this parasite’s biology. A high percentage of hypothetical proteins, few genes characterized and limitations on heterologous protein expression are the present scenario for this biological model. Thus, the need for development of a highthroughput gene characterization platform becomes evident. Ideally, such platform should allow efficient cloning and disponibility of different applications. In this context, the goal of this study was to use the GatewayÒ technology (Invitrogen) to construct plasmid vectors suitable for different uses. Our constructs contained 35.1 intergenic regions, T. cruzi Dm28c 18S ribosome or the T7 bacteriophage promoters, antibiotic resistance genes, and several tags for multiple purposes. Besides T. cruzi vectors, a Crithidia fasciculata heterologous protein expression system was created based on pNUS-H1 and modified for use of the bacteriophage T7 RNA polymerase. The advantages of the C. fasciculata system are that it is related to T. cruzi but it is not pathogenic for humans. Three T. cruzi genes were used to validate our strategy. Antibodies against the products of these genes were used to detect the presence of the recombinant proteins in T. cruzi and C. fasciculata extracts, and to compare the localization of the native proteins with that of the recombinant proteins tagged with cmyc epitope or fluorescent proteins GFP, CFP and YFP in T. cruzi. The results obtained with these antibodies corroborated the results obtained with our system. TAP tag protein complex purification was also used for strategy validation. Our results show that this platform is a fast and efficient cloning system that allows the characterization of Trypanosoma cruzi genes by different biological approaches. The development of this high-throughput platform is a step further to large scale applications such as the T. cruzi ORFeome.

Mestrado em Microbiologia Botryosphaeria é um género bem conhecido devido às espécies que causam doenças numa grande diversidade de plantas economicamente importantes. Este género é actualmente composto de duas espécies, Botryosphaeria dothidea e Botryosphaeria corticis. A parede celular é essencial à sobrevivência dos fungos, fornecendo protecção contra danos mecânicos e resistência à pressão interna. Dada à sua importância vital e natureza química, é alvo para acção de drogas antifúngicas. Como em todos os fungos, a quitina também faz parte da constituição da parede celular do género em estudo, sendo um polímero estrutural importante para a manutenção da forma e rigidez da parede, bem como na formação de septos. Vários genes que codificam diferentes isoformas de sintetases da quitina fúngicas foram já clonados e caracterizados. A partir de DNA genómico de B. dothidea CBS115476 e B. corticis CBS119047 foram amplificados, por PCR, fragmentos de genes de sintetase da quitina os quais foram, posteriormente, clonados e sequenciados. A análise das sequências nucleotídicas e sequências de aminoácidos deduzidas dos 17 clones revelou a existência de três classes distintas de CHS (I, II e III). A análise filogenética dessas sequências permitiu estabelecer algumas relações filogenéticas entre espécies de Botryosphaeria e outros fungos registados no GenBank. Em todas as análises filogenéticas verificou-se que as duas espécies de Botryosphaeria agrupam num ramo distinto. A análise de sequências de CHS de classe II e III permitiu ainda uma distinção entre as espécies B. dothidea e B. corticis, revelando potencial como marcadores filogenéticos ao nível da espécie. As sequências de CHS classe I não permitiram uma distinção clara entre ambas as espécies. Por hibridação pretendeu-se detectar fragmentos homólogos ao gene de sintetase da quitina em quatro estirpes de Botryosphaeria, sendo as sondas 3 clones sequenciados anteriormente, cada um pertencente a uma classe de sintetase da quitina (I, II e III). Após hibridação, foram detectados fragmentos HindIII em todas as estirpes testadas, para as três classes de sondas. Tal facto indica a presença de sequências homólogas do gene que codifica para a sintetase da quitina nos genomas das quatro estirpes. A detecção de um só fragmento por cada uma das classes sugere que estes genes são de cópia única. No entanto, a sequenciação de diversos clones revelou a existência de variantes moleculares em duas das classes. ABSTRACT: The genus Botryosphaeria is well known by the species that cause disease in a wide range of plant hosts economically important. This genus is currently composed of two species, Botryosphaeria dothidea and Botryosphaeria corticis. Integrity of cell walls is essential to survival of fungi, providing protection against mechanical damage and resistance to internal pressure. Because of the vital importance and chemical nature of fungal walls, they represent a target for the action of antifungal drugs. Chitin is a basic structural polymer, important for maintenance of cell form and walls rigidity, and to the formation of septa. Several genes coding specific chitin synthase isoforms have been cloned and characterized. From B. dothidea CBS115476 and B. corticis CBS119047 genomic DNA we amplified by PCR chitin synthase gene fragments, which were then cloned and sequenced. Analysis of the nucleotide and deduced amino acid sequences of 17 clones revealed three distinct classes of CHS (I, II and III). Phylogenetic analysis of these sequences allowed the establishment of phylogenetic relationships between species of Botryosphaeria and other fungi registered in the GenBank. In all phylogenetic analysis it was shown that the two species of Botryosphaeria grouped in a separate clade. Analysis of the CHS sequences from classes II and III allowed a distinction between the species B. dothidea and B. corticis, showing potential as a phylogenetic markers at the species level. The chitin synthase sequences from classe I did not allow a clear distinction between the two species. In hybridization experiments and using as probes three clones that were previously sequenced, each belonging to a distinct class of chitin synthase (I, II and III), chitin synthase gene fragments were detected in four Botryosphaeria strains. After hybridization, HindIII fragments were detected in all strains tested, for the three classes of probes. This indicates the presence of the gene sequences that encode chitin synthases in the four strains. The detection of a single fragment for each of the classes suggests that these genes are the single copy genes. However, the sequencing of multiple clones revealed the existence of molecular variants in two of the classes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. Condylorrhiza vestigialis multiple nucleopolyhedrovirus (CvMNPV) é um baculovirus patogênico a lagartas de Condylorrhiza vestigialis (Guenée, 1854) (Lepidoptera: Crambidae), uma praga de uma espécie florestal, conhecida como Álamo (Populus spp., Salicaceae), de considerável importância econômica. Este baculovirus foi recentemente identificado e pouca informação pertinente à sua taxonomia tem sido relatada. No estudo apresentado, o gene p74 de CvMNPV foi identificado, seqüenciado, e sua relação filogenética com outros baculovirus estimada. O gene p74 codifica uma proteína altamente conservada e é essencial para a infectividade do ODV. A detecção do gene p74 de CvMNPV foi feita usando hibridização Southern blot dos produtos do DNA genômico clivados com as enzimas de restrição HindIII, PstI e EcoRI com uma sonda radioativa de DNA obtida a partir da amplificação parcial do gene p74 por PCR. Dois fragmentos de restrição e um produto de PCR da região terminal do gene p74 foram clonados nos plasmídeos pBluescript II KS+ (Stratagene) e pGEM-T Easy (Promega), respectivamente. Utilizando-se ferramentas de bioinformática, a análise dos resultados do sequenciamento nucleotídico possibilitou a identificação da ORF p74 de 1935 pb (nº de acesso EU919397 no GenBank/EMBL) que codifica potencialmente um polipeptídeo de 644 aminoácidos de 73,6133 kDa e ponto isoelétrico de 5,1. O alinhamento da seqüência de aminoácidos P74 deduzida de CvMNPV com homólogas de baculovirus revelou a presença de quatro domínios conservados: dois domínios P74 relacionados à infectividade oral e dois domínios transmembrânicos na região Cterminal. Os domínios P74 hipoteticamente estão expostos na surperfície do envelope e interagem com receptores específicos na membrana plasmática da célula hospedeira. Os domínios transmembrânicos são responsáveis pela inserção da proteína na membrana do envelope do ODV. A seqüência de aminoácidos P74 deduzida de CvMNPV potencialmente sofre modificações pós-traducionais do tipo glicosilação, fosforilação e miristilação e apresenta como estrutura secundária predominante a α–hélice. A análise filogenética baseada na seqüência nucleotídica do gene p74 de CvMNPV e na sua seqüência de aminoácidos deduzida manteve a divisão da família Baculoviridae nos quatro grupos descritos em estudos similares (NPV específicos de lepidópteros, GV específicos de lepidópteros, NPV específicos de himenópteros e NPV específicos de dípteros) e forneceu dados consistentes para confirmar que o CvMNPV pertence ao Grupo I dos NPV, e que o CvMNPV é mais proximamente relacionado com Choristoneura fumiferana defective NPV. Estes resultados constituem uma importante contribuição para a caracterização deste novo vírus (CvMNPV), o qual possui grande potencial para o controle biológico de lagartas Condylorrhiza vestigialis. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT Condylorrhiza vestigialis multiple nucleopolyhedrovirus (CvMNPV) is a baculovirus pathogenic to Condylorrhiza vestigialis caterpillars (Guenée, 1854) (Lepidoptera: Crambidae), a pest of a forest species known as Poplar (Populus spp., Salicaceae) of considerable economic importance. This baculovirus was recently identified and few informations pertaining to its taxonomy has been reported. In the present study, the p74 gene from CvMNPV was identified, sequenced and its phylogenetic relationship with other baculoviruses estimated. The gene p74 encodes a protein that is highly conserved among all sequenced baculoviruses and is essential for ODV infectivity. The detection of CvMNPV p74 gene was done using Southern blot hybridization from genomic DNA digested with the restriction endonucleases HindIII, PstI, EcoRI and a radioactive DNA probe resulting from partial amplification of the p74 gene by PCR. Two DNA restriction fragments and a PCR product from terminal region of p74 gene were cloned in pBluescript II KS+ (Stratagene) and pGEM-T Easy (Promega) plasmids respectively. By using bioinformatics tools, the nucleotidic sequence analysis possibilited the identification of the p74 ORF of 1935bp (GenBank/EMBL accession number EU919397) that potentially encodes a polypeptide of 644 amino acids with predicted molecular mass of 73.6133 kDa and an isoelectric point of 5.12. The alignment of the CvMNPV P74 deduced amino acid sequence with other homologous baculoviruses revealed the presence of four conserved domains: two P74 domains related to oral infectivity and two transmembrane domains in the C-terminal region. The P74 domains are hypothetically exposed outside of ODV envelopes and attach with specific receptors present in the host cell plasma membrane. The transmembrane domains are responsible by anchored within of ODV envelope. The CvMNPV deduced amino acid sequence potentially undergoes post-translational modifications as glycosylation, phosphorylation and myristoylation and present α-helix as secundary structure. Phylogenetic analysis based on the CvMNPVp74 deduced amino acid and nucleotide sequences maintained the division of the Baculoviridae family in the four groups described in similar studies (lepidopteran-specific NPV, lepidopteran-specific GV, hymenopteran-specific NPV and dipteran-specific NPV) and provided consistent data to affirm that the CvMNPV baculovirus belongs to the lepidopteran NPV Group I, and that the CvMNPV is most closely related with Choristoneura fumiferana defective NPV (CfDEFNPV). These results constitute an important contribution to characterization of this new virus (CvMNPV) which has a high potential for biological control of Condylorrhiza vestigialis caterpillars.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-12-19Bitstream added on 2014-06-13T18:41:11Z : No. of bitstreams: 1 silva_gp_dr_rcla.pdf: 1260750 bytes, checksum: f19ff28f2ada22b250d02543a6ad96ca (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Hialuronidases pertencem a um grupo de enzimas hidrolíticas, as quais degradam o ácido hialurônico, um polissacarídeo de alta massa molecular, encontrado em todos os tecidos de mamíferos e fluídos corpóreos. O ácido hialurônico é um componente da matriz extracelular de vertebrados, que preenche os espaços entre células e fibras, e age como lubrificante, bem como uma barreira à penetração de partículas estranhas. Os níveis de ácido hialurônico são marcadamente aumentados durante a embriogênese, inflamação, transformação maligna e em qualquer lugar que seja requerido a rápida substituição de tecido e remodelamento. Os defeitos no metabolismo do ácido hialurônico parecem relacionar-se a várias doenças sugerindo que o seu nível seja altamente controlado. No entanto, surpreendentemente, o estudo de enzimas envolvidas na síntese e degradação do ácido hialurônico tem sido negligenciado. Em venenos de insetos Hymenoptera (abelhas, formigas e vespas), a hialuronidase é uma enzima comum e um dos mais importantes alérgenos, sendo também, o único em potencial, que pode promover reatividade-cruzada entre os venenos de abelhas e vespas, como também entre os de diferentes gêneros e espécies de vespídeos, levando à produção de reações alérgicas mediadas por IgE, umas das maiores causas de anafilaxia em pacientes alérgicos ao veneno. Neste trabalho, através da metodologia de RACE-PCR, foi determinada e caracterizada, a seqüência completa de cDNA do alérgeno - hialuronidase - do veneno da vespa urbana Polybia paulista, a qual, é bastante agressiva e abundante no Estado de São Paulo, sendo responsável por muitos acidentes de importância médica, devido ao seu veneno que, assim como em outros vespídeos, apresenta três conhecidos alérgenos - hialuronidase, fosfolipase e antígeno 5. O cDNA foi obtido a partir do mRNA extraído dos abdomens dos insetos e amplificado por iniciadores gene-específicos.... Hyaluronidases are a group of hydrolytic enzymes which degrade Hyaluronic acid (HA), the most abundant glycocaminoglycan of vertebrate extracellular space. HA is a high molecular weight polysaccharide found in virtually all mammalian tissues and body fluids, where it fills the space between cells and fibers and acts as a lubrificant as well as a barrier to penetration by foreign particles. Hyaluronic acid levels are markedly increased during the embryogenesis, inflammation, malignant transformation and whenever fast tissue turnover and remodeling is required. Defects in HA metabolism appear to be related to various diseases suggesting that the level of HA must be tightly controlled. Surprisingly, the study of the enzymes involved in HA synthesis and degradation has been greatly neglected. In venoms of Hymenoptera insects (bees, ants and wasps), the hyaluronidase is a common enzyme and one of the most important allergen, being potentially the unique that are able to promote immunological cross-reactivity between venoms from bees and wasps, and also among vespid venoms from different genus and species, producing allergic reactions IgE-mediated, one of the main causes of anaphylaxis in venom-allergic patients. In this work, by the RACE-PCR methodology, the hyaluronidase cDNA complete sequence from the urban wasp Polybia paulista was determined and characterized. This wasp is very aggressive and abundant in the São Paulo state, being responsible for many accidents of medical importance due its venom, which contains, like other vespids, three well known allergens- hyaluronidase, phospholipase and antigen 5. The cDNA was obtained from mRNA extracted from insect abdomens and amplified by gene-specific primers. At first, two consecutive sequences of about 800 and 600 bp were obtained, purified, cloned and sequenced. After, the hyaluronidase cDNA complete sequence of 991pb was obtained, purified and directly sequenced The resulting data were analyzed .

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico O objetivo deste estudo for desenvolver procedimentos para quantificar o volume de árvores e para estratificar as florestas, visando a classificação da capacidade produtiva e a modelagem do crescimento e da produção de plantios clonais de eucalipto não-desbastados. Para quantificar o volume de árvores foram utilizados dados de 2.036 árvores de clones comerciais de eucalipto pertencentes à empresa CAF Santa Bárbara, tendo sido ajustadas equações de volume para cada estrato (clone e região). Para cada árvore foi ajustado um modelo de taper. Posteriormente, foram realizados abates de três árvores de clones novos, que não possuíam equação de volume específica, sendo uma árvore pequena , uma média e uma grande em termos de dap e altura total. Com as três árvores cubadas foi ajustado o modelo de taper. De posse das estimativas dos parâmetros foi calculada uma medida de similaridade com os parâmetros dos modelos ajustados para as 2.036 árvores dos clones comerciais. A árvore do clone comercial que apresentou o menor valor de distância euclidiana, quando comparada com o clone novo, foi considerada a mais similar, portanto a equação de volume desse clone comercial foi usada para estimar o volume de árvores do novo clone. Este procedimento foi denominado método da similaridade de perfis. Para estratificação da floresta para fins de capacidade produtiva e modelagem do crescimento e da produção, foram utilizados dados de uma empresa do Estado da Bahia. O procedimento foi agrupar clones com características semelhantes em termos de crescimento em: volume, área basal, altura dominante e diâmetro médio, utilizando o método de agrupamento de Tocher, com a finalidade de obter estimativas de índice de local por grupos de clones. O procedimento mostrou-se eficiente e evidenciou a necessidade de estratificar florestas de eucalipto para estudos de capacidade produtiva. O estudo do crescimento e da produção mostrou −1 que o modelo V2 = V1 + β0 ⎛1 + β1e−β2I2 ⎞ − β0 ⎛1 + β1e−β2I1 ⎞ ⎜ ⎜ ⎟ ⎟ ⎝ ⎠ ⎝ −1 ⎠ ajustado por estrato de modelagem foi mais eficiente do que o modelo de Clutter, para fins de prognose de estoques volumétricos. Foi possível concluir que estimativas de crescimento e produção para clones que possuam menos de três medições podem ser realizadas por meio de modelos específicos por estrato ou de um modelo geral, porém esta decisão deve ser avaliada pelo modelador e pelo usuário. Para estudos de modelagem do crescimento e da produção é necessário grande interação entre modelador e usuário, para que se tenham estimativas volumétricas precisas e livres de tendência. The objective of this study was to develop procedures to quantify the volume of trees and stratify forests aiming to classify the productive capacity and growth and yield modeling of clonal plantings of non-thinned eucalyptus. To quantify tree volume data from 2.036 trees from commercial eucalyptus clones were used, owned by CAF Santa Bárbara Company, with volume equations being adjusted for each stratum (clone and region). For each tree, a taper model was adjusted. Three trees from new clones without specific volume equation were then felled, classified as small , medium and large in terms of dap and total height. The taper model was adjusted to the three cubed trees. Based on the parameter estimates, a measurement of similarity with the parameters of the adjusted models was calculated for the 2.036 commercial clone trees. The commercial clone tree presenting the lowest Euclidian distance value when compared with the new clone was considered the most similar, thus the volume equation of this clone was used to estimate the tree volume of the new clone. This procedure was denominated profile similarity method. For forest stratification for purposes of productive capacity and growth and yield modeling, data from a company in the state of Bahia were used. The procedure consisted of grouping clones with similar traits in terms of growth in volume, basal area, dominant height, and mean diameter, applying the Tocher grouping method to obtain site index estimates per groups of clones. The procedure was found to be efficient, evidencing the need to stratify eucalyptus forests for yielding capacity studies. The growth and yield ⎛ −β I ⎞ V2 = V1 + β0 ⎜1 + β1e 2 2 ⎟ ⎝ ⎠ study −1 showed ⎛ −β I ⎞ − β0 ⎜1 + β1e 2 1 ⎟ ⎝ ⎠ −1 that the model adjusted by modeling stratum was more efficient than the Clutter model, for purposes of volumetric stocking prognosis. It could be concluded that growth and yield estimates for clones with less than three measurements can be carried out by means of specific models by stratum or applying a general model. However, this decision must be evaluated by the modeling agent and by the user. For growth and yield modeling studies, a great interaction between modeling agent and user is necessary to obtain precise and bias-free volumetric estimates.

Este artigo apresenta as posições sobre a clonagem do biofísico e filósofo espinosista Henri Atlan, descritas nos diferentes registros das 'racionalidades científica e mítica' - categorias estruturantes do pensamento desse autor, nas fronteiras entre ciências naturais, ciências humanas e ética. Se, do primeiro ponto de vista, a clonagem, uma vez circunscrita a suas possibilidades efetivas de ocorrência, prenuncia aplicações propícias à saúde e ao bem-estar humanos, é sob a égide do segundo que surgem interpretações simbólicas dúbias e, freqüentemente, assustadoras. Além de expor a gênese mítica desses equívocos, Atlan - em conformidade com sua linhagem não-dicotômica e otimista espinosista - posiciona-se a favor do progresso científico ao qual seria paralelo o aumento da condição humana de compreensão mais ampla de sua 'origem e destino'. This article sets out the positions held on cloning by the contemporary French Spinozist philosopher and biophysicist, Henri Atlan, described in the different records of Atlan's "scientific and mythical rationales", which are categories that structure the thinking of this author, crossing boundaries between the natural, human and social sciences and ethics. Having set out the actual possibility of cloning taking place, if from the first perspective one can initially foretell applications that will foster human health and welfare, it is from the second that ambivalent and often alarming symbolic interpretations may arise. Not only does Atlan expose the mythical origins of these mistaken ideas, but, in line with his non-dichotomical and Spinozist lineage, he takes a stance in favor of scientific progress, which is paralleled by an expanded human propensity to comprehend more broadly their "origins and destiny".

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2007. A clonagem por Transferência Nuclear (TN) é uma técnica pouco eficiente e laboriosa. O processo, do ponto de vista técnico, é um dos principais fatores responsáveis pela quantidade e qualidade dos embriões produzidos. A enucleação é a etapa mais agressiva da TN. Apesar dos métodos alternativos propostos, a enucleação permanece sendo realizada como inicialmente descrita nos anos 50. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito do inibidor irreversível de transcrição e replicação actinomicina D (Fluka®, Suiça) como método de enucleação química de ovócitos. Ovócitos foram maturados in vitro (MIV) por 4 ou 6 horas e expostos a actinomicina D (T1, controle; T2 = 1,0 μg ml-¹ / 16hs; T3 = 1,0 μg ml-¹ / 14hs; T4 = 2,5 μg ml-¹ / 14hs; T5 = 5,0 μg ml-¹ / 14hs). Os ovócitos foram desnudados após 20 horas de MIV e ativados com 24-26 horas de MIV. As taxas de clivagem foram avaliadas 48 horas após a ativação (D2) e as de blastocisto após 168 (D7) e 192 (D8) horas de cultivo. Parte dos ovócitos foi fixada e corada com lacmóide ou orceína para determinação da fase da meiose ou para visualização da morfologia dos cromossomos, respectivamente. Posteriormente, ovócitos tratados com actinomicina D foram utilizados para clonagem por TN, sendo que parte dos embriões (D3) foi fixada para avaliar o percentual de células apoptóticas através do teste de TUNEL. Os dados relativos às taxas de maturação, clivagem e blastocisto foram analisados pelo teste do Qui-quadrado e os percentuais de apoptose pelo teste de Mann-Whitney. A taxa de maturação (T1 = 90,4%; T2 = 82,3%; T3 = 79,1%; T4 = 83,4%; T5 = 74,7%), clivagem (T1 = 68,9%; T2 = 46,0%; T3 = 49,7%; T4= 33,4; T5= 29,3%) e de blastocisto em D8 (T1 = 41,1%; T2 = 1,4%; T3= 1,3%; T4= 0,9%; T5= 0,0%) após o tratamento com actinomicina D foi significativamente menor. Dos ovócitos fixados, 63,2% estavam em metáfase II (MII). Ao avaliar os cromossomos, foi observada uma descondensação significativa com as concentrações mais altas (2,5 e 5,0 μg ml-¹). Os demais tratamentos não apresentaram modificações perceptíveis. Ovócitos tratados com 1,0 μg ml-¹ por 14 horas foram utilizados como citoplasmas receptores. A taxa de clivagem dos embriões reconstruídos (61,3%) foi semelhante ao grupo partenogenético tratado (61,3%) e inferior ao não tratado com actinomicina D (70,2%), embora a taxa de blastocisto tenha sido mais alta no grupo de TN (11,8%) em relação ao controle tratado (3,6%) e inferior ao controle sem tratamento (38,0%). Ao analisar o índice apoptótico dos embriões, os embriões partenogenéticos tratados tiveram um índice maior que os partenogenéticos não tratados (24,2% contra 4,8%). No entanto, os embriões oriundos de TN com ovócito tratado não foram diferentes estatisticamente dos TN controle (9,3 contra 13,0%). A actinomicina D é eficiente no bloqueio da transcrição e replicação embrionária. Além disso, foi possível obter embriões reconstruídos que apresentavam percentual de células apoptóticas indistinguível do controle. ___________________________________________________________________________________________ ABSTRACT Cloning by Nuclear Transfer (NT) is a low efficiency and labor intense technique. The process, in technical terms, is one of the main factors responsible for both embryo quality and quantity. Enucleation is the most aggressive step. Although alternative methods have been proposed, it remains mainly as it has been first described in the early fifties. The objective of the present work was to evaluate the effect of transcription and replication inhibitor actinomycin D as a chemical enucleation method for oocytes. Oocytes were matured in vitro (MIV) for 4 or 6 hours and exposed to actinomycin D (T1, control; T2 = 1,0 μg ml-¹ / 16hs; T3 = 1,0 μg ml-¹ / 14hs; T4 = 2,5 μg ml-¹ / 14hs; T5 = 5,0 μg ml-¹ / 14hs). The oocytes were denuded 20 hours after MIV and activated 24-26 hours after MIV. The cleavage rate was recorded 48 hours post activation and the blastocyst at 168 (D7) and 192 (D8) hours of culture. Some oocytes were fixed and stained with lacmoyd or orcein to determine the maturation status or for chromosome morphology evaluation, respectively. Furthermore, oocytes treated with actinomycin D were used as recipient cytoplasts for NT, while some embryos (D3) were fixed to evaluate the percentage of apoptotic nuclei by the TUNEL assay. The data relative to the maturation, cleavage and blastocyst rate were analyzed by the chi-square test and apoptosis percentages by the Mann-Whitney test. The maturation (T1 = 90,4%; T2 = 82,3%; T3 = 79,1%; T4 = 83,4%; T5 = 74,7%), cleavage (T1 = 68,9%; T2 = 46,0%; T3 = 49,7%; T4 = 33,4%; T5 = 29,3%) and blastocyst rate at D8 (T1 = 41,1%; T2 = 1,4%; T3 = 1,3%; T4 = 0,9%; T5 = 0,0%) after actinomycin D treatment was significantly different. Analyzing the fixed oocytes, 63,2% were in MII. While evaluating the chromosomes, it was observed a significant uncoiling when exposed to higher concentrations (2,5 and 5,0 μg ml-¹). The remaining groups had no apparent perceptible modifications. Furthermore, oocytes treated with 1 μg ml-¹ for 14 hours were used as recipient cytoplasts. The cleavage rate (61,3%) was similar to the actinomycin D treated control group (61,3%) and lower than the non-treated control (70,2%), although the blastocyst rate was higher in the NT group (11,8%) comparing to the treated control (3,6%) and lower to the untreated control (38,0%). After analyzing the embryos for apoptotic cells, the treated parthenogenetic embryos had a higher index than the parthenogenetic control (24,2% vs. 4,8%). However, the NT embryos generated by treated cytoplasts wasn’t statistically different from the NT control (9,3 vs. 13,0%). The actinomycin D treatment is efficient to block embryonic transcription and replication. Moreover, it was possible to obtain reconstructed embryos that possess an apoptotic cell index indistinguishable from the control.

Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência das auxinas AIB (ácido indolbutírico) e ANA (ácido naftalenoacético) no enraizamento adventício de miniestacas de clones de Eucalyptus cloeziana. Foram utilizadas miniestacas provenientes de sete clones de Eucalyptus cloeziana, estabelecidos em minijardim clonal, sendo avaliados os efeitos de AIB (0, 1.500, 3.000 e 6.000 mg L-1) na forma líquida e em pó e ANA (0, 3.000 e 6.000 mg L-1) na forma líquida. Os resultados apontaram ser a miniestaquia técnica viável na propagação vegetativa dos clones de Eucalyptus cloeziana estudados, apresentando, de modo geral, alto índice de enraizamento das miniestacas. Os clones com maior potencial de enraizamento adventício responderam mais positivamente às menores dosagens de AIB, enquanto nos clones com capacidade de enraizamento reduzida houve tendência de as maiores dosagens de AIB serem mais eficientes no enraizamento, independentemente da forma de aplicação do fitorregulador (líquido ou pó). O ANA, de modo geral, não influenciou significativamente o enraizamento das miniestacas da maioria dos clones estudados. The present work aimed to evaluate the efficiency of the auxins IBA (indolbutyric acid) and NAA (naphtaleneacetic acid) on the adventitious rooting of Eucalyptus cloeziana clones. Minicuttings originated from seven Eucalyptus cloeziana clones established in mini-clonal hedge, were evaluated for the effects of IBA (0, 1500, 3000 and 6000 mg L-1) in the liquid and powder forms and NAA (0, 3000 and 6000 mg L-1) in the liquid form. The results showed that minicutting is a viable technique for vegetative propagation of the studied Eucalyptus cloeziana clones, with overall high rooting rates. Clones with higher adventitious rooting potential gave better response to lower IBA doses, while clones with reduced rooting potential were more efficient with higher doses, independently of the form of the applied phytoregulator (powder or liquid). NAA, in general, had no significant effect on minicutting rooting for most studied clones.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-28Bitstream added on 2014-06-13T18:58:55Z : No. of bitstreams: 1 limaneto_jf_me_botfmvz.pdf: 482694 bytes, checksum: 8e409b567c057a2c7915beaa9c6e8077 (MD5) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) O primeiro sucesso na clonagem de eqüídeos através do uso de transferência nuclear foi relatado em maio de 2003 após o nascimento de uma mula clonada a partir de células fetais. Acredita-se que a utilização de células diplóides em fase do ciclo celular G0 ou G1 facilite a coordenação entre o ciclo celular e a reprogramação nuclear após a transferência de núcleo. Sendo assim, este experimento objetivou estudar o comportamento de fibroblastos de eqüinos adultos em cultura, analisando o estado do ciclo celular e a viabilidade das células em cultivo pré- e pós-descongelação. Fragmentos de pele de 6 eqüinos adultos, sendo 3 machos e 3 fêmeas, foram divididos em pedaços de aproximadamente 1mm3 e acondicionados (10 fragmentos/garrafa) no fundo de duas garrafas de cultivo (25cm2) umedecidas com 1mL SFB. As garrafas foram inclinadas para a posição vertical e adicionado 5ml de meio DMEM alta glicose + 10% SFB, 100UI/mL Penicilina / 100æg/mL Estreptomicina e 3,0æg/mL Anfotericina B. Após 30 minutos em estufa com 5% CO2 em ar, as garrafas foram dispostas em posição horizontal, para que o meio de cultivo entrasse em contato com os fragmentos teciduais. Todas as garrafas permaneceram por sete dias em estufa com 5% CO2 em ar até o início do crescimento celular. Com 70% de confluência, foi realizada a tripsinização e a primeira passagem. O mesmo procedimento foi repetido para a segunda passagem. Para os grupos de privação de soro (0,5% de SFB) foram produzidas garrafas de cultivo em duplicata para a análise da viabilidade e do ciclo celular nos períodos de 24, 48, 72, 96, 120, 144 e 168 horas de cultivo. Para os grupos de confluência foram produzidas duas garrafas de cultivo para a análise da viabilidade e do ciclo celular no período em que o tapete celular atingisse a confluência... The first success in equine cloning, using nuclear transfer, was reported in May of the 2003 after the birth of a cloned mule obtained from fetal cells. Nowadays there is an agreement, in the literature, that diploid cells in phase G0 or G1 of the cell cycle facilitate coordination between the cell cycle and the nuclear reprogramming after the nuclear transfer. This experiment aimed to study the behavior of equine fibroblasts in culture though the analysis of the cellular cycle and the viability of cells pre- and post-freezing. Skin fragments were obtained from 6 adult horses (3 females and 3 males) and divided in pieces of about 1 mm3. For culture, the bottoms of two culture bottles were moistened with 1 mL of FCS, 10 fragments of skin were deposited, and 5 ml of DMEM high glucose + 10% FCS, 100 IU/mL penicillin, 100 g/mL streptomycin and 3 g/ml amphotericin B were added with the bottles raised vertically. After 30 min incubation in 5% CO2 in air, the bottles were moved to a horizontal position allowing the culture media to make contact with the tissue fragments. All bottles were cultured for 7 days in 5% CO2 in air until the beginning of confluence. The complete culture media was replaced weekly and, at 70% of confluence, trypsinization (ATV Vernese, Adolfo Lutz Institute) and the first passage were performed. Two passages were performed before freezing. For the second passage, the culture and trypsinization were repeated. For cells subjected to serum starvation (0.5% FCS), culture bottles were produced in duplicate for viability and cellular cycle analysis at 24, 48, 72, 96, 120, 144 and 168 hours of culture. For the confluence groups bottles were produced for the analysis of viability and cellular cycle at the moment cells achieved confluence...(Complete abstract, click electronic address below)

Financiadora de Estudos e Projetos Cysteine proteases are enzymes found in many organisms and are characterized by the presence of cysteine residue in their active site. These proteases play an important role in the organism metabolism. In pathogenic organisms, for example, cysteine proteases may be involved in the pathogenicity process by unbalancing of the biological functions of the host (biochemical and physiological regulation). Since they are involved in several diseases, these enzymes have been considered of great interest for many researchers. The current work aims to express in E. coli a recombinant form of an ORF XAC2853 predicted to be a cysteine protease by annotation of the genome of Xanthomonas axonopodis pv citri. This bacterium is responsible for citrus canker, an infection affecting citrus species which can be evidenced by superficial lesions and early fall of leaves and fruits, thus resulting in significant losses to world agriculture. After expression, the protein was purified by nickel column affinity chromatography and inclusion body solubilization, inasmuch as this protein is almost fully insoluble. The purified protein was used to investigate the activity against such synthetic substrates as Z-FR-MCA and Z-RR-MCA, and no proteolytic activity was found. However, studies in vivo using clones of E. coli expressing the recombinant protein evidenced proteolytic activity against casein. In an attempt to demonstrate the involvement of this probable protease in the pathogenicity of Xac, the knockout of the cromossomal gene in Xac was performed. A mutant having the disrupted gene was obtained and characterized. The assays of the mutant growth, when compared with the wild strain, indicate that the cysteine protease may be involved in the pathogenicity of Xac, since the inactivation of its gene by the transposon insertion resulted in a less virulent strain. In this sense, this protein may be a promising target for the combat of citrus canker. As cisteíno proteases são enzimas presentes nos diferentes organismos e são caracterizadas pela presença de um resíduo de cisteína em seu sítio ativo. Essas proteases apresentam relevante papel no metabolismo desses organismos. No caso de organismos patogênicos, por exemplo, podem estar envolvidas no processo de patogenicidade por gerar o desequilíbrio das funções biológicas do hospedeiro (regulação bioquímica e fisiológica). Por esta razão, essas enzimas tem sido alvo de grande interesse por parte dos pesquisadores, uma vez que se encontram envolvidas em diversas doenças. Neste trabalho visamos à expressão em E. coli da forma recombinante de uma ORF XAC2853 predita como uma cisteíno protease na anotação do genoma de Xanthomonas axonopodis pv citri. Esta bactéria é responsável pelo cancro cítrico, uma infecção que afeta citros, caracterizando-se pelo aparecimento de lesões superficiais e queda precoce de folhas e frutos, resultando em grandes perdas para a agricultura mundial. Uma vez expressa a proteína, a mesma foi purificada por afinidade em coluna de níquel assim como pela solubilização dos corpos de inclusão, pois esta proteína encontra-se quase que exclusivamente insolúvel. A proteína purificada foi utilizada nos estudos de atividade contra os substratos sintéticos Z-FR-MCA e Z-RR-MCA não sendo verificada atividade proteolítica. No entanto, estudos de atividade realizados in vivo, com clones de E. coli expressando a proteína recombinante, demonstraram atividade proteolítica contra a caseína. Na busca de demonstrar o envolvimento desta provável protease na patogenicidade de Xac, foi realizado o nocaute do gene cromossomal que a codifica na bactéria. Um mutante com o gene inativado pela inserção de um transposon foi obtido e caracterizado, e os ensaios de crescimento desse mutante, comparado com o crescimento da linhagem selvagem, permitem concluir que a cisteíno protease estudada pode estar envolvida na patogenicidade de Xac, uma vez que a inativação do seu gene pela inserção do transposon gerou uma linhagem menos virulenta. Desta forma, esta proteína pode ser um alvo promissor para o combate ao cancro cítrico.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma das mais importantes micoses endêmicas da América Latina; ela é usualmente diagnosticada pela observação e/ou isolamento do seu agente etiológico Paracoccidioides brasiliensis, assim como por uma grande variedade de métodos imunológicos. Embora esses últimos sejam efetivos, dois grandes problemas, reação cruzada com outros agentes micóticos e complexidade dos antígenos utilizados, impedem a padronização desses procedimentos. Para superar essa falta de reprodutibilidade, ferramentas de biologia molecular foram utilizadas para produzir um antígeno recombinante, de aproximadamente 40kDa de peso molecular, desse fungo. Esse antígeno foi identificado por Góes e colaboradores (2005), através da estratégia da produção de ASTs, tendo sido caracterizado como uma proteína que apresentou homologia com a calcineurina B de Neurospora crassa. Essa proteína foi clonada em vetor pGEX4T-3 e expressa em sistema procarioto, apresentando-se como uma proteína de 378 aminoácidos e aproximadamente 40kDa, sendo denominada pb40r. Essa proteína possui dois motivos mão-EF de ligação ao cálcio e apresenta homologia com a EF-HAND domain protein de Neosartorya fischeri e de Aspergillus clavatus. Testes de ELISA utilizando soros de camundongos imunizados com a proteína recombinante demonstraram que a mesma é imunogênica, sendo capaz de induzir significativa produção de anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a. Além disso, camundongos infectados com P. brasiliensis também responderam a testes de ELISA, demonstrando a produção de IgG, IgG1 e IgG2a anti-pb40r. Uma bateria de 149 amostras de soro humano, consistindo de 72 de pacientes com PCM de diversas formas clínicas, 61 de pacientes com infecções diversas e 16 de indivíduos aparentemente saudáveis, foram testados por ELISA com a proteína recombinante, pb40r, purificada. A sensitividade e a especificidade da proteína em distinguir indivíduos sem infecção aparente de indivíduos com PCM de diversas formas clínicas foram de 90,3% e 81,25%, respectivamente. Já a especificidade desse antígeno frente a soros de indivíduos com outras infecções foi de 81,96%. Taxa significativa de reatividade cruzada foi observada com soros de pacientes com leishmaniose. Os resultados obtidos no presente trabalho demonstram que a proteína recombinante pb40r é um antígeno promissor, como alvo para imunodiagnóstico da PCM. Paracoccidioidomycosis (PCM) is one of the most important endemic mycoses in Latin America; its usually diagnosed by observation and/or isolation of the etiologic agent, Paracoccidioides brasiliensis, as well as by a variety of immunological methods. Although the latter are effective, two circumstances, cross-reactions with other mycotic agents and antigen preparation marked by extreme variability among batches, prevents a proper standardization of the procedures. To overcome this lack of reproducibility, molecular biology tools were used to produce a recombinant 40-kDa-molecular-mass antigen from this fungus. This antigen was identified by Goes et al. (2005), through the AST strategy, as a homolog of Neurospora Crassa calcineurin B. This cDNA was cloned in pGEX4T-3 vector and was expressed in a prokaryotic system as a protein with 378 amino acids and approximately 40 kDa of molecular weight, denominated pb40r. This protein has two EF-hand binding calcium domains and the comparisons of the transcribed sequence to sequences in different gene banks reveal a homology to the EF-HAND domain protein of Neosartorya fischeri and Aspergillus clavatus. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using mice immune serum samples against the recombinant protein, showed that pb40r is an immunogenic protein able to induce the production of a great quantity of IgG, IgG1 and IgG2a antibodies. Moreover, mice infected with P. brasiliensis are also able to recognize pb40r. They showed production of IgG, IgG1 and IgG2a against pb40r. A battery of 149 human serum samples, consisting of 72 sera samples from patients with several clinical forms of PCM, 61 sera sample from patients with diverse infections and 16 from healthy subjects, were all tested by ELISA using the purified pb40r. The sensitivity was 90.3%, when compared to the healthy subjects and the specificity for PCM patients was 81.25% while for patients with other diseases, it was 81.96%. A significant high cross-reaction was detected when sera from patients with leishmaniases was evaluated. These results indicate that the recombinant protein pb40r is a promising antigen to be used in immunodiagnosis of PCM.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-26Bitstream added on 2014-06-13T18:46:32Z : No. of bitstreams: 1 perecin_f_dr_jabo.pdf: 591625 bytes, checksum: f3212bddc59577b0aa73b9d7ef9f1d91 (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) A clonagem por transferência de núcleo é freqüentemente associada a resultados insatisfatórios devido à reprogramação nuclear anormal da célula somática doadora de núcleo e à expressão gênica alterada. O primeiro objetivo deste trabalho foi estudar a freqüência dos RNAs mensageiros das DNA metiltransferases (DNMT) 1, 3A e 3B, e do gene de expressão constitutiva gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) em blastocistos bovinos isolados produzidos in vivo e in vitro por transferência nuclear (TN) de célula somática, ativação partenogenética e fertilização in vitro (FIV). O segundo objetivo foi avaliar a expressão das DNMTs e dos genes imprinted IGF2, IGF2R e H19 em membranas cório-alantóide e fetos bovinos produzidos in vivo e in vitro por TN, ativação partenogenética e FIV e recuperados entre os dias 33 e 36 de gestação. Houve decréscimo (P

O presente trabalho aborda a quest?o da manipula??o gen?tica, especialmente a clonagem e o Diagn?stico Geral de Pr?-Implementa??o de Embri?es a partir de suas implica??es para a autocompreens?o do ser humano. Para tanto, as perspectivas de Hans Jonas, Jurgen Habermas, Michel Foucault e Giorgio Agamben ser?o consideradas, propondo uma leitura complementar destes autores que indica para um limite da pesquisa biom?dica. Tal limite ser? estabelecido a partir de uma perspectiva antropol?gica, que sustenta na diferencia??o entre a tomada biol?gica do homem, enquanto mero vivente, e na considera??o deste enquanto fen?meno espec?fico que ocorre em uma cesura d a vida nua para uma vida politicamente relevante

Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência do enraizamento adventício em estacas extraídas de brotações obtidas por meio da decepa da árvore, anelamento do caule e indução de brotações epicórmicas em galhos podados de árvores de Eucalyptus cloeziana, bem como a influência do AIB no enraizamento adventício dessas estacas. Foram utilizadas brotações de cepas de 3 e 5 árvores de 5 e 15 anos de idade, respectivamente, para o resgate por brotações de cepas. Para o anelamento do caule, foram utilizadas árvores de 5, 15 e 20 anos de idade, enquanto para o resgate por galhos podados as árvores utilizadas eram de 20 anos de idade. A indução de brotações em cepas mostrou melhores resultados para as árvores selecionadas com 5 anos de idade, em relação àquelas de 15 anos. No caso das estacas advindas das árvores de 5 anos de idade, a não-utilização de AIB proporcionou, para a maioria das características avaliadas, melhores respostas, ao passo que para as de 15 anos de idade a utilização de AIB apresentou melhor enraizamento. Quanto à formação de brotos induzidos em galhos podados e anelamento de caule, essas técnicas se mostraram eficientes na indução de brotações, porém as estacas obtidas não apresentaram resposta ao enraizamento adventício. De forma geral, o resgate por brotações de cepas mostrou-se mais viável em relação às demais técnicas estudadas, tanto pelo maior número de brotações emitidas quanto pela sua capacidade de enraizamento. The aim of this study was to evaluate the efficiency of adventitious rooting in cuttings of shoots obtained from tree severance, stem ringing and induction of epicormic shoots on pruned branches of Eucalyptus cloeziana trees, as well as the influence of IBA on the adventitious rooting of the same cuttings. Stump shoots were used from three and five trees, of 5 and 15 years old respectively. Trees of 5, 15 and 20 years old were used for the stem ringing, and 20-year-old trees were used for the delivery by means of pruned branches. Induction of stump shoots showed better results for the selected 5-year-old trees than for the 15-year-old ones. Cuttings originating from 5-year-old trees gave better results without IBA, while those originating from the 15-year-old trees presented better rooting when IBA was used. Shoot formation induced on pruned branches and through stem ringing were considered efficient techniques for shoot induction. The obtained cuttings, however, did not produce adventitious rooting. In general, delivery by stump shoots was shown to be a more viable technique when compared to the other techniques studied, both by the higher number of shoots emitted and their superior rooting capacity.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Visando ao desenvolvimento de um sistema heterólogo para produção de polihidroxialcanoatos (PHA) em Escherichia coli, clonou-se o gene da enzima PHA sintase de Chromobacterium violaceum (phaCCv) no plasmídeo pBHR69, o qual continha previamente os genes para as enzimas ß-cetotiolase (phbA) e acetoacetil-CoA redutase (phbB) do operon de Cupriavidus necator, ambas necessárias, juntamente com a PHA sintase, para a biossíntese de PHA em E. coli. Para verificação da produção de polímero em E. coli foram transformadas com o plasmídeo obtido (pRLC2) as linhagens JM101 e DH5a. Em cultivos não otimizados utilizando glicose como substrato obteve-se 1,15 e 1,52 g l-1 de biomassa com rendimento de 29,6 e 42,6 % de PHA do tipo poli(3-hidroxibutirato) nas linhagens JM101 e DH5a, respectivamente. Estes resultados evidenciaram que a PHA sintase de C. violaceum apresenta atividade aparentemente normal em E. coli, diferentemente do que sugeriram estudos anteriores, permitindo, portanto, a sua utilização para produção heteróloga de PHA nesta bactéria. O modelo estrutural teórico obtido para a enzima PhaCCv apresentou uma tríade catalítica similar à observada em lipases e outras enzimas da família a/ß-hidrolase, sugerindo que o resíduo de aspartato pertencente à tríade possa também estar associado à estabilização da ligação enzima-substrato. Assim como nas lipases, observou-se também no modelo a ocorrência de uma região possivelmente relacionada à ativação interfacial da enzima junto à superfície hidrofóbica do grânulo de PHA. As estruturas terciárias obtidas na modelagem estrutural sugerem a necessidade de reavaliação dos modelos mecanísticos de síntese atualmente propostos, uma vez que os mesmos pressupõem que o resíduo de aspartato não participaria da estabilização da ligação enzima-substrato, possuindo unicamente a função de ativação do radical hidroxila durante a biossíntese do polímero.

Mycoplasma hyopneumoniae (MH) é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial causando importantes perdas econômicas. Recentemente, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo três cepas de MH. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam o início da transcrição nestes microrganismos. Assim como em outras espécies deste gênero, M. hyopneumoniae não possui vários mecanismos que regulam a expressão gênica, incluindo o sistema de dois componentes e diversos fatores σ. Portanto, aparentemente, os sinais que promovem e regulam a transcrição, nestes organismos, devem diferir significativamente de outras bactérias. Além disso, o baixo conteúdo de GC e a falta de promotores experimentalmente caracterizados, também são fatores que dificultam o reconhecimento de seqüências controladoras. Para possibilitar a identificação das seqüências promotoras de MH in vitro, através da utilização da RNA polimerase holoenzima reconstituída, este trabalho tem como objetivo purificar o fator σ através da expressão heteróloga do gene rpoD de M. hyopneumoniae cepa 7448. Como esta CDS possui três códons de parada UGA – os quais codificam triptofano nos micoplasmas –, foi utilizado uma técnica baseada em PCR para introduzir as mutações (TGA→TGG) necessárias. A metodologia de mutagênese sítio-dirigida, empregada neste trabalho, apresentou eficiência relativamente boa na substituição dos nucleotídeos alvo. O gene íntegro e mutado foi subclonado no vetor pET23a-d(+) e expresso em Escherichia coli. De acordo com o fato de que os fatores σ exibem menor mobilidade em SDS-PAGE, a proteína expressa apresentou uma massa molecular aparente de 64 kDa, diferente dos 58 kDa deduzidos a partir da seqüência nucleotídica. Ainda, nas condições utilizadas, maior quantidade da proteína foi produzida de forma insolúvel. Para obtenção de um fator σ recombinante funcional, diferentes protocolos de expressão, solubilização e purificação serão testados. Mycoplasma hyopneumoniae (MH) is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and no cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. Recently, many species of this genus had their genome completely sequenced, including three strains of MH. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. To enable in vitro identification of the MH promoter sequences, the aim of this study is to purify the σ factor through the heterologous expression of the rpoD gene from the M. hyopneumoniae strain 7448, that will allow reconstituting RNA polymerase holoenzyme. As this CDS has three UGA stop codons – which encode tryptophan in mycoplasma –, a PCR-based method to introduce the necessary mutations (TGA→TGG) was used. The site-direct mutagenesis methodology, employed in this work, showed a relative good efficiency to substitute the targets nucleotides. The full length mutated gene was subcloned into pET23a-d(+) vector and expressed in fusion with a C-terminal polihistidine tag. In agreement with the fact that σ factors show slower mobility on SDS-PAGE, the expressed protein exhibited an apparent molecular mass of 64 kDa in despite of the 58 kDa that was deduced from the nucleotide sequence. However, most of the protein was insoluble under the conditions used. Therefore, to obtain a functional recombinante σ factor, different protocols related to the expression, solubilization, and purification will be tested.

The purpose of this study was to evaluate the influence of storage, antioxidants, auxins and their cofactors on the resulting rooting, as well as rooting rhizogenesis patterns in minicuttings of four Eucalyptus grandis x E. urophylla clones. The samples were collected from a clonal hydroponic minigarden. Regarding the evaluated characteristics, it was observed that the clones responded more effectively to the applications of IBA growth regulator than to the ANA applications, with the IBA doses ranging from 500 and 2,000 mg L-1 being more effective on the examined clones. As for the treatment of the minicuttings using cofactors associated to IBA, it was observed that chlorogenic acid and hydroquinone improved the rooting and survival indices in three clones; phenylalanine and phloroglucinol improved said indices in two of the clones; while only caffeic acid, tryptophane and especially proline improved these responses in all examined clones. The responses to the application of antioxidants varied: the best plant rooting and survival indices were obtained with the use of ascorbic acid and activated carbon with only one clone; whereas PVP showed to be effective with all the examined clones. The best technique was to plant the minicuttings immediately upon their harvest from a clonal minigarden, since it provided the best rooting and survival indices with all four clones, and avoided a negative impact on the propagators due to storage, even when stored for only a short period of time. As for the means used to store the minicuttings, it was observed that the best results were obtained by conditioning the minicuttings in a vertical position with a composite of vermiculite and PVP, possibly due to the specific use of PVP with certain types of clone. The obtained results allow the conclusion that there s a strong correlation between the genotypic differences of the analyzed materials and the plants rooting and their survival success as a response to the use of growth regulators, cofactors and antioxidants on different clones. Thanks to this study new information was brought about regarding the rhizogenesis patterns of minicuttings of the examined clones. It was observed the presence of an endogenous origin of the root primordia as well as the formation and proliferation of a disorganized mass of cells (calli) in minicuttings of up to 12 days old, with one H1 clone standing out from the others for having presented root primordia on or after the eighth day after the minicuttings were planted. O presente trabalho teve como objetivos a avaliação da influência do acondicionamento, antioxidantes, auxinas e seus cofatores no enraizamento adventício, bem como o padrão da rizogênese de miniestacas de quatro clones de Eucalyptus grandis x E. urophylla. Foram utilizadas miniestacas de quatro clones de Eucalyptus grandis x E. urophylla coletadas em minijardim clonal, conduzido em sistema de hidroponia em canaletas. Verificou-se, quanto às características avaliadas, que os clones responderam mais eficientemente às aplicações do regulador de crescimento AIB do que às aplicações de ANA, sendo que as doses entre 500 a 2000 mg L-1 de AIB mostraram-se mais eficientes para os clones estudados. Quanto à utilização dos cofatores associados ao AIB, no tratamento das miniestacas, observou-se que o ácido clorogênico e a hidroquinona melhoraram os índices de enraizamento e de sobrevivência dos três clones; a fenilalanina e o floroglucinol melhoraram os referidos índices em dois clones; somente o ácido cafeico, o triptofano e, principalmente, a prolina melhoraram essas respostas em todos os clones estudados. As respostas dos clones em relação à aplicação dos antioxidantes foram variadas, aonde os melhores índices de enraizamento e de sobrevivência das plantas foram obtidos com a utilização do ácido ascórbico e do carvão ativado para apenas um clone, no entanto o PVP mostrou-se eficiente em todos os clones avaliados. A melhor estratégia foi o plantio das miniestacas logo após a coleta no minijardim clonal, por proporcionar os melhores índices de enraizamento e sobrevivência para os quatro clones, sendo observado efeito negativo do armazenamento dos propágulos, mesmo quando realizado por curto período de tempo. Quanto ao modo de acondicionamento das miniestacas verificou-se que os melhores resultados foram obtidos com o acondicionamento das miniestacas em posição vertical na vermiculita, podendo ser associado com PVP, em função do clone. Os resultados obtidos permitiram concluir que as respostas dos clones em relação à utilização de reguladores de crescimento, cofatores e antioxidantes foram diferenciadas quanto ao enraizamento e sobrevivência das plantas devido às diferenças genotípicas dos materiais estudados. Quanto ao conhecimento do padrão da rizogênese das miniestacas dos clones estudados foi observada a origem endógena de primórdios radiculares, a proliferação e a formação de uma massa de células desorganizadas (calos) em miniestacas com até 12 dias de idade, sendo que um clone destacou-se dos demais por apresentar primórdios radiculares a partir de 8 dias após o plantio das miniestacas.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-08Bitstream added on 2014-06-13T20:25:29Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_ivm_dr_jabo.pdf: 1019049 bytes, checksum: 205fb28114ff3cf08f1d526343964c4e (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Esse trabalho teve por objetivo fornecer informações sobre aspectos morfológicos da semente; determinar a possibilidade de clonagem da variedade Duke 7 por alporquia; avaliar influência da época no pegamento da enxertia em abacateiro das variedades 'Hass' e 'Fortuna' e caracterizar, por estudos anatômicos e morfológicos, mudanças na gema vegetativa à florífera, para duas variedades de abacate 'Hass' e 'Fortuna'. As sementes são monoembriônicas e exalbuminosas, de germinação hipógea e a emergência das plântulas ocorreu 33 dias após a semeadura; a raiz primária é longa e de coloração branca e as raízes secundárias são curtas e filiformes; os cotilédones são maciços e de coloração rosada sendo que foi possível observar a presença de múltiplos caulículos na semente de abacate, originados do colo; os frutos são do tipo baga; as sementes apresentam policaulia; o início da estabilização da emergência de plântulas ocorre na oitava semana. Não houve enraizamento dos alporques; o período mais indicado para o sucesso da enxertia, é de modo geral, compreendido entre os meses de novembro e dezembro para ambas as variedades 'Hass' e 'Fortuna'. A transição entre a fase vegetativa e a reprodutiva ocorre no mês de maio, quando há diminuição da temperatura; a evocação floral ocorre um mês após, caracterizado pelo formato arredondado das gemas; a iniciação da inflorescência ocorre dois meses após a transição, no mês de julho. This work aimed to study morphological aspects of seeds; determine the cloning possibility of Duke 7 cultivar by air layering; evaluate the influence of the season on grafting of Hass and Fortuna avocado cultivars and to characterize by anatomical and morphological studies the modifications on vegetative to flowering bud. The seeds are monoembryonic, the germination is hypogea and the emergence of seedlings occurred 33 days after planting; the main root is long, white and the secondary roots are short; the cotiledons are hard and pink; the seeds presented polystems it was observed the presence of many small stems on avocado seed; the fruit is a berry. The stabilization of seed emergency occurred with eight weeks. There was no rooting in the air-Iayerings; the season more indicated for grafting is between November and December for both cultivars. The change from vegetative to reproductive phase was in May, when there is lower temperatures; the floral evocation occurs one month after, characterized by the rounded format of buds; the initiation of the inflorescence occurs after two months of the transition, in July.

Doenças causadas por bactérias constituem um novo desafio à cultura do Eucalyptus spp., podendo, inclusive, limitar o uso de clones suscetíveis. O presente trabalho objetivou avaliar a eficiência de antibióticos e rizobactérias na inibição do crescimento "in vitro" de isolados de bactérias fitopatogênicas ao Eucalyptus spp. na fase de viveiro e de campo. O antibiótico sulfato de amicacina e a rizobactéria S1 (Bacillus subtillis) destacaram-se quanto à inibição do crescimento do isolado fitopatogênico IP1-05 (Pseudomonas chichorii), enquanto a cefoxitina causou maior inibição dos isolados BSV16 e RVV11 (Rhizobium sp.). Os antibióticos de uso comercial na área agronômica, Mycoshield (oxitetraciclina) e Agrimicina (estreptomicina e tetraciclina) foram pouco efetivos. Este trabalho proporciona embasamento a alternativas para controle biológico de doenças bacterianas em mudas de Eucalyptus spp. na fase de viveiro. Diseases caused by bacteria represent a new challenge for Eucalyptus spp. and may also limit the use of susceptible clones. Our study aimed at an evaluation of the efficiency of antibiotics and rhizobacteria in inhibiting "in vitro" growth of phytopathogenic bacteria isolates in Eucalyptus spp. during the nursery stage and in the field. The antibiotic amicacine sulfate and rhizobacterium S1 (Bacillus subtilis) stood out inhibiting the growth of the phytopathogenic isolate IP1-05 (Pseudomonas chichorii), whereas cefoxitin caused a greater inhibition of the isolates BSV16 and RVV11 (Rhizobium sp.). The commercial antibiotics for agricultural use Mycoshield (oxitetracycline) and Agrimycin (estreptomycin and tetracycline) were little effective. This study offers a base for alternatives of biological control of bacterial diseases in Eucalyptus spp. nursery seedlings.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico The adventitious rooting of cuttings is influenced by intrinsic and extrinsic factors of the vegetal material. The knowledge on the way of action of these factors in the rooting is fundamental for the success of production of seedlings from minicutting technique. The aim of this work was to evaluate the degree of linear association between the nutritional state of ministumps and the meteorological conditions with the number and the rooting of minicuttings of Eucalyptus, cultivated in two types of minigarden (sand stream bed and tubes with subirrigation). Data from CENIBRA was used, in which were analyzed the rooting of minicuttings, the number of minicuttings per ministumps, the values of chemical analyses of foliate tissues and the data of climatic meteorologial. The number of minicuttings produced for ministumps and its rooting rate were correlated with the nutritional state of the shoots and the climatic data. The results indicated that the mineral nutrition has na important role in the adventitious rooting and in the number of minicuttings produced from ministumps, causing different responses according with each mineral nutrient considered and the type of clonal minigarden. The temperature influences the rooting of minicutings in different ways, varying the effect according wiht the clone and the type of clonal minigarden. For the clonal minigarden in sand stream bed, the temperature s reduction biased toward the rooting; in the other hand, the clonal minigarden in tubes with subirrigation, the rooting is biased toward the increase of the temperature. As for the munber of minicuttings, the increase of the temperature biased toward the production of minicuttings, regardless the type of minigarden. The light influenced the rooting and the number number of minicuttings positively, and the relative humidity of the air, negatively, regardless the type of minigarden, too. The data of this study points out that the nutritional solution should be specific for each clone, in the different minigardens. The increase of the luminous intensity and the reduction of the relative humidity of the air biases toward the rooting of the minicuttings and the number of minicuttings produced by the ministumps as well. O enraizamento adventício de estacas é influenciado por fatores intrínsecos e extrínsecos do material vegetal. O conhecimento sobre o modo de ação desses fatores sobre o enraizamento é fundamental para o sucesso da produção de mudas por miniestaquia. O objetivo deste trabalho foi avaliar o grau de associação linear entre o estado nutricional das minicepas e as condições metereológicas com o número e o enraizamento de miniestacas de eucalipto, cultivados em dois tipos de minijardim (leito de areia e tubetes com subirrigação). Foram utilizados dados da CENIBRA, dentre os quais foram analisados os de enraizamento de miniestacas, de número de miniestacas por minicepa, dos valores de análises químicas dos tecidos foliares e dos dados de monitoramento climático. O número de miniestacas produzidas por minicepa e sua taxa de enraizamento foram correlacionados com o estado nutricional das brotações e os dados climáticos. Os resultados indicaram que a nutrição mineral desempenha papel importante no enraizamento adventício e no número de miniestacas produzidos pelas minicepas, gerando respostas diferenciadas de acordo com cada nutriente mineral considerado e tipo de minijardim clonal. A temperatura influencia de diferentes maneiras o enraizamento de miniestacas, sendo seu efeito variável, de acordo com o clone e tipo de minijardim clonal. Para o minijardim clonal em leito de areia, a diminuição da temperatura favorece o enraizamento; já para o minijardim clonal em tubetes com subirrigação, o enraizamento é favorecido pelo aumento da temperatura. Em relação ao número de miniestacas, o aumento da temperatura favorece a produção de miniestacas, independente do tipo de minijardim. A luz influenciou positivamente e a umidade relativa do ar negativamente o enraizamento e o número de miniestacas, também independente do tipo de minijardim. Os dados desse estudo indicam que a solução nutritiva deve ser específica para cada clone, nos diferentes minijardins. Aumento na intensidade luminosa e diminuição da umidade relativa do ar favorecem tanto o enraizamento de miniestacas quanto o número de miniestacas produzidos pelas minicepas.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico The present work aimed at: a) evaluating rooting efficiency of adventitious cuttings made from shoots obtained through tree severance, stem ringing and epicormical shoot induction on pruned branches of selected Eucalyptus cloeziana trees; b) evaluating efficiency of growth regulators IBA and NAA in adventitious rooting of minicuttings of Eucalyptus cloeziana clones; c) evaluating efficiency of co-factors PVP and phloroglucinol in adventitious rooting of minicuttings of Eucalyptus cloeziana clones. To obtain shoots through tree severance, 3 and 5 matrices, respectively 5 and 15 years old, were selected. Stem ringing was realized in trees of 5, 15 and 20 years old and branches were cut of trees of 20 years old. To evaluate the growth regulators and co-factors, E. cloeziana clones, originating from the CAF miniclonal hedge, were used. Evaluations verified the efficiency of the root induction methods, survival of the cuttings/minicuttings on leaving greenhouse, rooting on leaving the shade house, survival and height of the cuttings at the age of 90 days, submitted to treatments with growth regulators and co- actors. In the experiment, which evaluated different forms of epicormical shoot induction, all methods were successful at shoot induction. However, only cuttings made of stump shoots resulted in adventitious rooting. Evaluation of the effect of growth regulators IBA and NAA on the rooting of minicuttings showed that clones with the highest rooting potential responded better at adventitious rooting at lowest IBA doses, independent of regulator appliance forms used (liquid or powder). Use of the growth regulator NAA showed no influence on rooting with the majority of the clones studied. In relation to co-factors phloroglucinol and PVP can be concluded that both showed beneficial effects for the majority of the characteristics analysed for the two clones of E. cloeziana. In a general way, based on the objectives of this work, on the applied treatments and on the genetic material used, the obtained results indicate rooting potential of minicuttings techniques of the E. cloeziana clones studied, permitting their clonal propagation in a satisfactory way. O presente trabalho teve por objetivos: a) avaliar a eficiência do enraizamento adventício de estacas confeccionadas a partir de brotações obtidas por meio da decepa da árvore, anelamento de caule e indução de brotações epicórmicas em galhos podados em árvores selecionadas de Eucalyptus cloeziana; b) avaliar a eficiência dos reguladores de crescimento AIB e ANA no enraizamento adventício de miniestacas de clones de Eucalytus cloeziana; c) avaliar a eficiência dos cofatores PVP e floroglucinol no enraizamento adventício de miniestacas de clones de Eucalyptus cloeziana. Para a obtenção de brotações por meio da decepa da árvore foram selecionadas 3 e 5 matrizes de 5 e 15 anos de idade, respectivamente. O anelamento de caule foi realizada em árvores de 5, 15 e 20 anos de idade e os galhos foram retirados de árvores de 20 anos de idade. Para a avaliação dos reguladores de crescimento e dos cofatores foram utilizados clones de E. cloeziana provenientes do minijardim clonal da CAF. As avaliações constaram da eficiência das formas de indução de brotações, da sobrevivência das estacas/miniestacas na saída da casa de vegetação, enraizamento na saída da casa de sombra, sobrevivência e altura das mudas aos 90 dias de idade, submetidas aos tratamentos, com os reguladores de crescimento e cofatores. No experimento em que se avaliou diferentes formas de indução de brotações epicórmicas, todas as formas testadas obtiveram sucesso na indução de brotações, porém, somente as estacas confeccionadas a partir de brotações de cepas, obtiveram resposta ao enraizamento adventício. Na avaliação do efeito dos reguladores de crescimento AIB e ANA no enraizamento das miniestacas, pode-se perceber que os clones com maior potencial de enraizamento responderam melhor ao enraizamento adventício nas dosagens mais baixas de AIB, independentemente da forma de aplicação do regulador (líquido ou pó). No uso de regulador de crescimento ANA, pode-se observar, para a maioria dos clones estudados, que este regulador não influenciou no enraizamento. Em relação aos cofatores floroglucinol e PVP, pode-se concluir que ambos apresentaram efeito benéfico na maioria das características analisadas para os dois clones de Eucalyptus cloeziana. De forma geral, com base nos objetivos do trabalho, nos tratamentos aplicados e material genético utilizado, os resultados obtidos indicam potencialidade de enraizamento das miniestacas dos clones de Eucalyptus cloeziana estudados, permitindo sua propagação clonal de forma satisfatória.

Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-27T11:21:49Z No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-05-27T14:38:09Z : No. of bitstreams: 1 2-s2.0-33646676282.pdf: 608428 bytes, checksum: a93d671ba39fdc01a516243c0dbcc135 (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-27T11:21:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-03-01 The retrovirus HTLV-1 is the etiological agent of the adult T-cell leukemia and HTLV-1 associated myelopathy/tropical spastic paraparesis. The proviral genome has 9,032 base pairs, showing regulatory and structural genes. The env gene encodes for the transmembrane glycoprotein gp 21. The development of methodologies for heterologous protein expression, as well as the acquisition of a cellular line that constituently expresses the recombinant, were the main goals of this work. The DNA fragment that encodes for gp 21 was amplified by nested-PCR and cloned into a pCR2.1-TOPO vector. After which, a sub-cloning was realized using the expressing vector pcDNA3.1+. The transfection of mammalian cells HEK 293 was performed transitorily and permanently. Production of the recombinant gp 21 was confirmed by flux cytometry experiments and the cell line producing protein will be used in immunogenicity assays. Laboratório de Pesquisa Centro Regional de Hemoterapia Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP Departamento de Análises Clínicas Faculdade de Ciências Farmacêuticas Júlio de Mesquita Filho Universidade Estadual Paulista, Araraquara, SP Departamento de Neurologia Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP Departamento de Clinica Medica Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP Centro Regional de Hemoterapia HCFMRP/Hemocentro de Ribeirão Preto. R. Tenente, Catão Roxo 2501, 14051-140 Ribeirão Preto, SP Departamento de Análises Clínicas Faculdade de Ciências Farmacêuticas Júlio de Mesquita Filho Universidade Estadual Paulista, Araraquara, SP

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-02-20Bitstream added on 2014-06-13T18:58:52Z : No. of bitstreams: 1 saraiva_nz_me_jabo.pdf: 431247 bytes, checksum: a83cbb84b25e1b75bfb892f8bc6cc5d0 (MD5) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O objetivo desse estudo foi avaliar a ação da demecolcina na composição de microtúbulos, maturação e desenvolvimento in vitro de oócitos bovinos, submetidos ao tratamento em metáfase I (MI) e metáfase II (MII). No experimento I, observamos que a concentração 0,05æg/mL foi a mais eficaz na indução de enucleação no grupo MI (15,2%) e na formação de protrusão no grupo MII (55,1%). No experimento II, verificamos manifestações da demecolcina em apenas 0,5 h de tratamento, pelo aumento significativo de categorias de oócitos sem microtúbulos. Houve nova polimerização dessas estruturas, quando oócitos expostos à droga em MII, foram cultivados em meio livre desse agente. No experimento III, evidenciamos influência negativa da demecolcina na maturação nuclear de oócitos tratados em MI, durante 12 horas (4,9% de oócitos em MII) e um diferente comportamento quanto à distribuição de grânulos corticais (GC); enquanto no grupo MI houve tendência à antecipação na migração de GC para a periferia, após 2 horas de exposição à droga, no grupo MII, observou-se nesse momento, ação prejudicial da mesma. Ainda, verificamos incompleta expansão das células do cumulus em oócitos expostos à demecolcina por 12 horas. No experimento IV, obtivemos alta eficácia da técnica de enucleação (90,6%) e grande variação quanto ao desenvolvimento até o estádio de blastocisto (12,5 a 47%), não verificando-se ação prejudicial da droga no desenvolvimento embrionário. The aim of this study was to evaluate demecolcine action on microtubules composition, maturation and in vitro development of bovine oocytes, submitted to the treatment in metaphase I (MI) and metaphase II (MII). In the experiment I, we observed that 0.05æg/mL was the most efficient concentration to induce the enucleation in group MI (15.2%) and protrusion formation in group MII (55.1%). In experiment II, we verified demecolcine manifestations already after 0.5 hour of treatment, supported by the significant increase of categories of oocytes without microtubules. There was new polymerization of these structures when oocytes exposed to the drug in MII were cultured in agent-free medium. In experiment III, we evidenced negative influence of demecolcine on nuclear maturation of oocytes treated on MI for 12 hours (4.9% of oocytes in MII) and a different behavior for cortical granules (CG) distribution; while in MI group there was a tendency for the anticipation of CG migration to periphery, after 2 hours of drug exposition, in the MIII group, was observed a harmful effect of the drug. Moreover, we verified incomplete expansion of cumulus cells in oocytes exposed to demecolcine for 12 hours. In experiment IV, we got high effectiveness of enucleation technique (90.6%) and wide variation for development to the blastocyst stage (12.5 to 47%), and no harmful effects of the drug on embryonic development were observed.

O veneno de cobras, escorpiões, aranhas e outros animais venenosos é uma fonte rica em toxinas. Uma característica importante de algumas toxinas é o fato de serem espécie específicas. Neste trabalho, nós realizamos a clonagem da seqüência codificante para a toxina LTx2 da aranha Lasiodora sp. no vetor de expressão pET11a. Esta toxina foi previamente identificada, através da varredura de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno desta aranha. A análise de similaridade, feita com o programa de alinhamento local BLAST, mostrou que esta toxina apresenta similaridade com as toxinas huwetoxina-II e huwetoxina-VII da aranha Selenocosmia huwena, bem como com as toxinas LTx1 e LTx3 da Lasiodora sp. Após a clonagem no vetor de expressão, nós sequenciamos o produto da clonagem pelo método de Sanger e verificamos que o mesmo foi inserido no frame correto. A indução da expressão da toxina recombinante foi feita usando IPTG na concentração de 0,6 mM, por 3-4 horas. Através de ensaios imunoquímicos, nós constatamos que neste sistema a proteína recombinante é expressa sobretudo na forma de corpos de inclusão. Definimos então, uma estratégia para obter a toxina solúvel renaturada. Utilizando uma solução contendo uréia na concentração de 6 M realizamos a desnaturação dos corpos de inclusão, e procedemos a renaturação da proteína recombinante através de diálise em um tampão de renaturação. A amostra foi então submetida a uma cromatografia líquida de alta pressão em coluna de fase reversa. Através de eletroforese e Western Blotting, nós observamos que a estratégia de purificação foi eficiente. Realizamos então um ensaio antimicrobiano, onde observamos que a toxina recombinante, na concentração de 400 mg/mL. inibiu o crescimento dos microrganismos Escherichia coli, Salmonella Agona e Staphylococcus epidermidis. A expressão e recuperação da proteína recombinante em maior quantidade permitirá a realização de testes em outros organismos e a realização de ensaios eletrofisiológicos. The venom from snakes, scorpions, spiders and other venomous animals is a very rich source of potent toxins. An interesting feature of some toxins is their remarkable species specificity. In the present work we cloned a sequence which codifies for the toxin LTx2 from the venom of the spider Lasiodora sp, in the expression vector pET11a. This toxin was previously identified in the screening of the cDNA library of the total venom. This toxin, when submitted to the local alignment tool, BLAST, shown similarity with the toxins huwetoxina-II and huwetoxina-VII, from the venom of the spider Selenocosmia huwena, as well as with the toxins LTx1 and LTx3 from Lasiodora sp. venom. After cloning in expression vector we verified if the fragment was inserted in the correct frame using the Sanger DNA sequencing method. The expression of the target protein was made by adding 0,6 mM IPTG to the media followed by a 3 to 4 hours incubation. With the assistance of immunochemical assays, we were able to detect that the target protein was been expressed in the form of inclusion bodies. Then we defined a strategy to recover the soluble refolded protein. Using a solution containing 6 M urea we proceed the solubilization of the inclusion bodies. The refolding of the soluble protein was made by the dialysis method in refolding buffer. The sample was, then, submitted to high pressure liquid chromatography, in a reversed phase column, to purify the protein. The purifying process was efficient, as shown by the Western Blotting and electrophoresis results. After that, we made an anti microbial assay, where we could see that the target protein, in the concentration of 400 mg/mL, inhibited the growth of the organisms used in the test. The expression and recovery of larger amounts of the target protein will allow tests with this toxin in other organisms and electrophysiological experiments.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Jurídicas. Programa de Pós-Graduação em Direito Esta dissertação é dedicada ao estudo das técnicas de manipulação de embriões humanos, seus aspectos éticos e sua relação com o Direito, tendo em vista o valor primordial da dignidade da pessoa humana. O objetivo deste trabalho é demonstrar que a manipulação de embriões somente é aceitável quando realizada dentro dos limites estritos do respeito ao ser humano, mesmo que o ser humano em questão esteja ainda na fase embrionária do seu desenvolvimento. O trabalho analisa o desenvolvimento do embrião humano desde o momento da fecundação e tece considerações sobre sua vida e o seu pertencimento à espécie. Analisa as diversas destinações possíveis para um embrião concebido in vitro, desde a implantação no ventre materno até a utilização como insumo em pesquisas de células-tronco e clonagem. Questiona a possibilidade ética de tais pesquisas, após discorrer sobre a individualidade e sobre o eventual reconhecimento do embrião como pessoa. Avalia a possibilidade de utilização das técnicas citadas, face ao valor primordial da dignidade humana. Apresenta instrumentos internacionais de direitos humanos relevantes para o tema e descreve a forma pela qual o ordenamento de determinados países aborda os procedimentos técnicos apresentados. Avalia o ordenamento jurídico brasileiro, sob a ótica da dignidade humana. Verifica que, apesar de insuficiente, a legislação brasileira não é indiferente aos temas aqui tratados, embora nem sempre adote a opção considerada mais adequada à proteção do ser humano. Por fim, tece considerações sobre uma regulamentação possível e concorde com o valor fundamental da dignidade humana. Quanto à metodologia, a abordagem se deu conforme o método indutivo, no procedimento utilizou-se o método monográfico e, quanto às técnicas, adotou-se a pesquisa bibliográfica e documental, em fontes primárias e secundárias.

A indução de resistência sistêmica mediada por rizobactérias promotoras do crescimento de plantas foi avaliada para a ferrugem do eucalipto (Eucalyptus spp.) causada por Puccinia psidii. Para isso, mudas com cerca de 80 dias de idade, previamente enraizadas em substrato tratado com diferentes isolados de rizobactérias foram inoculadas com uma suspensão de inóculo de P. psidii ajustada para 2 x 10(4) urediniósporos/ml. As plantas inoculadas foram mantidas em câmara de nevoeiro com nebulização intermitente a 25 ºC, no escuro por 24 h, e posteriormente transferidas para câmara de crescimento a 22 ºC, com fotoperíodo de 12 h e intensidade luminosa de 40 mmoles.s-1.m-2. Utilizou-se um delineamento inteiramente casualizado com quatro repetições, cada uma delas com quatro plantas. Após 13 dias da inoculação, avaliaram-se número médio de pústulas/folha, número de uredínias/amostra e número médio de esporos produzidos/uredínia. Os isolados FL2 e MF4 foram eficientes na redução da severidade da ferrugem. Além disso, o tratamento das mudas com rizobactérias, apenas uma semana antes da inoculação, com P. psidii foi menos eficiente em reduzir a severidade da doença do que o tratamento em que foram utilizadas mudas produzidas em substrato previamente rizobacterizadas, ou seja, com 80 dias. Estes resultados indicam que estes isolados de rizobactérias podem induzir maior resistência a doenças foliares diminuindo a necessidade de aplicação de fungicidas e otimizando a produção de mudas clonais de eucalipto. Induction of systemic resistance (ISR) by plant growth promoting rhizobacteria was tested against eucalypt (Eucalyptus spp.) rust caused by Puccinia psidii. Nearly 80 day old cuttings, previously rooted in rhizobacteria-treated and untreated (control) substrate, were inoculated with a 2 x 10(4) P. psidii urediniospore/ml suspension. The inoculated plants were incubated in an intermittent mist growth chamber at 25 ºC, in the dark for 24 h. Subsequently, the plants were maintained at 22 ºC and 12 h photoperiod at 40 mmoles (photons).s-1.m-2 light intensity. A completely randomized design with four replications and four plants each was used. After 13 days of inoculation, the mean number of pustules/leaf, number of uredinias/sample and the mean number of spores produced/uredinia were scored. Among the rhizobacterial isolates tested, FL2 and MF4 were significantly more efficient in reducing rust severity. This test was repeated and the same trend was found. These two best rhizobacterium isolates were not as efficient in reducing rust infection when inoculated on the same clone seven days before inoculation as they were when cuttings were rooted in rhizobacterial treated substrate.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Na busca de novos resultados para elucidar o papel de HAP1 e ROX1, que codificam um ativador do metabolismo oxidativo e um repressor do metabolismo oxidorredutivo, respectivamente, na levedura Crabtree negativa Kluyveromyces lactis cuja versatilidade metabólica pode ser explorada em vários campos da biotecnologia, inicialmente, foi identificado um gene ortólogo ROX1 à S. cerevisiae na seqüência genômica de K.lactis. O gene KlROX1 possui 40% de identidade daquele presente em S. cerevisiae e um motif característico do domínio HMG (High Mobility Group). Com base nessa seqüência uma linhagem mutante com deleção de ROX1 foi construída e confirmada. O fenótipo URA + e rox1 - dos transformantes obtidos, K.lactis ∆rox1::URA3, foram 100% estáveis sob condição seletiva. O gene putativo ROX1 de K.lactis teve a sua função em resposta ao oxigênio confirmada em culturas de K. lactis sob regime contínuo e desrepressão por glicose, pois, a deleção de ROX1 induziu a um aumento no nível do transcrito do gene hipóxico HEM13. A análise dos produtos do metabolismo permitiu inferir que a deleção do gene ROX1 em K. lactis aumentou a capacidade fermentativa dessa levedura sob aerobiose e de desrepressão catabólica. A investigação em culturas K. lactis ∆hap1 submetidas ao cultivo contínuo aeróbico sob desrepressão por glicose revelou um fenótipo relacionado ao metabolismo oxidorredutivo, ou seja, K. lactis ∆hap1 é mais fermentativa levando a diversidade de metabólitos em torno do piruvato. A proposta da via de regulação parcial negativa controlando a expressão de HEM13 foi confirmada nas culturas K. lactis. The objective of this study was to search for new results in order to elucidate the role of HAP1 and ROX1, which codify an oxidative metabolism activator and an oxidoreductive metabolism repressor respectively, in the Crabtree-negative yeast Kluyveromyces lactis, whose metabolic versatility can be exploited in several biotechnology fields. Initially, a ROX1 gene orthologous to S. cerevisiae was identified in the genomic sequence of K. lactis. The KlROX1 gene has 40% identity with the one present in S. cerevisiae and a characteristic motif of the HMG (High Mobility Group) domain. Based on this sequence, a mutant line with ROX1 deletion was built and confirmed. The obtained transformant URA + and rox1 - phenotypes, K. lactis ∆rox1::URA3, were 100% stable under selective condition. The putative K. lactis ROX1 gene had its function in response to oxygen confirmed in cultures of K. lactis under continuous regime and glucose derepression, since ROX1 deletion induced an increase in the level of the HEM13 hypoxic gene transcript. The analysis of metabolism products allowed inferring that the deletion of gene ROX1 in K. lactis increased the yeast fermentative capacity under aerobic and catabolic derepression. The investigation in K. lactis ∆hap1 cultures under continuous aerobic cultivation and glucose derepressiom revealed a phenotype related to oxidoreductive metabolism, in other words, K. lactis ∆hap1 is more fermentative, leading to metabolite diversity around the piruvate. The proposal of the partial negative regulation pathway controlling the HEM13 expression was confirmed in K. lactis cultures.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico O presente trabalho teve por objetivos: a) avaliar o efeito dos reguladores de crescimento 2,4-D, dicamba e picloram na indução de embriogênese somática em explantes juvenis de Eucalyptus grandis; b) avaliar o efeito dos meios de cultura MS, WPM e JADS na indução de calos embriogênicos em cotilédones de E. grandis e em folhas e entrenós de um clone híbrido de E. urophylla x E. grandis; e c) avaliar o efeito de fontes de carboidratos na indução de calos embriogênicos em cotilédones de E. grandis. Os parâmetros avaliados foram o percentual de explantes calejados, a intensidade de calejamento, a oxidação, a massa fresca de calos, a rizogênese, a coloração e a textura dos calos, bem como a presença de estruturas embriogênicas. Nos experimentos em que se utilizou 2,4-D, melhores resultados de calogênese foram observados em cotilédones, nas concentrações de 5 e 10 mg L-1, sendo 30 dias no escuro o melhor tempo e condição de indução. Os calos apresentaram coloração amarelo-clara a amarelo-escura e textura semicompacta a semifriável, porém não foram observadas estruturas embriogênicas. Os tratamentos de subcultivo em meio contendo diferentes combinações de reguladores de crescimento, acrescidos de PVP ou carvão ativado, não mostraram resultados satisfatórios. As auxinas dicamba e picloram demonstraram-se promissoras no desenvolvimento de um protocolo de embriogênese somática para E. grandis, sendo observadas estruturas semelhantes a embriões somáticos em diferentes estádios de desenvolvimento quando se utilizou 0,5 mg L-1 de dicamba ou 5,0 e 10,0 mg L-1 de picloram, em explantes cotiledonares. Em relação aos meios de cultura MS, WPM e JADS, maior massa fresca de calos e menores percentuais de oxidação e de regeneração de raízes foram observados em cotilédones de E. grandis, utilizando-se o meio MS. Diferença expressiva foi observada em calos obtidos em folhas do clone híbrido de E. urophylla x E. grandis, onde o meio WPM foi mais efetivo na formação de raízes em relação aos meios MS e JADS. Quanto à fonte de carboidrato, as combinações de glicose e sacarose com maltose ou frutose, em algumas situações, apresentaram maior percentual de calejamento e massa fresca de calos em relação à utilização de sacarose como única fonte de carboidrato. No entanto, quanto ao aspecto dos calos, melhores resultados foram obtidos quando se utilizaram 1,5 e 3% de sacarose, sendo observados calos de textura semifriável e de coloração amarelo-clara, enquanto em concentrações mais altas de sacarose houve tendência de maior compactação e oxidação. O glicerol promoveu aumento na massa fresca de calos nas concentrações de 0,5 e 1%, sendo, a partir dessa concentração, observado decréscimo dos valores desse parâmetro. Os resultados obtidos neste trabalho são concordantes com os da literatura existente, em que se relata a dificuldade de obtenção de um protocolo eficiente e reproduzível de embriogênese somática para espécies de Eucalyptus. Entretanto, em virtude da importância e do potencial de aplicação da embriogênese somática na silvicultura clonal, salienta-se a necessidade de realização de novos estudos relacionados a essa área de conhecimento, os quais envolvam espécies do gênero Eucalyptus. The present work had the following objectives: a) to evaluate the effect of the growth regulators 2,4-D, dicamba and picloram on the induction of somatic embryogenesis from juvenile explants of Eucalyptus grandis; b) to evaluate the effect of MS, WPM and JADS culture media, on embryogenic callus induction from cotyledons of E. grandis and leaves and stem internodes of a E. urophylla x E. grandis hybrid clone; and c) to evaluate the effect of carbohydrate sources on the embryogenic callus induction from cotyledons of E. grandis. The appraised parameters were the percentage of explant producing calli, the intensity of callus formation, oxidation, callus fresh weight, rhizogenesis, callus coloration and texture, as well as the presence of embryogenic structures. In experiments with 2,4-D the best results for callus production were found with cotyledons, being 5 and 10 mg L-1 and 30 days in the dark the best time and induction conditions. Callus coloration varied from light yellow to dark yellow and semi-compact to semi-friable texture, however no embryogenic structures were observed. Subculture in medium containing different combinations of growth regulators, added of PVP or activated charcoal, did not give good results. Dicamba and picloram showed potential for developing a protocol for somatic embryogenesis of E. grandis, producing structures similar to somatic embryos in different developmental stages with dicamba (0.5 mg L-1) or picloram (5.0 and 10.0 mg L-1), from cotyledon explants. In relation to the culture media MS, WPM and JADS, larger callus fresh weight and smaller percent of oxidation and root regeneration were observed in cotyledons of E. grandis with MS medium. Significant difference was observed in calli obtained from leaves of E. urophylla x E. grandis hybrid, where WPM medium was more effective for root formation compared to MS and JADS. Regarding to the carbohydrate source, the combinations of glucose and sucrose with maltose or fructose, in some situations, presented larger percent of callus production and callus fresh weight compared to the use of sucrose as only carbohydrate source. However, in relation to the callus aspect, better results were obtained with 1,5 and 3% of sucrose, giving semi-friable light-yellow calli, whereas in higher sucrose concentrations there was a tendency for increased hardness and oxidation. Glycerol at 0,5 and 1% increased callus fresh weight, but higher concentrations lowered these values. The results obtained in this work agrees with the existent literature on the difficulty of obtaining an efficient and reproducible protocol for somatic embryogenesis of Eucalyptus species. However, because of the importance and potential for application of somatic embryogenesis in clonal silviculture, it is emphasized the need for new studies on this area, involving species of the Eucalyptus.