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The contribution of cross-presenting XCR1+ dendritic cells (DC) in maintaining T cell function during exhaustion and immuno-therapeutic interventions of chronic infections remains poorly characterized. Using the mouse model of chronic LCMV infection, we found that XCR1+ DC were more resistant to infection and highly activated compared to SIRPɑ+ DC. Exploiting XCR1+ DC via Flt3L-mediated expansion or XCR1-targeted vaccination notably reinvigorated CD8+ T cells and improved virus control. Upon PD-L1 blockade, XCR1+ DC were not required for the proliferative burst of progenitor exhausted CD8+ T (TPEX) cells, but proved indispensable to sustain the functionality of exhausted CD8+ T (TEX) cells. Combining anti-PD-L1 therapy with increased frequency of XCR1+ DC improved functionality of TPEX and TEX subsets, while increase of SIRPɑ+ DC dampened their proliferation. Together, this demonstrates that XCR1+ DC are crucial for the success of checkpoint inhibitor-based therapies through differential activation of exhausted CD8+ T cell subsets. La participació de les cèl·lules dendrítiques (DC) cros-presentadores d’antígens, XCR1+ DC, en mantenir la funció de cèl·lules T CD8+ durant infeccions cròniques, i en la reactivació promoguda per immunoteràpies no està totalment caracteritzada. Emprant el model d’infecció crònica amb LCMV, hem determinat que XCR1+ DC són més resistents a infecció que SIRPɑ+ DC i mantenen alts nivells d’activació. Augmentar el número de XCR1+ DC via injecció de Flt3L o utilitzar vacunes dirigides al receptor XCR1 són estratègies capaces de reactivar cèl·lules T CD8+, millorant el control del virus. Durant el tractament d’immunoteràpia anti-PD-L1, XCR1+ DC no són necessàries per l’increment en proliferació de les cèl·lules T CD8+ progenitores (TPEX) però, són indispensables per sostenir la funcionalitat de la progènie (TEX). La combinació d’anti-PD-L1 i l’augment del número de XCR1+ DC incrementa la funció en TPEX i en TEX, mentre que augmentar el número de SIRPɑ+ DC en dificulta la proliferació. En conjunt, aquest estudi evidencia el paper crucial de XCR1+ DC en intervencions d’immunoteràpia mitjançant l’activació diferencial dels subconjunts de cèl·lules T CD8+ esgotades.

The main aim of this project was to uncover the spatiotemporal events influencing type I interferon (IFN-I) dynamics during the early phase of acute and chronic viral infections. Time-resolved spleen-transcriptome analysis of LCMV-infected mice revealed two waves of IFN-I expression in acute infection, while in chronically infected mice a single wave of IFN-I genes was induced. We identified CD169+ macrophages as the source of the second wave of IFN-I only during acute infection, and characterized its polyfunctional role involving (i) the induction of pro-inflammatory macrophages, and (ii) the expansion of virus-specific CD8 T cells. Importantly, the IFN-I-mediated antiviral CD8 T cell response resulted in the development of fibrosis in lymphatic tissue. In contrast, during chronic infection the early CD8 T cell-mediated depletion of CD169+ macrophages resulted in a lack of IFN-I production and the subsequent IFN-I-mediated-pro-inflammatory response. Overall, we demonstrated that the spatiotemporal regulation of IFN-I production in the early stages of infection is crucial for the induction of sequential immune events that lead to viral infection resolution. El objetivo principal de este proyecto fué analizar los eventos espacio-temporales que determinan la dinámica de la respuesta de interferón de tipo I (IFN-I) durante la fase inicial de las infecciones virales agudas o crónicas. El análisis de los transcriptomas de bazos de ratones infectados por LCMV reveló dos olas de expresión de IFN-I durante la infección aguda, en contraste con un único pico de expresión durante una infección crónica. Estudios posteriores permitierón demostrar que la segunda ola de producción de IFN-I durante una infección aguda está mediada por macrófagos CD169+, y que entre sus funciones se encuentran la inducción de (i) macrófagos proinflamatorios, y (ii) células T CD8 antivirales, las cuales son finalmente responsables de la aparición de fibrosis en tejido linfático. Por otro lado, durante una infección crónica los macrófagos CD169+ son eliminados por acción de las células CD8+, impidiendo así la producción de IFN-I y de la consiguiente respuesta proinflamatoria. En resumen, en este trabajo demostramos que la regulación espacio-temporal de la producción de IFN-I en las primeras etapas de una infección viral es determinante para la inducción de eventos inmunológicos secuenciales, que finalmente afectan el desarrollo de la misma.

The process of HIV latency establishment and maintenance is not clearly understood. Homeostatic proliferation (HSP) is a major mechanism by which long-lived naive and memory CD4 T cells are maintained in vivo. HSP also contributes to the persistence of HIV latent reservoir. Furthermore, HIV-infected naive CD4 T cells cultured under HSP condition are refractory to reactivation, in contrast to TCR-activated memory CD4 T cells. This might be due to the suggested post-transcriptional block in naive HSP-cultured cells. Here we compared a transcriptomic signature of naive and memory CD4 T cells. Among differentially expressed genes that may influence HIV latency, we identified Schlafen 12 (SLFN12) as an interesting candidate for a potential HIV restriction factor. Our results showed that SLFN12 establishes post-transcriptional block in HIV infected cells and thus inhibits both, HIV production as well as its reactivation from latently infected cells. These findings may help to better understand the mechanisms underlying HIV latency and its reversal in HSP-maintained naive CD4 T cells. All together it might contribute to the design of novel HIV eradication strategies. El proceso por el cual el virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) establece y mantiene un estado de latencia no se conoce en su totalidad. La proliferación homeostática (HSP, de sus siglas en ingés “Homeostatic proliferation”) es uno de los mecanismos por el cual las células T CD4 “naive” y de memoria se mantienen in vivo. Además, HSP también contribuye al mantenimiento del reservorio de virus en forma latente. Además, las células T CD4 “naive” infectadas y cultivadas en condiciones de HSP no son capaces de reactivarse a diferencia de las células T CD4 de memoria activadas vía TCR. Estudios previos sugieren que esta observación se debe a un bloqueo post-transcripcional en células T “naive” cultivadas en condiciones de HSP. En esta tesis comparamos la perfil del transcriptoma de células T CD4 “naive” y de memoria. Entre los genes diferencialmente expresados que podrían participar en el proceso de latencia del VIH, identificamos Schlafen 12 (SLFN12) como un candidato interesante que podría ser un factor de restricción del virus. Los resultados de este trabajo muestran que SLFN12 establece un bloqueo post-transcripcional en células infectadas por VIH, y de esta forma inhibe tanto la producción del virus como su reactivación en células infectadas de forma latente. Estas observaciones pueden ser de gran ayuda para entender mejor los mecanismos subyacentes a la latencia del VIH así como su reactivación en células CD4 T “naive” mantenidas bajo condiciones de HSP. En su conjunto, estos resultados podrían contribuir al diseño de nuevas estrategias para erradicar el VIH.

The processes and mechanisms of virus infection fate decisions that are the result of a dynamic virus - immune system interaction with either an efficient effector response and virus elimination or an alleviated immune response and chronic infection are poorly understood. Here, we characterized the host response to acute and chronic lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infections by gene coexpression network analysis of time-resolved splenic transcriptomes. We found first, an early attenuation of inflammatory monocyte/macrophage prior to the onset of T cell exhaustion and second, a critical role of the XCL1-XCR1 communication axis during the functional adaptation of the T cell response to the chronic infection state. These findings not only reveal an important feedback mechanism that couples T cell exhaustion with the maintenance of a lower level of effector T cell response but also suggest therapy options to better control virus levels during the chronic infection phase. Encara són poc coneguts els processos i mecanismes resultants de la interacció dinàmica entre el virus i l’hoste que determinen que una infecció es resolgui favorablement gràcies a una resposta efectora eficient o que esdevingui crònica degut a l’atenuació de la resposta immunitària. En aquesta tesi, hem caracteritzat la resposta de l’hoste en front a una infecció aguda o crònica amb el virus de la coriomeningitis limfocítica (LCMV) mitjançant l’anàlisi de xarxes de coexpressió de gens derivades de transcriptomes de melsa. Els resultats obtinguts mostren, primer, una atenuació de monòcits/macròfags inflamatoris durant els primers dies després de la infecció i abans de que hi hagi esgotament de les cèl·lules T i, segon, un rol important de l’eix XCL1-XCR1 durant l’adaptació funcional de la resposta de cèl·lules T a la fase crònica de la infecció. Aquests descobriments, no només posen al descobert un mecanisme important de retroalimentació que uneix les cèl·lules T esgotades amb el manteniment d’un cert nivell de resposta efectora, sinó que també suggererixen noves opcions terapèutiques per intentar controlar la expansió del virus durant la fase crònica de la infecció.

Hundreds of host factors related to viral infections like HIV, hepatitis C virus, dengue virus or West Nile virus have been identified. As many of these host factors are shared by different viruses, chemical blockade of key virus-associated cellular components may effectively act as broad-spectrum antiviral treatment. Broad-spectrum host-acting antivirals (HAAs) may reduce treatment complexity and costs, increase adherence to the therapy and may pose a higher barrier to develop resistance. In this thesis a high-throughput anti-HIV assay was used to screen for virus inhibitory effects of a library of secondary metabolites derived from myxobacteria. Compounds with high anti-HIV activity and low toxicity were classified as hits and two of them (ratjadone A and soraphen A) were selected for further analysis. The mechanism of HIV inhibition of both compounds is described here. The results presented in this thesis show that broad-spectrum HAAs are a feasible option for antiviral treatment and that the compounds identified can be further studied for hit-to-lead compound development., Cientos de factores del huésped relacionados con infecciones virales por VIH, hepatitis C, dengue o virus del Nilo occidental han sido identificados. Como muchos de esos factores del huésped son compartidos por diferentes virus, el bloqueo químico de un componente celular clave asociado al virus podría actuar de forma efectiva como un tratamiento antiviral de amplio espectro. Antivirales de amplio espectro contra factores del huésped podrían reducir la complejidad y el coste del tratamiento, incrementar el cumplimiento de la terapia y pueden suponer una barrera mayor al desarrollo de resistencia. En esta tesis un cribado de alta capacidad anti-VIH fue aplicado a una librería de metabolitos secundarios de myxobacteria. Compuestos con alta actividad anti-VIH y baja toxicidad fueron clasificados como hits y dos de ellos (ratjadone A y soraphen A) fueron seleccionados para posteriores estudios. El mecanismo de inhibition de VIH de ambos compuestos es descrito aquí. Los resultados presentados en esta tesis muestran que usar antivirales de amplio espectro contra factores del huésped es un opción viable para tratamientos antivirales y que los compuestos identificados pueden ser estudiados para el desarrollo de fármacos.

Bloquejar la via PD-1/PD-L1 ha sorgit com una estratègia prometedora per a restaurar la resposta immune efectora en individus infectats amb el virus de la immunodeficiència humana (VIH). Malgrat l’extensa recerca duta a terme en aquest camp, es desconeixen els efectes que aquesta immunoteràpia pot tenir en les cèl•lules T reguladores (Treg). En la present tesi he investigat l’expressió de PD-1/PD-L1 i l'impacte de bloquejar PD-L1 en les Treg de pacients infectats amb el VIH. Hem observat que la infecció pel VIH indueix l’augment del percentatge de Treg PD-1+ i PD-L1+, i que aquest augment correlaciona amb la progressió de la malaltia. Bloquejar PD-L1 augmenta la capacitat de proliferar de les Treg d’individus virèmics i a més causa un increment en la reactivació de virus. Al contrari, bloquejar PD-L1 no augmenta significativament la proliferació de les Treg d’individus que controlen la virèmia, però augmenta la capacitat de proliferar de les cèl•lules T-CD8 en tots els grups de pacients estudiats. En conjunt, aquests resultats indiquen que la virèmia de l’individu pot influir en el guany net de la funció efectora després de bloquejar PD-L1., Blocking the PD-1/PD-L1 pathway has emerged as a potential therapy to restore impaired immune responses in human immunodeficiency virus (HIV)-infected individuals. Most reports have studied the impact of the PD-L1 blockade on effector cells and neglected possible effects on regulatory T cells (Treg). In this thesis I investigated PD-1 and PD-L1 expression on Treg and the impact of ex vivo PD-L1 blockade on Treg from HIV-infected individuals. We observed that HIV infection led to an increase in PD-1+ and PD-L1+ Treg, which correlated with disease progression. Ex vivo PD-L1 blockade increased the proliferative capacity of Treg from viremic individuals and increased viral reactivation. In contrast, PD-L1 blockade had no significant effect on the proliferative capacity of Treg from individuals that control viremia, but increased CD8 T cell proliferation in all HIV-study groups. Taken together, this suggests that the net gain of T cell effector function after PD-L1 blockade may critically depend on the plasma viremia of the host.

Basierend auf der Notwendigkeit eines patientenspezifischen Systems für HCV-Infektionsstudien wurden Neohepatozyten im Rahmen der vorliegenden Arbeit als alternatives Zellsystem zu hepatischen Zelllinien charakterisiert. Infektionsexperimente mit HIV-HCVpp zeigten, dass humanes Serum, unabhängig vom Vorhandenssein HCV-neutraliserender Antikörper, donorabhängig steigernde oder inhibierende Einflüsse auf die Infektion von Neohepatozyten haben konnte. Die gleichen Seren wirkten stets inhibierend auf die Infektion von Huh7-Zellen. Dies korrelierte mit der Expression von Fcγ-Rezeptoren, die nur auf Zellen monozytärer Herkunft nachgewiesen werden konnten. Interessanterweise sind aber Neohepatozyten, unabhängig von der breiten Expression von Fcγ-Rezeptoren, die einzigen Zellen monozytärer Herkunft, die effizient infiziert werden konnten. Dies konnte zum Teil auf die differenzielle Expression des HCV-Eintrittsfaktors Occludin zurückgeführt werden. Durch mehrfache, zeitlich versetzte Präparationen von Neohepatozyten aus Monozyten konnten wir deutliche donorspezifische Unterschiede in den Infektionsfrequenzen beobachten. Des Weiteren wurden in dieser Arbeit Neohepatozyten anhand ihres miRNA-Profils zweifelsfrei als eine Makrophagen-Subpopulation klassifiziert. Insgesamt betrachtet sind Neohepatozyten ein effizientes System zur Untersuchung des HCV-Zelleintritts unter Beibehaltung donorspezifischer Eigenschaften. Based on the necessity of a more physiological and patient-specific system for HCV infection studies, neohepatocytes were characterized as an alternative cell system to hepatic cell lines. Infection experiments with HIV-HCVpp showed a donor-dependend influence of human serum on the infection of neohepatocytes independend of the existence of neutralizing antibodies. The same sera had a inhibiting influence on Huh7 infection. This correlated with the expression of Fcγ-receptors, that could only be observed on cells of monocytic origin. Interestingly neohepatocytes are the only cells of monocytic origin that could be infected efficiently independend of the broad expression of Fcγ-receptors. This could partly be due to the differential expression of the HCV entry factor Occludin. We could observe distinct differences in infection frequency at neohepatocytes prepared at different time points out of monocytes from two representative donors. Furthermore we were able to identify neohepatocytes as a macrophage subpopulation with their miRNA-profiles. Altogether neohepatocytes are an efficient system for analysing the HCV entry into target cells with donor-specific characteristics.

Etwa 200 Millionen HCV-Infektionen weltweit machen Hepatitis C zu einem globalen Gesundheitsproblem (WHO, 2008). In vivo sind Hepatozyten die primären Zielzellen der HCV-Infektion, doch ihre Verwendbarkeit für in vitro Studien ist stark limitiert. Humane Leberkarzinom-Zelllinien wie Huh7 bieten daher bislang die einzige Möglichkeit den HCV-Lebenszyklus zu untersuchen. Aufgrund ihres degenerierten Genoms sowie ihres abweichenden Stoffwechsels spiegeln Huh7-Zellen aber keineswegs die in vivo Situation einer Leberzelle wider. Basierend auf der Notwendigkeit eines alternativen hepatischen Zellsystems wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht, ob Monozyten-basierte Neohepatozyten als alternatives Zellsystem für HCV-Studien eingesetzt werden können. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expressionsprofile von Neohepatozyten und Huh7-Zellen große Ähnlichkeiten im Hinblick auf Hepatozyten-spezifische Faktoren aufweisen. Neben Albumin und den bis dato bekannten HCV-Rezeptoren konnte zudem die Leberzell-spezifische miRNA122 nachgewiesen werden. Die Generation der Neohepatozyten gelang dabei sowohl aus PBMC gesunder Spender, als auch aus den Blutzellen von HCV-Patienten. Infektionsexperimente mit hepatotrophen HCVpp konnten belegen, dass der Großteil der Neohepatozyten für die virale Infektion zugänglich ist. Humanes AB-Serum war dabei ebenso wie das Polysaccharid DEAE-Dextran in der Lage, die HCVpp-Infektionsfrequenz positiv zu beeinflussen. Die Neutralisation der HCVpp-Infektion durch antiCD81-, antiSR-BI- und antiCLDN1-Antikörper zeigte zudem, dass die HCVpp-Infektion in Neohepatozyten über die gleichen Rezeptoren vermittelt wird wie in Hepatozyten. Neutralisierende antiE1E2-Antikörper aus HCV-Patienten hatten dagegen in Neohepatozyten und Huh7-Zellen gegensätzliche Effekte. Während die Infektions-Frequenz in Huh7-Zellen in Anwesenheit der Antikörper gesenkt wurde, hatten die Patienten-Antikörper in Neohepatozyten einen infektionssteigernden Effekt. Dies könnte auf unterschiedliche Wechselwirkungen der Virus-Antikörper-Komplexe mit zellulären Fc-Rezeptoren oder andere Personen-spezifische Faktoren hindeuten. Aufgrund ihrer Eigenschaften als primäre Zellen kam dieser Effekt in Neohepatozyten wahrscheinlich deutlich stärker zum Tragen als in Huh7-Zellen. Der Unterschied zwischen Neohepatozyten und Huh7-Zellen wurde auch im Kontext der HCVcc-Infektion deutlich. Während die getesteten Huh7.5-Zellen aufgrund ihrer Mutation im RIG-Gen den HCVcc-Eintritt sowie die Replikation der viralen Partikel erlaubten, konnte in den Neohepatozyten keine effektive HCVcc-Infektion detektiert werden. Da primäre humane Hepatozyten vergleichbare Ergebnisse zeigten, scheinen Neohepatozyten den in vivo Zustand einer Leberzelle wohl besser zu reflektieren als Huh7-Zellen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Neohepatozyten ein effizientes System darstellen, um den HCV-Zelleintritt Patienten-spezifisch zu untersuchen. Replikations-Studien sind ersten Erkenntnissen zufolge nicht möglich. Die Weiterentwicklung dieses Systems, z.B. im Kleintiermodell könnte allerdings dazu beitragen, Wirts-Faktoren zu identifizieren, die einen Einfluss auf die HCV-Persistenz und -Pathogenese haben. Bezogen auf eine therapeutische Anwendbarkeit könnte die fehlende Replikationseffizienz zudem Vorteile haben: Leberzell-Transplantate wären aus autologen Körperzellen generierbar und eine erneute HCV-Infektion könnte ausgeschlossen werden. Inwieweit diese Ansätze allerdings praktisch umsetzbar sind, müssen künftige Experimente zeigen. HCV is a major cause of chronic liver disease. There is a growing interest in ex vivo generated hepatocytes for several therapeutic issues as well as for infection analysis under relevant ex vivo conditions. Primary human hepatocytes (PHH) represent the primary target cells of HCV, supporting viral replication in vivo, but their availability is limited and establishing and maintaining cultures of PHH has proven difficult. So by now, HCV studies are limited to human hepatoma cell lines like Huh7 that lack a substantial set of liver-specific functions and exhibit a degenerated karyotype with numerous abnormalities. A full understanding of the pathogenesis of HCV requires a tissue culture model that allows studies in a physiological context. According to previous studies we generated a hepatocyte-like cell system (termed Neohepatocytes) from peripheral blood monocytes by culture conditions that promote hepatocyte differentiation (Ruhnke et al., 2005). Based on this system it was investigated, whether Neohepatocytes can be used as a person-specific cell system for HCV infection studies. A first line of investigation showed that Neohepatocytes express hepatocyte-specific markers like albumin as well as the essential HCV receptors CD81, SR-BI and CLDN-1 in comparable levels to Huh7 cells. Additionally the liver-specific miRNA122 is detectable within these cells, although in lower concentrations than within Huh7 cells. Furthermore, the majority of Neohepatocytes is infectable with hepatotrophic HCV pseudotypes and antibodies against the known HCV host cell entry factors CD81, SR-BI and CLDN-1 are able to neutralize HCVpp infection. The frequency of HCVpp infection could be enhanced by human sera and DEAE-Dextran. Interestingly, neutralizing antibodies derived from chronically infected HCV patients appeared to show a different pattern of neutralization in Neohepatocytes compared to Huh7 cells. While anti-HCV antibodies neutralized HCVpp infection in the Huh7 cell system, nearly all patient-derived IgGs increased the infection rate of HCVpp in Neohepatocytes. These observations could be related to specific interactions of virus-antibody complexes with cellular Fc receptors or with other person-specific surface factors lost in Huh7 cells. HCVcc infection experiments unraveled additional differences between Neohepatocytes and Huh7 cells. While HCVcc infection and viral replication took place in the RIG-deficient Huh7.5 cells, no effective HCVcc infection could be detected in Neohepatocytes. PHH also fail to allow an efficient HCVcc infection, indicating a higher similarity to Neohepatocytes than to Huh7 cells. Taken together, the here established infection system may represent a valuable cell system to analyze patient-specific virus-host interactions during HCV infection. So far replication studies have been found impossible. But further development of the neohepatic cell system e.g. in a small animal model could help to identify host genetic markers that modify HCV persistence and pathogenesis. For clinical application the missing replication capacity could be even advantageous: transplantation of autologous cells would prevent negative immune responses and reinfection by HCV could be circumvented. However, the practicability of this theory remains to be determined by future investigations.

HIV zeichnet sich durch eine hohe genetische Variabilität aus. Die fehlerbehaftete Replikation stellt ein wesentliches Charakteristikum und die Grundlage für die Pathogenität dar. Um Einblicke in grundlegende Veränderungsmechanismen von HIV zu gewinnen, ist eine Analyse auf Ebene einzelner infizierter Zellen von Patienten notwendig. Die HIV-spezifische FISH spielt bei den Untersuchungen auf Einzelzellebene eine entscheidende Rolle. In dieser Arbeit konnte sowohl die RNA-FISH als auch die DNA-FISH erfolgreich etabliert und optimiert werden. Mit Hilfe beider Methoden gelang es, Patientenmaterial bezüglich der Zahl produktiv-infizierter Zellen und der Provirus-Kopienzahl zu analysieren. In einzelnen Zellen aus lymphatischen Geweben von SIV-infizierten Rhesus Makaken wurden von der Primärvirämie bis zum späten Stadium der Infektion zwei bis drei provirale SIV-Sequenzen spezifisch detektiert. Der Nachweis der Mehrfachinfektion in einzelnen MNC aus der Milz eines Rhesusaffens zwei Wochen nach Beginn der Infektion zeigte, dass der Grundstein zur Steigerung der Variantenvielfalt über Rekombinationsereignisse in der frühen Phase der Infektion gelegt wird. Die Bestimmung multipler Proviren während des gesamten Infektionsverlaufs demonstriert, dass dieser Prozess als ein kontinuierlich stattfindendes Ereignis während des Infektionsgeschehens anzusehen ist. Diese Daten dienen nun als Basis mathematischer Modellrechnungen zur HIV-Evolution. The pathogenic retrovirus HIV is characterized by a high genetic diversity, which is induced by different error processes. To get detailed insights into mechanisms that contribute to the genetic variants, the analysis of single infected cells of HIV-positive patients is essential. The HIV-specific FISH is of great importance for analysing HIV-infection on the single cell level. In the present work, the technical improvement of both, the HIV-specific RNA-FISH and the HIV-specific DNA-FISH, was successful. Using both techniques, productively infected cells and the provirus copy number in patient material could be determined. With the help of the SIV-specific DNA-FISH, two or three integrated proviral SIV-sequences were detected in single splenocytes of SIV-infected rhesus macaques from the primary viremia to the late stage of infection. The detection of multiple proviruses within single cells two weeks post infection shows that the increase of genetic diversity via recombination begins in the primary stage of infection. Furthermore, the detection of multiinfection in single cells during the complete course of infection demonstrates that recombination is a dominant continuous mechanism for generating new virus variants. These results will be incorporated as fundamental parameters in a mathematical model for simulating HIV-evolution.

The importance of HLA class I restricted CD8 T cell response in the control of HIV infection is generally accepted, yet few studies have shown a correlation of the CD8 T cell response with markers of HIV disease progression. Disease progression is dependent on several factors such as the virus load at set-point, rarely occurring mutations in the HIV co-receptor genes or the HLA class I alleles expressed by an HIV infected individual. It has been shown previously that particular HLA class I alleles are associated with a low plasma viral load. However, a relationship between these "protective'; HLA class I alleles and an efficient HIV-specific CD8 T cell response has not yet been demonstrated. In order to study the mechanism underlying the beneficial effect of "protective'; HLA class I alleles, 53 HIV-1 seropositive individuals from a high-risk cohort in southwest Tanzania were HLA-typed and the plasma viral load and CD4 counts were determined. The recognition of CD8 T cell epitopes within Gag, Nef and Env was analysed using a gamma interferon ELISPOT assay and freshly isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Gag and Nef were frequent targets of the HIV-specific CD8 T cell response with a median recognition of 3 Gag, 2 Nef and 1 Env epitopes per individual. The HLA class I alleles B5801, B8101 and B0702 were associated with a low median plasma viral load. At the same time expression of these correlated with a broader recognition of Gag epitopes (P = 0.0035), if compared with all other common HLA class I alleles. Further analysis of the Gag-specific T cell response revealed an inverse linear relationship between the number of Gag epitopes recognized and the plasma viral load (R = -0.36, P = 0.0016). Particularly, recognition of multiple epitopes within two regions of Gag (aa001-aa075 and aa248-aa500) was strongly associated with the maintenance of a low viral load, indicating that this pattern of HIV-specific CD8 T cell recognition is important for the control of viral replication during the chronic phase of HIV infection. In the second part of the present work, recognition of Gag and Nef variant epitopes was analysed using HIV-1 subtype A, C and D derived peptides. 83% of the Gag-specific responses were detected with subtype C derived peptides, whereas only 51% and 57% of responses were detected with subtype A or D peptides, respectively. The superiority of the subtype C Gag peptides for detecting CD8 T cell responses may in part reflect the predominance of subtype C and C-containing recombinant HIV-1 strains within the studied cohort. Nonetheless, screening for CD8 T cell responses with any one subtype-specific peptide set detected fewer responses and underestimated the breadth and the magnitude of responses within individuals, compared to the combined peptide sets from the three subtypes. Cross-subtype recognition for the 16 most frequently recognized peptides was identical only when the peptide sequences were invariant; in 9 of these 16 peptides, diminished recognition was the result of subtype-related sequence variation, and a frame-of-epitope effect diminished or abrogated recognition in 4 peptides. A minimal set of 15 frequently recognized Gag and Nef peptides was then designed and tested with cells from 50 HIV seropositive individuals and elicited responses in 47 of them, at a mean frequency of 715 SFC/106 peripheral blood mononuclear cells. Therefore incomplete cross-recognition between subtypes A, C, and D can be partially overcome using a defined peptide set representing frequently recognized epitopes, and potentially, by adjusting epitope frame within peptides. These strategies can help to define optimal vaccine epitopes. In the third part of the present work, the Gag-specific CD8 T cell response of individuals infected with a single HIV strain was compared with the response observed in individuals infected with multiple HIV-1 strains. Breadth of Gag epitope recognition and cross-recognition of subtype-specific peptide pools was enhanced in multiply infected study subjects, whereas CD8 T cell recognition of Nef or Env appeared to be unaffected. Therefore the increased viral diversity in individuals infected with multiple HIV-1 strains affects the Gag-specific T cell response. As a consequence inclusion of multiple Gag variants in a HIV vaccine is likely to enhance vaccine-induced CD8 T cell responses and cross-recognition of HIV epitopes. Es ist allgemein akzeptiert, daß die HLA Klasse I restringierte CD8 T Zellantwort bei der Kontrolle der Virusreplikation während einer HIV Infektion eine entscheidene Rolle spielt. Allerdings konnten nur wenige Studien eine Korrelation zwischen der HIV-spezifischen CD8 T Zellantwort und dem Krankheitsverlauf nachweisen. Der Krankheitsverlauf hängt von verschiedenen Faktoren ab, darunter die Viruslast nach der Primaervirämie, selten vorkommenden Mutationen in den HIV Korezeptorgenen, oder den HLA Klasse I Allelen. So geht beispielsweise die Expression bestimmter HLA Klasse I Allele mit einer niedrigen Plasma Viruslast einher. Eine Verbindung zwischen solchen "protektiven'; HLA Klasse I Allelen und einer effizienten HIV-spezifischen CD8 T Zellantwort konnte jedoch bisher noch nicht nachgewiesen werden. Zur Beantwortung des zugrundeliegenden Mechanismus, der mit "protektiven" HLA Allelen verbunden ist, wurden 53 HIV infizierte Frauen einer Hochrisikokohorte im Südwesten Tansanias bezüglich des HLA Typs, der Viruslast im Plasma und der CD4 T Zellzahl charakterisiert. Gleichzeitig wurde die Gag-, Nef- und Env-spezifische CD8 T Zell Antwort unter Verwendung eines Interferon gamma ELISPOT Assays bestimmt. Am häufigsten fanden sich in den Studienteilnehmerinnen CD8 T Zellantworten gegen Epitope in Gag und Nef, weniger häufig gegen Epitope in Env (Median: 3 Gag, 2 Nef und 1 Env erkannte Epitope/Individuum). Die HLA Klasse I Allele B5801, B8101 und B0702 waren mit einer niedrigen Viruslast assoziiert. Gleichzeitig korrelierte die Expression von einem oder zwei dieser Allele mit einer breiteren Erkennung von Gag Epitopen (P =0,0035, Median:4 erkannte Epitope/Individuum) verglichen mit anderen HLA Klasse I Allelen (Median: 2 erkannte Epitopen/Individuum). Die weitere Analyse der Gag-spezifischen CD8 T Zell Antwort offenbarte ein inverses lineares Verhätnis zwischen der Anzahl der erkannten Gag Epitope und der Viruslast im Plasma (R =-0,36 ; P = 0,0016). Des weiteren war die Erkennung von multiplen Epitopen in 2 Regionen des Gag Proteins (as001-as075 und as 248-500, GagR1R3) stark mit einer dauerhaften Kontrolle der Virusreplikation nach Serokonversion assoziiert. Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse darauf schließen, daß die Erkennung multipler Epitope im Gag Protein, ganz besonders in GagR1R3, wichtig für die Kontrolle der Virusreplikation während der chronischen Phase der HIV Infektion ist. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Erkennung von HIV-1 Subtyp A-, C- und D-spezifischen Gag und Nef Epitopvarianten durch CD8 T Zellen untersucht. 83% der Gag-spezifischen Epitopantworten wurden mit den Subtyp C Peptiden detektiert, während lediglich 51% und 57% der Gag-spezifischen Epitopantworten mit den Subtyp A beziehungsweise Subtyp D Peptiden detektiert wurden. Die erhöhte Frequenz Subtyp C-spezifischer Antworten könnte zum Teil mit dem vorherrschenden Vorkommen Subtyp C und Subtyp C-beinhaltenender rekombinanter HIV-I Stämme in Südwest Tanzania zusammenhängen. Dennoch würde die Anzahl der Gag-spezifischen Epitopantworten durch die ausschließliche Verwendung von Subtyp C-spezifischen Peptiden unterschätzt. Die Erkennung von Subtyp-spezifischen Peptidevarianten durch CD8 T Zellen war lediglich für Peptide gleicher Aminosäuresequenz identisch. Für 9 der 16 am häufigsten erkannten Peptide konnte eine abgeschwächte Erkennung von Varianten des selben Peptids mit Aminosäuresequenzunterschieden erklärt werden. Für 4 Peptide konnte eine abgeschwächte Erkennung von Peptidvarianten mit einer unterschiedlichen Positionierung des Epitops innerhalb der Peptidvarianten erklärt werden. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde ein minimales Set aus 15 der am häufigsten erkannten Peptiden zusammengestellt Dieses bestand vor allem aus Subtyp C-spezifischen, aber auch aus Subtyp A- und D-spezifischen Peptiden und wurde anschließend mit peripheren mononuklären Blutzellen ("peripheral blood mononuclear cells", PMBC) von 50 HIV infizierten Personen auf Erkennung getestet. Dieser Peptidpool wurde mit einer durchschnittlichen Frequenz von 715 SFC/106 PBMC von 47 dieser Personen erkannt. Zusammenfassend könnte diese Strategie dazu beitragen, optimale CD8 T Zell Epitopevarianten zu identifizieren, die in HIV Impfungen beinhaltet sein sollten. Im dritten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Gag-spezifische CD8 T Zell Antwort von Studienteilnehmerinnen verglichen, die mit einem oder mehreren verschiedenen HIV-1 Stämmen infiziert waren. Eine Mehrfachinfektion führt dazu, daß mehr Gagepitope erkannten werden. Darüber hinaus war auch die gleichzeitige Erkennung von subtypspezifischen Peptiden in diesen Studienteilnehmerinnen besser ausgeprägt. ... Für einen potentiellen HIV Impfstoff lässt sich aus der vorliegenden Arbeit schließen, daß es entscheidend sein kann, eine effiziente CD8 T Zellantwort zu induzieren. Vor allem sollten hierbei Gag-spezifische Epitopevarianten verschiedener Subtypen berücksichtigt werden.

In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Verfahren zur Induktion von zellulären Immunantworten untersucht, die vor allem einen Schutz gegen intrazelluläre Erreger, wie virale Infektionen bieten sollen. In vivo sind hauptsächlich DCs in der Lage, effizient naive T-Zellen zu stimulieren und so primäre Immunantworten zu induzieren. Außerdem sind DCs die einzigen Zellen, die Protein-Antigene in vivo im MHC-I-Präsentationsweg prozessieren und so ein Cross-Priming von T Zellen induzieren können. Strategien, die die Expression oder die Präsentation eines Antigens in DCs in vivo und in vitro ermöglichen, würden demnach eine erfolgsversprechende Immunisierungs-Strategie darstellen. Darauf basierend wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht: (1) ob und in welchen Rahmen DCs bei Immunisierungs-Strategien mit "Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus" (AcMNPV) transfiziert werden und (2) ob das HCMV-Tegumentprotein pp65 Eigenschaften aufweist, die es als potentielles Trägersystem für Proteinantigene in den Cross-Präsentationsweg von iDCs geeignet macht. (1) Es konnte in Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass humane iDCs in geringem Umfang gp64-abhängig durch rAcMNPV infiziert werden. Dies erlaubt eine transiente Expression von Reportergenen in den iDCs. Allerdings sinkt die Expression schnell ab, so dass zu dem Zeitpunkt optimaler Aktivierung der DCs durch AcMNPV die Expressionsstärke gering ist. Im Gegensatz zu iDCs können hingegen optimal aktivierte mDCs nicht von rAcMNPV infiziert werden. Da AcMNPV im hohen Grade in der Lage ist, DCs zu aktivieren, aber nur mit geringer Effizienz die iDCs infiziert, ist die Immunisierung mit rAcMNPV in vivo demnach wahrscheinlich von der Cross-Präsentation von Antigenen aus infizierten Körperzellen abhängig. (2) Das HCMV-Tegumentprotein pp65 vermittelt eine effizientere Bindung gekoppelter Proteine an iDCs, als die beschriebenen Protein-Transduktionsdomänen TatPTD und Penetratin. Außerdem vermittelt pp65 die Aufnahme fusionierter Proteine in iDCs. Darüber hinaus wird pp65 in iDCs effizient in den Cross-Präsentationsweg geschleust und induziert bei geringer Stoffmengenkonzentration CD4+ und CD8+ Gedächtnis- T Zell-Antworten. Obwohl pp65 keinen Einfluß auf die Aktivierung von DCs hat, stellt es ein vielversprechendes System dar, um fusionierte Proteine in den Cross-Präsentationsweg von DCs zu schleusen. In Kombination mit einem Adjuvans könnten so effektive zelluläre Immunantworten induziert werden. Die getesteten Systeme zur DNA- als auch Protein-Immunisierung sind beide Kandidaten zur Induktion von zellulären Immunantworten. Sie besitzen spezifische Eigenschaften, beispielsweise führt AcMNPV zu einer sehr effizienten Aktivierung von DCs, pp65 dagegen nicht. Andererseits ist die Effizienz der Infektion von iDCs durch AcMNPV gering, während pp65 sehr effizient von iDCs cross-präsentiert wird. Die vorliegenden Untersuchungen bieten in ihrer Gesamtheit einen Ansatzpunkt, um die Systeme für eine spezifische Anwendung in vivo zu optimieren. Intracellular pathogens, like viruses, are eliminated by cellular immune responses. During this work I investigated several systems to induce these immune responses. In vivo, primary T cell are mainly induced by dendritic cells (DCs). These are also the only cells to cross-present and finally cross-prime naive T cells with protein antigens in vivo. Immunization-strategies address therefore the expression and the presentation of antigens in DCs. Based on these findings, it was investigated: (1) whether and how efficient "Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus" (AcMNPV) is able to infect DCs and (2) whether the HCMV-tegument-protein pp65 shows properties of an efficient carrier system for antigens into DCs. (1) Human iDCs got infected by rAcMNPV with low efficiency. This infection was dependent on gp64. The infection of iDCs resulted in a transient expression of the reporter genes encoded by rAcMNPV. The levels of expression were decreasing rapidly. This results in low expression levels at the timepoint of optimal AcMNPV-mediated activation of DCs. In contrast activated mDCs were not infectable by rAcMNPV. Taken together, AcMNPV strongly activates DCs, but does infect DCs only with low efficiency. Therefore it is likely, that In-Vivo-immunization with rAcMNPV leads mainly to the infection of body cells other than DCs. The antigen from these cells might then be cross-presented by rAcMNPV-activated DCs. (2) Proteins, fused to HCMV-tegument-protein pp65 were bound with higher efficiency to DCs than those fused to the described protein-transduction-domains (PTD) TatPTD and Penetratin. Furthermore, the fusion of pp65 to proteins also led to an enhanced uptake by iDCs. Pp65 alone is inducing strong CD4+ und CD8+ memory-T cell-responses when taken up by DCs. Therefore it is also efficiently cross-presented by these cells. Taken together, pp65 is a promising candidate to direct fused antigens into the cross-presentation pathway of DCs. The pp65 does not activate DCs, but could be used to induce effective T cell responses in combination with adjuvants. The tested systems both contribute to the induction of cellular immunity. They both harbour specific advantages and disadvantages. Whereas AcMNPV leads to a very efficient activation of DCs, pp65 is not able to activate these cells. On the other hand, rAcMNPV does infect iDCs with low frequency. In contrast to this, pp65 is taken up and cross-presented very efficiently. These findings allow further optimization of the systems for specific In-Vivo-application.

Siedlungs- und Bevölkerungsgeschichte (des Kantons Schwyz) seit dem 18. Jahrhundert. La "Geschichte des Kantons Schwyz“ a été éditée en sept volumes sous la direction de la Société historique du Canton de Schwytz. Parmi la cinquantaine de contributions de ce très bel ouvrage, richement illustré, se trouve une contribution du Professeur Martin Schuler portant sur l’évolution démographique de l’habitat du 18e siècle à nos jours. L’article met l’accent sur la comparaison de périodes démographiques très différentes, allant de l’expansion de l’habitat vers les hautes altitudes durant les 18e et 19e siècles, et ce, en lien avec l’intensification de la production fromagère, puis de l’industrialisation à domicile, vers une longue période d’émigration et d’exode rural jusqu’en 1950, suivi par l’intégration du canton dans l’agglomération zurichoise, puis – très récemment – la création de pôles métropolitains au bord du Lac de Zurich. L’article, appuyé par une cartographie abondante, se base sur une saisie historique de l’habitat dispersé sur trois périodes (1910, 1960, 2000). L’évolution de l’habitat de Schwytz est marqué par des interventions parmi les plus massives connues en Suisse : la destruction de Goldau par l’éboulement du Rossberg en 1806, la création de grands barrages avec relocalisation de nombreuses habitants (Wägital 1922, Sihlsee, 1937), mais aussi la création de nouveaux villages, au 19e siècle, liés à l’industrialisation (Siebnen), au tourisme (Brunnen), au chemin de fer (Goldau, Pfäffikon) ou encore aux institutions ecclésiastiques (Ingenbohl, Immensee et bien sûr le vieux site d’Einsiedeln). Le canton de Schwyz a donc vécu sa modernisation en marge des structures communales traditionnelles et sans les traits classiques de l’urbanisation. Et, plus récemment, le canton marque un revirement tardif et fondamental, se hissant à la tête des cantons suisse quant à sa croissance démographique.