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Fortgeschrittene Nierenzellkarzinome werden in der urologischen Praxis immer wieder diagnostiziert und stellen häufig eine interdisziplinäre Herausforderung dar. Die Therapie wird individuell unter Berücksichtigung von Allgemeinzustand, Komorbiditäten, Tumorlast und -progress stattfinden. Hierbei haben die Tumornephrektomie respektive die nierenerhaltende Primärtumorresektion und auch die Metastasenchirurgie immer noch einen sehr hohen Stellenwert und stellen auch den einzigen bislang bekannten kurativen Ansatz dieser Erkrankung dar.

Despite enduring research the exact function of the glomerular filtration barrier has not yet been fully understood. Throughout a human lifetime more than 300 tons of plasma proteins enter the glomerular filter - without it ever showing signs of clogging. Hausmann et al. developed a model which approaches this question by considering electrokinetic effects within the glomerulus. According to their theory a filtration- dependent potential difference (streaming potential) is generated across the filter which influences charged plasma components. Via electrophoresis this potential carries negatively-charged molecules (such as albumin) against the pressure gradient back into the blood stream. Positively-charged plasma components are disposed into the urine: Thus the filter will not clog in an entire lifetime! The aim of this study was to examine the impact of streaming potentials in vivo using a rat model. In order to achieve this goal a new surgical method could be established that allowed the application of an electrical field via electrodes immediately onto the surface of the rat kidney. This extrinsic field meant to interfere with the potential within the kidney resulting in increased proteinuria, thus proving its significance in the functional properties of the glomerular barrier. Examinations were performed intraoperatively on sedated test animals with individual urine collection from both cannulated ureters. Therefore at any given time throughout the experiment urine samples of the contralateral kidney could be used as a control test and compared to those of the kidney within the electrical field. Furthermore, a central venous line allowed flexible fluid management as well as the administration of drugs during the procedure. An additional arterial line made a continuous invasive circulatory monitoring of the test animal possible. Upon analysis of the collected urine samples the postulated correlation of applied current and increased proteinuria could not be verified. As potential cause for this result it was discussed that no homogeneous electrical field could be generated across the entire kidney parenchyma. Furthermore, the kidney function was impaired by several factors throughout the procedures. Therefore, a significant influence of these factors on proteinuria during the experiments must be assumed. Based on the findings of this study further experiments are necessary in order to characterise the intrinsic electrical field of the kidney in more detail. In order to achieve this goal succeeding experiments using a modified version of the method established in this study could be performed. Another conceivable solution would be a transfer of the gained findings into an alternative experimental setup. For the latter option, it is a further examination of the streaming potential by means of the isolated perfused kidney model that appears particularly promising. Putting these approaches into practice could lead to a deeper understanding of the glomerular filter.

Ultrasonography of a six-year-old Simmental cow revealed an abscess like structure, approximately 15 cm in diameter, in place of the right kidney. The cow had a history of colic for 4 days and was referred to our clinic with a tentative diagnosis of caecal dilatation. The cow voided dark opaque urine with white floccules. Laboratory examination yielded increased haematocrit, leukocytosis with left shift, hyperbilirubinaemia and azotaemia. The diagnosis was confirmed, the caecum emptied surgically and the pus-filled structure at the site of the right kidney removed. A diagnosis of pyonephrosis was made after pathological examination of the pus-filled structure.

Polychlorierte Dibenzo-p-dioxine wie 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD), die zur Stoffgruppe der polyhalogenierten Kohlenwasserstoffe gehören, sind lipophile und persistente Umweltkontaminanten. Sie entstehen als unerwünschte Verunreinigungen bzw. Begleitstoffe vor allem während Verbrennungsprozessen organischer Materialien wie Holz oder Müll, im Tabakrauch sowie als Nebenprodukt chlororganischer Synthesen. Aufgrund ihrer hohen Lipophile reichern sie sich in der Nahrungskette an. Dioxine wie TCDD verursachen eine Vielzahl von biochemischen und toxischen Effekten wie z.B. Enzym-Induktion, Lebertoxizität, dermale Toxizität, Immuntoxizität und Kanzerogenität. Im Tiermodell konnte eine Beeinträchtigung des Fortpflanzungssystems und des Hormonhaushaltes beobachtet werden. In der Literatur herrscht Einigkeit, dass die meisten wenn nicht sogar alle toxischen Wirkungen der Dioxine über den Aryl-Hydrocarbon-Rezeptor (AhR) vermittelt werden. Im letzten Jahrzehnt konnten jedoch in mehreren Studien AhR-unabhängige TCDD-Wirkungen beobachtet werden. Nur wenige Studien befassen sich mit der Niere als Zielorgan, wobei belegt werden konnte, dass der AhR auch für die Entwicklung der Niere eine wichtige Rolle zu spielen scheint. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde eine Tierstudie mit Wildtyp- und AhR-defizienten-Mäusen durchgeführt und dabei auch die Niere als Zielorgan betrachtet. Zunächst wurden weibliche und männliche Wildtyp- und AhR-defiziente-Mäuse einmalig mit TCDD (25 µg/kg KG) oral behandelt. Anschließend wurden Genexpressionsmuster in den Nieren mittels Microarray analysiert. In den Nieren behandelter Wildtyp-Mäuse wiesen 172 Gene, und in den Nieren behandelter AhR-defizienter-Mäuse wiesen 325 Gene eine veränderte Expression auf. In den Nieren behandelter AhR-defizienter-Mäuse wurden Gene hochreguliert, die in Prozesse des blutbildenden Systems, der Blutgerinnung sowie der Biosynthese von Sterolen und des Katabolismus von organischen Säuren involviert sind. Herrunterreguliert wurden Gene, die in Prozesse des Lipidmetabolismus, der Biosynthese sowie des Metabolismus kleinerer Moleküle und des Metabolismus von Hormonen involviert sind. Mittels RT-PCR wurde die im Microarray beobachtete erhöhte Expression einiger ausgewählter Gene des blutbildenden Systems (z. B. Hba-a1, Hbb-b1 und Rps14) und der Blutgerinnung (z. B. Fgg und F10) sowie einiger hepatischer Gene wie Lpl, Anxa1, c-Myc, Igfbp1, Esm1 und Cdh1 (Microarray-Analyse der Lebern wurde in einer früheren Studie gemessen) bestätigt. Des Weiteren wurde eine leichte, teilweise signifikant erhöhte Expression einiger pro-bzw. antiinflammatorischer Zytokine (IL-1α, IL-1ß, Il-6, IL-10 und TNF-α) in den Lebern und Milzen behandelter AhR-defizienter-Mäuse beobachtet. Die Induktion fremdstoffemtabolisiernder Enzyme wie Cyp1a1, Cyp1a2 und Cyp1b1 in den Organen Leber, Niere, Lunge und Milz behandelter Wildtyp-Mäuse konnte mittels Western-Blot und RT-PCR bestätigt werden, jedoch mit einer Ausnahme. In den Milzen behandelter Wildtyp-Mäuse konnte keine Induktion dieser Enzyme auf mRNA-Ebene beobachtet werden. In den Lebern behandelter AhR-defizienter-Mäuse war die Cyp1b1-Expression signifikant erhöht sowie die AhR-Expression vermindert. Die Induktion der Vitmain D-Rezeptor (VDR)-regulierten Gene Cyp24a1, Cyp27b1 und VDR in den Nieren behandelter AhR-defizienter-Mäuse weist auf die Aktivierung des VDR hin. Des Weiteren stellt die verminderte Expression von c-Myc in den Nieren TCDD-behandelter Knockout-Mäuse ein Hinweis für die Aktivierung des VDR dar. Durch HPLC/MS-MS-gestützte Untersuchung des Vollblutes von AhR-Wildtyp- und AhR-Knockout-Mäusen konnten Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen den Genotypen bestimmt werden. So war es möglich Unterschiede im Aminosäuremetabolismus sowie im Tryptophan-Metabolismus zu identifizieren. Außerdem konnte gezeigt werden, dass sowohl im unbehandelten wie auch im TCDD-behandelten Zustand, Unterschiede zwischen den Genotypen bestanden. Polychlorinated dibenzo-p-dioxins like 2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxine (TCDD), which belong to the class of polyhalogenated aromatic hydrocarbons, are lipophilic and persistent environmental pollutants. They are generated as unwanted contaminants and by-products in chemical combustion processes for example waste and sewage sludge incinerations as well as in other chemical processes such as paper pulp bleaching or metal smelting. Due to their high persistence they accumulate in the feed and food chain. Dioxins evoke a broad spectrum of biochemical and toxicological effects like enzyme induction, hepatotoxicity, dermal toxicity, immunotoxicity and carcinogenicity. Adverse effects on reproduction, development, and the endocrine system have been demonstrated in numerous animal studies. Most, if not all, toxic effects of dioxins are mediated by the aryl-hydrocarbon-receptor (AhR). In the last decade AhR-independent TCDD-effects were observed in some studies. Only a few studies address the kidney as a target organ of TCDD, although the AhR seems to play an important role in kidney development. In the present work an animal study with AhR wild-type (AhR+/+) and AhR-deficient (AhR-/-) mice was performed. In this study female and male AhR+/+ and AhR-/- mice were treated with a single dose of TCDD (25 µg/kg bw) by gavage. A microarray analysis of renal gene expression patterns was performed aiming to characterize AhR-dependent and AhR-independent TCDD-mediated effects in AhR wild-type and AhR-Knockout mice. As a result of this study, 172 genes were regulated in the kidney of wild-type mice and 325 genes in the kidney of AhR-deficient mice. TCDD-treatment of AhR-/- mice resulted in upregualtion of genes involved in processes of hematopoietic system, blood coagulation, biosynthesis of sterols and catabolism of organic acids and downregulation of genes involved in processes of lipid metabolism, biosynthesis and metabolism of small molecules as well as hormone metabolism. Increased expression of a few selected renal genes of the hematopoietic system (e.g. Hba-a1, Hbb-b1 and Rps14), blood coagulation (e.g. Fgg and F10), as well as some hepatic genes such as Lpl, Anxa1, c-Myc, Igfbp1, Esm1 and Cdh1 (observed in earlier studies) were analyzed and confirmed by RT-PCR. In liver and spleen a slight and partly significant induction of some anti- and pro-inflammatory cytokines (IL-1α, IL-1ß, IL-6 and TNF-α) was determined. Furthermore the induction of the xenobiotic metabolizing enzymes Cyp1a1, Cyp1a2 and Cyp1b1 in liver, kidney, lung and spleen of TCDD-treated AhR wild-type mice were analyzed and confirmed by western blot and RT-PCR. With one exception, in spleen of treated wild-typ mice no induction was observed in RT-PCR. In livers of treated AhR-/- mice, the Cyp1b1-expression was significantly increased while gene expression of AhR was decreased. The induction of the vitamin d-receptor (VDR) regulated genes Cyp24a1, Cyp27b1 and VDR in kidneys of treated AhR-Knockout mice indicates an activation of VDR. Furthermore the additionally decreased c-Myc-expression in kidneys of treated AhR-deficient mice supports the proposed activation of VDR. Investigating the role of AhR in the metabolome, differences and similarities between AhR-deficient and wild-type mice were determined by HPLC/MS-MS analysis of mouse whole blood of each genotype with and without TCDD-treatment. Differences in amino acid and tryptophan metabolism between AhR+/+ and AhR-/- were observed.

Almost all progressive renal diseases lead to chronic kidney disease (CKD) and development of renal fibrosis. With a prevalence of more than 10% worldwide new therapeutic options are urgently needed. Today's only option for patients with end stage renal disease (ESRD) is renal replacement therapy (dialysis and kidney transplantation). Mesenchymal stem cell (MSC) transplantation could represent such a new therapy since it has the potential for organ repair. Nevertheless, some factors might lessen the regenerative potential of MSCs, e.g. donor age or systemic disease. In addition, first reports showed both antifibrotic as well as profibrotic effects after MSC therapy in different organs. In the present study the effect of bone marrow MSC transplantation into rats with 5/6 nephrectomy (remnant kidney RK) was investigated. Repeated MSC applications failed to improve renal function or kidney fibrosis. Next we analyzed the effects of CKD on bone marrow MSC function. Bone marrow MSCs were isolated from CKD rats (remnant kidney (CKD-RK-MSC) and adenine induced nephropathy (CKD-AD-MSC)) and compared to healthy MSC. We found signs of premature senescence in vitro: reduced proliferation capacity, spontaneous adipogenesis and accummulation of actin stress fibers and senescence-associated-beta-galactosidase. The in vivo functionality of CKD-MSCs was tested in rats with acute anti-Thy1.1-nephritis, where healthy MSCs have been shown to be beneficial. Rats received healthy MSCs, CKD-RK-MSC, CKD-AD-MSC or medium by injection into the left renal artery. Kidneys receiving healthy MSCs exhibited accelerated healing of glomerular lesions, whereas CKD-RK-MSC or CKD-AD-MSC or medium exerted no benefit. Another histological analysis showed that CKD can also influence a newly identified intrarenal cell population, which might have progenitor qualities. Taken together this study shows that CKD can influence the phenotype and function of bone marrow MSC and intrarenal cells. CKD-MSC show signs of premature senescence which might account for a reduced regenerative capacity. This emphasizes the importance of further studies identifying uremia-associated mechanisms that account for altered MSC function to ensure clinical safety of autologous MSC therapy in human renal diseases.

Computed tomographic (CT) findings of the urinary tract and adrenal glands of five healthy male calves in the first 105 days of life were compared with corresponding cadaver slices. The structures seen on CT images were identified using the corresponding cadaver slices. CT produced exact images of the kidneys, urinary bladder, urethra and adrenal glands, but reliable images of the ureters were only obtained near the renal hilus. There was excellent agreement between the structures on the CT images and the tissue slices. The structure and vessels of the kidneys, the origin of the ureters, the location, size and content of the urinary bladder and the course of the urethra in the pelvis and penis were evident on images. The size and volume of the kidneys and the length and width of the adrenal glands increased significantly during the study, but the ureteral and urethral diameters changed little.In der vorliegenden Arbeit werden die computertomographischen (CT) Befunde an Harnapparat und Nebennieren von 5 gesunden männlichen Kälbern von der Geburt bis zum Alter von 105 Tagen beschrieben und mit denjenigen der postmortalen Untersuchung verglichen. Nieren, Harnblase, Urethra und Nebennieren konnten computertomographisch exakt dargestellt werden, während die Ureteren nur im Bereich des Hilus renalis zuverlässig identifiziert werden konnten. Die Topographie der Organe bzw. der Strukturen und der anatomischen Schnittpräparate stimmten sehr gut überein. An den Nieren waren die Struktur und die Blutgefässe, an den Ureteren deren Anfangsteil, an der Harnblase Lage, Grösse und Inhalt und an der Urethra der Verlauf im Becken und Penis zu sehen. Die Ausdehnung und das Volumen der Nieren nahmen von der ersten bis zur sechsten Untersuchung signifikant zu. Das Gleiche gilt für die Länge und Breite der Nebennieren, während sich die Durchmesser von Ureteren und Urethra kaum veränderten.Dans le présent travail, on décrit les constatations tomodensitométriques sur l'appareil urinaire et les surrénales de 5 veaux mâles en bonne santé dans les 105 premiers jours de vie et on les compare avec les résultats des examens post-mortem. Il est possible de visualiser exactement les reins, la vessie, l'urètre et les surrénales par tomodensitométrie alors que les uretères ne peuvent être identifiés de façon sûre que dans la zone du hile rénal. La topographie des organes et leur structure correspondent très bien aux coupes anatomiques. Il est possible de visualiser la structure et les vaisseaux des reins, le début des uretères, la position, la taille et le contenu de la vessie et le parcours de l'urètre dans le bassin et le pénis. L'extension et le volume des reins augmentent de façon significative entre le premier et le sixième examen. Il en est de même pour la longueur et la largeur des surrénales, alors que les diamètres des uretères et de l'urètre ne changent presque pas.In questo studio sono stati descritti i risultati della tomografia computerizzata (CT) dell'apparato urinario e delle ghiandole surrenali di 5 vitelli sani dalla nascita fino al 105esimo giorno di vita e confrontati con le analisi post mortem. Reni, vescica, ureteri e ghiandole surrenali possono essere visualizzati precisamente tramite la tomografia computerizzata, mentre gli ureteri possono essere localizzati solo in modo affidabile nella zona dell'ilo renale. La topografia risp. le strutture degli organi e i preparati anatomici coincidevano molto bene. Ben visibili nei reni vi erano la struttura e i vasi sanguigni, negli ureteri la loro parte iniziale, nella vescica la posizione, le dimensioni e il contenuto e nell'uretra il corso nelle pelvi e nel pene. La dilatazione e i volumi dei reni aumentavano significativamente dalla prima alla sesta analisi. Lo stesso vale per le lunghezze e le larghezze delle ghiandole surrenali, mentre il diametro degli ureteri e dell'uretra rimaneva quasi immutato.

Hintergrund und Ziele: Tubulointerstitielle Fibrose ist ein häufiges Merkmal chronischer Nierenerkrankungen unabhängig von ihrer Genese. In dem fibrotisch veränderten Gewebe kommt es zu einem Mangel an Sauerstoff (Hypoxie). Hypoxie ihrerseits beeinflusst die Genexpression renaler Zellen und kann zur Entwicklung der Fibrose beitragen. Zur Regulation der Genexpression von profibrotischen Proteinen gab es zu Beginn der Arbeit in humanen Epithelzellen erst wenige Daten. Deshalb sollte am Beispiel des profibrotischen Proteins Connective Tissue Growth Factor (CTGF) die Wirkung von Hypoxie in humanen tubulären Epithelzellen untersucht werden. Methoden: Es wurden humane primäre Tubulusepithelzellen der Niere (human primary tubular epithelial cells - hPTECs) untersucht. Diese wurden aus tumorfernen gesunden Kortexanteilen von Nieren gewonnen, die bei Nephrektomien entnommen werden mussten. Die Primärzellen wurden durch die Proteine E-Cadherin, N-Cadherin und Cytokeratin immuncytochemisch charakterisiert. Vergleichende Untersuchungen wurden mit der proximalen Tubulusepithelzelllinie HK-2 durchgeführt. Die Expression von CTGF wurde auf mRNA- und Proteinebene unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen untersucht. Für hypoxische Bedingungen wurden die Zellen entweder in 1% O2-Gehalt kultiviert oder mit dem Prolylhydroxylase-Inhibitor DMOG stimuliert, der den Hypoxie-induzierten Faktor HIF stabilisiert. Zusätzlich erfolgte eine Stimulation mit dem profibrotischen Zytokin TGFβ. Die RNA-Expression wurde mittels real-time RT-PCR und die Protein-Expression mittels Western-Blot analysiert bzw. durch Immuncytochemie dargestellt. Ergebnisse und Beobachtungen: Anhand der Expression von E-Cadherin und N-Cadherin zeigte sich, dass die isolierten Primärzellen eine Mischung von proximalen und distalen Tubulusepithelzellen darstellen. Die weitere Charakterisierung der Zellen zeigte, dass die Zelldichte einen wesentlichen Einfluss auf die basale und die durch TGFβ induzierte CTGF-Expression hatte. Entgegen den Erwartungen führte Hypoxie bzw. die Behandlung mit DMOG nicht zu einer Induktion sondern zu einer Reduktion der CTGF mRNA- und CTGF Protein-Expression, wenn die Zellen über eine Zeitspanne von bis zu 24 Stunden kultiviert wurden. Hypoxische Präinkubation vor einer Stimulation mit TGFβ führte zu einer Reduktion der stimulierten CTGF-Expression. Dieser Effekt der Hypoxie war ursächlich auf den HIF-Signalweg zurückzuführen, da eine Hemmung der HIF-Expression durch siRNA die Reduktion der CTGF-Expression verhinderte. Praktische Schlussfolgerungen: In Untersuchungen der letzten Jahre wurde beobachtet, dass Hypoxie neben schädigenden Einflüssen auch protektive Wirkungen haben kann. Dazu passen die Daten dieser Arbeit, die zeigen, dass die Expression des profibrotischen Proteins CTGF durch Hypoxie reduziert wurde. In Zukunft wäre ein therapeutischer Einsatz von Substanzen zur gezielten HIF-Stabilisierung denkbar, um Schutzmechanismen der Zellen zu aktivieren und so mögliche Nierenschäden abzumildern. Background and Aims: Tubulointerstitial fibrosis is a common feature of chronic kidney diseases independent of their genesis. In fibrotic tissues there does occur a deficiency of oxygen (hypoxia). Hypoxia for its part exerts influence on the gene expression of renal cells and can account for the development of fibrosis. At the beginning of this study there did exist only few data relating to the regulation of gene expression of profibrotic proteins in human epithelial cells. Therefore the effects of hypoxia in human tubular epithelial cells on the basis of the profibrotic protein Connective Tissue Growth Factor (CTGF) should be examined. Methods: Human primary tubular epithelial cells (hPTECs) of the kidney were examined. These were obtained from healthy parts of the cortex distant to the tumor of kidneys that had to be resected in the context of tumornephrectomies. The primary cells were characterized by the use of immunocytochemical staining of the proteins E-Cadherin, N-Cadherin and Cytokeratin. Comparative analyses were performed with the proximal tubular epithelial cell line HK-2. The expression of CTGF was examined under normoxic and hypoxic conditions on mRNA and protein level. For hypoxic conditions cells were cultivated in 1% O2-content or stimulated with the prolylhydroxylase-inhibitor DMOG, which stabilizes the hypoxia-induced factor HIF. Additionally, cells were stimulated with the profibrotic cytokine TGFβ. The RNA expression was shown via real-time RT-PCR and the protein expression was shown by Western-Blot analysis and immunocytochemistry respectively. Results: On the basis of the expression of E-Cadherin and N-Cadherin it could be demonstrated that the isolated primary cells consist of a mixture of proximal and distal tubular epithelial cells. Further characterization of the cells showed that the cell density exerted an essential influence on the basal and TGFβ induced CTGF expression. Contrary to expectations hypoxia and treatment with DMOG respectively did not lead to the induction but to a reduction of CTGF mRNA and protein expression, when the cells were cultivated for a time period of up to 24 hours. Hypoxic preincubation before stimulation with TGFβ resulted in a reduction of the stimulated CTGF expression. This effect was ascribed to the HIF signaling pathway, because the inhibition of the HIF expression by siRNA treatment prevented the reduction of CTGF expression. Conclusions: Research during the last years showed that hypoxia can besides hazardous influence also have protective effects. These results are in accord with the data of this study, which show that the expression of the profibrotic protein CTGF was reduced by hypoxia. In the future a therapeutic use of substances for targeted HIF stabilization and following activation of protective mechanisms of the cells and thereby attenuation of potential kidney injury is imaginable.

Hintergrund und Ziele Neurone der Hinterwurzelganglien zeigen durch Stimulation hervorgerufene elektrophysiologische Reaktionen in Form von Aktionspotentialen. Spezifisch auf Neurone mit Afferenzen zur Niere bezogene Vordaten offenbaren während elektrischer Stimulation voneinander abweichende Antwortverhalten – entweder als kontinuierliche Abfolge von Aktionspotentialen (tonisches Verhalten) oder lediglich einmalige Reaktion (phasisches Verhalten). Ausgehend von vorherigen Versuchen, die unterschiedliche Aktivierungskurven für Natriumkanäle in Neuronen beider Gruppen erkennen lassen, wird das Augenmerk der Untersuchungen auf spannungsabhängige Natriumkanäle gelegt. Die Forschungshypothese lautet nun, dass tetrodotoxin (TTX-) resistente Natriumkanäle eine wichtige Rolle für das Auftreten eines tonischen Antwortverhaltens auf Stimulationsreize an peptidergen afferenten Nervenfasern spielen. Zusätzlich wird im Rahmen eines weiteren Versuchs ein potentieller Einfluss des verwendeten Tracers bzw. seiner Trägerlösung auf das Antwortverhalten untersucht. Methoden Die Untersuchungen werden an Neuronen der Hinterwurzelganglien vorgenommen, die aus männlichen Sprague-Dawley-Ratten stammen. Zur Identifikation der spezifisch renalen neuronalen Somata werden ihre Nieren mit einem farbstoffartigen Tracer subkapsulär beimpft. In der nach einer Woche Einwirkzeit gewonnenen Zellkultur afferenter Neurone können so renale von nichtrenalen Neuronen unterschieden werden. Die Neurone werden mittels Patch-clamp-Technik zunächst im Current-clamp-Modus und anschließend im Voltage-clamp-Modus untersucht. Darüber hinaus vergleicht der Kontrollversuch Daten aus Patch-clamp-Experimenten mit neuronalen Zellkulturen, die entweder ohne jeglichen Zusatz, mit Farbstoff oder auch mit Ethanol inkubiert werden. Ergebnisse und Beobachtungen Im Hauptversuch werden insgesamt etwa gleich viele tonische und phasische Neurone gefunden. Die Wahrscheinlichkeit bei renalen Neuronen auf tonische Neurone zu treffen, ist signifikant höher als bei nichtrenalen Neuronen. Phasische Neurone sind im mikroskopischen Durchmesser kleiner als tonische Neurone; ein ähnlicher Vergleich ihrer Zellkapazitäten offenbart hier aber keine signifikanten Unterschiede. Die normalisierte Rheobase ist in tonischen Neuronen signifikant geringer als in phasischen Neuronen und sinkt mit steigender Anzahl von Aktionspotentialen. Tonische Neurone sind durch signifikant höhere Schwellenpotentiale, Overshoots und längere Zeiten im Auf- und Abstrich der Aktionspotentiale gekennzeichnet. Außerdem zeichnen sich ihre Abstriche durch signifikant flachere Gefälle und häufigere Schulterbildung aus. Tonische Neurone weisen im Voltage-clamp-Modus signifikant höhere Natriumgesamtstromdichten sowie depolarisierter liegende Potentiale für die spannungsabhängige Aktivierung auf. Die Letztgenannten korrelieren signifikant positiv mit den Overshoots und der Dauer der Aktionspotentiale sowie negativ mit den Natriumgesamtstromdichten. Im Kontrollversuch konnten im Hinblick auf die Hauptparameter keine signifikanten Unterschiede zwischen unbehandelten, farbstoffbehandelten und ethanolbehandelten Neuronen beobachtet werden. Praktische Schlussfolgerungen Die Ergebnisse legen ein spezifisches Innervationsmuster in Bezug auf die vorwiegend tonischen renalen Neurone offen. Die Analyse der Aktionspotentiale und Natriumströme gibt deutliche Hinweise für die ursächliche Beteiligung des TTX-resistenten Natriumkanals Nav1.8 an diesem Verhalten, wohingegen überwiegend TTX-sensible Natriumkanäle das Verhalten der Vergleichsneurone bestimmen. Die angewandte Färbetechnik für renale Neurone scheint keinen Einfluss auf die untersuchten Parameter zu haben. Background and aims Upon stimulation dorsal root ganglion neurons show electrophysiological reactions in the form of action potentials. Preliminary data specifically referring to renal afferent neurons reveal variant responses, respectively continuous firing (tonic behaviour) or solely one-time action potentials (phasic behaviour). Based on previous experiments which show distinct activation curves for sodium channels in neurons of both groups, the attention is turned to voltage-gated sodium channels. The research hypothesis is now that tetrodotoxin (TTX-) resistant sodium channels play an important role for the occurance of tonic response upon stimulation in peptidergic afferent nerve fibres. Additionally a potential influence of the used tracer or its carrier solution on firing properties is investigated in yet another experiment. Methods Experiments are performed with dorsal root ganglia (DRG-) neurons from male Sprague-Dawley rats. To identify particular renal neuronal somata, their kidneys are inoculated subcapsulary with a dyestuff-like tracer. Like this, renal neurons can be distinguished from non-renal ones in the obtained cell culture of afferent neurons after a week of taking effect. The neurons are analyzed using patch clamp technique, initially in current clamp mode and subsequently in voltage clamp mode. Furthermore the control experiment compares data obtained in patch clamp experiments with neuronal cell cultures which are either incubated blank, with the dye-stuff, or with ethanol. Results and observations Overall about the same quantities of tonic and phasic neurons are found in the main study. In renal neurons, tonic neurons can be found significantly more likely than in non-renal ones. Rated microscopically, phasic neurons have smaller diameters than tonic neurons, but a similar comparison between their cell capacities reveals no significant differences. Normalized rheobase is significantly lower in tonic neurons compared to phasic ones and declines with increasing numbers of action potentials. Tonic neurons are characterized by significantly higher voltage thresholds, higher overhoots and longer periods in upstroke and downstroke of action potentials. In addition, their downstrokes feature significantly gentler slopes and inflections more frequently. In voltage clamp mode tonic neurons display significantly higher total sodium current densities and also more depolarized voltage dependences of activation. The latter correlate significantly and positively with overshoots and the duration of action potentials and negatively with the total sodium current densities. In control experiment no significant differences with regards to major parameters are noticed in untreated neurons and neurons incubated with dyestuff or ethanol. Conclusions The results reveal a specific innvervation pattern with regard to predominantly tonic renal neurons. Analysis of action potentials and sodium currents strongly indicate a causative involvement of tetrodotoxin (TTX-) resistant sodium channel Nav1.8 in this behavior, whereas the behavior of comparison neurons is determined by predominantly TTX-sensitive sodium channels. The applied technique for staining renal neurons appears to have no influence on the researched parameters.

1) Hintergrund und Ziele der Studie Sowohl in tierexperimentellen als auch in humanen Studien ist gezeigt worden, dass Adipositas zu einem erhöhten Risiko für eine chronische Niereninsuffizienz führt [20, 28, 47]. Es finden histologische Veränderungen im Sinne einer Obesity Related Glomerulopathy (ORG) [106] und eine niederschwellige systemische Inflammation statt [106, 125]. Dennoch ist es noch weitgehend ungeklärt, ob postnatale Hyperalimentation zu einem Funktionsverlust der Niere führt. Daher ist es das Ziel dieser Arbeit letzteres und eine sich eventuell entwickelnde profibrotische Neigung mit Inflammation sowie eine Veränderung von Signalwegen des Systems zwischen Leptin und dem sympathischen Kotransmitter Neuropeptid Y (NPY), zu untersuchen. 2) Methoden Die postnatale Hyperalimentation wurde durch eine Reduktion der primären Wurfgröße am postnatalen Lebenstag (P) 1 erreicht. Nach 24-stündiger Haltung in metabolischen Käfigen wurden die Tiere am Tag P70 getötet. Aus entnommenem Nierengewebe wurden Polymerase-Kettenreaktionen durchgeführt, um die Genregulation von NPY, seinen Rezeptoren, verschiedenen Adipozytokinen wie Leptin und Interleukin 6 zu untersuchen. Weiter wurden Western Blots von Interleukin-6, Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT-3) und Suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS-3) durchgeführt. Auch wurde eine Immunhistologie von Kollagen I angefertigt. 3) Ergebnisse und Beobachtungen Veränderungen betrafen nicht nur den Phänotyp der hyperalimentierten Tiere mit erhöhtem Körpergewicht, sondern sie manifestierten darüber hinaus eine eingeschränkte glomeruläre Nierenfunktion mit Veränderung der extrazellulären Matrix durch verstärkte Kollagen I Bildung, erhöhter Expression lokaler proinflammatorischer Zytokine wie IL-6 und des ebenso proinflammatorischen Peptidhormons Leptin. Im Gegensatz dazu war antiinflammatorisch wirkendes IL-10 vermindert. In hyperalimentierten Würfen kam es weiter zu einer verstärkten NPY-Expression mit einer Modifikation der Leptinsignalkaskade über STAT-3, da sowohl der Anteil an phosphoryliertem, also aktiven STAT-3 geringer und der Anteil des unphosphorylierten STAT-3 erhöht waren. Zusätzlich war mehr SOCS-3 messbar. 4) Praktische Schlußfolgerungen Zusammenfassend zeigt die vorgelegte Studie, dass postnatale Hyperalimentation vor allem bei einer Wurfreduktion auf sechs Tiere Veränderungen im renalen Leptin-NPY-System hervorruft, die am postnatalen Lebenstag P70 persistieren. Damit hat eine Programmierung des renalen Leptin-NPY-Systems stattgefunden. Wahrscheinlich kommt es im Rahmen der lokalen Leptinvermehrung zu einer Sympathikusaktivierung mit NPY-Freisetzung, das wiederum als Stimulus für eine IL-6-Sekretion aus zirkulierenden Makrophagen in Frage kommt. Die mögliche Sympathikusaktivierung könnte zur Modifikation der extrazellulären Matrix mit erhöhter Kollagen I Bildung in den Glomeruli beitragen, da Leptin profibrotisch wirkt. Die renale STAT-3/JAK-2 Signaltransduktion ist beeinträchtigt, erkennbar an einer verminderten Phosphorylierung von STAT-3 und erhöhter Messbarkeit von SOCS-3, einem Inhibitor des STAT-3/JAK-2 Weges. Dies deutet auf eine lokale Postrezeptor-Leptinresistenz hin. Alles in allem entsteht so das Bild einer ORG, die durch frühe postnatale Hyperalimentation getriggert wird. Adipositas ist eine Epidemie, die ein erhöhtes Risiko für chronische Niereninsuffizienz birgt. Daher sind diese Ergebnisse von großer Relevanz. 1) Background It has been shown that obesity leads to an increased risk for chronic kidney disease in animals as well as in humans [20, 28, 47]. Histological changes that are characteristic of an obesity related glomerulopathy (ORG) [106] and a low grade systemic inflammation occur [106, 125]. Still it is unknown wether postnatal hyperalimentation leads to a reduction of kidney function. The aim of this study was to determine if postnatal hyperalimentation by litter size reduction has an influence on kidney function, local inflammation and renal fibrosis. Moreover changes in the signal transduction in the interaction of leptin and neuropeptid Y (NPY) should be analysed. 2) Methods Postnatal hyperalimentation was induced by litter size reduction (LSR) on postnatal day (P) 1. After keeping the rats in a metabolic cage for 24 hours they were sacrificed on day P70. Kidney material was used to perform polymerase chain reactions to evaluate gene regulation of NPY and its‘ receptors, different adipocytokines like leptin and interleukin-6 (IL-6). Furthermore, western blots of IL-6, signal transducer and activator of transcription 3 (STAT-3) and Suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS-3) and an immunhistologic staining of collagen I were done. 3) Results Rats that were affected from LSR were heavier than animals from the control group. They also showed reduced glomerular kidney function and changes of the extracellular matrix with increased production of collagen I, increased production of proinflammatory cytokines like IL-6 and leptin, whereas anti-inflammatory IL-10 was reduced. In LSR rats NPY-expression was increased together with a modification of leptin signalling via STAT-3: phosphorylated, active STAT-3 was decreased, while unphosphorylated STAT-2 was elevated. Also SOCS-3 levels were higher in LSR animals. 4) Conclusions All in all, this study shows that postnatal hyperalimentation leads to changes in the leptin-NPY-system, especially in litters that were reduced to six animals. These changes persist until P70 which could be due to metabolic programming of the renal leptin-NPY-system. Probably local increase of leptin expression causes activation of the sympathetic nervous system and NPY secretion. NPY may stimulate IL-6 secretion in circulating macrophages. Consistent with leptin’s profibrotic function the activation of the sympathetic nervous system could then change glomerular extracellular matrix composition by increasing collagen I production. The renal STAT-3/JAK-2 pathway is impaired as phosphorylated STAT-3 levels are decreased and SOCS-3 levels are increased. SOCS-3 is a potent inhibitor of STAT-3/JAK-2 signalling. This indicates a local postceptor leptin resistance. Altogether early postnatal hyperalimentation creates an ORG. Obesity is a worldwide epidemic that involves a high risk of chronic renal failure. Because of that the results from this study are highly relevant and further work on this topic is necessary.

Die Epithelzellen des renalen proximalen Tubulus resorbieren große Mengen an Wasser, Glucose und weiteren wertvollen Substanzen aus dem Primärharn, um deren Ausscheidung zu verhindern. Weiterhin sekretieren sie harnpflichtige Substanzen in den Primärharn und sind in der Lage, in die Zelle aufgenommene Substanzen enzymatisch umzusetzen. Diese Funktionen machen den renalen proximalen Tubulus zu einer wichtigen Einheit für die Nie-renfunktion. Sie führen aber auch zu einer hohen Empfindlichkeit gegenüber toxischen Effek-ten von Fremdstoffen. Daher ist ein In-vitro-Modell des renalen proximalen Tubulusepithels sowohl für die Erforschung physiologischer und pathologischer Mechanismen als auch zur Testung der Toxizität von Substanzen, insbesondere neuen Arzneimitteln, bedeutend. Ein weiteres Forschungsfeld, für das ein In-vitro-Gewebe von großem Nutzen wäre, ist die Ent-wicklung von bioartifiziellen Nierenersatzsystemen. Aufgrund Spezies-spezifischer Unterschiede, z.B. in der Expression von Transportproteinen und Enzymen, ist ein Modell mit humanen Zellen anzustreben. Bisher besteht jedoch ein Mangel an Modellen, die das renale proximale Tubulusepithel für die oben genannten An-wendungsbereiche adäquat abbilden. Das Ziel dieser Arbeit war deshalb der Aufbau eines humanen In-vitro-Modells des renalen proximalen Tubulus unter Verwendung von humanen Nierenzellen (human kidney-derived cells, hKDCs), die Eigenschaften renaler Vorläuferzellen aufweisen. In Kombination mit die-sen Zellen wurden verschiedene Kultursubstrate getestet. Dabei zeigte sich, dass die Zellen sowohl in Zellkulturplatten als auch auf Kollagen-Typ-I-beschichteten Insertmembranen mehrschichtig wachsen, ohne die typische Morphologie renaler proximaler Tubuluszellen auszubilden. In einem dreidimensionalen Kollagen-Typ-I-Hydrogel bildeten die hKDCs hin-gegen tubuläre bzw. zystäre Strukturen mit einer kubischen bis hochprismatischen Morpho-logie. Da für die oben erwähnten Anwendungsbereiche jedoch eine planare Zellschicht benö-tigt wird, erfolgte die Testung weiterer biologischer Matrices. Diese waren die Small intestinal submucosa (SIS) und das Biological vascularized scaffold (BioVaSc). Beide ließen sich aus porcinem Dünndarm herstellen, wobei bei der SIS die Mucosa sowie das Mesenterium ent-fernt wurden. Bei der BioVaSc handelt es sich um ein Darmsegment mit erhaltenem Ge-fäßsystem, dass zur Perfusion genutzt wird. Nach ihrer Kultur auf der SIS wiesen die hKDCs das typische Wachstum und die charakteris-tische Morphologie des renalen proximalen Tubulusepithels auf. Dazu gehören die Kontakt-hemmung, die das einschichtige Wachstum ermöglicht, die kubisch bis hochprismatische Morphologie sowie die Bildung eines Bürstensaums an der apikalen Zellmembran. Anhand einer Kollagen-Typ-IV- und einer Alcianblau-Färbung ließ sich die Bildung einer Basalmemb-ran an der Grenze zur SIS nachweisen. Bürstensaum- und Basalmembranbildung zeigten die zelluläre Polarisierung. Weiterhin waren typische Markerproteine renaler proximaler Tu-buluszellen wie N-Cadherin und Aquaporin-1 immunhistochemisch, zum Teil deutlich stärker als bei den Ausgangszellen, nachweisbar. Dies belegt einen positiven Einfluss der extrazellu-lären Matrixkomponenten der SIS auf die Ausbildung von Charakteristika des renalen proxi-malen Tubulusepithels. Die Albuminaufnahme als spezifische Funktion war ebenfalls nach-weisbar. Die molekularen Veränderungen der hKDCs während der Kultivierung auf der SIS ließen sich weiterhin mittels Raman-Spektroskopie bestätigen. Aufgrund der starken Interak-tion zwischen Tubulusepithel und umgebenden Kapillarnetzwerk wurde weiterhin die Co-Kultur mit Endothelzellen etabliert. Für den Vergleich der hKDCs mit einer etablierten humanen Zelllinie renaler proximaler Tu-buluszellen wurde die HK-2-Zelllinie verwendet. Mit dieser Zelllinie ließen sich die Ergebnisse der hKDCs jedoch nicht reproduzieren, was auf die fehlende Sensitivität der transformierten Zelllinie auf die Substrateigenschaften zurückzuführen ist. In der dynamischen Kultur mit der BioVaSc als Matrix waren ein inhomogenes Wachstum sowie eine variierende Markerexpression zu beobachten. Die ließ sich vor allem auf den starken Einfluss der Aussaatdichte sowie die Festigkeit der Matrix zurückführen. Bei einer erfolgreichen Optimierung der Kultur kann dieses Modell jedoch für komplexere Studien in der pharmakologischen Entwicklung nützlich sein. Mit der Kombination aus hKDCs und SIS ist es gelungen, eine einzelne, durchgängige Zell-schicht zu generieren, die wichtige Charakteristika des renalen proximalen Tubulusepithels aufweist. Weitere Untersuchungen sind nun nötig, um die Funktionalität des Modells weiter-gehend zu charakterisieren (z.B. der Transport von Substanzen und Sensitivität gegenüber toxischen Substanzen). Anschließend kann es für die spezifischen Anwendungen weiterentwickelt werden., The epithelial cells of the renal proximal tubule resorb high amounts of water, glucose and other valuable substances from the primary urine to prevent their excretion. Furthermore, they secrete metabolic waste products into the primary urine and are able to enzymatically alter absorbed substances. These functions make the renal proximal tubule an important unit for kidney function, but also lead to a high sensitivity towards toxicity of xenobiotics. There-fore, an in vitro model of the renal proximal tubular epithelium is important not only for the investigation of physiological and pathological processes, but also for toxicity testing of sub-stances, in particular, new pharmaceuticals. A further research area, for which an in vitro tis-sue would be of great value, is the development of bioartificial kidney assist devices. Due to species-specific differences, e.g. regarding the expression of transport proteins and enzymes, a model with human cells should be aimed. Until recently, there has been a lack of models that adequately simulate the renal proximal tubular epithelium for the above men-tioned fields. Therefore, the aim of this work was to develop a human in vitro model of the renal proximal tubule using human kidney-derived cells (hKDCs), which exhibit renal progenitor cell charac-teristics. Different culture substrates were tested in combination with these cells. hKDCs in cell culture plates as well as on collagen type I-coated insert membranes grew in multilayers without developing the typical morphology of renal proximal tubular cells. In contrast, in a three-dimensional collagen type I hydrogel, hKDCs formed tubular and cystic structures with a cubic to high-prismatic morphology. However, since a planar cell layer is required for the above mentioned research fields, small intestinal submucosa (SIS) and the biological vascu-larized scaffold (BioVaSc) were tested, which are both made of porcine small intestine. For SIS production, the mucosa and the mesenterium were removed, whereas the BioVaSc is a segment of the small intestine with a preserved vascular system, which can be used for per-fusion. Following their culture on the SIS, hKDCs featured the typical growth and characteristic mor-phology of the renal proximal tubule epithelium. hKDCs were contact-inhibited, which allows monolayered growth; they had a cubic to high-prismatic morphology and developed a brush border at their apical cell membrane. By collagen type IV and alcian blue staining, the for-mation of a basement membrane at the cell-matrix border was detectable. Brush border and basement membrane formation showed cellular polarization. Furthermore, marker proteins of renal proximal tubular cells such as aquaporin-1 and N-cadherin were shown by immuno-histochemistry, which were partially stronger than before SIS culture. This demonstrates a positive influence of the extracellular matrix components of the SIS on the development of characteristics of the renal proximal tubular epithelium by hKDCs. Albumin uptake as a spe-cific function was likewise detectable. The molecular changes of hKDCs during their culture on the SIS were also identified by Raman spectroscopy. Due to the strong interaction of the tubule epithelium with the peritubular capillaries, the co-culture of hKDCs with endothelial was established as well. For comparison of hKDCs with a well-established human cell line of renal proximal tubular origin, the HK-2 cell line was used. With this cell line, the results of hKDCs were not repro-ducible, which can be explained by the lacking sensitivity of the transformed cell line towards the substrate properties. In the dynamic culture with the BioVaSc scaffold, an inhomogeneous growth and a varying marker expression were observed. This was ascribed to the strong influence of the cell seed-ing density and the low matrix stiffness. If successfully optimized, this culture model can be useful for more complex studies in the pharmacological development. In summary, with the combination of hKDCs and the SIS, a single, continuous cell layer could be generated that exhibits essential characteristics of the renal proximal tubular epithelium. More studies are required to further characterize the functionality of the model (e.g. transport of substances and sensitivity towards toxic substances). Subsequently, it can be further de-veloped for specific applications.

Hintergrund und Ziele Peptiderge afferente renale Nerven (PARN) wurden in der Literatur in Verbindung gebracht mit Nierenschädigung bei Hypertonie und Nephritis. Weder ihre Rezeptoren noch die verantwortlichen Signale für die lokale Freisetzung von Neurokininen wie Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) und Substanz P (SP) sowie ihre Transmission zum Gehirn sind bisher gut verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Hypothese untersucht, ob PARN verglichen mit nicht renalen Afferenzen (Nicht-RN) empfindlicher sind für die Säurestimulation in Bezug auf Generierung von Aktionspotentialen vermutlich über Transient Rezeptor Potential Vanilloid Typ 1 (TRPV1) Kanäle und ob sie unterschiedliche Feuerungsmuster zeigen, denen unterschiedliche Ausstattung mit spannungsabhängigen Ionenkanälen zugrunde liegen Methoden Insgesamt wurde an 180 Neuronen, stammend von 12 männlichen Sprague Dawley Ratten, experimentiert. PARN wurden von Nicht-RN durch Fluoreszenzfärbung mit einem inerten, lipophilen Farbstoff (DiI), der unter die Nierenkapsel platziert wurde, unterschieden. Retrograder axonaler Transport des Farbstoffs erlaubte zweifelsfreie Zuordnung der Neurone zum Projektionsort ihrer Dendriten. Nach sechs Tagen stand die primäre Zellkultur aus Hinterwurzelganglienneuronen (DRG; Th11-L3) für in-vitro Patch-Clamp-Experimente im Whole-cell-Modus zur Verfügung. Zunächst wurden mithilfe der Voltage-Clamp-Technik die nervenzelltypischen schnellen spannungsabhängigen Natrium- und Kaliumkanäle bezüglich ihrer Aktivierungs- und Inaktivierungsspannungen, Peak-Spannungen und Beträgen der Gesamtnatriumaktivierung in verschiedenen Neuronenpopulationen untersucht und verglichen. Im Current-Clamp-Modus wurde anschließend das Feuerverhalten und die Säuresensitivität untersucht. Feuermuster auf Strominjektion steigender Intensität sowie die Säuresensitivität in Bezug auf Generierung von Aktionspotentialen wurden bestimmt und Neurone danach klassifiziert. Dafür wurden Säurestimuli der Stärke pH 6 und pH 5 gewählt. Ergebnisse und Beobachtungen Die Fluoreszenzmarkierung der Neurone erwies sich als erfolgreich. Neurone konnten nach der Herkunft ihrer Dendriten sowie anhand ihrer Kapazität in sechs Gruppen eingeteilt werden. Phasische kleine und mittelgroße Neurone zeigten signifikant stärkere Kaliumauswärtsströme als tonische. Natriumkanalaktivierung von kleinen und mittelgroßen phasischen Neuronen erfolgte bei um 10 mV negativeren Rechtecksspannungen als bei tonischen Zellen. Dies war bei großen Neuronen nicht signifikant erkennbar. Die Peak-Spannung mit dem stärksten Natriumeinwärtsstrom lag sowohl bei tonischen als auch bei phasischen Neuronen bei –20 mV. Im Vergleich aller phasischen Zellen zeigten nicht renale Neuronen bei der Peak-Spannung von –40 mV maximale Natriumaktivierung, renale Zellen erst bei –20 mV. Auch unter allen gefärbten, renalen Zellen wurden Natriumkanäle bei phasischen Neuronen um 10 mV früher als in tonischen Zellen aktiviert. 48 % der PARN wurden als tonische Neuronen (TN = anhaltende Feuerungsmuster während der Strominjektion) und 52 % als phasische (PN = transientes Feuern) klassifiziert. Nicht-RN waren seltener tonisch (15 %), dafür öfter phasisch (85 %) als PARN (P < 0,001). TN waren öfter säuresensitiv als PN (50–70 % vs. 2–20 %, P < 0,01). Weiterhin waren renale PN öfter säureempfindlich als nicht renale PN (20 vs. 2 %, P < 0,01). Der Säurestimulus erwies sich als geeignet, da alle Neuronen während der Durchströmung ein Rezeptorpotential zeigten, der bei steigender Protonenkonzentration ebenfalls anstieg. Praktische Schlussfolgerungen In der vorliegenden Doktorarbeit wurde gezeigt, dass PARN durch deutlich unterschiedliche Populationen von kleinen bis mittleren Neuronen repräsentiert werden, und dass diese öfter tonische Feuerungsmuster sowie TRPV1 vermittelte Säuresensitivität zeigten. Die Ausstattung mit spannungsabhängigen Kalium- und Natriumkanälen scheint in Neuronen mit unterschiedlichem Feuerungsmuster zu differieren. Die unterschiedlichen Populationen von Hinterwurzelganglienneuronen könnten eine entscheidende Rolle in der Nierenphysiologie und Pathogenese spielen. Möglicherweise wirken die durch Protonen aktivierten Neuronen auf unterschiedliche Weise auf die sympathische, efferente Nervaktivität. Denkbar wären auch Änderungen der Feuerungsmuster durch Einfluss von lokalen Faktoren wie Gewebeazidose. In Nierenerkrankungen, die mit lokaler Azidose einhergehen, könnten PARN antagonistische Mechanismen wie die Ausschüttung des vasodilatatorisch wirksamen Neuropeptids CGRP vermittelt über TRPV1-Rezeptoren übernehmen. Weitere Erforschung insbesondere der intrarenal gelegenen Nervenfasern und ihrer Rezeptoren sind notwendig, um die Bedeutung renaler afferenter Innervation für die Äthiopathogenese von Nierenerkrankungen und der Hypertonie zu klären und pharmakologische Einflussmöglichkeiten abzuleiten. Background Peptidergic afferent renal nerves (PARN) have been linked to kidney damage in hypertension and nephritis. Neither the receptors nor the signals controlling local release of neurokinines calcitonin gene-related peptide (CGRP) and substance P (SP) and signal transmission to the brain are well-understood. We tested the hypothesis that PARN, compared with nonrenal afferents (Non-RN), are more sensitive to acidic stimulation via transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1) channels and exhibit a distinctive firing pattern, which is based on the presence of voltage-gated channels with different characteristics. Methods Altogether, 180 neurons were studied, harvested from 12 male Sprague-Dawley rats. PARN were distinguished from Non-RN by fluorescent labelling with inert, lipophilic dye (DiI), which was placed under the renal capsule. By retrograde axonal transport of the dye, neurons could be allocated to the projection places of their dendrites. After six days, the primary cell culture of labelled neurons from dorsal root ganglia (DRG; Th11-L3) was available for in-vitro patch-clamp experiments in a whole-cell mode. First of all, fast voltage-gated potassium and sodium channels, which are specific for neurons, were tested with respect to their activation and inactivation voltages, peak voltage and the overall sodium influx at the patch-clamp setting. In the second step, firing behaviour and acid sensitivity were investigated using current-clamp mode. Firing patterns due to current injection as well as generation of action potentials due to acid superfusion were determined in order to classify neurons. For this purpose, pH 5 and pH 6 were used as acid stimuli. Results and observations The fluorescent staining of neurons was successfully attained. According to the origin of their dendrites and to their capacity, neurons could be divided into six groups. Phasic small and medium-sized neurons showed significantly higher potassium currents than tonic ones. Furthermore, activation of sodium channels in small and medium-sized phasic cells occurred at 10 mV more negative voltage values than in tonic cells. However, both effects lacked statistical significance in large-sized neurons. The comparison of all stained, i.e. renal neurons, revealed that sodium currents in phasic neurons were also activated at 10 mV lower voltage values than in tonic ones. Forty-eight percent of PARN were classified as tonic neurons (TN = sustained firing during current injection), and 52 % were phasic (PN = transient firing). Non-RN were rarely tonic (15 %) but more frequently phasic (85 %) than PARN (P < 0.001). TN were more frequently acid-sensitive than PN (50–70 % vs. 2–20 %, P < 0.01). Furthermore, renal PN were more frequently acid-sensitive than nonrenal PN (20 % vs. 2 %, P < 0.01). Conclusion These data show that PARN are represented by a very distinct population of small- to medium- sized DRG neurons exhibiting more frequently tonic firing and TRPV1-mediated acid sensitivity. The pattern of expression of voltage-gated sodium and potassium channels seems to differ in different subclasses of DRG neurons. However, it deserves further studies to clarify these findings. These very distinct DRG neurons might play a pivotal role in renal physiology and patophysiology. It is possible that acid activated neurons affect sympathetic efferent nerve activity in different ways. Changes of firing patterns by influence of local factors like tissue acidosis could be considered. Furthermore, in kidney diseases accompanied by local acidosis, PARN might initiate antagonistic mechanisms like the release of neuropeptide vasodilator CGRP. Further investigations especially of intrarenally-localised nerve fibres and their receptors are necessary to elucidate the meaning of renal afferent innervation for pathogenesis of kidney diseases and hypertension, and to derive pharmacological implications.

Hintergrund und Ziele Hypoxie induzierbare Transkriptionsfaktoren (HIF), α/β-Heterodimere, spielen über die Transaktivierung von mehr als 200 HIF-Zielgenen eine relevante Rolle in der zellulären Adaption an Hypoxie. Unter hypoxischen Bedingungen zeigt sich in der Rattenniere ein differentielles Verteilungsmuster der beiden sauerstoffabhängig regulierten Untereinheiten HIF-1α und -2α. HIF-1α wird vor allem in Tubulusepithelzellen exprimiert, während HIF-2α in interstitiellen, glomerulären und endothelialen Zellen detektierbar ist, was eine differentielle Rolle der α-Untereinheiten in vivo suggeriert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden die Expression und die Verteilung des HIF-Proteins in der Maus untersucht. Dabei soll außerdem die Frage geklärt werden, ob HIF-2α in Tubulusepithelzellen auf transkriptioneller Ebene exprimiert wird. Methoden 1. Antikörpertestung in vitro: Es werden murine embryonale Fibroblasten (meF) hypoxisch oder pharmakologisch stimuliert. Dabei wird der Wildtyp mit HIF-1α-defizienten meF als Negativkontrolle verglichen. Mit Hilfe eines Immunoblots werden Proteinextrakte mit drei verschiedenen Antikörpern auf eine Akkumulation von HIF-1α getestet. Die Testung auf eine Akkumulation von HIF-2α erfolgt mit Hilfe von in vitro transkribierter und translatierter Proteine (IVTTs) von HIF-2α, sowie mit Hilfe von doxycyclin-abhängiger Expression von HIF-2α in NIH3T3-Zellen. 2. Die HIF-Akkumulation in Mausnieren in vivo nach hypoxischer oder pharmakologischer Aktivierung wird untersucht und mit der unter normoxischen Bedingungen verglichen. Aufgrund der posttranslationalen HIF-Regulation erfolgt der HIF-α-Proteinnachweis dabei immunhistochemisch unter Verwendung der als spezifisch getesteten Antikörper. Durch Folgeschnittfärbungen werden einzelne Nephronabschnitte der HIF-Expression zugeordnet. 3. Die zelltypspezifische Expression von HIF-1α- und HIF-2α-mRNA wird durch Mikrodissektion und anschließende real-time-PCR von Glomerulumund Tubulusdissektaten von Mausnieren untersucht. Ergebnisse und Beobachtungen Zwei der drei getesteten Antikörper sind spezifisch für Maus-HIF-1α. Für HIF-2α ist nur ein nicht-kommerzieller Antikörper verfügbar. Unter verschiedenen Stimuli ist HIF-1α in Tubulusepithelzellen detektierbar, während HIF-2α in interstitiellen, endothelialen und glomerulären Zellen akkumuliert. Die Expression von HIF-1α in den verschiedenen Nephronabschnitten ist stimulusabhängig. Im Gegensatz zur Ratte ist HIF- 1α unter normoxischen Bedingungen in einzelnen Tubulusepithelzellkernen nachweisbar. Auf mRNA-Ebene ist HIF-2α in Tubulusepithelzellen nur in sehr geringem Ausmaß detektierbar. Praktische Schlussfolgerungen In der Mausniere zeigt sich ein differentielles Verteilungsmuster der HIFα- Isoformen mit stimulusabhängiger sowie normoxischer Akkumulation von HIF-1α. HIF-2α scheint für die hypoxische Genregulation in tubulären Zellen keine Rolle zu spielen. Purpose Hypoxia inducible transcription factors play a crucial role in cellular oxygen adaption. In the rat kidney both oxygen dependent subunits, HIF-1α and HIF-2α, show a different pattern of distribution under hypoxic conditions. HIF-1α accumulates in renal tubular epithelial cells, whereas HIF-2α is detectable in interstitial, endothelial and glomerular cells. The present study focuses on the distribution of HIFα in the murine kidney. Furthermore it should be determined if there is any HIF-2α-mRNA in tubular epithelial cells at all. Methods 1. Anti-HIF antibody characterisation in vitro: murine embryonal fibroblasts (wild-type vs. HIF-1α-deficient (negative control)) were stimulated by hypoxia and also treated pharmacologically. Extracts of proteins were tested using three antibodies looking for HIF-1α-accumulation via immunoblot. IVTTs and NIH3T3-cells were tested looking for HIF-2α-accumulation via immunoblot. 2. HIF-activation in vivo in pharmacologically or by hypoxic conditions stimulated mice in comparison to normoxic mice. Immunohistochemical staining of HIF-α-protein using antibodies tested for specificity. On consecutive sections the HIF-expression with markers of the different parts of the nephron. 3. Cell type specific expression of HIF-1α- and HIF-2α-mRNA using microdissection and running a real-time-PCR out of glomerular and tubular dissections. Results Two of three antibodies were tested as being specific for the detection of HIF-1α protein. After different stimulations HIF-1α was expressed to a various extent in tubular epithelial cells, while HIF-2α accumulated in interstitial and glomerular cells. In opposite to the rat kidney we demonstrated the presence of HIF-1α in tubular cells under normoxic conditions. HIF-2α-mRNA is only marginally expressed in tubular epithelial cells. Conclusion The murine kidney shows a differential distributional pattern of the two HIFisoforms (HIF-1α in tubular epithelial cells, HIF-2α in interstitial, endothelial and glomerular cells). The HIF-1α expression along the nephron varies in dependence on the used stimulus. In addition, we found normoxic accumulation of HIF-1α. HIF-2α does not seem to play a role in hypoxic gene regulation in renal tubular epithelial cells.

Hintergrund und Ziele: Die beiden Rho-Kinase-Isoformen ROCK1 und ROCK2 sind wichtige Mediatoren der kleinen GTPase RhoA, welche eine fundamentale Rolle bei der Organisation des Aktin-Zytoskeletts spielt. In-vitro Daten aus der Literatur zeigen eine große Bedeutung der Rho-Kinasen bei Zellfunktionen wie Genexpression, Adhäsion und Migration. In Tiermodellen konnten für verschiedenartige Krankheitsbilder positive Effekte durch Inhibition der Rho-Kinasen gezeigt werden. Bis zum heutigen Zeitpunkt wurde in Untersuchungen zur physiologischen und pathologischen Bedeutung der Rho-Kinasen kein Schwerpunkt auf die spezifischen Eigenschaften der beiden Isoformen gelegt, obwohl es erste Hinweise für Isoform-spezifische Funktionen gibt. Diese Tatsache erklärt sich nicht nur durch die sehr große Homologie zwischen den beiden Kinasen, sondern reflektiert auch das Fehlen von Isoform-spezifischen Inhibitoren. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels siRNA selektive Knockdowns der beiden Isoformen in renal-tubulären Epithelzellen durchgeführt. Somit konnten mögliche, Isoform-spezifische Funktionen bei der Organisation des Zytoskeletts, der Zellmigration und der Genexpression des profibrotischen Proteins connective tissue growth factor (CTGF) untersucht werden. Die Ergebnisse wurden mit nicht-selektiver Inhibition der Rho-Kinasen durch Y-27632 und mit neuen, ROCK2-spezifischen Inhibitoren verglichen. Methoden: Für die Versuche wurde sowohl eine Epithelzelllinie des proximalen Tubulus (HKC-8) als auch humane primäre Tubulusepithelzellen (hPTECs) verwendet. Für die morphologischen Untersuchungen wurden immunzytochemische Fluoreszenzfärbungen durchgeführt. Zur Untersuchung der differentiellen Genexpression von Zielgenen der beiden Rho-Kinase-Isoformen kamen ROCK-Inhibitoren und siRNA zum Einsatz. Die Expressionslevel der Zielgene wurden mittels Western-Blot und Real-Time-RT-PCR quantifiziert. Analysen der Migrationsfähigkeit nach Behandlung der Zellen mit ROCK-siRNA oder Inhibitoren wurden entweder mittels eines Scratch-Assays oder eines Barrier-Assay durchgeführt. Ergebnisse: In den immunzytochemischen Fluoreszenzfärbungen konnten Isoform-spezifische Unterschiede in der Zellmorphologie gezeigt werden. Nach Behandlung der Zellen mit unselektiven und ROCK2-selektiven Inhibitoren oder selektivem Knockdown von ROCK1 und ROCK2 mittels siRNA, zeigten sich deutliche Unterschiede in der Zellform, aber auch in Organisation und Verteilungsmuster von Aktinfasern, fokalen Adhäsionen und den Zell-Zell-Adhäsionsmolekülen E-und N-Cadherin. Die Genexpression des profibrotischen Proteins connective tissue growth factor (CTGF) wurde unter nicht selektiver Inhibition der ROCKs mit Y-27632 stark gehemmt. Mittels siRNA-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass diese Funktion von ROCK2 und nicht von ROCK1 vermittelt wird. Die Zellmigration wurde durch Inhbition beider Rho-Kinasen mit Y-27632 deutlich stimuliert. In den siRNA-Untersuchungen zeigte sich ein etwa gleich hoher Anteil der beiden Kinasen an diesem promigratorischen Effekt. Schlussfolgerung: In der Arbeit konnte gezeigt werden, dass Isoform-spezifische Funktionen der Rho-Kinasen in renalen Epithelzellen nachweisbar sind und dass diese durch die Regulation der Genexpression möglicherweise auch bei pathologischen Vorgängen wie Fibrose eine Rolle spielen können. Besonders die morphologischen Unterschiede im Aktinzytoskelett deuten auf weitere, funktionell unterschiedliche Rollen der beiden Isoformen hin. Aufgrund dessen erscheint es sinnvoll, die Isoform-spezifische Hemmung der Rho-Kinasen auch in Krankheitsmodellen näher zu untersuchen. Introduction: The two Rho-kinase isoforms ROCK 1 and 2 are the main downstream mediators of the small GTPase RhoA, which is crucial for cytoskeletal organisation. In-vitro data in the literature show an involvement of the Rho-kinases in many cellular functions such as gene expression, adhesion and migration. In animal models of disease, inhibition of Rho-kinases has shown promising effects. Until now, studies on ROCK-inhibitors did not focus on specific physiological and pathophysiological qualities of ROCK 1 and 2 despite recent evidence that there are isoform-specific functions. This fact is not only due to the high homology between the two kinases, it also reflects the lack of isoform-specific inhibitors. In this work, a siRNA-based approach was used to selectively knockdown ROCK isoforms in renal tubular epithelial cells. Thereby, isoform-related changes in cytoskeletal organisation, migration and gene expression of the profibrotic protein connective tissue growth factor (CTGF) were investigated. The results were compared to cells treated with Y-27632, an inhibitor of both ROCK isoforms or new ROCK 2 specific inhibitors. Methods: The proximal tubular epithelial cell line HKC-8 and human primary tubular epithelial cells (hPTECs) were used for the experiments. Morphological analyses were made using immunocytochemic fluorescent staining. For the investigation of differential gene expression of target genes of the Rho-kinases, the ROCK-inhibitors Y-27632, Slx-2119, Slx-3058 and specific siRNA were used. Expression levels of the target genes were quantified with Western-Blot and Real-Time-RT-PCR. Migration studies were performed using a scratch assay or a barrier assay. Results: The immunocytochemical fluorescent stainings showed isoform-specific changes in cellular morphology. After treatment of the cells with the non selective inhibitor Y-27632, selective inhibition of ROCK2 or selective knockdown of ROCK1 or ROCK2, marked differences in cell shape, but also in organization and distribution of actin fibres, focal adhesions and the cell-cell adhesion molecules E- and N-Cadherin were observed. Gene expression of the profibrotic protein connective tissue growth factor (CTGF) was strongly inhibited after non selective inhibiton of both ROCK-isoforms with Y-27632. Using ROCK-specific siRNA, it could be shown, that this function is mediated by ROCK2 and not ROCK1. Cellular migration was markedly stimulated through inhibition of both isoforms with Y-27632. The siRNA-experiments showed an approximately equal contribution of the two kinase isoforms to this effect. Summary: In this work, it was demonstrated, that there are specific functions of the ROCK isoforms in renal tubular epithelial cells, which might also play a role in pathological processes such as fibrosis. Especially the distinct morphological differences of the actin cytoskeleton indicate different functional roles of both isoforms. Consequently, isoform-specific ROCK inhibition needs further investigation in disease models.

Die Bildung des Primärharns findet an der Filtrationsbarriere statt, bestehend aus fenestriertem Endothel, glomerulärer Basalmembran und Fußfortsätzen der Podozyten. Eine molekulare Schicht von Transmembranproteinen spannt sich zwischen benachbarten Fußfortsätzen und formt das Schlitzdiaphragma. Die Integrität des Schlitzdiaphragmas ist wichtig für die Filtration. Es wurden immortalisierte Podozytenzellen benutzt, um die Interaktion der Gene und Proteine des Schlitzdiaphragmas nach Stummschaltung der Podozyten-spezifischen Gene \(\it Neph1\), \(\it Neph2\) und \(\it Atoh8\) mittels RNAi zu untersuchen. Stummschaltung von \(\it Neph1\) führte zur Rückverteilung des Nephrinproteins ins Zytoplasma der Podozyten, während \(\it Atoh8\)-RNAi die Expression von \(\it Neph1\), (\it Neph2\), \(\it Zo1\), \(\it Nphs1\) und \(\it Nphs2\) verringerte. \(\it Neph2\)-RNAi führte zu verstärkter Nephrin Expression. Keine Effekte auf die Podocin Expression wurden nach \(\it Neph1\)- und \(\it Neph2\)-RNAi verzeichnet, während \(\it Atoh8\)-RNAi zur Verringerung von Podocin führte. Weiterhin wurde die Expression der Podozyten-spezifischen Gene im Hühnerembryo gezeigt. The formation of the primary urine occurs at the filtration barrier, composed of fenestrated endothelia, glomerular basement membrane and the podocyte foot processes. A molecular sheet of transmembrane proteins extends between the adjacent foot processes forming the slit diaphragm. The integrity of the slit diaphragm is important for filtration. In this work, immortalized human podocytes were used to study the interaction of these slit diaphragm genes and proteins following silencing of podocyte specific genes \(\it Neph1\), \(\it Neph2\) and \(\it Atoh8\) by RNAi. Silencing \(\it Neph1\) led to a redistribution of the nephrin protein in the cytoplasm of the podocyte, while \(\it Atoh8\) RNAi caused decrease expression of \(\it Neph1\), \(\it Neph2\), \(\it Zo1\), \(\it Nphs1\) and \(\it Nphs2\). \(\it Neph2\) RNAi lead to an increase of nephrin expression. No effects were recorded after \(\it Neph1\) and \(\it Neph2\) RNAi on podocin expression. But, \(\it Atoh8\) RNAi caused decrease in podocin. I also show the expression of podocyte-specific genes in the developing chicken embryo.

Ziel dieser Arbeit war es die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen für den renalen Verlust von Na+, K+, Ca2+ und Mg2+ in mit Gentamicin (GM) behandelten Ratten zu untersuchen. In zwei Tiermodellen injizierten wir männlichen Wistar Ratten GM (40 bzw. 80 mg/kg/d über 7 Tage; GM-40 bzw. GM-80). Wir untersuchten die Expression von NHE3, Na-K-ATPase, NKCC2, ROMK, NCC, α-, β-, γ-ENaC und des CaSR in der Niere durch Western Blot-Analysen und Immunhistochemie. Sowohl in GM-40 als auch in GM-80 war die fraktionelle Exkretion von Na+, K+, Ca2+ und Mg2+ im Urin erhöht. Die Konzentration des Urins war im Gegensatz dazu vermindert. Im Nierenkortex zusammengenommen mit dem äußeren Streifen des äußeren Nierenmarks (Kortex) des ersten Tiermodells (GM-80) war die Proteinexpression von NHE3, Na-Ka-ATPase und NKCC2 vermindert, die Expression von NCC unverändert und die von CaSR im Vergleich zu den Kontrollen gesteigert. Im inneren Streifen des äußeren Nierenmarks (ISOM) war bei GM-80 die Expression von NKCC2 und Na-K-ATPase herabgesetzt, CaSR war hochreguliert und die Expression von NHE3 und ROMK unverändert. Im zweiten Tiermodell (GM-40) war die Proteinexpression von NKCC2 im Kortex und ISOM vermindert. Unverändert war die Expression von NHE3, Na-K-ATPase, CaSR, ROMK und NCC sowohl im Kortex als auch ISOM. Die Immunhistochemie bestätigte die verminderte Expression von NKCC2 im dicken aufsteigenden Teil der Henle-Schleife (TAL) in beiden Tiermodellen, GM-80 und GM-40. Die Western Blot-Analysen und die Immunhistochemie zeigten eine gesteigerte Expression von α-, β-, γ-ENaC im Kortex bei GM-80, aber nicht bei GM-40., We aimed to investigate the molecular mechanisms underlying the renal wasting of Na+, K+, Ca2+, and Mg2+ in gentamicin (GM)-treated rats. Male Wistar rats were injected with GM (40 or 80mg/kg/day for 7 days, respectively; GM-40 or GM-80). The expression of NHE3, Na–K-ATPase, NKCC2, ROMK, NCC, α-, β- and γ-ENaC, and CaSR was examined in the kidney by immunoblotting and immunohistochemistry. Urinary fractional excretion of Na+, K+, Ca2+, and Mg2+ was increased and urinary concentration was decreased in both GM-40 and GM-80 rats. In cortex and outer stripe of outer medulla (cortex) in GM-80 rats, the expression of NHE3, Na–K-ATPase, and NKCC2 was decreased; NCC expression was unchanged; and CaSR was upregulated compared to controls. In the inner stripe of outer medulla (ISOM) in GM-80 rats, NKCC2 and Na–K-ATPase expression was decreased, whereas CaSR was upregulated, and NHE3 and ROMK expression remained unchanged. In GM-40 rats, NKCC2 expression was decreased in the cortex and ISOM, whereas NHE3, Na–K-ATPase, CaSR, ROMK, and NCC abundance was unchanged in both cortex and ISOM. Immunoperoxidase labeling confirmed decreased expression of NKCC2 in the thick ascending limb (TAL) in both GM-80- and GM-40-treated rats. Immunoblotting and immunohistochemical analysis revealed increased expression α-, β- and γ-ENaC in cortex in GM-80 rats, but not in GM-40 rats. These findings suggest that the decrease in NKCC2 in TAL seen in response to low-dose (40mg/kg/day) gentamicin treatment may play an essential role for the increased urinary excretion of Mg2+ and Ca2+, and play a significant role for the development of the urinary concentrating defect, and increased urinary excretion of Na+ and K+. At high-dose gentamicin, both proximal and TAL sodium transporter downregulation is likely to contribute to this.

Kidney disease imparts a vast burden on affected individuals and the overall health care system. Progressive tubulointerstitial fibrosis represents a common final pathway observed in all forms of chronic kidney diseases, characterized by deposition of extracellular matrix, immune cell infiltration, fibroblast proliferation and activation, injury to the tubular epithelium and rarefaction of the peritubular microvasculature. In the recent past, Notch receptors, which are involved in the nephron development, attributed increasingly a significant role in the development of various kidney diseases, and also in the tubulointerstitial fibrosis. In the present work, the involvement of the receptor Notch-3 in the immune cell response and kidney fibrosis was examined. First evidence for an involvement of Notch-3 receptor on the fibrogenesis was shown by in vitro studies in cultured kidney cells. Stimulation with the central profibrotic mediator TGF-beta1 resulted in an increased expression of the receptor Notch-1 and Notch-3 and so on both transcription and protein level. This has been confirmed in vivo in two different animal models of renal damage, the nephrotoxic nephritis (NTN) and the unilateral ureteral obstruction (UUO). The NTN is a primary inflammatory, glomerular and thus proteinuric model whose profile corresponds to a rapidly progressive glomerulonephritis. In addition to the glomerular injury it results in tubulointerstitial immune cell infiltration and fibrosis. The murine UUO model primarily caused damage to the tubular structures and also reflects the hallmarks of tubulointerstitial fibrosis. In both models an activation of the Notch-3 receptor, and increased expression of Notch ligands and target genes was detectable. Striking is, that the increased expression of Notch-3 occurred cell-specific and so after ureteral obstruction detected only in isolated tubular and in some tubulointerstitial. cells. This suggests that the Notch-3-mediated regulatory events are controlled only by subpopulations of cells. We hypothesized that Notch-3 plays a functional relevance in the chemotactic response. Therefore, we studied animals with genetic depletion of Notch-3 receptor after UUO and NTN induction. We could show that Notch-3 knockout (Notch-3 KO) mice were protected from injury and tubular cell loss. The infiltration of inflammatory cells was significantly reduced and delayed, presumably due to a reduced chemokine synthesis and release. The Notch-3 knockout mice also exhibited a very significant reduction in the matrix accumulation that is due to reduced proliferation of interstitial cells. To investigate a direct influence of Notch-3 receptor on the cell proliferation, a cell model was established, which simulates an increased Notch-3 expression/ activation. Overexpression of constitutively active intracellular Notch-3 domain increased proliferation rate of renal tubular cells in vitro. This result was confirmed by incubating the cells with the Notch ligand Jagged-1. In addition to the in vivo and in vitro studies in a third approach, we correlated the expression of members of the Notch receptor family with human renal diseases. Human biopsies of patients with tubular and glomerular kidney diseases have been studied in terms of a gene array where mRNA expression of Notch signal pathways components were measured and hence a heat map was created. It was found that Notch-3 was expressed strongest by all of the Notch family receptors. In summary, our results show that the Notch-3 receptor plays an important role in the orchestration of tubulointerstitial, inflammatory response and in particular the monocytic cell infiltration is affected by Notch-3. This makes the Notch pathway an attractive target for future therapeutic interventions in which an excessive matrix deposition and the consequent destruction of the tissue architecture is to be countered.

Claudin Tight Junction Proteine sind wichtige Komponenten für den parazellulären Ionentransport in Epithelien. In der Niere sind Claudine an der Ionenresorption im Rahmen der Urinbildung beteiligt. In meiner Arbeit wurde die renale Funktion von zwei Vertretern dieser Familie, Claudin-16 und Claudin-10, untersucht. Durch gerichtetes Gentargeting wurden murine Defizienzlinien für Cldn16 und Cldn10 generiert und hinsichtlich ihres Phänotyps charakterisiert, der Fokus der Untersuchungen wurde auf die Nierenfunktion gelegt. Claudin-16-Fehlfunktion wurde mit der herediären Nierenerkrankung FHHNC assoziiert. FHHNC ist charakterisiert durch renalem Salzverlust und die Ausbildung einer Nephrokalzinose, welche schließlich zu terminalem Nierenversagen führt. Claudin-16-defiziente Mäuse weisen ähnliche Elektrolytimbalanzen wie humane FHHNC-Patienten auf, zeigen jedoch kompensatorische Mechanismen auf physiologischer, endokrinologischer und Transkriptions-Ebene, welche eine Progression der Krankheit verhindern. Das Mausmodell eignet sich somit für Studien zum renalen Salzverlust und zur Analyse der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen. Zusätzlich konnten zwei putative Transporter gefunden werden, welche als interessante Kandidaten im renalen Magnesiumtransport weiteren Analysen unterzogen werden. Claudin-10 ist ubiquitär in Epithelien exprimiert, seine physiologische Rolle jedoch bis dato nur unzureichend geklärt. Claudin-10-defiziente Mäuse versterben wenige Stunden nach der Geburt. Untersuchungen an pulmonalem und renalem Gewebe konnten bislang keine Ursache für die Mortalität aufzeigen. Urinanalysen deuten jedoch auf eine Imbalanz der Magnesiumhomöostase hin. Durch konditionelle Knockout-Strategien soll im Folgenden die Claudin-10-Defizienz in einzelnen Geweben, etwa der Niere, untersucht werden. Auf diese Weise soll die Aufarbeitung des Phänotyps komplettiert und die Ursache der Letalität gefunden werden. Claudin tight junction proteins are essential components in the regulation of paracellular fluxes through epithelial layers. In the kidney, claudins contribute to the resorption of ions in urine formation. This thesis highlights the physiological role of two renally expressed family members, claudin-16 and claudin-10. Via conditional gene targeting, murine Cldn16 and Cldn10 deficiency strains have been generated and evaluated with respect to their phenotype, with a focus on the renal function. Claudin-16 has been attributed to the resorption of bivalent ions in the thick ascending limb of Henle’s loop. Protein malfunction in humans goes in hand with FHHNC, a genetic disorder characterized by renal loss of bivalent ions, finally leading to nephrocalcinosis and end stage renal disease. Claudin-16 deficient mice display similar electrolyte disorders as human patients, but also resemble compensatory mechanisms on physiological, endocrinological and transcriptional levels to prevent the progression of the disease state. Hence, Cldn16 knockout mice serve as an adequate model to study renal salt wasting as well as counterregulatory mechanisms which highlights molecular pathways underlying renal salt wasting. Additionally, we could identify putative transport proteins which are attractive candidates for transcellular magnesium transport in the kidney. Claudin-10 shows a wide distribution in various tissues, its physiological role, however, is still under evaluation. Mice lacking claudin-10 display a lethal phenotype shortly after birth. Investigations of renal and pulmonary histology has not yet revealed the cause for the mortality under claudin-10-deficiency. However, urine analysis suggests an imbalance in the magnesium homeostasis in these animals. By subsequent conditional gene knockout approaches, this model will serve as a basis for tissue specific claudin-10 ablation and thereby enables investigation into the contribution of claudin-10 to distinct organ functions.

Der Systemische Lupus erythematodes (SLE) gehört zu den Autoimmunerkrankungen. Die Erkrankung ist gekennzeichnet durch das Auftreten antinukleärer und anti-DNS Doppelstrang Antikörper. Die Inzidenz in Europa liegt bei 20-40 pro 100.000 Einwohner. Besonders die Nierenbeteiligung in Form einer Lupusnephritis ist prognostisch ungünstig und Therapieoptionen sind limitiert. Üblicherweise erfolgt die Therapie durch Immunsuppression mit Glukokortikoiden, Azathioprin und Methotrexat. Der Proteasomeninhibitor Bortezomib (Velcade®) wird klinisch bereits zur Therapie des multiplen Myeloms eingesetzt. Die Wirkung beruht auf einer Proteasomeninhibition, wodurch besonders bei synthese-aktiven Zellen, wie beispielsweise Plasmazellen (Antikörper Synthese), fehlgefaltete Proteine akkumulieren und die Zelle in Apoptose geht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Wirkung von Bortezomib auf die Entstehung von Nierenveränderungen in einem Mausmodell mit einer SLE ähnlichen Erkrankung zu untersuchen und genauer zu charakterisieren. Als Modell diente die F1 Generation von NZB/W Mäusen, welche ab einem Alter von 4-7 Monaten eine SLE Nephritis entwickelt, die von ihrer Ausprägung der menschlichen ähnlich ist. 3 Gruppen zu je 10 Tieren wurden in die Studie eingeschlossen. Die unbehandelte Gruppe NZB/W+ PBS diente als Kontrollgruppe. Die Gruppen NZB/W+ BZ 18 Wo und NZB/W+ BZ 24 Wo wurden ab der 18. bzw. ab der 24. Lebenswoche zweimal wöchentlich mit 0,75 mg/kg Bortezomib behandelt. Die Nierenuntersuchung erfolgte nach 56 Wochen. Der Grad der Nierenschädigung wurde histologisch durch standardisierte Auswertungsverfahren an Paraffinschnitten bestimmt, sowie auch durch Analyse von Semidünnschnitten und Anwendung morphometrischer Techniken. Ergänzende Untersuchungen erfolgten immunhistologisch. Anschließend wurden die 3 Gruppen miteinander verglichen. Die Bortezomib-behandelten Tiere zeigten ein signifikant längeres Überleben. Die Nieren-Schädigungsindices GSI, TSI und VSI zeigten bei den behandelten Tieren deutlich niedrigere Werte, und damit weniger Nierenschäden. Die Auswertung der Semidünnschnitte bestätigte diese Beobachtung: mesangiale Matrixvmehrung, Kapillarobliteration und Mesangialzellproliferation war in den behandelten Gruppen deutlich schwächer ausgeprägt als in der Kontrollgruppe. Immunhistochemisch konnte in der Kontrollgruppe NZB/W+ PBS eine gesteigerte interstitielle Apoptoserate und Zellproliferation, sowie eine Vermehrung von Kollagen IV interstitiell sowie auch intraglomerulär beobachtet werden. Die Podozytenmarker WT-1, Nephrin und Synaptopodin wurden in Gruppe NZB/W+ PBS deutlich schwächer exprimiert als in den beiden Behandlungsgruppen, was sich mit der Beobachtung eines globalen Podozytenverlustes bzw. Schädigung des glomerulären Filters deckt. Bortezomib kann Nierenschäden im NZB/W Mausmodell weitgehend verhindern. In der vorliegenden Studie wurde Bortezomib in einem sehr frühen Krankheitsstadium gegeben. Zu klären ist, ob eine positive Wirkung auch bei der Applikation in fortgeschrittenen Stadien eintritt und welche Effekte bei der Kombination mit anderen immunsuppressiven Medikamenten eintreten. Systemic lupus erythematosus (SLE) is characterisised by the presence of antinuclear and anti-dsDNA antibodies. Especially lupus nephritis is a severe complication and is attendend by a poor outcome. Bortezomib is well known in clinical therapy of multiple myeloma. It acts via proteasome inhibition. In a consequence, unfolded proteins accumulate leading to apoptosis. The aim of this study was to analyse the effect of bortezomib on the development of kidney damage in the NZB/W mouse model of SLE. As a model for systemic lupus erythematosus, the F1 generation of NZB/W mice was used. Three groups with 10 mice were studied. Group NZB/W+ PBS was the control group without treatment. Group NZB/W+ BZ 18 Wk and NZB/W+ BZ 24 Wk were treated with 0,75 mg/kg bortezomib twice per week from week 18 and week 24, respectively. After 56 weeks, kidneys were taken for histological examination. Kidney damage was determined by standardised damage scores on paraffin sections and by analysis of semithin sections using morphology and stereology. In addition, immunohistochemistry was used. Animals of group NZB/W+ BZ 18 Wk and NZB/W+ BZ 24 Wk showed prolonged survival. Renal damage scores showed lower values in these groups. This was confirmed by analysis of semi-thin slides: mesangial matrix proliferation, capillary occlusion and cell proliferation were less in group NZB/W+ BZ 18 Wk and NZB/W+ BZ 24 Wk. Immunohistochemistry revealed a higher rate of apoptosis as well as cell proliferation in the tubulointerstitium of group NZB/W+ PBS. Additionally, high values of collagen IV were found in the tubulointerstitium and in the glomeruli of group NZB/W+ PBS. Podocyte markers like WT-1, nephrin, and synaptopodin were expressed weakly in the untreated group compared to the two treatment groups. This is compatible with a general loss of podocyte adhaesion, footprocess effacement and damage of the glomerular filter. Bortezomib is able to prevent the development of lupus nephritis. In this study, bortezomib was applied at a very early stage of disease. Further studies have to proof if similar effects may be observed in severe states of disease and whether the combination of bortezomib with other immunosuppressive drugs has additional effects.

eingereicht von Doris Hofer Wien, Univ. für Bodenkultur, Dipl.-Arb., 2011

Für die enormen Transportleistungen der Niere bei der Reabsorption von Salz und Wasser, sowie auch für die Ausbildung der für die Schallempfindung im Innenohr wesentlichen elektrochemischen Gradienten spielen unter anderem die ClC-K-Chloridkanäle eine bedeutende Rolle. Dies wird unter anderem bei bestimmten Subtypen der Salzverlust-Tubulopathien deutlich. Trotz großer Fortschritte, die seit Ende der 1990er Jahre bei der Aufdeckung der molekulargenetischen Grundlagen dieser Erkrankungen gemacht wurden, bleibt auch heute noch bei einem nicht unbeträchtlicher Teil der klinisch betroffenen Patienten die genetische Grundlage ihrer Erkrankung ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde für eine dieser Patientinnen eine Kombination aus der Deletion des für ClC-Kb kodierenden Gens CLCNKB und der Mutation des Promotors des für ClC-Ka kodierenden Gens CLCNKA als genetische Grundlage ihres klinischen Phänotyps aufgeklärt. Hierzu wurde zunächst eine homozygote Mutation eines Teils der bekannten zu Salzverlust-Tubulopathien führenden Gene ausgeschlossen. Die verbleibenden bekannten Gene CLCNKA und CLCNKB sollten in einem zweiten Schritt sequenziert werden. Dies gelang bei CLCNKB nicht, da hier eine homozygote Mutation vorlag, was durch den Nachweis eines Fusionsfragmentes bewiesen werden konnte. Die exonischen Anteile von CLCNKA zeigten zwar keine die Aminosäure-Sequenz von ClC-Ka verändernden Mutation, wohl aber eine Mutation des Promotors von CLCNKA 832 Basen upstream seines ersten Exons. Die funktionelle Bedeutung dieser Promotor-Mutation wurde mittels eines Versuches nachgewiesen, bei dem ein Biolumineszenz katalysierendes Enzym als Markerprotein genutzt wurde, um den Expressionslevel eines vom Wildtyp-CLCNKA-Promotors im Vergleich zu seiner mutierten Variante kontrollierten Gens darzustellen. Hierbei konnte nachgewiesen werden, dass die bei der Patientin nachgewiesene Promotor-Mutation zu einer bis zu 77,5%-igen Reduktion der Expression des von diesem Promotor kontrollierten Gens führt. Dass der gleichzeitige Funktionsverlust von ClC-Ka und ClC-Kb zu einem deutlich schwereren Phänotyp führt, als der isolierte Verlust eines dieser beiden Proteine, wurde in der Vergangenheit mehrfach gezeigt. Die vorliegende Arbeit liefert einen Hinweis darauf, dass der deutlich mildere Phänotyp bei isoliertem Funktionsverlust von ClC-Kb (im Verglich zum funktionellen Verlust beider ClC-K-Kanäle) möglicherweise durch eine Hochregulation der Expression von ClC-Ka bedingt ist, da nicht der vollständige funktionelle Verlust des Zweiteren, sondern bereits die bloße Störung der Kontrolle seines Expressionslevels, zu einem schweren klinischen Phänotyp führt., Hereditary salt-losing tubulopathies are rare, but potentially life-threatening disorders. A better understanding of the genetic mechanisms underlying these diseases can lead to both earlier diagnosis of the affected patient and possibly a specific therapy, ultimately improving the care of our patients. Bartter´s syndrome with sensorineural deafness (BSND) is a particularly severe form of these tubulopathies, manifesting antenatally with polyhydramnios, subsequent premature labour and postnatally with deafness and renal salt wasting resulting in failure to thrive or even death. The molecular basis of this disorder was uncovered between 2001 and 2008. The chloride channels ClC-Ka and -Kb are expressed both in the kidney and the inner ear and are essential to renal salt reabsorption and the generation of the endochochlear electrochemical gradient. Mutations in either both ClC-channels, or their common subunit Barttin can lead to BSND. Unfortunately, for a significant number of patients with different forms hereditary salt-losing tubulopathies, the mechanism behind their disease is still unknown. This study presents one such patient with a BSND phenotype, lacking the typical genetic defects. The study shows that in this patient only one among the known genes leading to salt-losing tubulopathies, CLCKNB (encoding ClC-Kb), is affected. Since these mutations typically lead to a more benign phenotype than the one exhibited by this patient, the search for mutations was extended to the promoter of CLCNKA, the gene encoding the second chloride channel typically affected in BSND patients. Alongside several known single nucleotide polymorphisms only one previously unknown mutation, dubbed G832A, was found in CLCNKA´s promoter This mutation affects a nucleotide sequence commonly recognized by certain transcription factors. To elucidate the functional relevance of G832A, an established in vitro model for promoter-controlled gene expression was used in three different kidney cell lines. These experiments showed a reduction of up to 77.5% of the expression of genes controlled by a promoter with the G832A mutation compared to the unaffected wildtype promoter Although one should always be careful when translating in vitro findings to phenotypes in vivo, these results, combined with the knowledge that this patient´s phenotype typically results from mutations in both CLCNKA and CLCNKB, strongly hint that G832A contributes significantly to this patient´s disorder. Ultimately, this study, apart from elucidating the molecular basis of another patient´s salt-losing tubulopathy, sheds a little more light on the still insufficiently understood field of compensatory mechanisms in patients with renal salt-wasting – or deafness. The step from the rather benign phenotype of classical Bartter´s syndrome (where only CLCNKB is affected) to the much more severe antenatal from with sensorineural deafness seems to be a short one – only one mutation in CLCNKA´s promoter seems to be enough. It might be possible that this is due to an insufficient compensatory upregulation of CLCNKA, and the experiments elucidating this question should be subject of further studies.

By maintaining the volume and composition of the body fluids within narrow bounds and by producing a set of hormones that affect the blood vessels, the kidneys provide important long-term regulation of the blood pressure. Disturbances of kidney function can cause hypertension, a prevalent disease in modern societies. The kidneys protect their own function against short-term variations in the blood pressure. At the level of the individual functional unit (the nephron), pressure and flow control involves two different mechanisms: the tubuloglomerular feedback, which regulates the incoming blood flow in response to variations of the NaCl concentration of the tubular fluid near the terminal point of the loop of Henle (macula densa), and a myogenic mechanism by which the afferent arteriole regulates its diameter in response to variations in its transmural pressure. Experimentally, both of these mechanisms are found to produce oscillations. In the present study, analysis of experimental data of the tubular pressure and arteriole blood flow in combination with mechanism-based modelling has been used to answer the following questions: (i) How to reveal and characterize interactions between the two mechanisms of renal autoregulation? (ii) To what extend does nephron-to-nephron communication lead to cooperative behaviour? and (iii) How do intra- and inter-nephron interactions differ in normotensive and hypertensive rats? Analysis of experimental data revealed the presence of amplitude and frequency modulation, i.e. the regulation is provided not only by a change in the diameters of the active parts of the vessels, but also by an adjustment of the frequency of the myogenic oscillations. Interaction between the two mechanisms of renal autoregulation was found to be significantly stronger in spontaneously hypertensive rats than in normotensive rats. Synchronization phenomena in neighbouring nephrons were evaluated by measuring both frequency and phase entrainment. Statistical analysis showed that synchronization among mechanisms of renal autoregulation is reduced in hypertensive rats. With a probability exceeding 80%, normotensive rats demonstrated full entrainment in neighbouring nephrons where the oscillatory modes associated with two mechanisms of autoregulation were synchronized. Hypertensive rats displayed about half the probability of full synchronization and about twice the probability of partial synchronization, i.e. a state where neighbouring nephrons synchronize their slow tubuloglomerular feedback dynamics, while the fast myogenic dynamics remain desynchronized, or vice versa. Spontaneously hypertensive rats generally remained in synchrony for only 1/3 to 1/2 as long as the normotensive ones. Numerical simulations with a model of superficial nephrons connected via a flow mediated hemodynamic coupling and a vascular propagated coupling reproduced the experimentally observed patterns of behaviour. Lack of synchronization may be responsible for the development of irregular dynamics in the tubules of rats with experimental hypertension. The model has been extended by including deep nephrons for which it has not yet been possible to perform similar experimental measurements. Using available anatomical and physiological information we constructed a model of an nephron-vascular ensemble including superficial as well as deep nephrons with different length of loop of Henle. The computer simulation suggested that irregular dynamics of nephron ensemble increases at higher arterial pressures and values of the coupling strength. The model showed that, for physiologically reasonable parameter values, the deep nephrons do not synchronize with the superficial nephrons even though they are coupled via the same blood supply., Die Nieren sind wesentlich an der Regulierung des Wasser- und Elektrolyt-Haushalts beteiligt, und haben damit auch eine wichtige Funktion für die Langzeit-Regulation des Blutdrucks, mit zusätzlicher Kontrolle durch das Renin-Angiotensin-System. Störungen der Nierenfunktion können zu Hypertonie führen, einer häufigen Krankheit in modernen Gesellschaften. Die Nieren selbst sorgen für eine optimale Funktion, indem sie sich vor Kurzzeit-Schwankungen des Blutdruckes schützen. Auf der Ebene des Nephrons, der kleinsten Funktionseinheit der Niere, werden Nierendruck und Strömung durch zwei Mechanismen kontrolliert: durch das tubuloglomeruläre Feedback, das den einströmenden Blutfluss in Abhängigkeit von der NaCl-Konzentration in der tubulären Flüssigkeit nahe des Endpunktes der Henle-Schleife (macula densa) regelt, und durch einen myogenen Mechanismus, bei dem die afferente Arteriole ihren Durchmesser dem transmuralen Druck anpasst. Es ist experimentell bewiesen, dass beide Rückkopplungs-Mechanismen zu Oszillationen führen. In der vorliegenden Studie werden durch die Analyse experimenteller Daten des tubulären Druck und des Blutflusses in den Arteriolen in Verbindung mit Computer- Modellen der Autoregulation folgende Fragen bearbeitet: (i) Können Wechselbeziehungen zwischen diesen beiden Mechanismen der renalen Selbstregulierung erkannt und charakterisiert werden? (ii) Führt die Wechselwirkung zwischen benachbarten Nephronen zu synchronisiertem Verhalten? (iii) Lassen sich im Vergleich normo- und hypertensiver Ratten Unterschiede der Autoregulation oder Synchronisation erkennen? Die Analyse der experimentellen Zeitreihen ergab, dass die myogenen Oszillationen sowohl einer Amplituden als auch Frequenzmodulation unterliegen, was auf einen modulierenden Einfluss des tubulo-glomulären Rückkopplungskreises hindeutet. Es zeigte sich, dass die Wechselwirkung zwischen den beiden Oszillatoren der renalen Autoregulierung bei spontan hypertensiven Ratten signifikant stärker als bei normotensiven Ratten ausgeprägt ist. Der Synchronisationsgrad benachbarter Nephronen wurde durch Bestimmung von Frequenz und Phasenentrainment erfasst. Eine statistische Analyse zeigte, dass die Synchronisation zwischen den renalen Autoregulierungs-Mechanismen in hyptertensiven Ratten reduziert ist. Mit mehr als 80%er Wahrscheinlichkeit zeigten normotensive Ratten eine vollständige Synchronisation benachbarter Nephronen, was bedeutet, dass beide Prozesse der Autoregulierung synchron verlaufen. Bei hypertensiven Ratten war die Wahrscheinlichkeit vollständiger Synchronisation war auf die Hälfte reduziert (40%). Dahingegen fand sich eine doppelt so große Wahrscheinlichkeit für partielle Synchronisation - einem Zustand, bei dem nur einer der beiden Rückkopplungskreise, entweder der tubuloglomeruläre oder der myogene, synchronisiert ist. Außerdem dauern bei spontan hypertensiven Ratten die Phasen der Synchronisation nur ein drittel oder halb so lange wie bei normotensiven Ratten. Diese experimentellen Befunde konnten in Computer-Simulationen reproduziert werden, wobei Oberflächen-Nephronen über eine hämodynamische und eine vaskulär vermittelte Kopplung verknüpft sind. Sowohl Experiment als auch Modell lassen vermuten, dass der Mangel an Synchronisation für die Entstehung irregulärer Dynamik in den Tubuli von Ratten mit experimenteller Hypertonie verantwortlich sein kann. Dieses Computer-Modell wurde durch die Einbeziehung tiefliegender Nephronen erweitert, an denen entsprechende experimentelle Messungen bislang nicht möglich sind. Unter Berücksichtigung der aktuell verfügbaren anatomischen und physiologischen Informationen, zeigen die Computer Simulationen zunehmende Unregelmäßigkeiten im Zusammenspiel der Nephronen wenn der arterielle Druck zunimmt oder die Wechselwirkung zwischen den Nephronen größer wird. Allerdings lassen sich bei physiologischen Parameterwerten die tiefliegenden Nephronen nicht mit den Oberflächen-Nephronen synchronisieren, obwohl beide über ihre Blutverssorgung gekoppelt sind.

Der Typ I Transmembran-Rezeptor SORLA gehört zur VPS10p-Rezeptor Familie in Säugern. Der Rezeptor mit starker Homologie zu Endozytose- und Sorting-Rezeptoren ist am stärksten im zentralen Nervensystem (CNS) exprimiert. Außerhalb des CNS ist SORLA in einer Vielzahl von Geweben zu finden, unter anderem in der Niere. Das klare Expressionsmuster des Rezeptors im distalen Nephron lässt eine Rolle des Rezeptors in transepithelialen Transportprozessen vermuten. Um genau festzustellen, welche Prozesse von SORLA beeinflusst werden, wurde die Nierenfunktion von Mäusen mit einer vollständigen Defizienz des Sorla-Gens (Sorla-/-) untersucht. Diese Tiere zeigen Defekte in der renalen Ionenhomöostase: sie verlieren Na+, Cl-, K+, und Ca2+ (im Normalzustand und/oder nach Trinkwasserentzug). Eine Erniedrigung von Blutdruck und Herzfrequenz sowie eine fehlregulierte Sekretion von Aldosteron gehen mit dem Salzverlust-Phänotyp einher. Passend zu dieser Beobachtung konnte eine Expression von SORLA in der Nebenniere – speziell in der Zona glomerulosa, dem Ort der Aldosteron-Synthese – gezeigt werden. Des weiteren wurde eine signifikant verminderte Expression mehrerer Gene des Adrenalin-Synthesewegs in Sorla-/--Mäusen festgestellt, welcher in einer verringerten Menge des Hormons in den Nebennieren der Tiere resultiert. In der Niere bewirkt das Fehlen von SORLA insbesondere eine veränderte Phosphorylierung der beiden Kation-Chlorid-Cotransporter NCC und NKCC2 hervor, deren Aktivität durch Phosphorylierung reguliert wird. Es ist bekannt, dass die Signalkinase SPAK die Aktivität von NKCC2 und NCC reguliert. Die anormale Phosphorylierung fällt mit einer untypischen Verteilung der Kinase im TAL der SORLA-defizienten Mäuse zusammen. Dies deutet auf eine Funktion des Rezeptors beim Trafficking von SPAK hin. Durch die Identifizierung von Transportproteinen als putative Interaktionspartner SORLAs konnte diese Hypothese bekräftigt werden. The type I transmembrane receptor SORLA is a member of the mammalian VPS10p-receptor family. The receptor, which is mainly expressed in the central nervous system (CNS), is characterized by high structural homology to endocytosis- and sorting-receptors. Outside the CNS, expression of SORLA can be found in a variety of tissues, including kidney. This distinct expression pattern in the distal nephron suggests a role for SORLA in transepithelial transport processes. To determine which processes the receptor might be involved in, the kidney function of mice, wich carry a complete deficiency of the Sorla gene, was analyzed. These animals show defects in ion handling: they are wasting Na+, Cl-, K+, and Ca2+ (under normal conditions and/or after water deprivation). The salt loss phenotype is accompanied by decreased mean arterial pressure and heart rate as well as mis-regulated secretion of aldosterone. In line with this observation, SORLA is also expressed in the adrenal gland, particularly in the zona glomerulosa, the place of aldosterone synthesis. Additionally, a significant down-regulation of several genes of the epinephrine synthesis pathway in mice lacking SORLA was found. This defect results in lower adrenal levels of the hormone. In the kidney, the lack of SORLA results especially in altered phosphorylation of the two cation-chloride cotransporters NCC and NKCC2, as their activity is regulated by phosphorylation. The signaling kinase SPAK has been reported to regulate the activity of NKCC2 and NCC. The transporters’ abnormal phosphorylation coincides with the atypical distribution of the kinase in TAL of Sorla-/- mice, suggesting a role of the receptor in establishing the localization of SPAK. This hypothesis was further substantiated by the identification of putative SORLA-interacting proteins involved in trafficking.

Hintergrund und Ziele: Die Fibrose, Hauptmerkmal verschiedenster progressiver Nierenerkrankungen, stellt einen möglichen Auslöser für terminale Niereninsuffizienz dar. Ursächlich für die Zerstörung der Organstruktur sind unter anderem erhöhte Matrixablagerungen durch Fibroblasten, die wahrscheinlich aus der epithelial-mesenchymalen Transformation (EMT) von Tubulusepithelzellen hervorgehen. Die EMT beschreibt einen Vorgang, bei dem sich ruhende Epithelzellen aus ihrem Zellverband lösen, fibroblastoide Gestalt annehmen und nach Migration in umliegendes Gewebe (z.B. das Interstitium) neue Strukturen aufbauen. Dabei kommt es zur verminderten Expression spezifischer epithelialer Proteine. Im Gegensatz dazu ist die Bildung mesenchymaler Proteine gesteigert. Der transformierende Wachstumsfaktor-beta (TGF-ß) gilt als einer der bedeutendsten Auslöser der EMT in einer Vielzahl von Zelllinien. Er vermittelt seine Wirkung unter anderem über die Signalkaskade der kleinen GTPasen der Rho-Familie, die hauptsächlich in Regulation zytoskelettaler Strukturen und migratorischer Prozesse involviert sind. Die Rolle dieses als äußert wichtig erscheinenden Rho-Signalweges wurde in humanen proximalen Tubulusepithelzellen jedoch noch nicht hinreichend erforscht. Um mögliche neue Ansätze für eine Therapie der renalen Fibrose zu identifizieren, sollte zudem der Mechanismus der EMT genauer charakterisiert werden. Grundlage der Versuche waren in Zellkultur gezüchtete humane proximale Tubulusepithelzellen (HKC-8). Sie wurden mit TGF-ß inkubiert und auf die Expression profibrotischer sowie mesenchymaler Proteine hin untersucht. Neben der Proteindetektion mittels Western-Blot kamen auch immunzytochemische Färbungen zum Einsatz. Die Beteiligung der Rho-Signalkaskade sollte mit spezifischen Inhibitoren wie Sim-vastatin und Y 27632 geklärt werden. Dabei verhindert Simvastatin, ein HMG-CoA-Reduktase-Hemmer, die Aktivierung der kleinen Rho-GTPasen, während Y 27632 selektiv die Rho-Kinase ROCK blockiert. Zur Erforschung migratorischer Prozesse nach Applikation von TGF-ß, Simvastatin und Y 27632 wurde zusätzlich ein in vitro Scratch-Assay verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass TGF-ß zu einer ausgeprägten Induktion von profibrotischen (z.B. Connective Tissue Growth Factor) und mesenchymalen (z.B. Fibronektin) Markern führte. Des Weiteren kam es zu einer vermehrten Stressfaserbildung sowie zu einem erhöhten migratorischen Potential. Die Inhibition der Rho-Proteine durch Simvastatin und der Rho-Kinase durch Y 27632 hatte jeweils eine ausgeprägte Reduktion der TGF-ß vermittelten Expression von CTGF und Fibronektin sowie der F-Aktin-Fasern zur Folge. Trotz dieser unterschiedlichen Regulation bezüglich verschiedener EMT-Merkmale wies die Inkubation sowohl mit Y 27632 als auch mit TGF-ß eine vermehrte Migration der Tubulusepithelzellen auf. Dabei migrierten die mit Y 27632 behandelten Zellen eher singulär, während TGF-ß stimulierte Zellen als geschlossene Kohorte die künstliche Wunde reepithelialisierten. Unsere Daten deuten zwar auf eine vermehrte Epithelzellmigration durch Y 27632 und TGF-ß hin, doch lassen morphologische Unterschiede die Beteiligung verschiedener Signalwege vermuten. TGF-ß als Induktor der EMT in humanen Nierenzellen ist wahrscheinlich an der Fibroseentstehung mitbeteiligt. Die Eigenschaft von Y 27632 diesem Vorgang einerseits mit verminderter Expression mesenchymaler Marker entgegen zu wirken, andererseits aber möglicherweise mit seinem migratorischen Potential die Regeneration nach Tubulusschädigung zu erleichtern, macht seinen Einsatz in neuen Therapieoptionen bei chronischer Nierenfibrose denkbar. Darauf aufbauend sind weitere Untersuchungen nötig, die molekularen Signalkaskaden, die in der EMT eine Rolle spielen, genauer zu erforschen und die physiologischen sowie pathologischen Konsequenzen zu interpretieren. Fibrosis, a main feature of a variety of progressive renal diseases, represents a possible trigger for a final end-stage renal failure. The reasons for the destruction of the structure of the organ are, among other things, the increased matrix deposition of fibroblasts, which probably derive from the epithelial-mesenchymal transformation (EMT) of tubular epithelial cells. EMT describes an event, in which dormant epithelial cells detach from their cell association, adopt a fibroblastic phenotype and, after migration into surrounding tissue (e.g. the interstitium), form new structures. At the same time the expression of specific epithelial proteins is decreased, while the formation of mesenchymal proteins increases. Transforming growth factor-ß (TGF-ß) is regarded as a prominent elicitor of EMT in a variety of cell lines. Its effects are at least partly mediated via the signalling pathway of the small GTPases of the Rho family, which are mainly involved in the regulation of cytoskeletal structures and migratory processes. The role of this appearant important Rho signalling cascade in human proximal tubular epithelial cells has not been investigated in detail. To identify possible novel targets for the therapy of renal fibrosis, the mechanism of EMT should additionally be precisely characterised. The experiments are based on human proximal tubular cells (HKC-8) grown in a cell culture. After incubation with TGF-ß, the expression of profibrotic and mesenchymal proteins was tested. Besides the protein detection with western-blot, immuncytochemical staining was used. The involvement of the Rho signalling pathway should be assessed with specific inhibitors like Simvastatin and Y 27632. Simvastatin, a HMG-CoA reductase inhibitor prevents the activation of the small Rho GTPases, while Y 27632 selectively blocks the Rho-kinase ROCK. With regard to the research of migra-tory processes after TGF-ß, Simvastatin and Y 27632 applications, we additionally set up an in-vitro scratch-assay. It could be shown that TGF-ß led to a significant induction of profibrotic (e.g. connective tissue growth factor) and mesenchymal (e.g. fibronectin) markers. It additionally increased the formation of stress fibers and the migratory potential. The inhibi-tion of the Rho-proteins through Simvastatin and the Rho-kinase through Y 27632 caused a marked reduction of the TGF-ß mediated expression of CTGF and fibronectin as well as the f-actin fibers. Despite these different regulations regarding divers EMT characteristics, the incubation with Y 27632 and with TGF-ß showed higher migration rates of the tubular epithelial cells. Cells treated with Y 27632 migrated singularly, whereas TGF-ß stimulated cells closed the artificial wound as a cohort. Our data indicate an increased epithelial cell migration by Y 27632 and TGF-ß, yet morphological differences lead to the assumption that diverse signalling pathways are involved. TGF-ß as inductor of EMT in human renal cells, plays a pivotal role in the cause of fibrosis. The ability of Y 27632 to counteract this process on the one hand by a decreased expression of mesenchymal markers and on the other hand to facilitate the regeneration after tubulus damage with its migratory potential, makes its use in novel therapy options, concerning chronically renal fibrosis, conceivable. Based on these observations, further investigation, which will clarify the role of the molecular signalling cascade and help interpret the physiological and pathological consequences, are needed.

Das sympathische Nervensystem ist an der Regulation des renovaskulären Widerstands beteiligt. Noradrenalin und ATP vermitteln dabei als Neurotransmitter vasokonstriktive Effekte. Postsynaptische Wirkungen von Noradrenalin und extrazellulären Nucleotiden, die involvierten purinergen Rezeptoren sowie ihre Interaktionen wurden am Modell isoliert perfundierter Niere von Wildtyp- und P2Y\(_{4}\)-Rezeptor-Knockout-Mäusen analysiert. Renale Nervenstimulationen lösen frequenzabhängig Druckerhöhungen und neuronale Noradrenalinfreisetzung aus. Neuronal und nicht neuronal freigesetzte Nucleotide rufen durch Aktivierung von P2X\(_{1,3}\)- und P2Y\(_{6}\)-Rezeptoren renale Vasokonstriktionen hervor. Beide Rezeptorsubtypen interagieren miteinander, indem die Desensitisierung von P2X\(_{1,3}\)-Rezeptoren, die durch P2Y\(_{6}\)-Rezeptoren vermittelte Vasokonstriktionen potenziert. Bei sympathischer Überaktivität werden extrazelluläre Nucleotide freigesetzt und können zur Entwicklung einer essentiellen Hypertonie beitragen.

Cilia are hair-like structures that extend from the surface of epithelial cells. Human diseases referred to as ciliopathies arise from defects in cilia function. Autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD), the most frequent cause of hereditary cystic kidney disease in infancy and childhood, and Usher syndrome, the most frequent hereditary cause for combined deaf-blindness, are two important ciliopathies. Senior-Løken syndrome as another ciliopathy affects both organs, the kidney and the eye. The characterization of protein-protein-interactions is of particular interest for the understanding of ciliopathies. The intention of this thesis was to characterize the interaction between the ARPKD protein Polyductin and the Usher syndrome protein Harmonin. As indispensable prerequisite for interaction, the proteins show a partly overlapping expression pattern, e.g. in renal primary cilia. Due to its PDZ-domains, Harmonin acts as a scaffold protein. In line, an extended network including Polyductin can be hypothesized. Although Polyductin lacks certain characteristics of a typical binding partner of Harmonin, such as a characteristic PDZ-binding motif, the interaction of both proteins seems well plausible. In a yeast-two-hybrid screen previously performed in our group, the intracellular domain of Polyductin as bait protein, Harmonin was among the proteins detected as potential binding partner of Polyductin. In the following, respective Polyductin- and Harmonin-constructs were cloned, transfected into COS7-cells and finally expressed. Afterwards co-immunoprecipitation and western blot experiments confirmed the result of the yeast-two-hybrid screen. Thus, overall the interaction of these two proteins is likely albeit. Further experiments for validation are reasonable. Characterization of protein networks will help to elucidate the pathogenesis and molecular and cellular mechanisms underlying ciliopathies like ARPKD and Usher syndrome. Hopefully new therapeutic options will evolve from this and other studies.

Der Prozess von der Entdeckung und Entwicklung eines potentiellen Arzneistoffs bis zu dessen Zulassung ist extrem kosten‐ und zeitintensiv und eine Vielzahl dieser Stoffe kann aufgrund toxischer Nebenwirkungen in präklinischen Studien nicht weiterentwickelt werden. Dabei ist die Niere eines der Hauptziele von Xenobiotika‐induzierter Organtoxizität, jedoch ist eine frühe Detektion von Nierenschäden schwierig. Den derzeitig verwendeten klinischen Parameter, wie Blutharnstoff (BUN) und Serumkreatinin fehlt es an Sensitivität und Spezifität, da sie Fremdstoff‐induzierte Toxizität meist erst aufzeigen, wenn schon ein erheblicher Teil der Nierenfunktion beeinträchtigt ist. Daher ist es notwendig, empfindlichere und zuverlässigere Biomarker zu identifizieren und zu validieren, welche kleinste Nierenschädigungen früher als traditionelle Parameter erkennen. In den letzten Jahren wurden in der Literatur aber auch von verschiedenen Projekten eine Reihe neuer gen‐basierender und Urinbiomarker (Kim‐1, Clusterin, Lipocalin‐2, Timp‐1) identifiziert. Ziel dieser Dissertation war es die Aussagekraft dieser Marker im Vergleich zu traditionellen Endpunkten, einschließlich klinische Chemie und Histopathologie an Gewebe‐, Urin‐ und Serumproben von männlichen Ratten, welche mit Modellsubstanzen für Nephrotoxizität (Aristolochiasäure und Gentamicin) oder nephrotoxischen Arzneistoffkandidaten (PredTox Projekt) behandelt wurden, mittels qRT‐PCR, Immunhistochemie und ELISA zu untersuchen. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Effekte auf Ebene der Gen‐ und Proteinexpression generell sehr gut mit den histopathologischen Veränderungen korrelieren. Sie konnten meist früher oder in niedrigeren Dosierungen als die traditionellen Nierenmarker BUN und Serumkreatinin detektiert werden. Eine erhöhte Expression und Exkretion von Kim‐1 zeigte sich in allen Studien als eine der frühesten Antworten auf Schädigung der proximalen Tubuli und stellt somit den empfindlichsten Biomarker dar. Die erhöhte Ausscheidung von Clusterin konnte teilweise vor einer veränderten Gen‐ und Proteinexpression im Gewebe detektiert werden und unterstützen die Verwendung von Clusterin als nicht‐invasiven Biomarker. Obwohl eine gesteigerte Exkretion von Lipocalin‐2 sehr früh nach Schädigung des proximalen Tubulus detektiert werden konnte, ist diese nicht spezifisch für einen Nierenschaden. Dennoch könnte die vermehrte Expression/Ausscheidung von Lipocalin‐2 als frühe Antwort auf eine Entzündung oder einen Gewebeschaden eine sinnvolle Ergänzung der routinemäßigen Testung auf Toxizität darstellen. Ebenfalls konnte ein dosis‐ und zeitabhängiger Konzentrationsanstieg von einem Großteil der potentiellen Biomarker des „WideScreen™ Rat Kidney Toxicity Panels 1 and 2“ im Urin beobachtet werden. Da jedoch die potentiellen Biomarker unterschiedliche Empfindlichkeiten besitzen und unter Umständen auch vom Mechanismus der Toxizität von Verbindungen abhängen, erscheint eine Kombination von verschiedenen Biomarkern zur frühzeitigen Erkennung von proximalen Nierenschäden sowie zur Verlaufskontrolle von Nierenerkrankungen sinnvoll. Durch die einfache Probenahme und leichte Bestimmung ist die Messung der neuen potentiellen Nierenbiomarker im Urin neben der Bestimmung der traditionellen Parameter der klinischen Chemie sowie der Histopathologie sinnvoll für die Identifizierung von Nierenschädigungen in präklinischen Studien., The discovery and development of new drugs is very costly and time‐consuming and the rate of drug failure due to late‐breaking findings in preclinical toxicity studies is high. The kidney is a major target of xenobiotic induced organ toxicity but early detection of renal damage or minor effects on renal function is challenging due to the functional reserve of the kidney. Current clinical pathology parameters of nephrotoxicity such as blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine are relatively insensitive and non specific, revealing kidney damage not until 70‐80 % of the renal epithelial mass has been lost. There is a clear need for the identification and validation of more sensitive and reliable biomarkers, which are indicators of minimal kidney damage rather than impaired kidney function. Recently a range of novel gene‐based and urinary kidney biomarker (Kim‐1, clusterin, lipocalin‐2 and Timp‐1) was identified from literature and various colloraborative projects. The aim of this work was to investigate the performance of these markers compared to traditional endpoints, such as clinical chemistry and histopathology in tissue, urine and serum samples collected from studies, in which male Wistar rats were treated either with model compounds of nephrotoxicity (aristolochic acid and gentamicin) or drug candidates (PredTox) using qRT‐PCR, immunohistochemistry and ELISA. In summary, effects on marker gene and protein expression generally correlated well with the renal histopathology alterations and were frequently detected at earlier time‐points or lower doses than the traditional clinical parameters BUN and serum creatinine. Overexpression and enhanced urinary excretion of Kim‐1 was one of the earliest responses to proximal tubule damage and might be seen as the most sensitive marker of nephrotoxicity. Furthermore, urinary Clusterin was increased before changes in gene and protein expression or even histopathological alterations were evident, confirming urinary clusterin as a sensitive, non‐invasive marker for renal injury. Although changes in urinary lipocalin‐2 occurred very early after proximal tubule damage, lipocalin‐2 may not specific for kidney injury. However, its rapid response to inflammation and tissue damage in general may reinforce its use in routine toxicity testing. A dose‐ and time‐dependent increase in most of the novel urinary biomarkers was evident using the “WideScreen™ Rat Kidney Toxicity Panels 1 and 2”. Due to the the variable sensitivity of a single biomarker, a combination of many different biomarkers to detect kidney injury appears to be useful. Concerning of the easy sampling and measurement, the additional determination of potential urinary biomarkers of nephrotoxcity next to the traditional clinical chemistry parameters and histopathological changes is helpful to identify kidney damage at early time‐points.

In dieser Arbeit sind pathologische Änderungen geschildert, bestimmt bei der Nekropsie der Tierleiche von rotohriger Schildkröte (Trachemys scripta elegans), die seitens des Besitzers unter der Verdacht, dass es sich um eine vorangeschrittene „Krankheit des Panzers“ geht, zugestellt wurde. Durch die äußere Untersuchung wurde die Anwesenheit von fleckenartigen Blutungen festgestellt, die besonders am Kopf, an den Teilen des abdominalen Panzers und an den Zusammenfügungen der Beine mit dem Panzer ausgeprägt waren, sowie die charakteristischen kraterartigen Beschädigungen des Plastrons und Panzercarapace. Nach dem Abnehmen des Bauchpanzerteiles wurden an dessen Innenseite drei Gewebeanhäufungen unregelmäßiger Form, hart elastischer Konsistenz, und pathologische Änderungen an anderen Organen festgestellt. Durch spezielle histologische Färbung Sudan III wurde die Anwesenheit von fettigen Vacuolen innerhalb des Hepatozytes und Nierenglomeruli bewiesen, was auf eine Feffdegeneration und Infiltration der Leber und Nieren hinweist. In dieser Arbeit ist der Fall einer Schildkröte geschildert, gestorben an einer ulzerösen Krankheit des Panzers, es sind makroskopische und pathologische Befunde besprochen.

Thesis (M.Sc. (Environmental Science and Management))--North-West University, Potchefstroom Campus, 2011. The study attempted to quantify the elemental concentrations and possible accumulation levels in the antelope's organ tissue at Rheinmetal Denel Munitions (RDM), as well as to correlate the findings with the surrounding environment. To achieve this, the elemental concentrations within the kidney, liver and lung tissue of the antelope, and environmental factors such as the soil, vegetation and waterholes were quantified. STATISTICA was used to determine meaningful differences between variables and Canoco to determine the relationship between the different datasets. PCA analyses of the vegetation confirmed that the natural slope at RDM could have contributed to the distribution and variation of the elemental concentration. It became apparent that positive associations existed between the liver tissue and the K, the kidney tissue and Ni and Cd, and the lung tissue had a positive association with Mg, Mn, V, Rb and Co elemental concentrations. It became evident in this study that the elemental concentrations of Al and Ni were higher in the liver and kidney tissue of the antelope than the recommended concentration for livestock (Puls, 1994). The elemental concentration of Al, Ca, Fe and Mn also exceeded the recommended elemental concentration for livestock, in the water sampled at RDM (Puls, 1994). Four distinct areas were identified within the study area, the area above the factory, the area under the factory, the testing area and the area under the factory. Significant differences between the testing area and the area under the factory were found regarding the Tl, Ag, Hg and B elemental concentrations in the vegetation. Furthermore, it became apparent that the amount of precipitation could have contributed to the variation of the elemental concentrations and distribution in the study area as well as in the organ tissue of the antelope. Masters

Ill., graph. Darst.

Ill., graph. Darst.

The study attempted to quantify the elemental concentrations and possible accumulation levels in the antelope's organ tissue at Rheinmetal Denel Munitions (RDM), as well as to correlate the findings with the surrounding environment. To achieve this, the elemental concentrations within the kidney, liver and lung tissue of the antelope, and environmental factors such as the soil, vegetation and waterholes were quantified. STATISTICA was used to determine meaningful differences between variables and Canoco to determine the relationship between the different datasets. PCA analyses of the vegetation confirmed that the natural slope at RDM could have contributed to the distribution and variation of the elemental concentration. It became apparent that positive associations existed between the liver tissue and the K, the kidney tissue and Ni and Cd, and the lung tissue had a positive association with Mg, Mn, V, Rb and Co elemental concentrations. It became evident in this study that the elemental concentrations of Al and Ni were higher in the liver and kidney tissue of the antelope than the recommended concentration for livestock (Puls, 1994). The elemental concentration of Al, Ca, Fe and Mn also exceeded the recommended elemental concentration for livestock, in the water sampled at RDM (Puls, 1994). Four distinct areas were identified within the study area, the area above the factory, the area under the factory, the testing area and the area under the factory. Significant differences between the testing area and the area under the factory were found regarding the Tl, Ag, Hg and B elemental concentrations in the vegetation. Furthermore, it became apparent that the amount of precipitation could have contributed to the variation of the elemental concentrations and distribution in the study area as well as in the organ tissue of the antelope. Thesis (M.Sc. (Environmental Science and Management))--North-West University, Potchefstroom Campus, 2011.