Search

Primary somatic embryogenesis, secondary somatic embryogenesis (cyclic) and shoot organogenesis protocols, were developed, for 2 genotypes of cassava plants – Tapicínea and Bujá Preta, cultivated in the state of Ceará. Cultures were established, using shoot apical meristems of plants maintained in the field, and using the basic MS medium, supplemented with sucrose, copper sulfate and agargel. The material was maintained by monthly sub-culture as in vitro shoot, using nodal explants and cultured on MS medium without growth regulators. Apical shoot meristems from in vitro plants, with 2 or 3 immature leaves were used for induction of primary somatic embryos, on basic medium, supplemented with Picloram. That growth regulator was capable to induce the embryos formation in different concentrations, being the 8,0 mg/L concentration, the most appropriate for the 2 genotypes. The embryos were, then, transferred to maturation medium (MS + 0,1 mg/L of BAP). Cotyledons from germinating primary somatic embryos were used to induction secondary (cyclic) somatic embryos, in MS medium supplemented with different Picloram concentrations. A larger competence was observed for the embriogênese in that explante type, when compared to shoot apexes, in both, frequency and productivity. The most appropriate concentrations for the 2 genotypes were 4,0 mg/L and 8,0 mg/L - Tapicínea and Bujá Preta, respectively. Pieces of cotyledons from secondary somatic embryos were used in the shoot organogenesis induction. The explantes were inoculated in MS medium, supplemented with IBA and BAP (0,0; 0,25; 0,5; 1,0 and 3,0 mg/L, for both regulators), in factorial (5 x 5) arranged. The positive answer was observed in both genotypes, being the concentrations of IBA and BAP of 1,0 mg/L and 0,25 mg/L, and of 1,0 mg/L and 0,5 mg/L, the best for Bujá Preta and Tapicínea, respectively. The histological analysis of secondary somatic embryogenesis – Bujá Preta cultivar - showed an embryogenics cells proliferation, starting from the vascular areas. Globular structures appeared starting from that cellular mass, configuring the multicelular origin of the embryos. Histological analysis of the shoot organogenesis, also in Bujá, Preta cultivar, presented different result compared to embryogenesis. The structures formation occur in sub-epidermal layers, forming buds that development in to shoots, with a vascular connection from the explante Protocolos de indução de embriogênese somática primária, embriogênese somática secundária (cíclica) e organogênese de partes aéreas, foram desenvolvidos, objetivando a regeneração de novo, de plantas de mandioca de duas cultivares amplamente exploradas no estado de Ceará, Tapicínea e Bujá Preta. As culturas foram estabelecidas in vitro, a partir de meristemas apicais caulinares de plantas no campo e mantidas em meio básico MS, suplementado com sacarose, sulfato de cobre e agargel. A multiplicação se deu através de repicagens mensais de ápices e regiões nodais. Ápices caulinares com 2 ou 3 primórdios foliares, de plantas mantidas in vitro, foram utilizados para a indução de embriogênese somática primária, em meio básico MS, suplementado com Picloram. Esse regulador de crescimento foi capaz de induzir a formação de embriões em diferentes concentrações, sendo a concentração de 8,0 mg/L a mais apropriada para as duas cultivares estudadas. Os embriões foram, então, transferidos para o meio de maturação (MS + 0,1 mg/L de BAP). Fragmentos de cotilédones verdes (± 6 mm2), de embriões somáticos primários em processo de maturação, foram utilizados para a indução de embriogênese somática secundária, em meio MS suplementado com diferentes concentrações de Picloram. Foi observada uma maior competência para a embriogênese nesse tipo de explante, quando comparado a ápices caulinares, tanto em freqüência como em produtividade. As concentrações de Picloram mais adequadas para os 2 genótipos foram 4,0 mg/L para a Tapicínea e 8,0 mg/L para a Bujá Preta. Segmentos de cotilédones de embriões somáticos secundários foram utilizados nos experimentos de indução de organogênese de partes aéreas. Os explantes foram inoculados em meio MS suplementado com AIB e BAP, nas concentrações de 0,0; 0,25; 0,5; 1,0 e 3,0 mg/L, para ambos os reguladores, combinados segundo fatorial (5 x 5), num total de 25 tratamentos. Houve resposta positiva em ambos os genótipos, sendo as concentrações de AIB e BAP de 1,0 mg/L e 0,25 mg/L, e de 1,0 mg/L e 0,5 mg/L, as mais adequadas para Bujá Preta e Tapicínea, respectivamente. A análise histológica dos processos de embriogênese somática secundária em Bujá Preta mostrou uma proliferação de células embriogênicas, iniciando-se a partir das regiões vasculares. Estruturas globulares surgiam a partir dessa massa celular, configurando a origem pluricelular dos embriões. A análise histológica da organogênese de partes aéreas, também em Bujá Preta, apresentou resultado bastante diverso daquele da embriogênese. O início da formação das estruturas ocorreu em camadas sub-epidérmicas, formando protuberâncias (gemas adventícias) que se desenvolviam em partes aéreas, mantendo uma conexão vascular com o explante.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Avaliou-se o potencial genético de nove cultivares de soja em relação à embriogênese somática utilizando 2,4-D como agente indutor a fim de selecionar os genótipos mais responsivos para serem transformados com o gene que codifica a citrato sintase (CS). Foi verificado um efeito marcante do genótipo nas respostas morfogênicas. Os cultivares Spring, CAC-1 e COODETEC 201 apresentaram as melhores respostas, com médias de produções de embriões por cotilédone de 32,63, 27,60 e 26,80, respectivamente. Cinco cultivares foram utilizados na fase de proliferação. Destes, os cultivares CAC-1 e Spring apresentaram altas freqüências de formação de agregados de embriões secundários, 90,6% e 91,6%, respectivamente. Para avaliar a fidelidade genética das plantas regeneradas por este sistema embriogênico foram utilizados marcadores RAPD. Vinte “primers” foram usados para avaliar 44 regenerantes do cultivar Spring e 28 do cultivar CAC-1. Três “primers” apresentaram bandas polimórficas para dois regenerantes do cultivar Spring, em relação à planta matriz, com uma freqüência de variação somaclonal de 4,5%. Para ‘CAC-1’, quatro “primers” mostraram polimorfismos em um regenerante, com freqüência de variação de 3,5%. Estes resultados mostram que marcadores RAPD podem ser utilizados para assegurar a estabilidade genética de plantas regeneradas via sistema de embriogênese somática em soja, garantindo a fidelidade genética dos regenerantes. A taxa de variação somaclonal, avaliada em nível molecular, foi relativamente baixa para as plantas regeneradas (menor que 5%) quando comparado às relatadas para outras espécies. Portanto, o protocolo de embriogênese somática com 180 μM de 2,4-D foi usado para obter plantas de soja geneticamente modificadas com o gene CS. Após seleção dos cultivares mais responsivos à embriogênese, seguiu-se a transformação genética. Cotilédones dos cultivares Spring e CAC-1 foram utilizados para avaliar o nível de expressão transitória em resposta à transformação mediada por Agrobacterium com o auxílio da sonicação. O tempo de sonicação foi de 2 segundos e os cotilédones foram co-cultivados em meio MSD40 suplementados e não-suplementado com acetossiringona (100 μM). A freqüência relativa da expressão transitória de gene GUS, na face adaxial dos cotilédones, foi de 13,9% e 19,3% para os cultivares CAC-1 e Spring, respectivamente, quando acetossiringona foi empregado. Porém, na ausência de acetossiringona, a freqüência relativa reduziu para 0,37% e 1,46% para CAC-1 e Spring, respectivamente. A avaliação da expressão transitória na otimização de sistemas de transformação serviu como suporte para transformação com o gene CS. Agregados de embriões do cultivar CAC-1 foram transformados com o gene (CS) de Daucus carota e de Escherichia coli. Um total de 26 embriões transformados com o gene CS de D. carota e 31 com o gene CS de E. coli chegaram à fase final para conversão em plantas. Quando colocados no meio de conversão e germinação o processo de conversão foi iniciado com a emissão dos primeiros folíolos. No entanto, logo em seguida iniciava um forte processo de necrose dos folíolos com conseqüente morte das plântulas. Sugere-se que o efeito necrótico observado nos folíolos das plântulas transgênicas poderia estar associado ao nível de expressão do gene CS. Uma superexpressão desse gene levaria ao acúmulo de citrato nas folhas, inibindo a respiração o que acarretaria acúmulo de piruvato. Piruvato em excesso na folha é utilizado na síntese de lactato, causando elevação na acidez. Este fato promoveria a necrose observada nos folíolos das plântulas de soja transformadas com o transgene CS. The genetic potential of nine soybean cultivars were evaluated in relation to the somatic embryogenesis using 2,4-D as inductor in order to select the most responsive genotypes to be transformed with the gene that codifies citrate synthase (CS). It was observed a strong effect of the genotype in the morphogenic response. Spring, CAC 1 and COODETEC 201 cultivars showed the best answers, with averages of embryo production for cotyledon of 32.6, 27.6 and 26.8, respectively. Five cultivars were used in the proliferation phase. Of these, CAC 1 and Spring showed the highest frequencies in the formation of secondary embryo clusters, 90.6% and 91.6%, respectively. It was concluded that the embryogenic system optimized in this work can be employed for soybean transformation once a responsive cultivar is used. RAPD markers were used to evaluate genetic stability of regenerants of soybean plants obtained via somatic embryogenesis using 180 μM 2,4-D. Twenty primers were used for screening 44 regenerants from cultivar ‘Spring’ and 28 from cultivar ‘CAC 1’. Three primers were polymorphic for two of the Spring-derived regenerants, with a somaclonal frequency of 4.5 %. Four primers were polymorphic for the CAC 1-derived regenerant, with a somaclonal frequency of 3.57%. The present results indicate the usefulness of RAPD markers to detect genetic instability in soybean primary regenerant plants derived from somatic embryogenesis, and as a certification tool for monitoring genetic stability during the regeneration process. Therefore, the somatic embriogenesis protocol with 180 μM 2,4-D was used to obtain genetically modified soybean plants with the CS gene. Cotyledons of the cultivar Spring and CAC-1 were used to evaluate the transient expression level in response to sonication-assisted Agrobacterium- mediated transformation. The time of sonication was of two seconds and the cotyledons were co-cultivated in MSD40 medium supplemented or not with acetosyringone (100 μM). The relative frequency of transient expression of GUS gene, in the adaxial face of the cotyledons, was 13.9% and 19.3% for cultivar CAC-1 and Spring, respectively, when acetosyringone was used. However, in the absence of acetosyringone, the relative frequency reduced to 0.37% and 1.46% for CAC-1 and Spring, respectively. Optimization of the transient expression in transformation systems gave support for transformation with the CS gene. Embryo clusters of cultivar CAC-1 were transformed with CS gene from Daucus carota and from Escherichia coli. A total of 26 transformed embryos with the CS gene from D. carota and 31 with the CS gene from E. coli was obtained for conversion into plants. When these embryos were placed in the conversion and germination medium, the conversion process was initiated by emitting the first leaflets. However, soon after it began a strong necrosis took place of the leaflets with consequent death of the plants. It is suggested that the necrotic effect observed in the leaflets could be associated with the level of expression of the CS gene. Over expression of this gene would lead to citrate accumulation in the leaflets, inhibiting the respiratory process. That would induce piruvate accumulation. Piruvate in excess would be used for lactate synthesis, causing an increase of the acidity. This fact would promote the necrosis observed in the leaflets of the transformed soybean plants with the CS gene.

A embriogênese somática pode ser uma alternativa para o melhoramento de espécies vegetais, quando associada à transformação genética. A regeneração de plântulas a partir de embriões somáticos é dependente de vários fatores, entre eles, a qualidade do embrião somático. Neste trabalho embriões somáticos com diferentes características morfológicas são descritos. Embriogênese somática de bananeira, cv. Grand Nain e Nanicão Jangada foi induzida a partir de inflorescências funcionalmente masculinas, em meio de indução (MI) seguido de subcultivo em meio de germinação (MG), em ausência de luz. A presença de luz na indução, não favoreceu a resposta embriogênica. Em ausência de luz, os explantes da cv. Nanicão Jangada, durante os seis meses de cultivo, sofreram diversas alterações, como a formação de calos embriogênicos e não embriogênicos, formação de embriões somáticos, continuidade no desenvolvimento do botão floral ou oxidação do explante. A freqüência de resposta embriogênica foi baixa, com apenas 6% dos explantes formando embriões somáticos e 23% com formação de calos embriogênicos. O acompanhamento histológico e morfológico das alterações ocorridas nos explantes permitiu a identificação de embriões somáticos com características morfológicas distintas: com maior freqüência observou-se um tipo de embrião com morfologia semelhante ao embrião zigótico de Musa acuminata; em menor freqüência desenvolveram-se embriões somáticos semelhantes a embriões zigóticos de outras monocotiledôneas, indicando que em um único protocolo de embriogênese somática, é possível ocorrer a formação de diferentes padrões morfológicos de embriões somáticos. Somatic embryogenesis is an alternative for genetic breeding of plant species when associated to genetic transformation techniques. Regeneration of plantlets from somatic embryos relies on somatic embryo quality, among other factors. In this work, banana somatic embryos with different morphological characteristics are described. Banana somatic embryogenesis was obtained from functional male inflorescences in induction medium (MI) followed by subculture to germination medium MG, in the absence of light. Induction under a 16-h photoperiod did not favor the embryogenic formation. In absence of light, inflorescence explants of the cultivar Nanicão Jangada responded by several morphogenic responses. Induction of embryogenic and non-embryogenic callus, development of somatic embryos, continuity of the flower bud development or oxidation of the explants were observed in the cultures. The frequency of embryogenic response was low, with only 6% of the explants forming somatic embryos, while 23% showed the formation of embryogenic callus. Histological and morphological studies presented the formation of two types of somatic embryos: one resembling the zygotic embryo of Musa acuminata, and the other type showing more similarity to the zygotic embryo of other monocotyledonous species, indicating that in one somatic embryogenic protocol different morphological patterns can be observed. In addition to the formation of somatic embryos, continuity in the development of floral buds was frequently observed.

In an attempt to establish an alternative plant regeneration system for soybean [Glycine max (L.) Merrill] cultivars used in Brazilian breeding programs, ten genotypes were tested for their embryogenic potential. Cotyledons were removed as explants from immature seeds harvested from field-grown plants. After 45 days on induction medium, the number of responding cotyledons and the number of somatic embryos per immature cotyledon were evaluated. The percentage of explants that produced somatic embryos varied from 1 to 70% among cultivars. The average number of somatic embryos produced per cotyledon pair ranged from 0.01 to 10.3 with a mean of 3.4. Suspension cultures were initiated with three Agrobacterium tumefaciens susceptible cultivars. Suspensions were successfully developed from Bragg and IAS5 cultivars. The packed cell volume, in one-month growth, increased 8.1 fold for Bragg and 3.5 fold for IAS5 and the fresh weight increased 6.6 and 2.8 fold, respectively. The cultivars differed for the analysed parameters. All tissue from each cultivar was transferred to the maturation medium and subsequently to the germination medium. The germination frequency was 45.7 and 54.9% for Bragg and IAS5, respectively. Plants were gradually exposed to ambient humidity over one week and then planted in soil. All plants yielded seeds in the greenhouse. Com o objetivo de estabelecer um sistema alternativo de regeneração de plantas para cultivares de soja [Glycine max (L.) Merrill] utilizadas em programas de melhoramento no Brasil, dez genótipos foram testados quanto ao seu potencial embriogênico. Os cotilédones utilizados como explantes foram excisados de sementes imaturas de plantas provindas do campo. Após 45 dias em meio de indução, o número de cotilédones embriogênicos e o número de embriões somáticos por cotilédone imaturo foram avaliados. A porcentagem de explantes que produziram embriões somáticos variou de 1 a 70% entre cultivares. O número médio de embriões somáticos produzidos por par de cotilédones variou de 0,01 a 10,3, com uma média de 3,4. Culturas em suspensão foram iniciadas a partir de três cultivares suscetíveis a Agrobacterium tumefaciens. Suspensões foram estabelecidas com sucesso para os cultivares Bragg e IAS5. Em um mês, o volume celular aumentou 8,1 vezes para Bragg e 3,5 vezes para IAS5 e o peso fresco aumentou 6,6 e 2,8 vezes, respectivamente. Todo o tecido de cada cultivar foi transferido para meio de maturação e, subseqüentemente, para meio de regeneração. A freqüência de germinação foi de 45,7 e 54,9% para Bragg e IAS5, respectivamente. Durante uma semana, as plantas foram expostas gradualmente à umidade do ambiente, sendo então plantadas em solo em casa de vegetação. Todas as plantas produziram sementes.

A regeneração de plantas in vitro é uma limitação encontrada na maioria dos cereais. Uma forma de minimizar essa dificuldade tem sido a busca de fontes alternativas de tecidos com habilidade para esse fim. O objetivo deste trabalho foi investigar o potencial e o período necessário para regeneração de plantas in vitro de genótipos brasileiros de aveia (Avena sativa L.) a partir de segmentos da base da folha. Segmentos de 1-2mm retirados do coleóptilo de genótipos de aveia foram cultivados por 21 dias em meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) suplementado com 2,0mg L-1 de 2,4-D (ácido 2,4- diclorofenoxiacético) e, posteriormente, transferidos para meio de regeneração de plantas. Não foi encontrada variabilidade entre os genótipos quanto à capacidade de induzir calos embriogênicos e regenerar plantas a partir de segmentos da base da folha, tendo sido possível regenerar genótipos de aveia antes considerados sem habilidade para o cultivo in vitro. O uso desse explante possibilitou reduzir o tempo de regeneração de plantas de aveia para cinco meses e a não correlação entre a percentagem de embriogênese somática e regeneração de plantas indica que a embriogênese não é o único caminho de regeneração a partir desse explante. The ability for in vitro plant regeneration is limited in most of the cereal crops. One way to minimize this problem has been to search for alternative sources of tissues with the ability for in vitro cultivation. This report aims at the investigation of the potential and the amount of time necessary for in vitro plant regeneration of Brazilian oat (Avena sativa L.) genotypes from leaf base segments. One to two millimeter coleoptile segments of oat genotypes were cultivated for 21 days on MS medium (MURASHIGE & SKOOG, 1962) plus 2,0mg L-1 de 2,4-D (2,4- dichlorophenoxyacetic acid), and transferred to plant regeneration media. Variability among genotypes for somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf base segments was not found, but it was possible to regenerate oat genotypes previously considered recalcitrants for in vitro regeneration. Besides that, it was possible to reduce to 5 months the plant regeneration period with this explant. The non-significant correlation between the percentage of somatic embryogenesis and plant regeneration indicates that the embryogenesis is not the only way for plant regeneration from this explant

A salinidade do solo é um problema muito importante em áreas irrigadas do semi-árido brasileiro, onde o milho é uma cultura de subsistência. Este trabalho teve como objetivo estudar o efeito de concentrações de NaCl sobre calos embriogênicos, da cultivar Jatinã C3 Anão, uma importante cultivar de milho no Nordeste do Brasil. A indução dos calos foi feita a partir de embriões imaturos assepticamente retirados das sementes e inoculados em meio de cultura N6 suplementado com 2 mg L-1 de 2,4-D. Os calos embriogênicos foram submetidos a diferentes concentrações de cloreto de sódio (0; 50; 100; 150 e 200 mmol L-1 de NaCl), com três repetições durante 60 dias. Os calos submetidos a 100 mmol L-1 de NaCl apresentaram aumento no conteúdo de prolina na ordem de 37% quando comparado com o nível de 50 mmol L-1 de NaCl, sugerindo um efeito positivo da acumulação deste aminoácido em resposta ao estresse salino. Por outro lado, em elevadas concentrações salinas (150 e 200 mmol L-1) observou-se decréscimo no crescimento dos calos, bem como redução nos teores de prolina, provavelmente em função de um aumento da fração não embriogênica dos calos.

A salinidade do solo é um problema muito importante em áreas irrigadas do semi-árido brasileiro, onde o milho é uma cultura de subsistência. Este trabalho teve como objetivo estudar o efeito de concentrações de NaCl sobre calos embriogênicos, da cultivar Jatinã C3 Anão, uma importante cultivar de milho no Nordeste do Brasil. A indução dos calos foi feita a partir de embriões imaturos assepticamente retirados das sementes e inoculados em meio de cultura N6 suplementado com 2 mg L-1 de 2,4-D. Os calos embriogênicos foram submetidos a diferentes concentrações de cloreto de sódio (0; 50; 100; 150 e 200 mmol L-1 de NaCl), com três repetições durante 60 dias. Os calos submetidos a 100 mmol L-1 de NaCl apresentaram aumento no conteúdo de prolina na ordem de 37% quando comparado com o nível de 50 mmol L-1 de NaCl, sugerindo um efeito positivo da acumulação deste aminoácido em resposta ao estresse salino. Por outro lado, em elevadas concentrações salinas (150 e 200 mmol L-1) observou-se decréscimo no crescimento dos calos, bem como redução nos teores de prolina, provavelmente em função de um aumento da fração não embriogênica dos calos. Soil salinity is a very important problem in irrigated areas of the brazilian semi-arid area, where maize is a subsistence crop. To study the effect of NaCl concentrations in embryogenic calli of Jatinã C3 Anão, an important maize cultivar of the Northest of Brazil, calli were induced using immature embryos aseptically removed from the seeds and grown on N6 medium supplemented with 2 mg L-1 of 2,4-D. To study the effect of salinity in vitro, embryogenic calli were subjected to different concentrations of sodium chloride (0; 50; 100; 150 and 200 mmol L-1 of NaCl), in three replicates, during 60 days. Calli subjected up to100 mmol L-1 NaCl showed proline concentration 37% higher than callus treated with 50 mmol L-1 NaCl. This result suggests a positive effect of proline accumulation at salt stress conditions. However, at the highest concentration tested (150-200 mmol L-1 NaCl) as lower growth and also a lower proline accumulation was observed, probably due to an increase of the non embryogenic fraction of calli.

Este trabalho teve por objetivo estabelecer um protocolo para a indução e desenvolvimento de calos e embriões somáticos em mamoeiro (Carica papaya L. cv. Tainung n.1). Foram utilizados quatro tipos de explantes (hipocótilo com folhas cotiledonares, hipocótilo, folhas cotiledonares e epicótilo) e duas condições de cultivo (escuro e 16 horas de luz). A indução e o desenvolvimento de calos foram avaliados nos meios de cultura ½MS2, ½MS10 e HMH e a indução e o desenvolvimento de embriões somáticos nos meios ½MS e HMH1. O cultivo de explantes de hipocótilo com folhas cotiledonares em meio de cultura ½MS10, por 20 dias, sob condições de escuro, foi o mais adequado para a indução (100%) e o crescimento de calos friáveis embriogênicos. O cultivo desses calos em meio ½MS, por duas subculturas de 30 dias, sob condições de escuro, foi o mais adequado para a indução (60%) e o desenvolvimento de embriões somáticos. O tipo de explante, meios de cultura e condições de cultivo foram definidos para a embriogênese somática em mamoeiro. In order to establish a protocol for induction and development of callus and somatic embryos of papaya (Carica papaya L. cv. Tainung n.1) four explant types (hypocotyl with cotiledonary leaves, hypocotyl, cotiledonary leaves and epycotyl) and two light conditions (dark and 16 h photoperiod) were used. Callus induction and development were evaluated in ½MS2, ½MS10 and HMH media, and somatic embryo induction and development in ½MS and HMH1 media. In vitro culture of hypocotyl with cotiledonary leaves in ½MS10 medium, under dark condition for 20 days, was suitable for induction (100%) and growth of embryogenic friable callus. The culture of these callus in ½MS medium, under dark condition for two subcultures of 30 days, was suitable for induction (60%) and development of papaya somatic embryos. The explant type, culture media and culture conditions were defined for papaya somatic embryogenesis.

Como parte de um programa que visa a seleção de linhagens adaptadas a regiões tropicais, com a capacidade para regenerar plantas a partir de calos embriogênicos de curta duração, foram investigadas três linhagens obtidas a partir de uma variedade de milho tipo flint, e seus respectivos híbridos. As culturas foram obtidas a partir de embriões imaturos inoculados em meio N6 suplementado com 1,5 mg L-1 de 2,4-D e prolina 12 mM. A frequência de calos embriogênicos 45 dias após o início da cultura foi semelhante aos melhores genótipos descritos na literatura (83-99%), refletindo a alta qualidade dos genótipos testados para o estabelecimento de culturas de curta duração. O número médio de plantas férteis regeneradas em culturas com 2-3 meses de idade variou de 2 a 8,15 por calo, destacando-se os híbridos 13342/5 x 13342/2 e 132331/1 x 13342/5. Os resultados mostram que estes genótipos são promissores para utilização em programas envolvendo transformação de plantas e propagação de genótipos. As part of a breeding program to select tropical maize lines which are able to regenerate plants from embryogenic calli, three lines obtained from a flint maize variety, and their respective hybrids, have been investigated. Short-term tissue cultures were obtained from immature embryos inoculated on N6 medium suplemented with 1.5 mg L-1 2,4-D and 12 mM L-proline. The frequency of 45 day-old embryogenic calli was similar to those of the best genotypes described in the literature (83-99%), reflecting the high quality of the genotypes evaluated to estabilish short-term tissue cultures. The average number of fertile regenerated plants in 2-3 month-old cultures ranged from 2 to 8.15 per callus, and the hybrids 13342/5 x 13342/2 and 132331/1 x 13342/5 showed the bestg performance. The results show that these genotypes may be used in programs involving plant transformation and genotype propagation.

Submitted by Margarida Galamba (galamba@isa.utl.pt) on 2018-10-11T09:58:58Z No. of bitstreams: 1 REP-ANAIS-104-20083202064.pdf: 383261 bytes, checksum: 207db9fd8d3956317e63bb19b10dd856 (MD5) Made available in DSpace on 2018-10-11T09:58:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 REP-ANAIS-104-20083202064.pdf: 383261 bytes, checksum: 207db9fd8d3956317e63bb19b10dd856 (MD5) Previous issue date: 1999 info:eu-repo/semantics/publishedVersion

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Esta pesquisa foi conduzida com o objetivo de verificar a exeqüibilidade da fusão protoplástica interespecífica como ferramenta no melhoramento parassexual em Coffea. Para tanto, pretendeu-se a introgressão das resistências aos nematóides Meloidogyne incognita e M. exigua, do cultivar canéfora Apoatã, nos genótipos arábicas diplóide DH 3 e tetraplóides Catimor e Catuaí Amarelo. Com vistas à obtenção dos protoplastos, foi dado início a suspensões celulares embriogênicas a partir de calos friáveis embriogênicos induzidos de explantes foliares. Posteriormente foram estudadas, nas suspensões celulares Apoatã e DH 3 , as cinéticas do crescimento e do rendimento protoplástico em função do tempo pós-subcultura, bem como as condições de digestão enzimática da parede celular de seus agregados celulares. Foram realizados, ainda, estudos para a seleção dos heterofusionados. Embora todos os genótipos testados tenham reagido favoravelmente à formação de tecido embriogênico friável, apenas os arábicas DH 3 e Catuaí Vermelho requereram a ação conjunta de auxina e citocinina. Os demais Apoatã, Catimor e Catuaí Amarelo reagiram mais favoravelmente quando o regulador de crescimento foi apenas a citocinina BAP. As maiores freqüências de explantes com calos friáveis verificadas para os genótipos canéfora Apoatã e arábicas DH 3 , Catimor, Catuaí Amarelo e Catuaí Vermelho foram, respectivamente, 80, 60, 40, 40 e 20%. A diferenciação embriogênica dos agregados celulares, em cultura líquida, rendeu cerca de 241.000, 72.870 e 121.760 embriões g -1 MF de agregados celulares Apoatã, Catimor e DH 3 , respectivamente. As suspensões celulares Apoatã e DH 3 revelaram, imediatamente após a subcultura, uma fase exponencial de crescimento celular até um ponto de inflexão, a partir do qual as taxas de crescimento reduziram progressivamente para atingir um peso de matéria fresca dos agregados celulares assintótico. Coincidentemente, os menores rendimentos protoplásticos foram observados para tempos pós-subcultura superiores àquele do ponto de inflexão. A pré-plasmólise, a seleção dos agregados celulares de diâmetro inferior a 1 mm e a adição de cisteína 0,83 mM, durante a digestão enzimática, não interferiram no rendimento protoplástico das suspensões celulares Apoatã e DH 3 , ao contrário das concentrações das enzimas pectinases e celulase. De maneira geral, o rendimento protoplástico Apoatã, sempre inferior àquele DH 3 , foi maior quando as duas pectinases, pectoliase e macerozima, estiveram associadas à celulase, as três nas maiores concentrações testadas. Os 12 meios de cultivo de protoplastos testados não permitiram distinguir os protoplastos parentais Apoatã e DH 3 em nível de crescimento dos microcalos. Alternativamente, os inibidores metabólicos iodoacetamida e rodamina, nas respectivas concentrações de 2 e de 0,9 mM, mostraram-se eficazes em inibir a regeneração dos protoplastos parentais em microcalos. Seu aproveitamento permitiu a realização de 23 ensaios de eletrofusão interespecífica, cujos produtos, aparentemente justificados pela complementação metabólica, encontram-se em desenvolvimento com vistas à diferenciação embriogênica e regeneração de plantas. Esta última permitirá análises para verificação do potencial da fusão protoplástica no melhoramento parassexual em Coffea. The aim of the present work was to evaluate the feasibility of interspecific protoplast fusion as a tool in the parassexual improvement in Coffea. Introgression of nematode resistance from Coffea canephora cv. Apoatã was attempted in diploid (DH 3 ) and tetraploid (Catimor and Catuaí Amarelo) C. arabica genotypes by protoplast fusion. Protoplasts were isolated from embryogenic cell suspensions initiated from leaf explants-derived friable embryogenic calli. For Apoatã and DH 3 cell suspensions the kinetics of growth and protoplast yield was evaluated as affected by the intervals of subcultures and the conditions of enzymatic digestion of the cell walls of their small cell aggregates. Investigations aiming at selection of protoplast heterofused-derived cell aggregates were also accomplished. All genotypes studied reacted favorably to the formation of friable embryogenic calli. C. arabica genotypes, DH 3 and Catuaí Vermelho, however, required the use of both auxin and cytokinin. Conversely, Apoatã, Catimor and Catuaí Amarelo presented similar morphogenetic responses when induction media were supplemented with BAP only. Frequencies of friable embryogenic calli of 80, 60, 40, 40 and 20% were obtained for Apoatã, DH 3 , Catimor, Catuaí Amarelo and Catuaí Vermelho, respectively. Embryogenic differentiation from cell aggregates, in liquid culture, produced about 241.000, 72.870 and 121.760 embryos g -1 FW for Apoatã, Catimor and DH 3 , respectively. Immediately to the subculture, Apoatã and DH 3 cell suspensions revealed a typical sigmoidal growth curve. Coincidentally, the lowest protoplast yields were observed for post-subculture intervals above the inflection point. The pre-plasmolysis, the size of the aggregates (smaller than 1 mm diameter) and the addition of cysteine 0.83 mM, during the enzymatic digestion, did not affect protoplast yield of Apoatã and DH 3 cell suspensions, unlike the concentrations of the pectinases and cellulase enzymes. In general, protoplast yields of Apoatã were always inferior to that DH 3 . High yields were achieved when the two pectinases (pectolyase and macerozyme) were combined to cellulase, at the highest tested concentrations. The twelve protoplast culture media tested did not allow any distinction between parental protoplasts Apoatã and DH 3 , at microcalli growth stages. Alternatively, the metabolic inhibitors iodoacetamide and rhodamine, at the concentrations 2 and 0.9 mM, respectively, were effective in inhibiting microcalli formation from cultured parental protoplasts. Its use allowed the accomplishment of 23 independent interspecific electrofusion assessments whose products led to the development of embryogenic differentiation. Further work will be carried out in order to characterize the putative heterofused regenerants and to examine the potential of somatic hybridization as a tool for parassexual improvement in Coffea.

Tecidos de rizoma e pseudocaule de bananeira (Musa spp.), de plântulas micropropagadas, dos cultivares Maçã, Nanicão e GN-60 foram utilizados para indução de estruturas embriogênicas. Explantes obtidos desses tecidos foram cultivados em meio de cultura, segundo Schenk & Hildebrandt, com vitaminas de Staba em concentrações modificadas por Novak et al., acrescido do regulador de crescimento Dicamba, nas concentrações de 0; 2,0; 3,5 e 6,63 mg/L. A formação de tecidos com capacidade embriogênica (calos e estruturas globulares) foi observada em tecidos localizados próximo ao ápice meristemático, para os três cultivares testados. A partir dessas estruturas, foram obtidas suspensões celulares que deram origem a estruturas semelhantes a embriões somáticos, que, após germinação, emitiram raiz ou parte aérea, não apresentando, no entanto, germinação satisfatória. Structure formations with embryogenic capacity were induced on rhizome and pseudostem tissues of micropropagated plants of the banana (Musa spp.) cultivars Maçã, Nanicão e GN-60. Explants obtained from these tissues were cultivated in a media as cited by Schenk & Hildebrandt, with Staba vitamines in modified concentration by Novak et al., supplemented with Dicamba, a growth regulator, used at concentrations of 0, 2.0, 3.5, 6.63 mg/L. The treatments induced the formation of structures with embryogenic capacity in tissues (callus and globular structures) originated fromregions immediately above and below the meristematic apex, on the three tested cultivars. Starting from these structures, cellular suspensions were obtained. These structures were cultivated and gave origin to structures similar to somatic embryos which after germination produced roots or aerial paris. Germination, however, was not satisfactorily present.

Submitted by Guilherme Lemeszenski (guilherme@nead.unesp.br) on 2013-08-22T19:00:46Z No. of bitstreams: 1 S0103-90161995000300020.pdf: 256743 bytes, checksum: ff4a5fced803ca218e0958ae9bea7ca3 (MD5) Made available in DSpace on 2013-08-22T19:00:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 S0103-90161995000300020.pdf: 256743 bytes, checksum: ff4a5fced803ca218e0958ae9bea7ca3 (MD5) Previous issue date: 1995-12-01 Made available in DSpace on 2013-09-30T19:59:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0103-90161995000300020.pdf: 256743 bytes, checksum: ff4a5fced803ca218e0958ae9bea7ca3 (MD5) S0103-90161995000300020.pdf.txt: 12197 bytes, checksum: e32414dff014b4633cdf87da343b3327 (MD5) Previous issue date: 1995-12-01 Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T15:15:22Z No. of bitstreams: 2 S0103-90161995000300020.pdf: 256743 bytes, checksum: ff4a5fced803ca218e0958ae9bea7ca3 (MD5) S0103-90161995000300020.pdf.txt: 12197 bytes, checksum: e32414dff014b4633cdf87da343b3327 (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-20T15:15:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0103-90161995000300020.pdf: 256743 bytes, checksum: ff4a5fced803ca218e0958ae9bea7ca3 (MD5) S0103-90161995000300020.pdf.txt: 12197 bytes, checksum: e32414dff014b4633cdf87da343b3327 (MD5) Previous issue date: 1995-12-01 As poliaminas, putrescina (put), espermidina (spd) e espermina (spm) são amplamente distribuídas na natureza, desempenhando importante papel em vários eventos celulares. Considerando que as poliaminas estão envolvidas no processo embriogênico, torna-se importante conhecer as bases para estas alterações no metabolismo. O objetivo do presente trabalho foi observar os teores de poliaminas durante as diferentes fases da embriogênese somátka da cenoura. As análises foram realizadas, através da modificação do método de Flores e Galston a cada 96 horas durante 50 dias da cultura de células em suspensão. As células foram obtidas a partir de calos e inoculadas em meio de Murashige & Skoog (MS), modificado e acrescido de 0,2 mg/l de 2,4-D e 0,1 mg/l de cinetina durante os primeiros 14 dias da cultura, sendo que no restante do período permaneceram em meio MS desprovido de fiorreguladores. Os teores de poliaminas oscilaram durante todo o processo embriogênico, sendo que a putrescina foi a que apresentou maior acúmulo. Estes resultados sugerem que os níveis de espermidina e espermina são reduzidos em relação a putrescina devido a intensa utilização da spd e spm no processo de divisão e diferenciação celular, enquanto que a put parece ter apenas a função de sintetizar as outras duas amidas. The polyamines, putrescine (Put), Spermidine (Spd) and Spermine (Spm) are widely present in nature, performing an important role in various cellular events. Considering that polyamines take part of the embryogenic process, it is important to know the bases for these alterations in the metabolism. The objective of the present study was to observe the contents of polyamines during the different phases of somatic embryogenesis of carrot. Analyses were carried out, according to a modification of the method developed by Flores & Galston every 96 hours during 50 days from the culture of cell suspensions. The cells were provided from callus and inoculated in Murashige & Skoog (MS) medium which had been modified and added with 0.2 mg/l of 2,4-D and 0.1 mg/l of Idnetin during the first 14 days, whereas for the other days, they were kept in MS medium deprived of phytoregulators. The contents of polyamines varied during all the embryogenic process, when putrescine showed the most accumulated. These results suggest that the levels of Spermidine and spermine are reduced in relation to putrescine due to the intense use of Spd and Spm in the process of cell division and differentiation, whereas Put seems to have only the function of synthetizing the other two amines. UNESP Depto. de Química UNESP Depto. de Química

As poliaminas, putrescina (put), espermidina (spd) e espermina (spm) são amplamente distribuídas na natureza, desempenhando importante papel em vários eventos celulares. Considerando que as poliaminas estão envolvidas no processo embriogênico, torna-se importante conhecer as bases para estas alterações no metabolismo. O objetivo do presente trabalho foi observar os teores de poliaminas durante as diferentes fases da embriogênese somátka da cenoura. As análises foram realizadas, através da modificação do método de Flores e Galston a cada 96 horas durante 50 dias da cultura de células em suspensão. As células foram obtidas a partir de calos e inoculadas em meio de Murashige & Skoog (MS), modificado e acrescido de 0,2 mg/l de 2,4-D e 0,1 mg/l de cinetina durante os primeiros 14 dias da cultura, sendo que no restante do período permaneceram em meio MS desprovido de fiorreguladores. Os teores de poliaminas oscilaram durante todo o processo embriogênico, sendo que a putrescina foi a que apresentou maior acúmulo. Estes resultados sugerem que os níveis de espermidina e espermina são reduzidos em relação a putrescina devido a intensa utilização da spd e spm no processo de divisão e diferenciação celular, enquanto que a put parece ter apenas a função de sintetizar as outras duas amidas. The polyamines, putrescine (Put), Spermidine (Spd) and Spermine (Spm) are widely present in nature, performing an important role in various cellular events. Considering that polyamines take part of the embryogenic process, it is important to know the bases for these alterations in the metabolism. The objective of the present study was to observe the contents of polyamines during the different phases of somatic embryogenesis of carrot. Analyses were carried out, according to a modification of the method developed by Flores & Galston every 96 hours during 50 days from the culture of cell suspensions. The cells were provided from callus and inoculated in Murashige & Skoog (MS) medium which had been modified and added with 0.2 mg/l of 2,4-D and 0.1 mg/l of Idnetin during the first 14 days, whereas for the other days, they were kept in MS medium deprived of phytoregulators. The contents of polyamines varied during all the embryogenic process, when putrescine showed the most accumulated. These results suggest that the levels of Spermidine and spermine are reduced in relation to putrescine due to the intense use of Spd and Spm in the process of cell division and differentiation, whereas Put seems to have only the function of synthetizing the other two amines.

Objetivando a definição da metodologia básica para a obtenção em meio de cultura sólido de embriogênese somática, em explantes de hipocótilo e folha cotiledonar de cenoura (Daucus carota L.) cultivares Kuroda, Nantes e Brasília foi realizado um experimento em condições de laboratório, utilizando-se as concentrações de 0,5; 1,0; 2,5 e 5,0 mg/litro do ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D) e 1,0 mg/litro do ácido beta-naftoxiacético (NOA). Pelos resultados obtidos, os explantes de hipocótilo foram em geral mais adequados para o desenvolvimento do processo de embriogênese somática nos três cultivares estudados. A melhor concentração de 2,4-D na indução da embriogênese foi de 0,5 mg/litro. O tratamento com o NOA apresentou maior freqüência de embriogênese comparativamente àqueles com o 2,4-D. Houve uma resposta diferencial dos cultivares e explantes utilizados em relação aos diferentes meios de cultura. An investigation was conducted under laboratory conditions, to define the basic methodology in solid culture, to achieve somatic embryogenesis in tissue of hypocotyl and cotyledon of carrot (Daucus carota L.) cultivars Kuroda, Nantes and Brasília. Different concentrations of 2,4-D (0.5; 1.0; 2.5 and 5.0 mg/l) were studied in comparison to 1.0 mg/l of NOA. The results showed that the hypocotyl explants of the three cultivars were more adequate to develop somatic embryogenesis than the cotyledonary tissues. The best concentration of 2,4-D for inducting embryogenesis was 0.5 mg/l, independently of the kind of explant and cultivar. However it was less efficient than NOA at 1.0 mg/l. It was also observed that the carrot cultivars and the explants studied, reacted differently to the tissue culture medium utilized.

Objetivando a definição da metodologia básica para a obtenção em meio de cultura sólido de embriogênese somática, em explantes de hipocótilo e folha cotiledonar de cenoura (Daucus carota L.) cultivares Kuroda, Nantes e Brasília foi realizado um experimento em condições de laboratório, utilizando-se as concentrações de 0,5; 1,0; 2,5 e 5,0 mg/litro do ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D) e 1,0 mg/litro do ácido beta-naftoxiacético (NOA). Pelos resultados obtidos, os explantes de hipocótilo foram em geral mais adequados para o desenvolvimento do processo de embriogênese somática nos três cultivares estudados. A melhor concentração de 2,4-D na indução da embriogênese foi de 0,5 mg/litro. O tratamento com o NOA apresentou maior freqüência de embriogênese comparativamente àqueles com o 2,4-D. Houve uma resposta diferencial dos cultivares e explantes utilizados em relação aos diferentes meios de cultura.An investigation was conducted under laboratory conditions, to define the basic methodology in solid culture, to achieve somatic embryogenesis in tissue of hypocotyl and cotyledon of carrot (Daucus carota L.) cultivars Kuroda, Nantes and Brasília. Different concentrations of 2,4-D (0.5; 1.0; 2.5 and 5.0 mg/l) were studied in comparison to 1.0 mg/l of NOA. The results showed that the hypocotyl explants of the three cultivars were more adequate to develop somatic embryogenesis than the cotyledonary tissues. The best concentration of 2,4-D for inducting embryogenesis was 0.5 mg/l, independently of the kind of explant and cultivar. However it was less efficient than NOA at 1.0 mg/l. It was also observed that the carrot cultivars and the explants studied, reacted differently to the tissue culture medium utilized.

In this study, the somatic embryogenesis and regeneration of Cigana Preta plants from shoot apices and immature leaves taken from plants cultivated in vitro were examined. To embryo induction the explants were cultivated in Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) or 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (Picloram) at concentrations of 8.0 and 12 mg L-1. To development of embryos two media cultures with different concentration of BAP (D1 or D2) were evaluated. Embryos in the cotyledonary stage were incubated in germination medium containing MS salts and vitamins, 2.0 µM copper sulfate, 2.4 g L-1 of Phytagel® and 1.77 µM BAP. The highest frequency of calluses and the greatest number of embryos per explant were obtained using the auxin picloram at a concentration of 8.0 mg L-1. The plants regenerated in the picloram treatment exhibited normal development and were transferred to a multiplication medium after a minimum of four weeks. The histological sections of the malformed embryos from foliar explants cultured in the presence of 2,4-D demonstrated that the origin of the cotyledonary structures was independent of the formation of the shoot apical meristem, which was not formed in the embryos, and the majority of the embryos were classified as cornet-shaped. This study demonstrates that in cassava, the use of different auxins provides different conditions for the formation of somatic embryos, and the low rate of conversion into plants results from abnormalities in the embryos. Este trabalho teve como objetivo estudar a embriogênese somática e a regeneração de plantas da variedade Cigana Preta a partir de ápices caulinares e folhas imaturas obtidos de plantas cultivadas in vitro. Para a indução de embriões, os explantes foram cultivados em meio Murashige e Skoog (MS) suplementados com ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D) ou 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (Picloram), ambos nas concentrações 8,0 e 12 mg L-1. O desenvolvimento dos embriões obtidos foi testado por dois meios de cultura com diferentes concentrações de benzilaminopurina (BAP) (D1 ou D2). Embriões em estágio cotiledonar foram incubados em meio de germinação, constituído de sais e vitaminas do MS, 2,0 µM de sulfato de cobre, 2,4 g L-1 de Phytagel®, e 1,77 µM BAP. A maior frequência de calos e números de embriões por explantes foi obtida com 8,0 mg L-1 da auxina Picloram. As plantas regeneradas, oriundas do tratamento com Picloram apresentaram desenvolvimento normal e num período mínimo de quatro semanas foram transferidas para meio de multiplicação. Cortes histológicos de embriões malformados, provenientes dos explantes foliares cultivados em 2,4-D revelaram que as estruturas cotiledonares têm origens independentes da formação do meristema apical caulinar e não houve formação do meristema apical caulinar nos embriões, sendo a maioria classificado como corneta. Este trabalho demonstrou que em mandioca o uso de diferentes auxinas proporciona diferentes condições para a formação de embriões somáticos e que a baixa conversão em plantas foi decorrente de anormalidades desses embriões.

Tese (doutorado) - Universidade de São Paulo. Instituto de Biociencias Não possui conteúdo digital