Environmental monitoring indicators guide the decision-making process of public policies. Bioassays using seeds are a potential tool to evaluate water quality indicators, since their results can be expressed in a phytotoxicity scale, the tests are quite simple, relatively fast, and low cost. In this context, the objectives of this study were to evaluate the phytotoxicity of Rio Grande reservoir waters and its relationship with environmental variables. In Brazil, this reservoir is an important water source for the public supply of the Metropolitan Region of São Paulo. In 2018, subsurface and bottom water were collected in four sampling campaigns. The environmental variables were measured both in field and at the laboratory. In field, it was used a multiprobe of ammonium (N-NH4+), electrical conductivity (EC), nitrate (N-NO3-), pH, dissolved oxygen (DO) and water temperature (T); and, at the laboratory, of total nitrogen (TN) and total phosphorus (TP). Bioassays using seeds of cucumber (Cucumis sativus), garden cress (Lepidium sativum), and mustard (Sinapis alba) were performed (n = 6). The bioassays consisted of incubating the seeds and the water samples on Petri dishes at (20º ± 2 ºC) in the absence of light for 3 days, in case of S. alba, and for 4 days, in case of C. sativus and L. sativum. ISO water was used as a control. Afterward, the number of germinated seeds and the roots' length were determined to calculate the Germination Index (GI). Statistical analyses were performed, such as the Shapiro-Wilk test, the analysis of variance (ANOVA) and the Tukey test, to verify the differences between the seeds' responses to the environmental variables. The Principal Component Analysis (PCA) was applied to the environmental variables and the GI to identify the most representative variables. This study indicated that, in May of 2018, the subsurface water was moderately phytotoxic to L. sativum (GI = 61.3 ± 8.2%); and the bottom water was very phytotoxic to L. sativum (GI = 23.6 ± 14.5%) and S. alba (26.2 ± 12.0%). In all other sampling campaigns, the water samples potentiated seed germination, which can be related to nutrients concentrations The L. sativum proved to be more sensitive, due to the lower degrees of data dispersion and the higher degrees of toxicity when compared to the other analysed seeds. Os indicadores de monitoramento ambiental norteiam o processo de tomada de decisão de políticas públicas. Bioensaios com sementes são ferramentas potenciais como indicadores de qualidade da água, pois seus resultados podem ser expressos em uma escala de fitotoxicidade, os testes são bastante simples, relativamente rápidos e de baixo custo. Nesse contexto, os objetivos deste estudo foram: avaliar a fitotoxicidade das águas do reservatório do Rio Grande e sua relação com as variáveis ambientais. Este reservatório é uma importante fonte de água para a Região Metropolitana de São Paulo no Brasil. Água subsuperficial e de fundo foram coletadas em quatro campanhas de amostragem em 2018. As variáveis ambientais foram medidas em campo usando uma multi-sonda: amônio (N-NH4+), condutividade elétrica (CE), nitrato (N-NO3-), pH, oxigênio dissolvido (OD) e temperatura da água (T); e no laboratório: nitrogênio total (NT) e fósforo total (PT). Foram realizados bioensaios com sementes de pepino (Cucumis sativus), agrião (Lepidium sativum) e mostarda (Sinapis alba) (n = 6). Os bioensaios consistiram em incubar as sementes e amostras de água em placas de Petri a (20º ± 2 ºC) na ausência de luz por 3 dias (S. alba) e 4 dias (C. sativus e L. sativum). Água ISO foi usada como controle positivo. Na sequência foram determinados o número de sementes germinadas e o comprimento das raízes para cálculo do Índice de Germinação (IG). Foram realizadas análises estatísticas, como o teste de Shapiro-Wilk, análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey para verificar as diferenças entre as respostas das sementes às variáveis ambientais. A Análise de Componentes Principais (ACP) foi aplicada às variáveis ambientais e IG para identificar as variáveis mais representativas. O estudo indicou que em maio de 2018 a água subterrânea era moderadamente fitotóxica para L. sativum (IG = 61,3 ± 8,2%); e a água do fundo foi muito fitotóxica para L. sativum (IG = 23,6 ± 14,5%) e S. alba (26,2 ± 12,0%). Em todas as demais campanhas de amostragem, as amostras de água potencializaram a germinação das sementes, o que pode estar relacionado à concentração de nutrientes. A espécie L. sativum mostrou-se mais sensível, devido ao menor grau de dispersão dos dados e ao maior grau de toxicidade em relação às demais sementes analisadas.