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Le virus de l'hépatite delta humaine (VHD) est un pathogène infectieux qui est associé à une hépatite fulminante chez l'humain. Ce virus possède un génome circulaire d'ARN simple brin comportant deux régions auto-catalytiques (ribozymes). Ce présent travail à [i.e. a] pour but de mieux comprendre la spécificité de substrat pour la coupure du ribozyme delta . À partir de la séquence du type sauvage, une collection de substrats mutants, aux positions -1 à -4 du site de coupure, a été synthétisée. La caractérisation de ces substrats a été effectuée par cinétique enzymatique et diverses constantes thermodynamiques ont été calculées. Quelques substrats n'ont pas pu être coupés tandis que d'autres l'ont été mais avec une différence de spécificité de plus de 60 fois."--Résumé abrégé par UMI

Le développement de ribozymes actifs in vivo comporte plusieurs étapes limitantes comme la sélection des sites, la livraison de ribozymes efficaces ainsi que la stabilité des ribozymes au niveau cellulaire. Pour la sélection des sites, nous avons procédé avec la méthode conventionnelle d'analyse des structures secondaires par ordinateur de l'ARN messager de la désoxygénase de Solanum chacoense suivi d'essais d'accessibilité par digestion avec la ribonucléase H. De plus, nous avons établi deux autres critères de sélection qui sont la présence de la séquence consensus de reconnaissance du ribozyme hammerhead au niveau des sites cibles (i.e. 5'N[indice inférieur 5] GUC /N[indice inférieur 6]'3) ainsi que la présence de ces derniers au niveau des 200 premiers nucléotides de l'ARNm de la désoxygénase de Solanum chacoense afin d'éviter la production de protéines tronquées présentant une activité. Une fois les sites sélectionnés, nous avons développé une cassette cis-trans-cis permettant la libération efficace de ribozymes trans exempts de séquences supplémentaires en 5 ' et en 3 ' pouvant interférer avec l'activité du ribozyme."--Résumé abrégé par UMI

Les viroïdes sont de petits ARN circulaires simple brin qui infectent les plantes supérieures, causant ainsi d'importantes pertes économiques dans le domaine agroalimentaire. Ces ARN ne sont pas encapsidés et se répliquent par un mécanisme en cercle roulant. Puisqu'ils ne semblent coder pour aucune protéine, les viroïdes sont dépendants de la machinerie enzymatique de l'hôte pour les différentes étapes de leur cycle de vie. La trentaine d'espèces différentes de viroïdes connues à ce jour sont classées en 2 grandes familles, celle des Pospiviroidae et celle des Avsunviroidae. Ces derniers sont caractérisés par la présence de séquences permettant l'adoption de la structure autocatalytique en tête de marteau (hammerhead) qui est responsable de la coupure des brins multimériques en monomères dans le cycle de réplication de ces viroïdes. Le but de mon projet de recherches était de mieux comprendre les différents mécanismes régissant les différentes étapes du cycle de vie des membres de la famille des Avsunviroidae, plus précisément du viroïde responsable de la mosaïque latente du pêcher (PLMVd). Dans un premier temps, nous avons démontré que PLMVd peut être recircularisé in vitro par un mécanisme d'autoligation. Il s'agit d'une démonstration originale d'une telle réaction en biologie et plusieurs aspects de cette réaction non-enzymatique ont été mis à jour. Dans un second temps, des expériences d'initiation de la réplication utilisant l'ARN polymérase de E. coli, qui est fortement similaire à la polymérase de type bactérienne du chloroplaste, ont démontré que celle-ci pouvait répliquer des transcrits de PLMVd in vitro . Dans un autre ordre d'idée, la possibilité que la pathogenèse de PLMVd puisse être le résultat d'une coupure en trans d'un ARN de l'hôte par la structure hammerhead de celui-ci a été étudiée. Finalement, des études structurales ont permis de déterminer la structure secondaire de PLMVd en solution. Celle-ci révèle la présence de plusieurs éléments conservé

Le virus de l'hépatite D (VHD), autrefois appelé agent delta, infecte plus de 15 millions d'individus à travers le monde. Cet agent infectieux requiert la présence du virus de l'hépatite B (VHB) pour former son enveloppe. L'infection par le VHD cause des hépatites fulminantes et chroniques avec cirrhose du foie. Le VHD est un petit virus de forme circulaire dont le diamètre est de 36 nm. Le génome viral est constitué d'un ARN circulaire de 1,7 kilobases qui présente beaucoup de complémentarité interne le conduisant à se replier en une structure semblable à une tige. Il existe beaucoup de variations de séquence du génome du VHD et plusieurs génotypes différents ont été identifiés. Chez un patient infecté par un même génotype, la population virale est aussi hétérogène (quasi-espèce). Possiblement en raison de cette diversité génétique, le VHD réussit à déjouer la surveillance immunitaire de l'hôte, démontre des symptômes variés, échappe souvent au traitement et rend le développement d'un vaccin difficile. Le VHD possède plusieurs caractéristiques uniques qui en font un sujet d'étude très intéressant. L'objectif de ce projet de recherche est de développer des outils pour faciliter l'étude et la compréhension des propriétés biologiques de ce virus.

Les viroïdes sont de courts ARN simple brin circulaires (~300 nucléotides) qui infectent les plantes supérieures causant des pertes économiques importantes en agriculture. Ils se répliquent à l'intérieur des cellules infectées par un mécanisme en cercle roulant (Branch et Robertson, 1984). Leur génome ne code apparemment pour aucune protéine et ils sont ainsi dépendant [i.e. dépendants] de leur hôte pour assurer certaines étapes de leur cycle vital. On connaît aujourd'hui 29 espèces de viroïdes appartenant à deux groupes distincts. Les viroïdes du groupe B possèdent certains éléments de séquence et de structure qui sont conservés. Leur génome est subdivisé en 5 domaines caractéristiques auxquels on attribue certaines fonctions biologiques (Keese et Symons, 1985; Flores et al., 1997). Ces ARN se retrouvent au niveau du noyau des cellules infectées où ils seraient répliqués par l'ARN polymérase II. Les viroïdes du groupe A ne possèdent pas l'organisation génomique typique des viroïdes du groupe B et on ne dénote aucune conservation au niveau de leur séquence ou de leur structure. Ils sont caractérisés par la présence de motifs autocatalytiques (hammerhead) qui permettent la coupure des brins multimériques produits lors de la réplication en cercle roulant. Ces motifs autocatalytiques sont également présents chez certains ARN satellites de virus de plantes. Ces ARN diffèrent des viroïdes du groupe A puisqu'ils sont dépendant [i.e. dépendants] de la présence d'un virus associé pour leur réplication et leur propagation. Les nombreuses similarités entre ces ARN satellites et les viroïdes suggèrent une origine évolutive commune (Branch et al., 1990). La méconnaissance de la biologie des viroïdes du groupe A est en grande partie attribuable au peu d'ampleur des recherches entreprises sur ces agents pathogènes. En 1994, on ne connaissait que deux espèces appartenant à ce groupe, soit ASBVd et PLMVd. Nous avons donc initié des études visant à mieux comprendre certains aspects

Le virus de l'hépatite delta (VHD) est un virus satellite du virus de l'hépatite B (VHB). Chez les humains, la co-infection de VHD avec VHB, ou la super-infection des individus porteurs de VHB, augmente la sévérité de la maladie. Le VHD possède un génome ARN circulaire simple brin d'environ 1700 nucléotides dont la structure secondaire n?est probablement pas branchée puisque le génome possède une haute autocomplémentarité. La progéniture du virus est assurée par le mécanisme de la réplication en double cercle roulant. La réplication engendre des multimères linéaires génomiques et antigénomiques qui sont maturés par la suite en monomères par les séquences autocatalytiques respectives (génomiques et antigénomiques). Nous avons effectué plusieurs alignements: les séquences complètes, les séquences autocatalytiques des deux polarités ainsi que les séquences contenant les promoteurs potentiels. Cette opération a été effectuée principalement dans le but d'obtenir de l'information supplémentaire (ex: covariation) sur l'organisation structurale des motifs autocatalytiques. Cependant, dû au très haut degré de conservation des nucléotides au niveau des séquences catalytiques, nous n'avons pas été en mesure de faire ressortir des données significatives nous permettant d'établir de nouvelles contraintes structurales. Nous avons développé un site Web permettant la consultation en ligne de notre compilation et de nos alignements. Cet outil de travail est aujourd'hui consulté sur une base quasi-quotidienne par une multitude de laboratoires répandus à travers la planète (sondage effectué à l'aide de www.superstats.com ). L'aspect thermodynamique est au coeur même de la compréhension du mécanisme moléculaire du ribozyme delta. Plusieurs méthodes doivent être utilisées en parallèle afin de déchiffrer le plus justement possible le mécanisme catalytique employé par le ribozyme delta. Finalement, la caractérisation des interactions métallo-nucléiques au sein du ribozyme delta a été effe

Le virus de l'hépatite delta humaine (VHD) est un petit virus d'ARN circulaire qui infecte plus de 15 millions d'individus à travers le monde. Ce virus code pour un seul ARN messager (ARNm) et celui-ci génère deux isoformes de l'antigène delta (HDAg), des protéines essentielles au VHD. Le ribozyme delta reconnaît son substrat d'ARN par appariement de paires de bases et la séquence reconnue est : une pyrimidine, suivie d'une guanosine et de six autres nucléotides (PyGN[indice inférieur 6]). Il est théoriquement possible de modifier le domaine de reconnaissance du substrat du ribozyme delta afin d'inactiver n'importe quel substrat d'ARN portant le PyGN[indice inférieur 6]. Le ribozyme delta et d'autres ribozymes possèdent donc un potentiel thérapeutique énorme pour l'inactivation d'ARN indésirables tels que les ARN viraux ou oncogènes. L'objectif de ce projet de recherche est de développer des ribozymes delta qui inactivent l'ARNm du VHD et d'approfondir les connaissances sur la spécificité de reconnaissance du substrat par le ribozyme delta."--Résumé abrégé par UMI.