Search

Studium živých organismů bylo vždy zájmem vědeckých oborů a v dnešní době tomu není jinak. S moderními přístupy se otevírají nové možnosti, což souvisí i se značným rozmachem tzv. "omics" metod, kam patří například genomika, proteomika, metabolomika nebo glykomika. Lipidomika je nejmladším podoborem metabolomiky a zaměřuje se na analýzu lipidů v živých organismech. Lipidy jsou rozsáhlou skupinou přírodních látek, které jsou obsaženy v rostlinách, houbách, bakteriích nebo v těle živočichů, kde plní životně důležité funkce. Hmotnostní spektrometrie je nejpoužívanější technikou v kvalitativní i kvantitativní analýze lipidů. V teoretické části této práce jsou popsány základní poznatky o lipidech, současné názvosloví a biologické funkce v živých organismech. Současně je vysvětlena lipidomická analýza od přípravy vzorků až po nástroje využívané ke zpracování naměřených dat. Zvláštní pozornost je věnována principům chromatografických technik a využití jejich spojení s hmotnostní spektrometrií v lipidomické analýze, kdy jsou kromě výhod a limitací shrnuty také zásady pro kvalitativní a kvantitativní analýzu. Literární rešerše poté ukazuje potenciál lipidů pro diagnostiku různých typů onemocnění a přínos derivatizačních postupů v lipidomické analýze. V experimentální části je diskutován vývoj nových metod pro analýzu lipidů v tělních tekutinách s využitím spojení chromatografických technik a hmotnostní spektrometrie. V této práci jsou použity dva přístupy využívané v lipidomické analýze, separace lipidů dle lipidových druhů pomocí kapalinové chromatografie s obrácenými fázemi a separace dle lipidových tříd pomocí hydrofilní interakční chromatografie a superkritické fluidní chromatografie. Separace lipidů dle lipidových druhů je aplikována pro kvalitativní popis lidské plazmy s využitím klasického i derivatizačního přístupu, naopak metody založené na separaci dle lipidových tříd jsou využity pro kvantitativní analýzu velkého množství vzorků a pomocí statistických nástrojů jso, The living organisms have always been studied by scientific disciplines, and it is also valid at the present time. New modern approaches open new possibilities, which relates to the considerable expansion of "omics" methods including genomics, proteomics, metabolomics, or glycomics. Lipidomics is the youngest subgroup of metabolomics focusing on the analysis of lipids in living organisms. Lipids are a large group of natural substances, which are contained in plants, fungi, bacteria, or in the body of animals, where they are responsible for essential life functions. Mass spectrometry is the most widely used technique in the qualitative and quantitative analysis of lipids. The theoretical part of this thesis describes the basic knowledge about lipids, systematic nomenclature, and biological functions in living organisms. At the same time, the lipidomic analysis is described from sample preparation to data processing. A special attention is paid to the principles of chromatographic techniques associated with mass spectrometry for lipidomic analysis, and advantages, disadvantages, and principles of qualitative and quantitative analysis are summarized. The review shows the potential of lipids for the diagnosis of various types of diseases and the benefits of derivatization procedures in lipidomic analysis. The experimental part deals with the development of new methods for the analysis of lipids in body fluids by chromatographic techniques coupled with mass spectrometry. Lipidomic analysis follows two chromatographic approaches in this thesis, lipid species separation is achieved by reversed-phase liquid chromatography and lipid class separation by hydrophilic interaction chromatography and supercritical fluid chromatography. Lipid species separation is used for the qualitative analysis of human plasma by nonderivatization and derivatization approaches. On the other hand, the lipid class separation is used for the quantitative analysis of a large number of samples, and s, Fakulta chemicko-technologická, Dokončená práce s úspěšnou obhajobou

Effects of blood collection tubes, the time period, the sample origin, and the method used on the lipidomic profile are investigated by ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography - mass spectrometry (UHPSFC/MS) and hydrophilic interaction liquid chromatography ultrahigh-performance liquid chromatography - mass spectrometry (HILIC-UHPLC/MS). Heparin plasma samples have been obtained from 99 healthy volunteers at three time points separated by six-month intervals together with one collection for EDTA plasma and serum. Furthermore, lipid concentrations in heparin plasma collected at two different sites are compared. 171 lipid species from eight lipid classes are quantified with UHPSFC/ MS, and 122 lipid species from four lipid classes with HILIC-UHPLC/MS. The accuracy of both methods is monitored by the quantitation error using two internal standards (IS) per individual lipid classes. No significant differences in lipid profiles are observed for different time points and types of collection tubes (heparin plasma, EDTA plasma, and serum). Most pronounced lipid concentration differences are observed for the comparison of NIST SRM 1950 human plasma and mean lipid concentrations of the investigated cohort. Furthermore, differences in lipid concentrations are observed between employed methods (UHPSFC/MS vs. HILIC-UHPLC/MS), which can be compensated by the normalization using NIST SRM 1950 human plasma used as the quality control sample., Účinky zkumavek pro odběr krve, doba, původ vzorku a metoda použitá na lipidomický profil jsou zkoumány pomocí vysokoúčinné superkritické kapalinové chromatografie - hmotnostní spektrometrie (UHPSFC / MS) a kapalinové chromatografie s hydrofilní interakcí - hmotnostní spektrometrie (HILIC-UHPLC / MS). Vzorky heparinové plazmy byly získány od 99 zdravých dobrovolníků ve třech časovýchúsecích oddělených v šestiměsíčních intervalech společně s jedním odběrem EDTA plazmy a séra. Dále jsou srovnávány koncentrace lipidů v heparinové plazmě shromážděné na dvou různých místech. 171 lipidových druhů z osmi lipidových tříd je kvantifikováno pomocí UHPSFC / MS a 122 lipidových druhů ze čtyř lipidových tříd pomocí HILIC-UHPLC / MS. Přesnost obou metod je sledována kvantifikační chybou pomocí dvou vnitřních standardů (IS) na jednotlivé třídy lipidů. Nebyly pozorovány žádné významné rozdíly v lipidových profilech pro různé časové body a typy odběrových zkumavek (heparinová plazma, EDTA plazma a sérum). Nejvýraznější rozdíly v koncentraci lipidů jsou pozorovány při srovnání lidské plazmy NIST SRM 1950 a průměrných koncentrací lipidů ve zkoumané kohortě. Dále jsou pozorovány rozdíly v koncentracích lipidů mezi použitými metodami (UHPSFC / MS vs. HILIC-UHPLC / MS), které lze kompenzovat normalizací pomocí lidské plazmy NIST SRM 1950 použité jako vzorek kontroly kvality.

Ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography - mass spectrometry (UHPSFC/MS), ultrahigh-performance liquid chromatography - mass spectrometry (UHPLC/MS), and matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) - MS techniques were used for the lipidomic characterization of exosomes isolated from human plasma. The high-throughput methods UHPSFC/MS and UHPLC/MS using a silica-based column containing sub-2 mu m particles enabled the lipid class separation and the quantitation based on exogenous class internal standards in < 7 minute run time. MALDI provided the complementary information on anionic lipid classes, such as sulfatides. The nontargeted analysis of 12 healthy volunteers was performed, and absolute molar concentration of 244 lipids in exosomes and 191 lipids in plasma belonging to 10 lipid classes were quantified. The statistical evaluation of data included principal component analysis, orthogonal partial least square discriminant analysis, S-plots, p-values, T-values, fold changes, false discovery rate, box plots, and correlation plots, which resulted in the information on lipid changes in exosomes in comparison to plasma. The major changes were detected in the composition of triacylglycerols, diacylglycerols, phosphatidylcholines, and lysophosphatidylcholines, whereby sphingomyelins, phosphatidylinositols, and sulfatides showed rather similar profiles in both biological matrices., Ultravysokoúčinná superkritická kapalinová chromatografie - hmotnostní spektrometrie (UHPSFC / MS), ultravysokoúčinná kapalinová chromatografie - hmotnostní spektrometrie (UHPLC / MS) a laserová desorpce / ionizace (MALDI) - MS byly použity pro lipidomickou charakterizaci exosomů izolovaných z lidské plazmy. Vysokoúčinné metody UHPSFC / MS a UHPLC / MS využívající kolonu na bázi oxidu křemičitého obsahující částice sub-2 um umožnily separaci lipidové třídy a kvantifikaci na základě interních standardů exogenní třídy v době běhu <7 minut. MALDI poskytl doplňující informace o třídách aniontových lipidů, jako jsou sulfatidy. Byla provedena necílená analýza 12 zdravých dobrovolníků a byla kvantifikována absolutní molární koncentrace 244 lipidů v exosomech a 191 lipidů v plazmě patřících do 10 lipidových tříd. Statistické vyhodnocení dat zahrnovalo analýzu hlavních složek, ortogonální částečnou diskriminační analýzu nejmenších čtverců, S-grafy, p-hodnoty, T-hodnoty, násobné změny, míru falešných objevů, krabicové grafy a korelační grafy, které vyústily v informace o lipidech změny v exosomech ve srovnání s plazmou. Hlavní změny byly detekovány ve složení triacylglycerolů, diacylglycerolů, fosfatidylcholinů a lysofosfatidylcholinů, přičemž sfingomyeliny, fosfatidylinositoly a sulfatidy vykazovaly v obou biologických matricích poměrně podobné profily

Ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography-mass spectrometry (UHPSFC/MS) has a great potential for the high-throughput lipidomic quantitation of biological samples; therefore, the full optimization and method validation of UHPSFC/MS is compared here with ultrahigh-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC/MS) in hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) mode as the second powerful technique for the lipid class separation. First, the performance of six common extraction protocols is investigated, where the Folch procedure yields the best results with regard to recovery rate, matrix effect, and precision. Then, the full optimization and analytical validation for eight lipid classes using UHPSFC/MS and HILIC-UHPLC/MS methods are performed for the same sample set and applied for the lipidomic characterization of pooled samples of human plasma, human serum, and NIST SRM 1950 human plasma. The choice of appropriate internal standards (IS) for individual lipid classes has a key importance for reliable quantitative workflows illustrated by the selectivity while validation and the calculation of the quantitation error using multiple internal standards per lipid class. Validation results confirm the applicability of both methods, but UHPSFC/MS provides some distinct advantages, such as the successful separation of both non-polar and polar lipid classes unlike to HILIC-UHPLC/MS, shorter total run times (8 vs. 10.5 min), and slightly higher robustness. Various types of correlations between methods (UHPSFC/MS and HILIC-UHPLC/MS), biological material (plasma and serum), IS (laboratory and commercially mixtures), and literature data on the standard reference material show the intra- and inter-laboratory comparison in the quantitation of lipid species from eight lipid classes, the concentration differences in serum and plasma as well as the applicability of non-commercially available internal standard mixtures for lipid quantitation., Vysokoúčinná superkritická fluidní chromatografie-hmotnostní spektrometrie (UHPSFC / MS) má velký potenciál pro vysokoúčinnou lipidomickou kvantifikaci biologických vzorků; proto je zde úplná optimalizace a validace metody UHPSFC / MS srovnávána s ultravysokoúčinnou kapalinovou chromatografií-hmotnostní spektrometrií (UHPLC / MS) v režimu hydrofilní interakční kapalinové chromatografie (HILIC) jako druhé výkonné techniky pro separaci lipidových tříd. Nejprve se zkoumá účinnost šesti běžných extrakčních protokolů, kde Folchova metoda přináší nejlepší výsledky s ohledem na míru obnovy, maticový efekt a přesnost. Poté se provede úplná optimalizace a analytická validace pro osm lipidových tříd pomocí metod UHPSFC / MS a HILIC-UHPLC / MS pro stejnou sadu vzorků a použije se pro lipidomickou charakterizaci shromážděných vzorků lidské plazmy, lidského séra a NIST SRM 1950 lidská plazma. Volba vhodných interních standardů (IS) pro jednotlivé lipidové třídy má klíčový význam pro spolehlivé kvantitativní pracovní toky ilustrované selektivitou při validaci a výpočtem kvantifikační chyby s použitím více interních standardů na lipidovou třídu. Výsledky validace potvrzují použitelnost obou metod, ale UHPSFC / MS poskytuje některé výrazné výhody, jako je úspěšná separace nepolárních a polárních lipidových tříd na rozdíl od HILIC-UHPLC / MS, kratší celkové doby běhu (8 vs. 10,5 min ) a mírně vyšší robustnost. Různé typy korelací mezi metodami (UHPSFC / MS a HILIC-UHPLC / MS), biologickým materiálem (plazma a sérum), IS (laboratorní a komerčně dostupné směsi) a literárními údaji o standardním referenčním materiálu ukazují intra- a mezilaboratorní srovnání v kvantifikaci lipidových druhů z osmi lipidových tříd, rozdíly v koncentraci v séru a plazmě, jakož i použitelnost nekomerčně dostupných směsí vnitřních standardů pro kvantifikaci lipidů.

Lipidomics is a subgroup of metabolomics, which is the last step of the omics cascade closest to the organism function, and therefore the analysis of metabolites (including lipids) can provide an important information about ongoing processes in the human body, such as diseases or disorders reflected in dysregulations of lipid concentrations. The main goal of this Ph.D. thesis is the development of high-throughput methods for the quantitation of lipids in biological samples using the following mass spectrometry (MS) based strategies: lipid species separation and lipid class separation, which have own requirements for the lipid quantitation mainly based on the selection and the number of internal standards (IS). The lipid species separation is applied for the analysis of oxylipins using a reversed-phase ultrahigh-performance liquid chromatography (RP-UHPLC) coupled to tandem mass spectrometry with prior solid phase extraction from biological samples. The lipid class separation is used for the comprehensive quantitation of multiple lipid classes including monoacylglycerols, diacylglycerols, triacylglycerols, cholesteryl-esters, ceramides, sphingomyelins, phosphatidylcholines, and lysophosphatidylcholines. The lipid class separation approach is achieved by hydrophilic interaction ultrahigh-performance liquid chromatography (HILIC-UHPLC) or ultrahighperformance supercritical fluid chromatography (UHPSFC) coupled to mass spectrometry. Advantages and limitations of both approaches for the lipidomic quantitation are discussed including the method validation, the use of quality control samples, and the data normalization using NIST SRM 1950 Reference Material human plasma. Finally, all developed analytical methods have been applied for sets of clinical samples of cancer patients and healthy controls followed by multivariate data analysis to distinguish both groups., Lipidomika je podskupinou metabolomiky, která je jako poslední krok omické kaskády nejblíže k funkci organismu, proto analýza metabolitů (zahrnující lipidy) může poskytnout důležité informace o probíhajících procesech v lidském těle spojené se změnami koncentrací lipidů. Cílem této práce je vývoj vysokokapacitních metod pro kvantifikaci lipidů v biologických vzorcích pomocí metod chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií: separace jednotlivých lipidů a separace tříd lipidů, které s sebou přináší vlastní nároky na kvantitu převážně založené na výběru a počtu interních standardů. Separace jednotlivých lipidů je aplikována na analýzu oxylipinů pomocí ultravysokoučinné kapalinové chromatografie v systémech s obrácenými fázemi spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií, kdy k přípravě biologických vzorků je nutná extrakce na pevné fázi. Separace tříd lipidů je použita pro stanovení kvantity několika lipidových tříd zahrnující monoacylglyceroly, diacylglyceroly, triacylglyceroly, cholesteryl-estery, ceramidy, sfingomyeliny, fosfatidylcholiny a lysofosfatidylcholiny. Separace tříd lipidů je možné dosáhnout pomocí hydrofilních interakcí ultravysokoučinné kapalinové chromatografie nebo ultravysokoučinné superkritické fluidní chromatografie spojených s hmotnostní spektrometrií. Výhody a limitace obou přístupů pro lipidomickou kvantifikaci jsou popsány spolu s validací metody, sledováním kontroly kvality měření a normalizací dat pomocí referenčního materiálu lidské plazmy NIST SRM 1950. Všechny vyvinuté metody byly nakonec použity pro měření série klinických vzorků pacientů s rakovinou a zdravých dobrovolníků s následnou vícerozměrnou statistikou analýzou dat pro rozlišení obou skupin., Fakulta chemicko-technologická, Dokončená práce s úspěšnou obhajobou

The identification and quantitation of all lipids in complex biological tissues is the first step towards the understanding how lipids function in a biological system and the elucidation of the mechanism of lipid-related diseases including obesity, atherosclerosis, cancer, cardiovascular diseases, etc. Our optimized nontargeted method using hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) coupled to electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) was used for the characterization of the lipidome, mainly glycerophospholipids and sphingolipids in porcine brain, heart, kidney, liver, lung, spinal cord, spleen and stomach. Individual lipid classes are quantified based on the peak integration of individual lipid classes separated in the HILIC mode multiplied by their response factors and correlated by sphingosylethanolamine (d17:1/12:0) as a single internal standard. Subsequently, relative abundances of deprotonated molecules [M-H]– in negativeion ESI mass spectra are used for determination of lipid species concentration inside individual classes. The approach using [M-H]– ions enables to obtain detailed information about phosphatidylethanolamines and their different forms of fatty acyl linkage on the glycerol skeleton (plasmalogens and ether analogs), phosphatidylinositols and hexosylceramides in studied organs. Our results provide important knowledge about lipid representations in vital porcine organs and can be applied for future metabolic studies on human to investigate serious lipid-related human disorders.

The ultrahigh-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC/MS) method was optimized and validated for the determination of oxylipins in human plasma using the targeted approach with selected reaction monitoring (SRM) in the negative-ion electrospray ionization (ESI) mode. Reversed phase UHPLC separation on an octadecylsilica column enabled the analysis of 63 oxylipins including numerous isomeric species within 12-min run time. The method was validated (calibration curve, linearity, limit of detection, limit of quantification, carry-over, precision, accuracy, recovery rate, and matrix effect) and applied to 40 human female plasma samples from breast cancer patients and age-matched healthy volunteers (control). Thirty-six oxylipins were detected in human plasma with concentrations above the limit of detection, and 21 of them were quantified with concentrations above the limit of quantitation. The concentrations determined in healthy controls are in a good agreement with previously reported data on human plasma. Quantitative data were statistically evaluated by multivariate data analysis (MDA) methods including principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least square discriminant analysis (OPLS-DA). S-plot and box plots showed that 13-HODE, 9-HODE, 13-HOTrE, 9-HOTrE, and 12-HHTrE were the most upregulated oxylipin species in plasma of breast cancer patients., Metoda ultra-vysokoúčinné kapalné chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií (UHPLC / MS) byla optimalizována a validována pro stanovení oxylipinů v lidské plazmě pomocí Selected Reaction Monitoring (SRM) s ionizací elektrosprejem (ESI) v negativním režimu. UHPLC separace na obrácených fázíxćh s využitím oktadecylsilikagelové kolony umožnila analýzu 63 oxylipinů včetně četných izomerních druhů během 12 minut. Metoda byla validována (kalibrační křivka, linearita, mez detekce, limit kvantifikace, přesah, Preciznost, přesnost, rychlost obnovy a matrixový efekt) a aplikována na 40 vzorků lidské ženské plazmy od pacientů s rakovinou prsu a zdravých dobrovolníků (kontrola). V lidské plazmě bylo zjištěno třicet šest oxylipinů s koncentracemi nad mezí detekce a 21 z nich bylo kvantifikováno s koncentracemi nad mezí kvantity. Koncentrace zjištěné při zdravých kontrolách jsou v dobré shodě s dříve uváděnými údaji o lidské plazmě. Kvantitativní údaje byly statisticky vyhodnoceny metodami multivariate data analysis (MDA), včetně principal component analysis (PCA) a orthogonal partial least square discriminant analysis (OPLS-DA). S-plot a box plots ukázaly, že 13-HODE, 9-HODE, 13-HOTrE, 9-HOTrE a 12-HHTrE jsou nejvíce upregulované oxylipinové druhy v plazmě pacientů s rakovinou prsu.

This work presents a computational method for deconvolution of interfered peaks of protonated and sodiated phosphatidylcholines (PCs) to solve the problem of relative quantitation of these PCs. The method is based on the fact that adducts of PCs with proton and sodium ion give unique characteristic peaks in tandem mass spectra. The intensities of these peaks were used to find out contribution of protonated and sodiated PCs to the formation of interfered peak in full-scan mass spectrum and, further, to correlate peak intensities that correspond to PCs in fullscan mass spectrum with PC’s concentrations. The model was calibrated on synthesized PCs and verified for applicability in the range of Na+ ion concentrations from trace to physiological one.

Modern mass spectrometric technologies provide quantitative readouts for a wide variety of lipid specimens. However, many studies do not report absolute lipid concentrations and differ vastly in methodologies, workflows and data presentation. Therefore, we encourage researchers to engage with the Lipidomics Standards Initiative to develop common standards for minimum acceptable data quality and reporting for lipidomics data, to take lipidomics research to the next level., Moderní technologie hmotnostní spektrometrie poskytují kvantitativní údaje pro širokou škálu lipidových vzorků. Mnoho studií však nehlásí absolutní koncentrace lipidů a značně se liší v metodikách, pracovních posupech a prezentaci dat. Proto vybízíme výzkumníky, aby se zapojili do iniciativy Lipidomics Standards, aby vypracovali společné standardy pro minimální přijatelnou kvalitu dat a vykazovali lipidomické data, aby mohl výzkum lipidomiky přejít na další úroveň.

This review summarizes available mass spectrometry (MS) based approaches for the quantitative analysis of lipids in biological samples in the cancer research, which is termed here as oncolipidomics. The methodological part shows possible configurations of stand-alone MS or MS coupled to liquid-phase separation techniques. For the characterization of various lipids with the special emphasis on methods convenient for robust high-throughput lipidomic quantitation of biological samples, such as body fluids, tissues, and cell lines. The critical assessment of lipid species dysregulated in various cancer types is provided with the goal to summarize and generalize the typical up and down regulated lipids associated with the progress of tumor growth and evaluate possible future use of lipidomic analysis in the early cancer diagnosis., Toto review shrnuje dostupné přístupy založené na hmotnostní spektrometrii (MS) pro kvantitativní analýzu lipidů v biologických vzorcích ve výzkumu rakoviny, která je označována jako onkolipidomika. Metodická část ukazuje možné konfigurace samostatných MS nebo MS spojené s technikami separace na kapalných fází. Pro charakterizaci různých lipidů se zvláštním důrazem na metody vhodné pro robustní high-throughput lipidomické kvantifikace biologických vzorků, jako jsou tělní tekutiny, tkáně a buněčné linie. Kritické hodnocení lipidových druhů dysregulovaných u různých typů rakoviny je poskytováno s cílem shrnout a zobecnit typické up and down regulované lipidy spojené s pokrokem růstu nádoru a vyhodnotit možné budoucí použití lipidomické analýzy v časné diagnóze rakoviny.