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During crises, intralingual translation (or simplification) of medical content can facilitate comprehension among lay readers and foster their compliance with instructions aimed to avoid or mitigate the cascading effects of crises. The onus of simplifying health-related texts often falls on medical experts, and the task of intralingual translation tends to be nonautomated. Medical authors are asked to check and remember different sets of plain language guidelines, while also relying on their interpretation of how and when to implement these guidelines. Accordingly, even simplified health-related texts present characteristics that make them difficult to read and comprehend, particularly for an audience with low (health) literacy. Against this background, this chapter describes an experimental study aimed at testing the impact that using a controlled language (CL) checker to semi-automate intralingual translation has on the readability and comprehensibility of medical content. The study focused on the plain language summaries and abstracts produced by the non-profit organisation Cochrane. Using Coh-Metrix and recall, this investigation found that the introduction of a CL checker influenced some readability features, but not lay readers’ comprehension, regardless of their native language. Finally, strategies to enhance the comprehensibility of health content and reduce the vulnerability of readers in crises are discussed.

Translation technology is now widely used almost in all areas where multilingual needs are identified, at least in commercial settings. From a market perspective, it offers a wealth of tools that contribute to speeding up multilingual processes, reducing costs and improving quality. Interestingly enough, the multilingual needs of the third sector and more specifically those of NGOs in the aid chain, seem to have fallen into oblivion as far as translation technology is concerned. We see that there are no easily accessible/shareable large scale resources or tools in this area (translation memory databases, termbases or corpora, to name but a few) and stakeholders, working mostly on a volunteer basis, are ultimately forced to create their own ad hoc materials. With a few exceptions, no reference corpora, public sharing-data initiatives or collaborative experiences can easily be found in the context of not-for-profit. In this scenario, it is my contention that the implementation of language tools and resources specifically designed for the needs of the third sector may see its impact on three key areas: economic, social and technical. The ultimate purpose of the present contribution is to create momentum towards the association of translation technology and the humanitarian aid chain. Sin financiación No data (2019) UEM

When a sudden-onset emergency occurs, the language needs of those affected and those involved in the relief efforts cannot be foreseen. Provided that access to online communication is still available, it is not unlikely that many involved in the crisis will resort to language technologies such as machine translation and initiatives such as crowdsourcing to assist in the urgent need for multilingual communication. This may be done in an attempt to understand the key messages from official bodies, or relief organisations, when there is a lack of professional translators to assist in the multilingual communication process. This approach - machine translation and crowdsourcing - was successfully used in a previous crisis, i.e. the 2010 earthquake in Haiti. However, the use of technologies cannot be taken for granted. Even if they are supposedly used for good, a number of ethical issues should be given consideration before using these technologies, when using them, and in the aftermath of a crisis. In this chapter, we describe those issues by having a closer look at potential crisis translation workflows which rely on machine translation and crowdsourcing.

The three measurements for post-editing effort as proposed by Krings (2001) have been adopted by many researchers in subsequent studies and publications. These measurements comprise temporal effort (the speed or productivity rate of post-editing, often measured in words per second or per minute at the segment level), technical effort (the number of actual edits performed by the post-editor, sometimes approximated using the Translation Edit Rate metric (Snover et al. 2006), again usually at the segment level), and cognitive effort. Cognitive effort has been measured using Think-Aloud Protocols, pause measurement, and, increasingly, eye-tracking. This chapter provides a review of studies of post-editing effort using eye-tracking, noting the influence of publications by Danks et al. (1997), and O’Brien (2006, 2008), before describing a single study in detail. The detailed study examines whether predicted effort indicators affect post-editing effort and results were previously published as Moorkens et al. (2015). Most of the eye-tracking data analysed were unused in the previous

In natura i microrganismi raramente si trovano in forma planctonica; piuttosto, tendono ad associarsi con una matrice solida e con altre cellule microbiche sviluppando una complessa comunità che prende il nome di “Biofilm”. Sebbene i funghi sono dei candidati ideali per la formazione dei biofilm, l’informazione a riguardo risulta essere ancora piuttosto carente. Le proprietà filmogene del fungo white rot Pleurotus ostreatus, da solo o in associazione con batteri del genere Pseudomonas, sono note da tempo. Tuttavia, non vi sono ancora informazioni relative alla struttura e alle proprietà fisiologiche del biofilm di P. ostreatus. Infatti, lo scopo generale di questo lavoro di tesi era di fornire informazioni relative alla produzione, alla caratterizzazione biochimica e strutturale e alla risposta a contaminanti ambientali del biofilm di P. ostreatus. In particolare, le proprietà filmogene del fungo sono state valutate utilizzando due diversi approcci metodologici che consentivano di ottenere biofilm mono-specifici stabili di P. ostreatus che rispondevano perfettamente ai requisiti sia strutturali che fenotipici proposti da Harding e collaboratori (2009) per i biofilm di funghi filamentosi. Il primo prevedeva l’utilizzo di piastre a 12 pozzetti con membrane circolari di vario materiale, quali supporti di adesione. Attraverso questo approccio è stato possibile determinare l’effetto delle variabili supporto e terreno di crescita sulla produzione, ultrastruttura e attività metabolica specifica del biofilm di P. ostreatus. I supporti idrofilici e mediamente idrofobici sono risultati essere più idonei alla formazione del biofilm rispetto a quelli idrofobici quali il teflon; mentre l’ultrastruttura del biofilm era maggiormente influenzata dal terreno di crescita piuttosto che dal supporto utilizzato. L’effetto principale delle variabili supporto e terreno di crescita nonché la loro interazione binaria risultava essere altamente significativo (P< 0.001) tanto che l’effetto di una delle variabili dipendeva fortemente dal livello dell’altra. Il secondo approccio metodologico, invece, prevedeva l’utilizzo dei sistemi MBECTM-P&G e MBECTM-HTP largamente utilizzati per lo studio di biofilm batterici e di alcuni lieviti. Con la prima configurazione, in modo indipendente dal tempo di incubazione, si ottenevano significative quantità con una distribuzione uniforme del biofilm. Nel sistema MBECTM-HTP, invece, sia le quantità che l'uniformità spaziale del biofilm di P. ostreatus erano notevolmente influenzate dalle condizioni di incubazione. Sia le analisi chimiche sia quelle strutturali evidenziavano la maggiore presenza di ECM nelle colture in biofilm rispetto a quelle planctoniche. Il cadmio e i composti fenolici presenti nelle acque reflue dei frantoi oleari erano scelti come contaminanti ambientali per valutare comparativamente la risposta del biofilm e della coltura planctonica di P. ostreatus. I biofilm di P. ostreatus esibivano una maggiore tolleranza al cadmio ed erano più efficienti nel trattamento delle acque reflue di frantoio oleario rispetto alle colture planctoniche coeve. Comunemente in natura i biofilm sono formati da microrganismi appartenenti a specie diverse come batteri e funghi insieme e questo rappresenta un punto di fondamentale importanza sia nei processi di biorisanamento sia in applicazioni rilevanti in agricoltura. Quindi, altro scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di studiare la formazione del biofilm misto di P. ostreatus e Pseudomonas alcaliphila. Dagli studi effettuati sui campioni ottenuti a diversi tempi di crescita si è visto che la specie batterica, caratterizzata dall’avere tassi di crescita maggiori rispetto alla specie fungina, costituiva la maggiore componente cellulare del biofilm misto dato, questo, confermato sia dall’analisi quantitativa sia strutturale. In nature, microorganisms are seldom found in planktonic form; rather, they tend to interact with solid matrices and other microbes so as to develop complex systems named ‘biofilms’. Although filamentous fungi are ideal biofilm-forming candidates, there is scant information regarding this topic. The biofilm-forming properties of the fungus Pleurotus ostreatus, alone or in association with bacteria has been reported. However, no basic information is currently available on structural and physiological properties of P. ostreatus-based biofilm systems. In fact, the general aim of this thesis was to gain insights into P. ostreatus biofilm production, its biochemical and structural characterization and response to environmental contaminants. In particular, the biofilm-forming properties of P. ostreatus were evaluated using two different methodological approaches that allowed to obtain P. ostreatus biofilms that fully met the structural and phenotypic criteria suggested by Harding et al. (2009) for fungal biofilm. The first approach involved the use of 12-well plates hosting circular membranes made of various materials as the adhesion supports. In this way, it was possible to elucidate the effect of support and growth medium on production, specific metabolic activity and ultrastructure of P. ostreatus biofilm. Hydrophilic and mild hydrophobic supports were more adequate for biofilm production than highly hydrophobic supports, such as Teflon, while the biofilm ultrastructure was more significantly affected by growth media than support type. The main effects of support and growth media variables and their binary interactions on both biofilm production and specific metabolic activity were all highly significant (P< 0.001); thus, the effect of each variable strongly depended on the level of the other one. The second methodological approach, instead, relied on the use of MBECTM-P&G and MBECTM-HTP systems, that had been extensively used for the study of bacterial and yeast biofilms. With the former configuration, significant biofilm amounts were produced and an even distribution of biofilm was observed regardless of the incubation time. In the MBECTM-HTP, instead, both amounts and spatial uniformity of P. ostreatus biofilms were markedly affected by the incubation conditions. Both chemical analyses and electron microscopy observations showed that biofilm cultures were characterized by higher amounts of ECM than planktonic system. Cadmium and phenol compounds in olive mill wastewater were chosen as environmental contaminants to evaluate comparatively the response of P. ostreatus biofilm and planktonic cultures. P. ostreatus biofilms exhibited a significantly higher tolerance to cadmium and a higher efficiency in olive-mill wastewater treatment than coeval planktonic cultures. In nature, commonly, biofilms are concomitantly composed of bacteria and fungi and this is important in bioremediation processes and in agricultural applications. In fact, another aim of this thesis was study the biofilm formation of P. ostreatus and Pseudomonas alcaliphila. In the mixed biofilm systems, P. alcaliphila predominated over the fungus due to its higher growth rate as assessed by both quantitative PCR and electron microscopy analyses. Dottorato di ricerca in Evoluzione biologica e biochimica

Infectious diseases, particularly in less developed countries, remain among the leading causes of global mortality, most of these infections are caused by Gram-negative bacteria which are the major pathogens responsible of neonatal sepsis and cause of a range of diarrheal, respiratory and invasive diseases. The most frequent Gram-negative isolates are E.coli, Salmonella spp and Shigella spp. Salmonella infection represents a considerable burden in both developing and developed countries. Efforts to reduce transmission of salmonellae by food and other routes must be implemented on a global scale thus the development of cost effective, needle-independent vaccines is a high priority. Vaccine for Developing Countries should be designed to be inexpensive (less than one euro for association like UNICEF and GAVI), stable at room temperature, simple to administer to infants, readily administered by nonprofessionals using a needle-free method and the vaccines formulation would protect against multiple agents. Novartis Vaccines Institute for Global Health (NVGH) aims to develop a broadly protective vaccine using outer membrane particles. These particles, called Generalized Modules for Membrane Antigens (GMMA), also known as outer membrane vesicles (OMV), are naturally shed from the surface of living Gram‐negative bacteria. GMMA are different from the detergent‐extracted OMV which are depleted of lipooligosaccharides and lipoproteins. The purpose of this PhD project was to investigate the possibility to develop low cost vaccines applicable to Gram-negative strains, intended for neglected infectious diseases of impoverished communities, using the GMMA technology platform. This work showed the possibility to use GMMA particles as starting material for membrane components extraction, optimizing new and innovative platform, particularly for LPS or proteins recovery, in order to decrease the costs of goods (COGs). The present work is focused on the O: 4,5-antigen polysaccharide extraction (using the acid hydrolysis approach), purification and characterization from Salmonella Typhimurium SL1344 tolR- GMMA. NVGH, to over produce and collect GMMA, is developing new methods using over producing GMMA mutant strain (the tolR gene deletion results in substantial overproduction of outer membrane particles) and two consecutive TFF steps (Tangential Flow Filtration steps: micro-filtration at 0.2 μm and thereafter a second micro-filtration at 0.1 μm) at the end of the fermentation process to collect GMMA from bacterial suspensions. NVGH has developed another innovative platform for O-antigen extraction from biomass at the end of the fermentation process, using the acid hydrolysis approach of whole bacterial culture. The present work shows for the first time the possibility to use GMMA particles as O-antigens source (and in general as source of membrane components) due their membrane composition enriched in LPS. We have proven that, O-antigens can be extracted from GMMA using the direct acid hydrolysis method thus the consequent O-antigen purification process is easy and cost effective. This work provides the basis for the development of new vaccines, glyconiugate or proteins based, exploiting the same approach used and developed for S. Tyhphimurium SL1344 tolR- GMMA, which could be applied to other Gram negative strains. Le malattie infettive causate dai microrganismi Gram-negativi rappresentano una tra le principali cause di mortalità a livello mondiale, specialmente nei paesi in via di sviluppo. L’attenzione di organizzazioni come UNICEF e WHO si è focalizzata sullo sviluppo di progetti volti a migliorare le aspettative di vita delle propalazioni nei paesi sottosviluppati, dove la scarsa disponibilità d’acqua potabile e le condizioni igienico-sanitarie precarie favoriscono il diffondersi di malattie diarroiche e respiratorie associate a microrganismi patogeni Gram-negativi. Una tra le soluzioni proposte per contenere e prevenire la diffusione di tali malattie è rappresentata dallo sviluppo di vaccini specifici contro i patogeni responsabili. I vaccini pensati, sviluppati e prodotti per i paesi in via di sviluppo devono però rispettare alcuni requisiti. Un aspetto importante è quello legato ai costi, i vaccini devono essere prodotti e immessi nel mercato a basso costo, per l'UNICEF e il GAVI, il prezzo per singola dose non deve superare la soglia di 1.00 euro. Un’altra caratteristica rilevante è legata alle proprietà del vaccino stesso, la preparazione finale deve rimanere stabile a temperatura ambiente e possibilmente garantire la protezione a largo spettro. Idealmente un vaccino per i paesi in via di sviluppo dovrebbe essere pensato e progettato in modo da essere facilmente manipolato e somministrato da personale non esperto, ad esempio evitando l’utilizzo di siringhe con ago. Novartis Vaccines Institute for Global Health (NVGH) mira a sviluppare un vaccino ad ampio spettro utilizzando una particolare caratteristica dei Gram negativi, ossia la capacità di originare e secernere vescicole dalla membrana esterna. Queste vescicole, chiamate Generalized Modules for Membrane Antigens (GMMA), note anche come “native outer membrane vesicles” (NOMV), sono naturalmente rilasciate dalla superficie dei batteri Gram-negativi rispecchiando quindi la composizione della membrana esterna, a differenza delle DOMV (detergent extracted outer membrane vesicles), ottenute da biomassa opportunamente trattata con specifici detergenti, le quali si presentano con struttura lipopolisaccaridica e lipoprtoieca diversa rispetto alla composizione della membrana esterna del batterio d’origine. Lo scopo di questo progetto di dottorato è stato quello di esaminare la possibilità di sviluppare vaccini a basso costo per i paesi in via di sviluppo, contro i microrganismi Gram-negativi utilizzando la piattaforma tecnologica GMMA. Questo lavoro ha dimostrato la possibilità di utilizzare le GMMA come materiale di partenza per l'estrazione di componenti di membrana, in particolare LPS o proteine. Il presente lavoro è focalizzato sull’estrazione, purificazione e caratterizzazione del polisaccaride O:4,5-antigen da GMMA secrete dal patogeno Salmonella Typhimurium SL1344 tolR-. Tale microrganismo geneticamente modificato (delezione del gene tolR) è stato utilizzato perché capace di sovra rilasciare GMMA durante il processo fermentativo, successivamente separate e recuperate dalla biomassa tramite due step consecutivi di filtrazione a flusso tangenziale (TFF) utilizzando membrane a cut-off decrescenti, 0.2 μm per la prima TFF e 0.1 μm per la TFF successiva. Inoltre, NVGH ha sviluppato una piattaforma innovativa per l’estrazione del polisaccaride dalla membrana esterna dei Gram negativi utilizzando l'approccio dell’idrolisi acida direttamente su biomassa a fine fermentata, evitando così l’utilizzo del fenolo, considerato uno tra i metodi classici di estrazione di polisaccaridi da biomassa. Il presente lavoro mostra per la prima volta la possibilità di utilizzare le GMMA come fonte di estrazione dell’O-antigen per lo sviluppo di vaccini glico-coniugati e in generale come fonte di estrazione di componenti di membrana. Abbiamo dimostrato che, il polisaccaride O-antigen può essere estratto dalle GMMA applicando il metodo dell’idrolisi acida diretta e dimostrando come il conseguente processo di purificazione sia più facile e conveniente partendo dalle GMMA invece che dalla biomassa. Questo lavoro fornisce le basi per lo sviluppo di nuovi vaccini, proteici o gliconiugati, contro microrganismi patogeni Gram negativi, ai quali può essere applicata la stessa piattaforma sviluppata e ottimizzata per le GMMA prodotte da S. Tyhphimurium SL1344 tolR. Dottorato di ricerca in Evoluzione biologica e biochimica

La diffusa contaminazione di ecosistemi terrestri e acquatici dovuta all’immissione di composti di origine antropica ad elevata persistenza è un problema che sta assumendo una rilevanza sempre maggiore. Date le quantità prodotte e i potenziali effetti negativi sull’ambiente e sulla salute umana il gruppo di composti più importante è quello dei cosiddetti “xenobiotici”, molecole di sintesi ad elevata persistenza ed estranee ai processi biologici. Le tecnologie che, sfruttando la capacità dei microrganismi, batteri, alghe o funghi, di degradare i contaminanti, sono in grado di accelerare i fenomeni naturali di detossificazione dell’ambiente stanno attirando sempre maggiore attenzione (Šašek et al., 2003). In questo senso, i funghi Basidiomiceti appartenenti al gruppo dei white-rot sembrano i più interessanti. Nel biorisanamento è anche fondamentale il ruolo della microflora endogena e fondamentali appaiono le eventuali interazioni con le specie esogene usate per il bioarrichimento. Negli ultimi venti anni, è profondamente cambiato l’approccio metodologico allo studio delle comunità microbiche naturali: sempre più frequente, infatti, è l’utilizzo di metodi indipendenti dalla coltivazione al fine di superare il problema della non coltivabilità della maggior parte dei batteri ambientali. Tranne che nella diretta ibridazione del DNA con sonde specifiche, la maggior parte di tali metodi (DGGE/TGGE, ARDRA, RFLP/T-RFLP, RISA/ARISA, qRT-PCR) si basano sulla’analisi di marcatori genetici amplificati con primers “universali” a partire dal metagenoma estratto direttamente da campioni di suolo, acqua o sedimenti. Il target maggiormente impiegato nello studio della diversità microbica è il gene codificante l’rRNA 16S, ma anche molti geni funzionali sono base per lo studio di subpopolazioni con capacità metaboliche e fisiologiche specifiche (amoA, rpoB, PmoA, nifH). I principali obiettivi della presente tesi di dottorato sono stati lo studio della dinamica della struttura e funzione delle comunità microbiche autoctone in seguito a processi di micorisanamento su scala di laboratorio condotti su due suoli storicamente contaminati, uno da idrocarburi aromatici e l’altro da PCB, ed un suolo modello contaminato “ad hoc” in laboratorio con una miscela di IPA. Sul suolo modello, contaminato in laboratorio con una miscela di ognuno (50 μg/g) dei seguenti di IPA: fenatrene, antracene, fluorantene, pirene, crisene, benzo[k]fluorantene e benzo[a]pirene, è stato valutato l’effetto combinato di agenti II mobilizzanti (AM) e micorisanamento (Irpex lacteus 617/93, Pleurotus ostreatus 3004, Allescheriella sp. DABAC 1 e Phlebia sp. DABAC 9) sulla struttura delle comunità batteriche indigene. Con Allescheriella sp. e Phlebia sp. sono stati utilizzati gli AM Tween20 (TW20), Tween 80 (TW80) e olio di soia (OS). Con I. lacteus e P. ostreatus sono stati usati come AM anche RAMEB (β-ciclodestrine metilate) ed acque di vegetazione delle olive (AV). Con Phlebia sp., l’unico AM in grado di provocare un aumento significativo della deplezione degli IPA, espressa come peso totale dei contaminati residui (TWOC: Tatal Weight of Organic Contaminants), e valutata sia nei controlli di incubazione che nei suoli sottoposti a micorisanamento dopo 45 giorni di incubazione, era l’OS. Con Allescheriella sp., invece, le migliori performance degradative si ottenevano, nel suolo trattato con TW20 ove si raggiungeva una diminuzione del TWOC pari al 21,6% rispetto al biotrattamento fungino senza aggiunta di AM. La detossificazione dei suoli è stati valutata quantificando l’attività deidrogenasica; Phlebia sp. induceva un livello significativo di detossificazione solo in presenza di TW80, mentre nel caso di Allescheriella sp. il livello più elevato era raggiunto quando non erano presenti AM. La microflora batterica coltivabile endogena era diversamente influenzata con effetto negativo di OS e TW80 sia nel controllo di incubazione che nel suolo inoculato con Phlebia sp. mentre con Allescheriella sp. non si osservavano differenze significative in nessuno dei campioni, indipendentemente dall’AM impiegato. In ogni caso, era evidente un generale effetto positivo esercitato dai funghi sullo sviluppo della microflora residente coltivabile. L’analisi DGGE dimostrava che nel controllo di incubazione in assenza di AM, entrambi gli indici di biodiversità stimati, richness e Shannon-Weaver, non differivano significativamente dagli stessi nel suolo pristino. Entrambi questi parametri risultavano comunque aumentati nei controlli di incubazione trattati con gli AM e i valori più elevati erano osservabili nei suoli sottoposti a micorisanamento. In base alla cluster analysis, infine, era evidente come i funghi esercitavano un’influenza decisiva sulla similarità tra le specie batteriche. Tra gli AM impiegati, il maggior impatto era dovuto a TW20 e TW80. Con I. lacteus e P. ostreatus era riscontrabile un’azione diversa degli AM sulle performance degradative: l’OS risultava il migliore ma un effetto positivo sulle potenzialità degradative di I. lacteus e P. ostreatus era esercitato, rispettivamente, anche da TW20 e TW80. III Anche in questo caso, l’OS esercitava il maggior effetto negativo sullo sviluppo della microflora residente, dimostrato anche mediante analisi DGGE: più bassi indici di biodiversità si riscontravano, infatti, nel controllo di incubazione e nel suolo con I. lacteus in presenza di tale surfactante. L’analisi DGGE mostrava, inoltre, che la biodiversità, con P. ostreatus, non aumentava ma era influenzata dal tipo di AM utilizzato. La cluster analysis indicava come l’inoculo del suolo con P. ostreatus esercitava la maggiore influenza sulla similarità tra le popolazioni batteriche; con I. lacteus, invece, il maggior effetto era esercitato dai surfactanti. Il sequenziamento di alcuni cloni, corrispondenti a particolari bande DGGE, mostrava la presenza di specie batteriche, note per le loro capacità di degradare IPA, appartenenti a generi come Bacillus e Burkholderia. P. pulmonarius CBS 664.97 e B. rhodina DABAC P82 sono stati testati su suolo storicamente contaminato sia come tale che fumigato con cloroformio per valutare il contributo della microflora endogena sull’intero processo. Inaspettatamente, B. rhodina colonizzava meglio il non fumigato mentre era vero il contrario con P. pulmonarius. Le performance degradative di entrambi i funghi erano nettamente superiori nei suoli non fumigati rispetto ai fumigati. Per valutare l’effetto del micorisanamento sulla microflora endogena sono state anche effettuate conte dei batteri eterotrofi totali ed analisi DGGE del gene dell’rRNA 16S. Il numero degli eterotrofi totali era superiore nei suoli non fumigati rispetto ai fumigati, soprattutto biotrattati. L’analisi DGGE evidenziava minore biodiversità nel suolo come tale (t0 – tf), rispetto al controllo e ai suoli sottoposti ai trattamenti fungini. I due ceppi sembravano, quindi, aver avuto un significativo effetto sulla struttura della comunità batterica: le specie stimolate a crescere appartenevano infatti a generi noti per l’abilità di degradare idrocarburi aromatici. Un’ulteriore prova di micorisanamento del suolo ACNA è stata condotta con P. tigrinus con prelievi all’inizio della prova (t0) e dopo 7, 15, 30, 60 giorni (t7, t15, t30,t60) di incubazione. Sia da ispezione visiva che da dosaggio dell’ergosterolo (743 μg/g suolo dopo 60 giorni di incubazione) si rilevava veloce colonizzazione del suolo ammendato con la paglia di mais; venivano, inoltre prodotte Laccasi e Mn-perossidasi (6,54 U/g e 182 mU/g suolo, rispettivamente, dopo 30 giorni di incubazione). L’analisi GC-MS del suolo trattato con P. tigrinus mostrava abbattimento di molti dei contaminanti prioritari presenti nel suolo quali: naftalene (57,3%), 1,2,3,4- IV tetraclorobenzene (73,5%), 2,4- e 2,6-dicloroaniline (100 e 82.8%, rispettivamente) e difeniletere (78%). Conte vitali e analisi DGGE mostravano che, nel tempo, si aveva sia aumento del numero dei batteri eterotrofi totali, che incremento della biodiversità. Gli indici di biodiversità subivano infatti un aumento, nel caso del controllo di incubazione, ed in modo più evidente nel suolo biotrattato con il fungo, già dopo 7-15 giorni di incubazione. L’effetto del trattamento fungino, sulla diversità delle popolazioni batteriche, come emerso dalla cluster analysis era invece riscontrabile dopo 30 giorni di incubazione: si ottenevano infatti due sotto-cluster separati che comprendevano, uno i controlli di incubazione t30 e t60 e l’altro i suoli biotrattati con P. tigrinus t30 e t60. Infine, per valutare se vi fossero effetti, in seguito al micorisanamento, anche su alcune funzioni metaboliche espletate dalle popolazioni batteriche, sono state effettuate real-time PCR sui geni codificanti enzimi chiave (naftalene-diossigenasi e catecolo 2,3- diossigenasi) nella degradazione di alcuni IPA al fine di stimare le variazioni nel numero di copie dei geni stessi. Sia nel caso del gene nahAc che del gene C230 si assisteva ad una diminuzione del numero di copie dei geni stessi in seguito al trattamento fungino. P. tigrinus e OS sono stati infine impiegati in un suolo storicamente contaminato da PCB monitorandone nel tempo gli effetti con prelievi all’inizio della prova (t0) e dopo 30 e 60 giorni di incubazione (t30 e t60). Nei suoli biotrattati la crescita fungina era visibile microscopicamente; quantificando l’ergosterolo, veniva rilevata, seppur in esigue quantità, anche nei controlli di incubazione, indicando quindi crescita di specie fungine autoctone. Nei suoli sottoposti a micorisanamento erano inoltre riscontrabili sia attività enzimatiche idrolasiche che ossidasiche. Le prime raggiungevano i livelli più elevati dopo 30 giorni soprattutto in assenza di OS. L’andamento delle attività ossidasiche era sostanzialmente simile alle idrolasi, ma in questo caso l’OS mostrava pesante influenza negativa sulla laccasi e positiva sulla perossidasi Mn-dipendente. Dall’analisi dei dati relativi alle percentuali di deplezione dei congeneri di PCB estratti dai campioni derivati dalle diverse tesi dopo 60 giorni di incubazione e quantificati attraverso GC-MS, erano evidenti differenti tipi di effetti dovuti all’azione della microflora indigena e del fungo esogeno oppure all’aggiunta di OS o stocchi di mais. L’effetto positivo della microflora residente era evidenziato dalla deplezione dei diversi congeneri nei microcosmi; emergeva tuttavia un effetto negativo esercitato dall’OS. Simile effetto sembrava esercitato anche dagli stocchi di mais sulla deplezione V dei PCB da parte delle comunità microbiche autoctone. Infine, l’effetto del fungo, valutato confrontando il controllo d’incubazione ed il suolo bistrattato (con e senza OS), risultava trascurabile. L’impatto del micorisanamento sulla composizione delle popolazioni batteriche autoctone è stato valutato con conte vitali e analisi DGGE. Inoltre, vista la presenza di funghi autoctoni l’analisi è stata condotta anche sui prodotti di amplificazione del gene codificante il 18S rRNA eucariotico. Attraverso le conte si è osservato un graduale aumento del numero di batteri durante i 60 giorni di incubazione: i maggiori livelli di crescita si avevano nei campioni trattati con fungo e OS dimostrandosi così un loro effetto positivo sulla componente coltivabile della microflora endogena. Dalle analisi DGGE dei geni 16S e 18S rDNA si è evidenziato come sia il biotrattamento che l’uso di OS avevano effetto significativo sulla biodiversità sia dei batteri che dei funghi autoctoni, anche non coltivabili. In base ad analisi qRT-PCR dei geni C230 e bph codificante la bifenil-diossigenasi, enzima chiave dell’upper pathway della degradazione aerobica dei PCB, non si osservavano differenze notevoli nel numero di copie; ciò farebbe supporre che a livello funzionale, il fungo non abbia avuto effetti rilevanti sulle popolazioni batteriche coinvolte nella degradazione degli inquinanti presenti. In conclusione, sia la concentrazione che la biodiversità delle popolazioni batteriche endogene mostrano incrementi in seguito ai processi di micorisanamento ad eccezione dei casi in cui si utilizza OS con Phlebia sp. e, indipendentemente dall’AM impiegato, con P. ostreatus. Tutti i funghi utilizzati risultavano efficaci nella decontaminazione e nella detossificazione dei suoli trattati tranne nel caso di P. tigrinus utilizzato su suolo storicamente contaminato da PCB. Le attività degradative batteriche si mostravano coerenti con i risultati di decontaminazione: se il fungo provocava una diminuzione dei livelli di contaminazione, anche i geni catabolici batterici ne erano influenzati, se il fungo non aveva effetti, anche i livelli dei geni catabolici batterici non subivano cambiamenti durante il trattamento. In the recent years, several polluting compounds have been released into the environment because of industrial and agricultural activities and represent a threat to humans and other living organisms. These contaminants are either natural compounds that have been mobilized to a bioavailable form that is toxic to organisms, such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) present in fossil fuels and heavy metals present in minerals, or compounds of industrial origin that present chemical structures alien to the biosphere (xenobiotics), such as polychlorobiphenyls (PCBs). To address the challenge of cleaning up contaminated sites, there has been an increasing interest in biological methodologies, collectively indicated as bioremediation, that take advantage of the astonishing catabolic versatility of microorganisms to degrade or transform contaminants to less toxic or nontoxic products. A promising bioremediation approach is represented by the use of white-rot fungi, due to their unspecific, radical-based degradation machinery that mainly operates in the extracellular environment (mycoremediation). A better understanding of the structure and functions of the microbial communities of a given contaminated site and how they are affected by biotechnological interventions, such as bioaugmentation with fungi and/or addition of mobilizing agents, may assist in the design of more appropriate remediation strategies. In these respects, the increased development of molecular-based techniques, mainly based on the isolation and analysis of the genome of the entire microbial community in an environmental sample (the so called ‘metagenome’), has allowed the direct investigation of microorganisms in their natural environment without laboratory culturing and thus allowing to mine the whole microbial diversity, including the vast uncultivable majority. Considering that white-rot fungi have been successfully employed in several bioremediation trials but that little is known about whether and how the indigenous microflora is affected by the massive inoculation with the allochtonous fungi, the aim of the present Ph.D. thesis project was to investigate the structural and functional modifications of the microbial communities in contaminated soils following mycoremediation. In particular, several laboratory-scale trials have been implemented on historically contaminated soils and model soils (ad hoc contamination) applying different white-rot fungi, alone or in combination with mobilizing agents. VII Combined use of white-rot fungi and mobilizing agents for the remediation of a model soil artificially contaminated with PAHs: Bioremediation efficacy by microorganisms is strongly affected by the low water solubility and bioavailability of PAHs and so the use of additives capable of mobilizing these contaminants from the soil organic phase to the aqueous one has been shown to positively influence their degradation. The first part of this thesis work was thus aimed to evaluate the effect of mobilizing agents (MA) on mycoremediation efficiency and to better understand the impact of this remediation strategy on the composition and diversity of the indigenous bacterial community. The study was conducted in a model system where a pristine soil was spiked with a mixture of seven PAHs (50 mg/g each of phenanthrene, anthracene, fluoranthene, pyrene, chrysene, benzo[k]fluoranthene and benzo[a]pyrene), to simulate a recent contamination, and subsequently incubated with white-rot fungi (Irpex lacteus 617/93, Pleurotus ostreatus 3004, Allescheriella sp. DABAC 1 and Phlebia sp. DABAC 9) and/or mobilizing agents, namely two polyoxyethylenepolysorbates (Tween-20 and Tween-80), a plant seed oil characterized by high concentration of polyunsaturated fatty acid (soybean oil, SO), olive-oil mill wastewaters (OMW) and randomly methylated -cyclodextrins (RAMEB). In the first part of this study Phlebia sp. and Allescheriella sp. have been used with or without the addition of Tween 20, Tween 80 and SO. The two fungal strains markedly differ for their growth capabilities under non-sterile conditions and without MAs (3.0 vs. 0.1 μg ergosterol g-1 soil, for Phlebia sp. and Allescheriella sp., respectively). However, SO led to a 35-fold increase of Allescheriella sp. growth. Contaminant degradations by Phlebia sp. and Allescheriella sp. were best supported by SO and Tween 20, respectively. Interestingly, the highest level of soil detoxification, as evaluated by assessing dehydrogenase activity, was reached following incubation with Allescheriella sp. without the addition of any MA. In accordance with these findings, enumeration of cultivable bacteria and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of PCR-amplified 16S rRNA showed that microbial growth and biodiversity were positively affected by remediation with white-rot fungi, and especially when Allescheriella sp. was used. In the second part of the study two white-rot fungi, namely Irpex lacteus and Pleurotus ostreatus, were tested alone or in combination with five MAs (Tween-20, Tween-80, SO, OMW, and RAMEB). Among the different MAs, SO best supported fungal growth and positively affected PAH degradation and soil detoxification but, VIII interestingly, showed a negative effect on both bacterial biomass and biodiversity when either one of the two fungi was used. It is worth noticing that even if both fungi showed a general decrease of the total weight of contaminants and an increase of soil detoxification in combinations with all MAs, their impact on endogenous bacteria was different. Indeed, when the soil was incubated with P. ostreatus bacterial biodiversity decreased and the type of MA used did not significantly affect the composition of the indigenous microflora. By contrast, when I. lacteus was used as inoculum, the diversity of the bacterial community increased and its structure was influenced by the type of MA used. Finally, cloning-sequencing of PCR-amplified 16S rRNA genes suggested the presence of well known PAH-degrading bacterial species belonging to the Bacillus e Burkholderia genera. Bioremediation of a historically contaminated soil with Botryosphaeria rhodina and Pleurotus pulmonarius: Two white-rot fungi, namely Botryosphaeria rhodina DABAC P82 and Pleurotus pulmonarius CBS 664.97 were tested for their ability to grow and to degrade aromatic hydrocarbons in an aged contaminated soil from the ACNA site (Cengio, SV, Italy), a former industrial area, decommissioned in 1994, where large-scale production of a wide array of organic chemicals had taken place for more than 100 years. The soil was characterized by the concomitant presence of both aromatic hydrocarbons, including chlorinated benzenes and anilines, thiophenes and polyaromatic hydrocarbons, and heavy metals (mainly Hg, Cu and As). Previous studies had demonstrated the unfeasibility of biostimulating the indigenous microflora to bioremediate this soil and thus mycoremediation with white-rot fungi was attempted. To evaluate the role of the indigenous microflora on the overall process, incubations were performed on both fumigated and non-fumigated soils. Fungal colonization by B. rhodina was unexpectedly lower in the fumigated than in the non-fumigated soil while the growth of P. pulmonarius showed an opposite response. Interestingly, degradation performances and detoxification by both fungi were markedly higher in the non-fumigated soil than those observed in the fumigated one suggesting an apparent synergistic effect occurring between the bioaugmented fungi and indigenous soil microflora. Heterotrophic bacterial counts in nonfumigated soil inoculated with either B. rhodina or P. pulmonarius were significantly higher than those of the corresponding incubation control. To evaluate the effects of fungal IX bioremediation on the bacterial community structure, numerical analysis of DGGE profiles of PCR-amplified 16S rRNA genes was performed. The bacterial community in the original non-amended ACNA soil was characterized by a low biodiversity. The amendment with sterilized maize stalks led to an augmentation of species richness and to marked changes in the community structure. Bioaugmentation with both fungi further increased the community diversity and resulted either in the appearance or in the enrichment of dominant hydrocarbon-degrading species as suggested by cloning and sequencing of 16S rRNA genes. Structural and functional modifications of the indigenous bacterial community during bioremediation of a historically contaminated soil with Panus tigrinus: Bioremediation of the aged contaminated soil ACNA was further investigated using the white-rot fungus Panus tigrinus. In this part of the thesis project a laboratory-scale trial was setup to monitor the structural and functional modifications of the indigenous bacterial community during mycoremediation. Analyses were performed at the beginning of the experiment (t0) and after 7, 15, 30 and 60 days of incubation (t7, t15, t30 and t60). Amendment of contaminated soil with milled maize stalks proved to be valuable for the fungus growth under non-sterile conditions: the matrix was rapidly colonized within the first two weeks, thus indicating good tolerance towards both organic contaminants and heavy metals and capability to compete with the autochthonous microflora. Moreover, and in spite of the non-favorable pH (around 7.4) and the presence of heavy metals, P. tigrinus produced interesting lignin-modifying enzyme activities such as laccase and Mn-peroxidase. Although bioremediation experiments were prolonged for only 60 days, GC-MS analysis of the soil treated with P. tigrinus indicated removal or strong reduction of several contaminants such as naphthalene, 1,2,3,4- tetrachlorobenzene, 2,4- and 2,6-dichloroaniline, 2,3,4,5,6-pentachloroaniline, diphenylether and 1,1’-binaphtalene. Heterotrophic bacterial counts and DGGE analysis showed that the size and the diversity of the endogenous bacterial populations increased during fungal bioaugmentation. Cluster analysis of DGGE fingerprints indicated that bacterial populations in the incubation control and in the fungal-augmented soil during the first fifteen days of incubation remained quite similar. On the contrary, after 30 and 60 days of incubation, a higher degree of diversification between incubation controls and fungal treatments was evident suggesting a specific effect of P. tigrinus inoculation X on the endogenous bacterial community. Finally, to evaluate the impact of mycoremediation on the bacterial community function, Real-Time PCR experiments were performed targeting genes involved in the degradation of aromatic contaminants. In particular, it was found that the copy number of both naphthalene dioxygenase and catechol 2,3-dioxygenase genes tended to decrease over time in soils incubated with P. tigrinus. This finding suggested the occurrence of a functional shift in soil microbial populations, probably as a consequence of aromatic contaminant degradation, and thus leading to a reduction in the relative abundance of specialized bacterial groups. Cloning and sequencing of 16S rRNA genes further confirmed this hypothesis showing that following remediation both specialized and opportunistic bacteria belonging to several different genera were present. Combined use of Panus tigrinus and soybean oil for the bioremediation of a soil historically contaminated with polychlorinated biphenyls: Based on the encouraging results obtained with the use of white-rot fungi for the remediation of PAH-contaminated soils, the aim of the last part of the thesis work was to evaluate a similar mycoremediation approach for the reclamation of a soil historically contaminated with polychlorinated biphenyl (PCB). Indeed, PCBs are toxic xenobiotics of great ecological concern present in large amounts throughout the environment, and in particular in soils and sediments. A laboratory-scale mycoremediation trial with P. tigrinus, alone or in combination with SO as mobilizing agent, was established and analyses were performed at the beginning of the experiment (t0) and after 30 (t30) and 60 (t60) days of incubation. Colonization of P. tigrinus was clearly visible and also confirmed by ergosterol quantification. Interestingly, ergosterol slightly increased in non-inoculated incubation controls as well, suggesting the presence of a viable indigenous fungal community. Extracellular enzymatic activities were detected in soil inoculated with P. tigrinus. In particular, hydrolase activities peaked after 30 days of incubation especially in the absence of SO. On the contrary, the use of the MA had opposite effects on lignin-modifying enzyme activities: SO inhibited the production of laccase but stimulated that of Mn-peroxidase. GC-MS analysis of PCB concentration in the different soil samples showed that, as expected, there was a significant degradation activity carried on by the endogenous microflora but that, interestingly, the addition of the mobilizing agent negatively affected this activity. On the contrary, mycoremediation with P. tigrinus did not lead to a significant PCB depletion. Nevertheless, heterotrophic XI bacterial counts and DGGE analysis of both 16S and 18S rRNA genes showed that the size and the diversity of the bacterial and fungal communities increased following incubation with the fungus and the mobilizing agents, suggesting a significant effect of these biological interventions on the endogenous microflora. Real-Time PCR quantification of catabolic genes, namely biphenyl dioxygenase and catechol 2,3- dioxygenase, showed that the number of gene copies remained unchanged during the incubation period, suggesting that treatment with P. tigrinus and/or SO did not affect the function of the endogenous microbial community. In conclusion, the results obtained during this thesis project confirmed the importance of using white-rot fungi, alone or in combination with mobilizing agents, to decontaminate and detoxify PAH-contaminated soils. On the contrary, more investigations are needed to assess the validity of a similar strategy for the bioremediation of soils polluted with PCBs. The detailed, culture-independent, molecular-based analyses of soil microflora revealed that mycoremediation, both with and without the use of mobilizing agents, had a profound effect on the structure and function of the endogenous microbial communities. In particular, and with the only exception of the use of Phlebia sp. in combination with SO, all fungi and all mobilizing agents stimulated bacterial growth and enhanced bacterial biodiversity. Furthermore, when the mycoremediation of the soil was successful, also the function of the bacterial community seemed to undergo a shift toward a less specialized role. Taken together these results point out the importance of gaining insights about the ecological effects of biotechnological interventions, particularly those involving bioaugmentation with fungi, on the endogenous microbial populations in order to design more integrated, successful bioremediation strategies. Dottorato di ricerca in Evoluzione biologica e biochimica