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El desarrollo de moléculas y estrategias terapéuticas llevado a cabo en los últimos años se ha mostrado ineficaz en el tratamiento del cáncer. Por esta razón, es necesario el desarrollo de nuevas moléculas, búsqueda de nuevas dianas y nuevas aproximaciones terapéuticas. Los polifenoles son un grupo de compuestos químicos de origen vegetal con efectos beneficiosos para la salud. Se han observado efectos favorables en la prevención y tratamiento del cáncer (1), enfermedades cardiovasculares (2), neurodegenerativas (3) y en aquellas patologías donde el estrés oxidativo juega un papel importante. Se asume que estos efectos beneficiosos se deben fundamentalmente a sus propiedades antioxidantes (4), antiinflamatorias (5) y anticancerígenas (6). El resveratrol es un polifenol presente en el hollejo de la uva con capacidad de: proteger frente a la carcinogénesis (1, 7), suprimir la iniciación y promoción tumoral (8), reducir el crecimiento tumoral (9), prevenir la transformación de celular (6, 10), inducir la muerte celular de cáncer colorrectal (11) e inhibir la neoangiogénesis (12). La inhibición de la proliferación tumoral observada in vitro se ha atribuido a la capacidad que posee el resveratrol de detener el ciclo celular (13), promover la diferenciación celular (14) y activar la apoptosis (4, 6, 15), así como, la autofagia (16). Estas características hacen que el polifenol se haya mostrado como un agente muy atractivo en la lucha contra el cáncer desde un punto de vista tanto preventivo como terapéutico. Sin embargo, la baja disponibilidad del resveratrol in vivo, hace difícil su uso a concentraciones biológicamente activas en la terapia contra la gran mayoría de cánceres. En este aspecto el pterostilbeno, un análogo estructural dimetoxilado del resveratrol (17), además de presentar una mayor biodisponibilidad temporal muestra unas actividades antioxidantes y anticarcinogénicas similares a las del resveratrol (18,19), sin embargo, los mecanismos que subyacen la acción antitumoral no se conocen con exactitud. La permeabilización de la membrana lisosomal (LMP) y la liberación masiva de las hidrolasas que contiene al citosol es un potente inductor de muerte celular por necrosis. Sin embargo, niveles menores en la permeabilización lisosomal activan mecanismos de muerte celular dependientes e independiente de caspasas (20). Así, la regulación de la LMP puede ser una buena estrategia terapéutica para eliminar las células tumorales. BIBLIOGRAFIA BÁSICA: 1.Lambert, J. D., Hong, J., et al. Am J Clin Nutr, 81: 284S-291S, 2005. 2.Renaud, S. and de Lorgeril, M. Lancet, 339: 1523-1526, 1992. 3.Sun, A. Y., Simonyi, A., et al. Free Radic Biol Med, 32: 314-318, 2002. 4.Frankel, E. N., Kanner, J., et al. Lancet, 341: 454-457, 1993. 5.Haqqi, T. M., Anthony, D. D., et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 96: 4524-4529, 1999. 6.Yang, C. S., Landau, J. M., et al. Annu Rev Nutr, 21: 381-406, 2001. 7.Bhat, K. P. and Pezzuto, J. M. Ann N Y Acad Sci, 957: 210-229, 2002. 8.Jang, M., Cai, L., et al. Science, 275: 218-220, 1997. 9.Carbo, N., Costelli, P., et al. Biochem Biophys Res Commun, 254: 739-743, 1999. 10.Jones, P. A. and Baylin, S. B. Nat Rev Genet, 3: 415-428, 2002. 11.Trincheri, N. F., Follo, C., et al. Carcinogenesis, 2007. 12.Tseng, S. H., Lin, S. M., et al. Clin Cancer Res, 10: 2190-2202, 2004. 13.Joe, A. K., Liu, H., et al. Clin Cancer Res, 8: 893-903, 2002. 14.Wolter, F. and Stein, J. J Nutr, 132: 2082-2086, 2002. 15.Ferrer, P., Asensi, M., et al. Neoplasia, 7: 37-47, 2005. 16.Opipari, A. W., Jr., Tan, L., et al. Cancer Res, 64: 696-703, 2004. 17.Stivala, L. A., Savio, M., et al. Biol Chem, 276: 22586-22594, 2001. 18.Rimando, A. M., Cuendet, M., et al. J Agric Food Chem, 50: 3453-3457, 2002. 19.Cichocki, M., Paluszczak, J., et al. Mol Nutr Food Res, 52 Suppl 1: S62-70, 2008. 20.Boya P, Kroemer G. Oncogene, 27:6434-51, 2008.

Este estudio de la precisión diagnóstica de la Imagen Térmica Infrarroja (ITI) en el diagnóstico de lesiones traumatológicas durante la infancia, ha sido motivado por la alta incidencia de este tipo de lesiones (fracturas, esguinces y contusiones) que habitualmente se diagnostican mediante rayos X, con el potencial riesgo que supone el uso de este tipo de radiación ionizante en pacientes pediátricos. La valoración de la precisión diagnóstica de otra prueba de imagen alternativa, como es la Termografía Infrarroja (TI), puede evitar la radiación ionizante producida por las radiografías o TAC usadas en la práctica diaria en los hospitales para la atención urgente de niños que han sufrido un traumatismo. Para la evaluación de la capacidad o precisión de la termografía infrarroja y poder discriminar entre niños con lesión (fracturas, esguinces o contusiones) o niños sin lesión, se ha utilizado un patrón de referencia y las pautas recomendadas (Standards for the Reporting of Diagnostic Accuracy Studies). La memoria que se presenta se divide en diez apartados o capítulos, como sigue: En el primero, se realiza un resumen del trabajo en el que se describe de forma breve cada uno de los apartados. En el segundo apartado, introductorio al tema, se describe el problema que origina la motivación para la realización del estudio: su representación epidemiológica, consecuencias, el tipo de lesión a estudiar y sus características. En este mismo apartado, se mencionan los signos y síntomas de las lesiones, haciendo hincapié en el aumento de temperatura ocasionado por la inflamación de la zona lesionada tras un traumatismo, punto clave en el estudio, ya que la prueba a valorar mide la temperatura. Se presentan los siguientes puntos: aspectos generales de la termometría, la fisiología de la termorregulación, la metodología elegida para la detección de la temperatura, una aproximación a las bases físicas de la termografía infrarroja, y la actualidad de las aplicaciones de la termografía infrarroja en salud y otras aplicaciones. En el tercer apartado, en base a lo descrito anteriormente, se plantea la justificación, hipótesis y objetivos del estudio. Se propone, como alternativa al uso de pruebas diagnósticas de radiación ionizante, la utilización de la termografía infrarroja en el diagnóstico de lesiones traumatológica en la edad pediátrica, apoyándonos en las ventajas que ofrece dicha técnica y en el aumento de temperatura que los procesos fisiológicos producen tras un traumatismo. El propósito último fue determinar la precisión de la imagen térmica infrarroja como herramienta diagnóstica en las fracturas óseas infantiles. El cuarto apartado se ha realizado “ad hoc” con el objetivo de plantear un diseño riguroso del trabajo. Se trata de una revisión sistemática de la literatura sobre los estudios de precisión diagnóstica (DTA) de la termografía infrarroja en lesiones traumatológicas, valorando la metodología utilizada y los resultados obtenidos. Para ello, se realizó la búsqueda en MEDLINE, EMBASE, CINAHL, Cochrane Library, DARE, CENTRAL, SCOPUS, Web of Science, IME e ICYT. Se planificó una síntesis cualitativa de todos los estudios y un metaanálisis para la sensibilidad y especificidad cuando se encontrase baja heterogeneidad e inconsistencia y no hubiera efecto de umbral diagnóstico. Las pruebas estadísticas se realizaron con α = 0.05. Se incluyeron seis estudios en la revisión y síntesis cualitativa: uno evaluó el síndrome compartimental, tres las fracturas por estrés, uno las fracturas de escafoides y el último distintas patologías de rodilla. La calidad metodológica de los estudios fue mayoritariamente baja. Se realizó una síntesis cuantitativa de los estudios que evaluaron las fracturas por estrés, pero debido a la heterogeneidad e inconsistencia halladas para la sensibilidad, sólo pudo combinarse el resultado para la especificidad (0.69 [CI 95 %: 0.49 – 0.85]). El quinto apartado está dedicado a la descripción del material y los métodos empleados en el estudio. En él se describen el diseño y la población de estudio, con los criterios de inclusión y exclusión. Asimismo, se detalla la recogida de datos, los protocolos que se diseñaron para la captura de las imágenes, la cámara utilizada y las características de la misma. Para terminar se específica el proceso de análisis de las imágenes, en el que se incorpora la creación de un software “ad hoc” que ha posibilitado un análisis sencillo de las mismas, así como también los diferentes análisis estadísticos de las variables consideradas en el estudio. Los resultados, tanto del análisis de las imágenes como de los análisis estadísticos de los datos, se muestran en el apartado sexto. La muestra de niños lesionados estuvo formada por 133 niños atendidos en el servicio de urgencias del Hospital Dr. Peset de Valencia. Se analizaron las imágenes termográficas obtenidas comparando la diferencia de temperaturas medias, temperaturas máximas y de áreas en las regiones de interés (ROI) de la zona lesionada y la zona sana homóloga. Se construyeron modelos de Regresión Logística y de Árbol de Decisión o Clasificación para valorar la capacidad de la técnica en la clasificación de fracturas y determinar su precisión diagnóstica. El modelo Árbol de Decisión fue el que mejores valores de clasificación presentó, con una sensibilidad de 0.913, una especificidad de 0.885 y un área bajo la curva (AUC) de 0.969. La precisión diagnóstica de la imagen térmica infrarroja hallada muestra un gran potencial como elemento de cribado para reducir el número de exploraciones realizadas en niños, mediante técnicas que emitan radiación ionizante, resultando de gran utilidad la cuantificación de la diferencia de áreas, que hasta ahora no se había tenido en cuenta en otros estudios. A partir de los resultados se realiza la discusión de los mismos, para terminar con las conclusiones del estudio. El documento se completa con la relación de referencias bibliográficas utilizadas y una recopilación de documentos que se han elaborado para su utilización en la revisión sistemática y en la recogida de datos en forma de anexos. This study of the diagnostic accuracy of Infrared Thermal Imaging (ITI) in the diagnosis of orthopedic injuries in childhood has been motivated by the high incidence of these injuries (fractures, sprains and contusions), which are usually diagnosed by X-rays with the potential risk posed by the use of this type of ionizing radiation in pediatric patients. The evaluation of the diagnostic accuracy of other alternative imaging tests, such as Infrared Thermography (IT), could avoid exposure to the ionizing radiation produced by X-rays or CT used in daily practice in hospital emergency units which care for children who have suffered trauma. To evaluate of the ability, or accuracy, of Infrared Thermography, and in order to be able to discriminate between children with injuries and those without, a reference standard was used and recommended guidelines were followed (Standards for the Reporting of Diagnostic Accuracy Studies). The document is divided into ten sections or chapters as follows: Firstly, there is a summary of the work carried out which briefly describes each of the sections. The second introductory section describes the rationale for the study, its epidemiological representation, consequences, the type of injury being studied and its characteristics. In this section, signs and symptoms of injuries are described, emphasizing the temperature rise caused by inflammation in the injured area after trauma, a key point in the study, since the test being assessed measures temperature. Several topics are presented in this section: general aspects of thermometry, the physiology of thermoregulation, the chosen method to detect the temperature, an approximation to the physical basis of Infrared Thermography and applications of Infrared Thermography in health and other areas. In the third section, based on the above, the hypothesis and the objectives of the study are presented. As an alternative to the use of diagnostic tests for lesions in childhood trauma based on ionizing radiation, the use of Infrared Thermography is proposed, based on the advantages of this technique and the increase in temperature that physiological processes produce following a trauma. The main intention was to determine the accuracy of Infrared Thermal Imaging as a diagnostic tool in childhood bone fractures. The fourth section, carried out "ad hoc", aims to propose a rigorous design of the study. This consists of a systematic review of the literature on diagnostic accuracy studies (DTA) of Infrared Thermography in orthopedic injuries, evaluating the methodology used and the results obtained. To this end, a search was carried out in MEDLINE, EMBASE, CINAHL, the Cochrane Library, DARE, CENTRAL, SCOPUS, the Web of Science, IME and ICYT. A qualitative synthesis of all studies was planned, along with a meta-analysis for sensitivity and specificity when low heterogeneity and inconsistency were found and there was no diagnostic threshold effect. Statistical tests were performed with α = 0.05. Six studies were included in the review and qualitative synthesis: one of them evaluated compartment syndrome, three evaluated stress fractures, one scaphoid fractures and the last one various knee pathologies. The methodological quality of the studies was mostly low. A quantitative synthesis of the studies evaluating stress fractures was performed, but because of the heterogeneity and inconsistency found for sensitivity, the result could only be combined for specificity (0.69 [95 % CI: 0.49 to 0.85]). The fifth section is devoted to the description of the materials and methods used in the study. It describes the study design, and the population under study, with both inclusion and exclusion criteria. It also details the data collection protocols that were designed to capture the images, the camera used and its technical characteristics. Finally, the process for image analysis is detailed, which includes the creation of "ad hoc" software that allowed a simple yet interesting analysis to be carried out, as well as different statistical analysis of the variables considered in the study. The results of both the analysis of the images as well as the statistical analysis of the data are shown in the sixth section. The sample of children was made up of 133 injured children treated in the emergency unit of the Dr. Peset Hospital, Valencia. The thermal images obtained were analyzed by comparing the difference in mean temperatures, maximum temperatures and areas in the regions of interest (ROI) of the injured area and its healthy counterpart. Regression models and Logistic Decision Tree or Classification were constructed to assess the ability of the technique in the classification of fractures and to determine its diagnostic accuracy. The Decision Tree model gave the best rating values, showing a sensitivity of 0.913, a specificity of 0.885 and an area under the curve (AUC) of 0.969. The diagnostic accuracy of Infrared Thermal Imaging found shows that it has great potential as a screening method to reduce the number of scans given to children using ionizing radiation techniques. Quantifying the difference of areas, something raised for the first time in this work, has been seen to be extremely useful. A discussion of the results is then presented, followed by the conclusions of the study. Finally, there is a bibliographic list of references used, along with a compilation of the documents that have been developed for use in the systematic review and data collection, which are presented as annexes.

After ischemic damage in kidney, alternatively activated or M2 macrophages are key players in resolving inflammation and participating in kidney repair. Obtaining this particular phenotype is a process controlled by deregulation of a series of genes. Modulation of those genes could result in controlling macrophages phenotype and functions, aiming new approaches in resolving ARF. The first aim of this study was to identify genes that are related to M2 macrophages that are involved in tissue repair. By functional genomics we have identified the expression of 14 genes crucial for the induction of the endogenous reparative capacity of the kidney that are modulated by the presence of macrophages. We also demonstrated that modulation of Ivns1abp gene can modulate renal repair. More concrete we show that over-expression of the Ivns1abp gene can enhance macrophages regenerative capacity and switch their phenotype towards M2, provoking modulation of their inflammatory state and increasing its resistance against inflammation inputs. We also demonstrated that silencing of the Ivns1abp genet to macrophages leads them to acquire a M1 phenotype and decrease their reparative and phagocytosis capacity. As a last step, we define pathways that regulate the transcription of the Ivns1abp gene. We show that Ivns1abp gene expression in macrophages is regulated by the c-myc transcription factor and modulated by the presence of cytokines determining cell fate., Después de la lesión isquémica en el riñón, los macrófagos activados alternativamente o M2 no solo participan en la reparación del daño sino son factores clave en la resolución de la inflamación. La obtención de este fenotipo particular es un proceso controlado por la desregulación de una serie de genes. Modulando estos genes, se podría controlar el fenotipo y las funciones de los macrófagos, con el objetivo de nuevos enfoques en el tratamiento de FRA. El primer objetivo de este estudio fue identificar los genes que están implicados en la reparación de tejidos y que están relacionados con los macrófagos M2. Por genómica funcional hemos identificado la expresión de 14 genes cruciales para la inducción de la capacidad regeneradora endógena del riñón y modulados por la presencia de macrófagos. A continuación hemos demostrado que la modulación del gen Ivns1abp puede modular la reparación renal. En concreto hemos demostrado que la sobre-expresión del gen Ivns1abp en macrófagos puede mejorar su capacidad regenerativa y cambiar su fenotipo hacia M2, provocando la modulación de su estado inflamatorio y aumento de su resistencia frente la inflamación. Se demostró además que el silenciamiento del gen Ivns1abp en macrófagos disminuye su capacidad reparadora y fagocítica transformando su fenotipo a M1. Como ultimo, hemos definido las vías que regulan la transcripción del gen Ivns1abp. Hemos demostrado que la expresión del gen Ivns1abp en los macrófagos está regulada por el factor del trascripción c-myc y modulada por la presencia de citoquinas, determinando el destino de la célula.

[cat] L’èxit de l’aqüicultura moderna es basa en el control sobre la reproducció de les espècies, en el millor coneixement de la seva biologia, en les innovacions tecnològiques i en el desenvolupament d’aliments específics. En base a aquests requisits per la millora de la pràctica de l’aqüicultura, i també a l'esmenada necessitat de fonts alternatives de les matèries primeres (farina i oli de peix) per als pinsos d’engreix, es van plantejar els estudis que constitueixen la present tesis. Els treballs que la composen tenen com a objectiu general abordar la millora del cultiu de peixos amb interès comercial a partir de l’optimització de l’ús dels nutrients. Més concretament, es va determinar com es pot afectar la capacitat d’aprofitament dels carbohidrats digeribles de la dieta en dues espècies de peixos carnívors com són la truita (O. mykiss) i l’orada (S. aurata). Per aconseguir-ho, primer es va intentar incrementar la demanda energètica del peix mitjançant un exercici moderat però sostingut (a 1.3 LC•s-1 en la truita i 1.5 LC•s-1 en l’orada, en els Capítols I, II i III) i també es va variar la distribució dels nutrients en els diferents moments d'alimentació del dia (estudi del règim diari en el Capítol IV). Mantenint els animals en aquestes condicions es van estudiar les relacions entre la nutrició i el metabolisme dels peixos analitzant primer la composició tissular dels animals; segon, fent el seguiment del nutrients marcant-los amb traçadors metabòlics (midó amb C13 i proteïna amb N15), i en tercer lloc estudiant els canvis de les fibres musculars. Els estudis presentats ens permeten concloure que la truita sotmesa a natació sostinguda incrementa l'ús dels carbohidrats de la dieta i dels dipòsits de lípids i glicogen en músculs. Convertint una part significativa dels carbohidrats a lípids en el fetge, i oxidant-ne una altra part en els músculs, especialment en el múscul vermell. A més a més, la major recuperació de N15 en el total del peix exercitat 24 h després d’una ingesta forçada, principalment en la fracció proteica dels dos músculs (RM i WM), evidencia objectivament que la natació sostinguda augmenta la deposició de proteïnes en la truita irisada, resultant en un estalvi proteic. L’orada, per altra banda, té una capacitat considerable per usar els carbohidrats de la dieta per a la producció d'energia, presentant també un major recanvi (turnover) dels nutrients amb l'exercici. En l'orada, una major retenció de les proteïnes de la dieta (major deposició de N15 en el múscul blanc durant tot el període postprandial) sota condicions d'exercici sostingut demostrà un estalvi proteic (sparing-effect) per a l'ús de carbohidrats, evitant la deposició excessiva de lípids. I el creixement hipertròfic del múscul blanc sota condicions d’activitat explica l'augment en el creixement de l’orada i és indicatiu de la producció d’un major filet. Això demostra que les dos espècies presenten marcades diferències en l'ús de nutrients. Per altra banda, quan es combina la major activitat que l’orada presenta durant el dia amb la composició de la dieta s'incrementen les interconversions metabòliques i l’eficiència de retenció proteica en el múscul blanc. Per això, l’administració d’una dieta rica en carbohidrats al matí no va perjudicar la incorporació de proteïnes de la dieta, ni la deposició en el múscul, ni el creixement. A la vegada, els isòtops estables van mostrar que els canvis metabòlics postprandials de distribució i destí dels nutrients marcats (C13-carbohidrat i N15-proteïna) són deguts al règim alimentari (nombre de menjars per dia i freqüència), però a la vegada estan condicionats per l’última ingesta rebuda. Les aplicacions practiques dels estudis haurien de tenir present que l’exercici combinat amb la composició de la dieta contribueix a una reducció en la contaminació de l'aigua a causa de la major retenció de la proteïna de la dieta. I que la reducció en el contingut de proteïna de la dieta va ser compensada amb major retenció proteica, però els carbohidrats no varen ser usats igual d’eficientment a la tarda que al matí. Les implicacions científiques d’aquests resultats van més enllà d'uns estudis concrets en condicions controlades. Així, les investigacions futures haurien de dirigir-se a l’exploració sobre l'ús dels nutrients en dietes balancejades i que continguin diferents proporcions de nutrients no proteics (hidrats de carboni/lípids) com a font d'energia, juntament amb l'optimització de les condicions de natació sostinguda i de la freqüència i quantitat d’aliment diari en altres espècies de peixos., [eng] The aim of the Thesis is to study the improvement of fish farming through the optimization of the use of nutrients. We determined how to optimize the capacity to use dietary carbohydrates in two species of carnivorous fish, rainbow trout (O. mykiss) and sea bream (S. aurata). Firstly, we tried to increase the energy demand of fish through a sustained moderate exercise, and then we varied nutrients distribution through the day. We kept animals in these conditions and after we studied the relationship between nutrition and metabolism in fish by analyzing animals tissue composition and tracing the nutrients with C13-starch and N15-protein. We also studied the changes in the muscle fibers. The studies included in this Thesis allow us to conclude that trout, subjected to sustained swimming, increases the use of dietary carbohydrate and also augments the lipid and glycogen deposits in muscles. In trout under sustained-exercise, a noticeable of carbohydrates were transformed to lipids in the liver and other amount was oxidized in muscles. The total N15 recovery on exercised fish was mainly in protein fraction of both muscle (red & with), at 24 hours after forced-feeding, shows that sustained swimming increases protein deposition resulting in a protein sparing. On the other hand, sea bream has a good capacity to use dietary carbohydrate for energy production, also showing a great nutrient turnover under exercise. Greater retention of dietary protein under conditions of sustained exercise demonstrated a sparing-effect for the use of carbohydrates, preventing an excess of lipid deposition. In addition, the hypertrophic growth of white muscle under conditions of activity explains the growth of the sea bream. This demonstrates that both species show marked differences in nutrient use. Furthermore, when you combine the increased activity of the sea bream showed during the day with the composition of the diet, it is observed an increase of the metabolic interconversion and efficiency of protein retention in the white muscle. The administration of a carbohydrate-rich diet in the morning did not impair the incorporation of dietary protein or deposition in muscle or growth. Stable isotopes showed that postprandial metabolic changes of distribution and fate of nutrients marked are due to diet, yet are conditioned by the last intake received.

[spa]Las malformaciones esqueléticas y problemas pigmentarios son dos de los problemas más importantes que afectan actualmente a la producción masiva de juveniles de peces planos. Estas anomalías, que ocurren desde las etapas iniciales del desarrollo larvario, afectan su apariencia externa, disminuyen su precio final en el mercado y representan un importante cuello de botella para la acuicultura. Entre los factores implicados en la aparición de los citados desórdenes, la nutrición lipídica es uno de los parámetros más importantes afectando a la esqueletogénesis y a la pigmentación. Un desequilibrio en los niveles de lípidos y/o ácidos grasos esenciales (AGE) puede conducir a un desarrollo anormal del esquelético y despigmentación. El objetivo de la presente tesis doctoral investigó el efecto de los lípidos y AGE (particularmente el ácido araquidónico, ARA) administrados en la dieta, sobre la esqueletogénesis y pigmentación en larvas del lenguado senegalés (Solea senegalensis), especie de pez plano producido en la península Ibérica, con alto precio en el mercado. El efecto de diferentes productos comerciales con distintos perfiles de ácidos grasos (AG) usados comúnmente para enriquecer Artemia, fue evaluado sobre el crecimiento, la maduración del sistema digestivo, la deposición de lípidos en diversos tejidos objetivos, la osificación y la incidencia de deformaciones esqueléticas en larvas de lenguado senegalés, trabajos que fueron completados con el estudio de la regulación molecular de dichos procesos durante el proceso de metamorfosis. Los efectos de los lípidos oxidados en la dieta también fueron evaluados sobre el crecimiento larvario, la actividad de enzimas antioxidantes, la deposición intestinal de lípidos, la osificación y la incidencia de deformidades esqueléticas en el lenguado senegalés. Finalmente, los efectos del ARA de la dieta sobre el crecimiento, la osificación, la incidencia de malformaciones esqueléticas y los desórdenes pigmentarios fueron evaluados y relacionados con las proporciones de prostaglandinas PGE2 y PGE3. La ontogenia de la pigmentación de la piel del lado ocular fue estudiada a nivel morfológico y molecular con el fin de detectar posibles alteraciones de un perfil normal de desarrollo de la pigmentación, mientras que la aparición del fenotipo pseudo-albino inducido nutricionalmente por un exceso de ARA fue también caracterizada., [eng]Skeletal deformities and pigmentary disorders, occurring from the early larval stages, affect the external appearance of fish, downgrade the market value of the final product and reduce the intensive production of flatfish juveniles. Among other factors, lipid nutrition is known to be involved in skeletogenesis and pigmentation, and unbalanced levels of lipids or essential fatty acids (EFA) or their inappropriate form of supply in the diet during larval development may lead to skeletal deformities and pigmentary disorders. This thesis aimed to study the role of dietary lipids and EFA in the incidence of skeletal and pigmentary disorders in Senegalese sole (Solea senegalensis), a flatfish of high market value produced in the Iberian Peninsula. In a first part, larvae were fed different commercial enriching products for Artemia metanauplii, presenting distinct FA profiles. Absolute levels of DHA, EPA and ARA of 9.5, 3.1 and 0.7% TFA, respectively, and n−3/n−6 PUFA, DHA/EPA, ARA/ DHA and OA/PUFA ratios of 5.2, 3.0, 0.1, 0.5, respectively, were recommended as more suitable for Senegalese sole growth performance, larval development and ossification, although the incidence of skeletal deformities was not significantly affected by the dietary FA composition. A variation, even slight, of these proportions might have modified the metabolism of lipids and disrupted the profile of lipid accumulation in the target tissues, leading to severe intestinal and hepatic steatosis and reduced larval growth and development. In a second part, larvae were fed increasing amounts of dietary peroxidized lipids (34.5 to 78.8 nmol MDA g-1 w.w.). Although no physiological alterations were detected on their FA profile, oxidative stress status, survival, growth performance, metamorphosis and ossification, fish seemed to activate antioxidant defense mechanisms in response to the dietary oxidative stress, through the consumption of the dietary vitamin E and the activation of antioxidant enzymes. Feeding fish with highly oxidized diets caused an increase of fat accumulation in the enterocytes and a reduction in bone mineralization. Vitamin E was suggested to interact with ossifying cartilage. In a third part, the effects of dietary arachidonic acid (ARA) on the incidence of skeletal malformations and pigmentary disorders were evaluated on Senegalese sole larvae. The amount of 4.5% TFA of ARA fed to larvae during the Artemia feeding period was optimal for proper growth and ossification, whereas 1 and 7.5% TFA of ARA led to imbalanced ARA/EPA and n-6/n-3 ratios that was suspected to disrupt the relative proportions of prostaglandins PGE2 and PGE3, and significantly delayed somatic growth and skeletal ossification. None of the dietary ARA contents affected the incidence of skeletal deformities in vertebral and caudal regions, but feeding larvae with high levels of dietary ARA (10.2% TFA in rotifer and 7.1% in Artemia metanauplii) during the pre-, pro- and/or post-metamorphosis induced an impaired eye migration in larvae, altered their head shape and cranial bone remodeling and induced malpigmentations. The ontogeny of the pigmentation of the ocular side skin at both morphological and molecular levels was studied in Senegalese sole larvae and the appearance of the ARA-induced pseudo-albino phenotype was characterized. A high “sensitivity window” to ARA-induced malpigmentation was identified during pre- and pro-metamorphosis stages, resulting in pseudo-albino specimens characterized by the absence of differentiation of post-metamorphic populations of chromatophores and the inhibition of the melanogenesis, reflected by the disrupted expression of genes involved in these processes (asip, pax3, cKit, mitf, tyr, trp1 and slc24a5). Supplying high ARA amounts to larvae altered their dietary ARA/EPA ratio and relative concentrations of PGE2 and PGE3, causing pigmentary disorders. This work provides helpful knowledge to understand how dietary lipids and EFA affect skeletogenesis and pigmentation processes, to improve actual Senegalese sole larval rearing and juveniles’ quality.

[spa] El epitelio intestinal forma una barrera que permite el paso de nutrientes pero restringe el de substancias potencialmente nocivas. La alteración de dicha función se relación a con enfermedades gastrointestinales como la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) en la que, además, la producción de eicosanoides en la mucosa intestinal se encuentra incrementada. Por ese motivo, el objetivo del presente trabajo ha sido investigar el papel de los eicosanoides producidos en la cascada del ácido araquidónico en la regulación de la función epitelial de barrera en un modelo intestinal de células Caco-2. La permeabilidad paracelular (PP) se ha estudiado en cultivos mantenidos sobre filtros, a partir de la determinación de la resistencia eléctrica transepitelial (TER) y de los flujos de dextrano. La concentración intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) se ha determinado por espectrofluorimetría, y la de AMPc así como la activación de NFkB por enzima inmuno ensayo. La fosforilación de la cadena ligera de miosina (MLC) se ha realizado por western blot y la localización de las proteínas de la unión estrecha (TJ) por inmunofluorescencia. Los resultados revelan que la PGE2, la PGE3, el LTD4 y los 5-, 12-(R)-, 12-(S)- y 15-HETE son capaces de romper la función barrera. En cambio, la PGD2, el LTB4, el 13-HODE, el 20-HETE, los 11,12- y 14,15-EET, los 11,12 y 14,15-DHETE y el 12-HEPE no tienen este efecto. La PGE2 y PGE3 incrementan la PP al interacciónar con los receptores EP1 y EP4 que a su vez activan la vía de la PLC-IP3-Ca2+ y la via del AMPc-PKA, respectivamente. En el caso de LTD4, se ha observado que el receptor implicado en la disrupción de la función barrera es el CysLT1R. En el caso del 5-HETE se ha descartado la participación de BLT1, BLT2, CysLT1R y CysLT2R. En el caso del LTD4 y 5-HETE, además de inducir un incremento de la [Ca2+]i, se ha demostrado la activación de la vía de la PLC-Ca2+/PKC y de la vía de la PKA independiente de AMPc y de NFkB. En el caso de 12-(R)-, 12-(S)- y 15-HETE también se ha observado un incremento de la [Ca2+]i pero no de AMPc, a excepción de 12-(S)-HETE que si que incrementa la concentración de AMPc. En todos los casos en los que un eicosanoide ha alterado la función epitelial de barrera se ha observado una relación entre el incremento de la PP y la redistribución hacia el citosol de las proteínas de la TJ ocludina y claudina-4, sin alteración de la localización de ZO-1, claudina-1 o claudina-2. Dichos eicosanoides, a excepción del 5-HETE, también incrementan la actividad de la MLCK provocando la desorganización del anillo de actina. A pesar de que la disrupción de la función epitelial de barrera observada en pacientes con IBD se ha atribuido tradicionalmente al efecto de citocinas proinflamatorias como TNF-α e IFN-γ, en la presente memoria se aportan evidencias del papel de los eicosanoides en la regulación de la PP. Además se aporta una posible explicación para los efectos negativos de la inhibición de la COX en pacientes con IBD y la posibilidad de nuevas estrategias terapéuticas. Si bien se ha descrito un efecto beneficioso del consumo de aceite de pescado o ácidos grasos n-3 en pacientes con IBD, este no puede ser atribuido a la reducción de la relación PGE2/PGE3 ya que ambas PG tienen un efecto negativo sobre la función epitelial de barrera. Sin embargo, dicho efecto sí que podría atribuirse a la generación de 12-HEPE que al contrario que 12-HETE no altera la PP., [eng] The intestinal epithelium forms a barrier that allows the passage of nutrients but restricts the passage of potentially harmful substances. Alteration of epithelial barrier function is the mechanism responsible for the persistence of inflammation that occurs in gastrointestinal diseases such as inflammatory bowel disease (IBD) in which various eicosanoids are increased in the mucosa. For this reason, the objective of this study was to investigate the role of eicosanoids produced by different pathways of AA metabolism in the regulation of epithelial barrier function in a Caco-2 cell model. The paracellular permeability (PP) was estimated in Caco-2 cell cultures from the transepithelial electrical resistance (TER) and dextran fluxes. Intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) was quantified by spectrofluorimetry, cAMP and NFkB levels by enzyme immunoassay, MLC phosphorylation by Western blot and the state of the tight junction (TJ) proteins by immunofluorescence. The results indicate that PGE2, PGE3, 5-, 12-(R)-, 12-(S)-, 15-HETE and LTD4 are able to increase PP, whereas no alteration is induced by 13-HODE, 20-HETE, 11,12- and 14,15-EET, 11,12- and 14,15-DHETE or 12-HEPE. PGE2 and PGE3 alter the barrier function through the interaction with EP1 and EP4 receptors that activate the PLC-IP3-Ca2+ pathway and the cAMP-PKA pathway, respectively. In the case of LTD4 and 5-HETE, along with an increase in [Ca2+]i there is an activation of PLC-Ca2+/PKC and PKA independent of cAMP and NFkB pathways. For 12- and 15-HETE we have also observed an increase in [Ca2+]i but not in cAMP, except for 12-(S)-HETE which did increase cAMP levels. From the study of the TJ protein immunolocalization, in all cases in which an eicosanoid has increased PP a redistribution of occludin and claudin-4 without altering ZO-1, claudin-1 or -2 can be observed. Furthermore, the alteration of the actin ring and the increase in MLCK activity has been observed in all the eicosanoids that increased PP except for 5-HETE. Although the disruption of epithelial barrier function observed in IBD patients has been traditionally attributed to the effect of proinflammatory cytokines such as TNF-α and IFN-γ, this thesis evidences a role for the eicosanoids in the regulation of PP, opening up possibilities for new therapeutic strategies.

El epitelio intestinal forma una barrera que permite el paso de nutrientes pero restringe el de substancias potencialmente nocivas. La alteración de dicha función se relación a con enfermedades gastrointestinales como la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) en la que, además, la producción de eicosanoides en la mucosa intestinal se encuentra incrementada. Por ese motivo, el objetivo del presente trabajo ha sido investigar el papel de los eicosanoides producidos en la cascada del ácido araquidónico en la regulación de la función epitelial de barrera en un modelo intestinal de células Caco-2. La permeabilidad paracelular (PP) se ha estudiado en cultivos mantenidos sobre filtros, a partir de la determinación de la resistencia eléctrica transepitelial (TER) y de los flujos de dextrano. La concentración intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) se ha determinado por espectrofluorimetría, y la de AMPc así como la activación de NFkB por enzima inmuno ensayo. La fosforilación de la cadena ligera de miosina (MLC) se ha realizado por western blot y la localización de las proteínas de la unión estrecha (TJ) por inmunofluorescencia. Los resultados revelan que la PGE2, la PGE3, el LTD4 y los 5-, 12-(R)-, 12-(S)- y 15-HETE son capaces de romper la función barrera. En cambio, la PGD2, el LTB4, el 13-HODE, el 20-HETE, los 11,12- y 14,15-EET, los 11,12 y 14,15-DHETE y el 12-HEPE no tienen este efecto. La PGE2 y PGE3 incrementan la PP al interacciónar con los receptores EP1 y EP4 que a su vez activan la vía de la PLC-IP3-Ca2+ y la via del AMPc-PKA, respectivamente. En el caso de LTD4, se ha observado que el receptor implicado en la disrupción de la función barrera es el CysLT1R. En el caso del 5-HETE se ha descartado la participación de BLT1, BLT2, CysLT1R y CysLT2R. En el caso del LTD4 y 5-HETE, además de inducir un incremento de la [Ca2+]i, se ha demostrado la activación de la vía de la PLC-Ca2+/PKC y de la vía de la PKA independiente de AMPc y de NFkB. En el caso de 12-(R)-, 12-(S)- y 15-HETE también se ha observado un incremento de la [Ca2+]i pero no de AMPc, a excepción de 12-(S)-HETE que si que incrementa la concentración de AMPc. En todos los casos en los que un eicosanoide ha alterado la función epitelial de barrera se ha observado una relación entre el incremento de la PP y la redistribución hacia el citosol de las proteínas de la TJ ocludina y claudina-4, sin alteración de la localización de ZO-1, claudina-1 o claudina-2. Dichos eicosanoides, a excepción del 5-HETE, también incrementan la actividad de la MLCK provocando la desorganización del anillo de actina. A pesar de que la disrupción de la función epitelial de barrera observada en pacientes con IBD se ha atribuido tradicionalmente al efecto de citocinas proinflamatorias como TNF-α e IFN-γ, en la presente memoria se aportan evidencias del papel de los eicosanoides en la regulación de la PP. Además se aporta una posible explicación para los efectos negativos de la inhibición de la COX en pacientes con IBD y la posibilidad de nuevas estrategias terapéuticas. Si bien se ha descrito un efecto beneficioso del consumo de aceite de pescado o ácidos grasos n-3 en pacientes con IBD, este no puede ser atribuido a la reducción de la relación PGE2/PGE3 ya que ambas PG tienen un efecto negativo sobre la función epitelial de barrera. Sin embargo, dicho efecto sí que podría atribuirse a la generación de 12-HEPE que al contrario que 12-HETE no altera la PP., The intestinal epithelium forms a barrier that allows the passage of nutrients but restricts the passage of potentially harmful substances. Alteration of epithelial barrier function is the mechanism responsible for the persistence of inflammation that occurs in gastrointestinal diseases such as inflammatory bowel disease (IBD) in which various eicosanoids are increased in the mucosa. For this reason, the objective of this study was to investigate the role of eicosanoids produced by different pathways of AA metabolism in the regulation of epithelial barrier function in a Caco-2 cell model. The paracellular permeability (PP) was estimated in Caco-2 cell cultures from the transepithelial electrical resistance (TER) and dextran fluxes. Intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) was quantified by spectrofluorimetry, cAMP and NFkB levels by enzyme immunoassay, MLC phosphorylation by Western blot and the state of the tight junction (TJ) proteins by immunofluorescence. The results indicate that PGE2, PGE3, 5-, 12-(R)-, 12-(S)-, 15-HETE and LTD4 are able to increase PP, whereas no alteration is induced by 13-HODE, 20-HETE, 11,12- and 14,15-EET, 11,12- and 14,15-DHETE or 12-HEPE. PGE2 and PGE3 alter the barrier function through the interaction with EP1 and EP4 receptors that activate the PLC-IP3-Ca2+ pathway and the cAMP-PKA pathway, respectively. In the case of LTD4 and 5-HETE, along with an increase in [Ca2+]i there is an activation of PLC-Ca2+/PKC and PKA independent of cAMP and NFkB pathways. For 12- and 15-HETE we have also observed an increase in [Ca2+]i but not in cAMP, except for 12-(S)-HETE which did increase cAMP levels. From the study of the TJ protein immunolocalization, in all cases in which an eicosanoid has increased PP a redistribution of occludin and claudin-4 without altering ZO-1, claudin-1 or -2 can be observed. Furthermore, the alteration of the actin ring and the increase in MLCK activity has been observed in all the eicosanoids that increased PP except for 5-HETE. Although the disruption of epithelial barrier function observed in IBD patients has been traditionally attributed to the effect of proinflammatory cytokines such as TNF-α and IFN-γ, this thesis evidences a role for the eicosanoids in the regulation of PP, opening up possibilities for new therapeutic strategies.

[spa] La hidratación de los oocitos de teleósteos marinos que producen huevos pelágicos es clave para la supervivencia de los embriones en el océano. Estudios previos han descu-bierto el papel de una acuaporina específica de teleósteos (Aqp1b) durante este proceso, pero se carece todavía de evidencias experimentales directas, así como información sobre la regulación molecular de la Aqp1ab. En la presente tesis, estudios iniciales con el fletan Atlántico (Hippoglossus hippoglossus) confirman que los parálogos aqp1aa y -1ab de teleósteos han surgido probablemente por duplicación génica en tándem, y han demostrado el papel esencial de la Aqp1ab durante la hidratación del oocito. Para investigar el control transcripcional del gen aqp1ab en los oocitos de la dorada (Sparus aurata) se ha aislado su región promotora, la cual contiene elementos cis-reguladores de unión al receptor nuclear de progestinas (Pgr), como la 17α,20β-dihidroxi-4-pregnen-3-ona (17,20β-P), y factores de transcripción Sox. Estudios de localización subcelular indican que el Pgr aparece en el citoplasma de las oogonias, así como en el núcleo de oocitos en crecimiento primario (pre-vitelogénicos) coincidiendo con la activación de la expresión de aqp1ab. En este estadio también se expresan cuatro isoformas diferentes del Pgr, dos de las cuales pueden inhibir la transcripción mediada por el Pgr de forma dominante negativa. Las oogonias también expresan sox3 y -8b, mientras que el sox9b aparece en el estadio de alveolo cortical, cuando se reduce la expresión de aqp1ab. Ex-perimentos de transactivación indican que el Pgr activa la transcripción de aqp1ab, con Sox3 y -8b actuando de forma sinérgica, mientras que el Sox9b reprime este mecanismo. El papel del Pgr se ha investigado sobre explantes ováricos pre-vitelogénicos incubados in vitro, lo cual ha demostrado que la 17,20β-P, producida en las células de la granulosa en respuesta a la hormona folículo estimulante, activa el promotor de aqp1ab en el oocito induciendo la síntesis de Aqp1ab. Los resultados de esta tesis revelan por primera vez una estricta regulación transcripcional del gen aqp1ab durante la oogénesis de teleósteos marinos, lo cual remarca la función fisiológica esencial de este canal de agua durante la formación de los huevos pelágicos, [eng] In marine teleosts that spawn pelagic eggs (pelagophils), the process of oocyte hydration that occurs during meiosis resumption is a key physiological process for the survival of the eggs in the ocean. Previous studies have discovered the role of a teleost-specific aquaporin water channel (Aqp1b) during fish oocyte hydration, but direct experimental evidence for the function of Aqp1b in oocytes is still lacking. In addition, the molecular regulation of the Aqp1b-mediated mechanism remains poorly understood. In this context, the main objectives of the present thesis were to investigate the evolutionary origin of aqp1ab in teleosts, to provide functional evidence of the role of Aqp1b during oocyte hydration, and to begin to dissect the molecular mechanisms involved in the transcriptional regulation of aqp1b in the oocyte of marine teleosts. By integrating the molecular phylogeny with synteny and structural analyses we show that the teleost aqp1aa and -1ab paralogs (previously annotated as aqp1a and -1b, respectively) arose by tandem duplication, and that the Aqp1ab C-terminus is the most rapidly evolving subdomain within the vertebrate aquaporin superfamily. The functional role of Aqp1ab was investigated in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus), a marine acanthomorph teleost that spawns one of the largest pelagic eggs known. Using immunological inhibition of Aqp1ab in halibut oocytes and artificial expression of the halibut paralog Aqp1aa, we demonstrate that Aqp1ab is required for full hydration of oocytes undergoing meiotic maturation. To investigate the aqp1ab transcriptional regulation in oocytes, we isolated the 5’-flanking region of the gilthead seabream (Sparus aurata) aqp1ab gene which contains regulatory cis-elements for the nuclear progestin receptor (Pgr) and SOX transcription factors. The Pgr, as well as sox3 and -8b transcripts, are co-expressed in seabream oo-gonia, whereas in primary growth oocytes, when aqp1ab mRNA and protein are synthesized, the Pgr is translocated into the nucleus. In contrast, sox9b is highly expressed in more advanced oocytes showing the depletion of aqp1ab transcripts. In the seabream, four different pgr transcript variants are expressed in primary growth ovaries which are generated by alternative pre-mRNA splicing. Seabream wild-type Pgr shows the highest transactivation response to progestins such as 17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one (17,20β-P) and 17α,20β,21-trihydroxy-4-pregnen-3-one (17,20β,21-P), whereas two of the N-terminally truncated Pgr isoforms regulate novel nuclear and cytosolic mechanisms of dominant-negative repression of Pgr-mediated transcription. Transactivation assays on the aqp1ab promoter demonstrated that aqp1ab transcription is dependent on wild-type Pgr, with Sox3 and -8b acting synergistically, while Sox9b acts as a repressor. Incubation of primary ovarian explants in vitro with 17,20β-P, followed by chromatin immunoprecipitation, confirmed that 17,20β-P-activated Pgr enhanced aqp1ab promoter activation. The production of 17,20β-P in seabream primary growth ovaries in vivo was consistent with the expression of P450c17-II (Cyp17a2) and 20β-hydroxysteroid dehydrogenase (Cbr1), enzymes needed for progestins synthesis, in granulosa cells associated with primary growth oocytes, and with a high concentration of 17,20β-P. Incubation of primary ovarian explants with recombinant piscine follicle-stimulating hormone (rFsh) in vitro stimulated 17,20β-P synthesis, which was reduced in the presence of Cbr1 inhibitors. The rFsh-mediated production of 17,20β-P correlated with the up-regulation of cyp17a2 and cbr1 transcription, as well as of wild-type pgr mRNA and protein levels. Altogether, these data suggest that aqp1ab transcription in seabream primary growth oocytes is under Fsh regulation through the synthesis of progestins. The results of this thesis show that the Aqp1ab mediated mechanism for oocyte hy-dration is likely conserved in marine teleosts. In addition, the tight transcriptional reg-ulation of Aqp1ab during oogenesis highlights the essential physiological role of this water channel and opens new research avenues for understanding the molecular basis of egg formation in marine fish.

[spa] Los tensioactivos son compuestos altamente versátiles con amplia utilización en la industria farmacéutica y cosmética. Aquellos derivados de aminoácidos presentan una baja toxicidad y elevada biodegradabilidad y, por lo tanto, tienen un abanico más amplio de aplicaciones y constituyen una alternativa a los tensioactivos sintéticos convencionales. En los últimos años, existe un interés creciente en la utilización de excipientes bioactivos con actividad lítica pHsensible en sistemas nanoestructurados, con el fin de aumentar la especificidad y eficacia de dichos vehículos para la liberación de fármacos en órganos o células dianas. En este trabajo se ha planteado estudiar dos grupos de tensioactivos derivados de lisina: tensioactivos aniónicos de doble cadena derivados de la N(α,)N(ε)-dioctanoil lisina y tensioactivos catiónicos de cadena simple derivados de la N(ε)-acil lisina o N(α)-acil lisina. En primer lugar, se ha procedido con el estudio de las propiedades de interacción de estos tensioactivos con membranas celulares en función del pH del medio, utilizando el eritrocito como modelo de membrana endosomal. Se ha demostrado que los tensioactivos aniónicos tienen actividad lítica pHdependiente independiente del contraión, mientras que las propiedades de los tensioactivos catiónicos dependen especialmente de la posición de la carga catiónica y, en menor medida, de la longitud de cadena alquílica. La actividad pH-sensible se atribuye a la presencia de la carga positiva en el grupo α-amino de la lisina, mientras que el aumento de la fluidez de la membrana y la pérdida de sus proteínas estructurales se han evidenciado como los mecanismos involucrados en el aumento de la lisis celular a pH ácidos. Una vez corroborado el potencial lítico pH-dependiente de los tensioactivos, se ha avanzado en el desarrollo, caracterización y estudio toxicológico de sistemas nanoestructurados conteniendo estos compuestos. En primer lugar, se han desarrollado nanovesículas lipídicas con los tensioactivos catiónicos y se ha procedido con el estudio de sus efectos tóxicos en células representativas de la piel, como propuesta de su potencial aplicación en formulaciones de administración tópica. Se han observado efectos citotóxicos moderados, respuesta inflamatoria leve y ausencia de fototoxicidad. A continuación, se han llevado a cabo estudios de los mecanismos involucrados en la toxicidad de las nanovesículas, además de la evaluación de su capacidad de internalización celular. Se ha propuesto que el estrés oxidativo, la disfunción mitocondrial y la apoptosis son los principales mecanismos involucrados en la toxicidad. Por otra parte, los estudios de internalización celular y estabilidad endosomal han mostrado la capacidad de las nanovesículas que contienen los tensioactivos con carga positiva en el grupo α-amino de la lisina para romper la membrana de los endosomas, lo que corrobora su actividad pH-dependiente. Por último, se han desarrollado nanopartículas poliméricas incluyendo el tensioactivo aniónico 77KL como excipiente pH-sensible. Se ha encapsulado el fármaco antitumoral metotrexato y se ha demostrado su mayor actividad en inhibir la proliferación de las células tumorales en comparación con el fármaco libre no encapsulado. Este hecho se atribuye, especialmente, a la actividad pH-dependiente de las nanopartículas. Tras la internalización y liberación específica del fármaco a nivel intracelular, la inhibición del ciclo celular, la apoptosis y, en menor medida, el daño mitocondrial y lisosomal, se han demostrado como los mecanismos involucrados en la actividad antitumoral del metotrexato encapsulado en las nanopartículas. En conclusión, es importante destacar que el desarrollo de vehículos con actividad pHdependiente es una propuesta interesante para mejorar la liberación intracelular de fármacos y para aumentar sus efectos terapéuticos. Por lo tanto, se considera que los tensioactivos derivados de lisina estudiados en esta Tesis son potenciales excipientes bioactivos en formulaciones nanoestructuradas. Del mismo modo, los métodos in vitro utilizados se mostraron eficaces en demostrar los mecanismos involucrados en los efectos tóxicos de los nanomateriales., [eng] Surfactants are among the most versatile and widely applied excipients in cosmetics and pharmaceuticals. Amino acid-based surfactants, which have this versatility together with biocompatibility, low toxicity and pH-responsive membrane-disruptive activity, could be potential bioactive excipients in intracellular drug delivery systems. In this line, five anionic and three cationic lysine-based surfactants were studied concerning their pH-dependent properties using the erythrocyte as a model of endosomal membrane. All the anionic surfactants showed pH-sensitive activity independently on the counterion, whereas among the cationic amphiphiles, only those with the positive charge on the α-amino group of lysine displayed membrane-lytic activity dependent on the pH. Thereafter, these amphiphiles were applied in the development of pH-sensitive nanocarriers. The cationic surfactants were included in lipid-based nanovesicles, while the anionic compound 77KL was used for the preparation of methotrexate-loaded chitosan nanoparticles. It was assessed whether the cationic compounds increase the likelihood of intracellular delivery and modulate the toxicity of the nanovesicles, as a proposal for their potencial intravenous application. Due to increasing concern over animal use, in vitro alternative methods were used for all studies. The induction of mitochondrial dysfunction, oxidative stress and apoptosis were the general mechanisms underlying cytotoxicity. Fluorescence microscopy analysis demonstrated that nanovesicles were internalized by cells, and evidenced that their ability to release endocytosed materials into cell cytoplasm depends on the structural parameters of amphiphiles. Moreover, the cytotoxicity of nanovesicles was evaluated using representative skin cell lines, and the wide range of in vitro assays proved the applicability of these nanocarriers for topical administration. On the other hand, the pH-sensitive behavior of nanoparticles containing 77KL allowed accelerated release of methotrexate in an acidic medium, as well as membrane-lytic pH-dependent activity, which facilitated the cytosolic delivery of endocytosed materials. Besides, our results clearly proved that the drug encapsulated into the nanoparticles were more active against the tumor cells than the free drug. Altogether, these studies showed that the design of nanocarriers containing pHsensitive surfactants as bioactive excipients for endosome disruption is a promise approach for intracellular drug delivery and increased therapeutic effects. Furthermore, the insights into some toxicity mechanisms of these new nanomaterials contribute to reducing the uncertainty surrounding their potential health hazards.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca de l'Hospital Universitari Vall d'Hebron - Grup d'Immunologia / CIBBM-Nanomedicina, [eng] The main goal of this thesis was to investigate the function of the endogenous CD300f. Initially, CD300f was described as an inhibitory receptor, although some data generated in our lab strongly suggested the possibility that the receptor could trigger activating signals in specific situations. It was planned to use two monoclonal antibodies (UPD1 and UPD2), that recognize the extracellular domain of CD300f in order to analyze the function of the endogenous CD300f. However, extracellular domain of CD300f has a high homology with the extracellular domain of CD300d, a new member of the CD300 family receptors. Thus, it was essential to check if UPD1 and/or UPD2 cross-reacted with CD300d. Unexpectedly, CD300d was unable to reach the cell surface in transfected cells, so it was not possible to check if the antibodies recognize it. That result prompted us to further investigate and characterize the CD300d receptor. Finally, the cloning and characterization of CD300d has contributed to complete the description of the human CD300 locus. Concretely, the CD300d gene spans a 12.5 kb region on chromosome 17 (position 17q25.1), has an open reading frame of 585 bp and encodes for a type I transmembrane protein of 194 amino acids. The molecule is composed by an immunoglobulin-like extracellular domain, a transmembrane domain containing a negative charged residue and a short cytoplasmic tail without known signaling motifs. CD300d has a predicted molecular mass of 21.5kDa, however presents two distinct mature forms of 30 and 34 KDa in transfected COS-7 cells. Both conformations are posttranslationally modified by N-glycosylations in the Ig domain. The CD300d receptor is expressed by primary monocytes and granulocytes. Conversely, T, B or NK lymphocytes do not express the receptor. Unpredictably, CD300d is retained in the endoplasmic reticulum of transfected cells. Even so, the interaction with the FcR-gamma adapter permits a slight surface recovery of the receptor in COS-7 cells but not in RBL-2H3 cells. In addition, CD300d is able to interact in vitro with the rest of known CD300 family receptors, with the exception of CD300c. Therefore, CD300d could play a role in the formation of CD300 complexes on the cell surface and consequently could modulate the state of activation of myeloid cells. The CD300d and CD300f immunoglobulin domains present a 71% of identity. Nevertheless, UPD1 and UPD2 mAb recognize exclusively the CD300f receptor. Surprisingly, the stimulation of the endogenous CD300f receptor induces the production of TNF pro-inflammatory cytokine in primary monocytes, giving support to the dual activity of the receptor, initially described as inhibitor. Furthermore, crosslinking of endogenous CD300f, in PMA differentiated U937 or THP-1 monocytic cells, induce the production of TNF-alpha and IL-1-beta pro-inflammatory cytokines. The activating functions of the CD300f could be mediated through its association with FcR-gamma and/or DAP12 adapter molecules, proved in vitro. The binding involves the transmembrane charged residue of the adapters and the transmembrane domain of the receptor. The expression of endogenous FcR-gamma nd DAP12 adapter molecules was upregulated, in U937 and THP-1 cells. In addition Syk kinase, JNK kinase and PKC-delta are involved in the activating signaling mediated by CD300f. Altogether, supports the functional association of FcR-gamma and/or DAP12 with the CD300f receptor. Finally, we prove the existence of soluble forms of the CD300f receptor., [cat] L'objectiu principal d’aquesta tesis era investigar la funció del receptor CD300f endogen. Inicialment, el CD300f es va descriure com a receptor inhibidor, tot i que alguns resultants del nostre laboratori suggerien la possibilitat que el receptor podia desencadenar respostes cel•lulars activadores en algunes circumstàncies. Amb el propòsit d’estudiar la funció del receptor CD300f endògen, es va decidir usar dos anticossos monoclonals (UPD1 i UPD2), que tenien la capacitat de reconèixer el domini extracel•lular del CD300f. Ambdós anticossos es varen obtenir en el nostre laboratori anteriorment, amb l’objectiu de permetre caracteritzar el receptor CD300f; varen ser seleccionats segons la seva capacitat per reconèixer el CD300f i no cross-reaccionar amb la resta de molècules CD300 conegudes fins al moment (CD300a, CD300b, CD300c i CD300e). Tot i així, poc temps abans de començar a treballar en aquesta tesis, en el laboratori s’havia clonat un nou membre de la família CD300, anomenat CD300d. Així doncs era necessari comprovar si els anticossos UPD1 o UPD2 cross-reaccionaven amb aquest nou membre de la família. Malauradament, el receptor CD300d era incapaç d’expressar-se a la membrana de cèl•lules transfectades, així doncs no era possible verificar si els anticossos el reconeixien. Aquest resultat ens va portar a investigar en més profunditat el CD300d. Finalment, el clonatge i caracterització del receptor CD300d ha contribuït a la descripció del locus humà CD300, que conté sis membres (del CD300a al CD300f) i ocupa una regió de 450 Kb en el cromosoma 17. Es va poder confirmar que els anticossos UPD1 i UPD2 reconeixien específicament el CD300f i no el CD300d. Sorprenentment, es va demostrar que l’estimulació del receptor CD300f endògen en monocits primaris o les línies monocítiques U937 i THP-1 generaven una resposta pro-inflamatòria. En referència al receptor CD300d es va observar que no s’expresa a nivell de membrana cel•lular sinó que era retingut al reticle endoplasmàtic, indicant que la seva funció biològica podria ser la de regular l’expressió superficial de la resta de membres de la família CD300.

[spa] En el presente trabajo de tesis doctoral se presenta y describe por primera vez el comportamiento reproductivo del lenguado senegalés (Solea senegalensis) de origen salvaje mantenido en cautividad, trabajando con un total de 15 cortejos. El cortejo del lenguado senegalés se inicia mediante una serie de contactos entre machos y hembras, seguido de una serie de comportamientos de tipo competitivo observados exclusivamente en los machos. Posteriormente un macho centra su atención sobre una determinada hembra, apoyando su cabeza sobre la zona dorsal, la aleta caudal y la gónada de la hembra, hasta que ésta comienza a nadar, momento en el que el macho se sitúa debajo de ella. A continuación ambos individuos nadan de forma sincronizada hacia la superficie, y tras unos segundos comienzan a liberar los gametos. Los comportamientos considerados como más relevantes en el estudio del cortejo se han denominado: “apoyar la cabeza”, “temblor”, “seguir a”, “seguido por”, “separarse”, “quieto”, “nadar solo”, “quieto con acciones sobre el”. Además de la descripción del comportamiento reproductivo de los lenguados salvajes, en este trabajo se han estudiado otros grupos de peces: la primera generación de lenguados criados en cautividad G1, mezcla de G1 y salvajes (machos salvajes–hembras G1 y machos G1-hembras salvajes) y G1 sometidos a inducción hormonal a fin de estudiar la existencia o no de comportamientos similares a los descritos previamente de lenguados salvajes. Como resultado de dichos estudios se ha podido establecer por primera vez que el problema reproductivo de los lenguados G1 es de naturaleza comportamental y se ha descrito la ausencia de comportamiento reproductivo en los lenguados nacidos y criados en cautividad (G1). Se ha descrito la ausencia total de una serie de comportamientos imprescindibles para el cortejo del lenguado como “seguir a”, “seguido por”, la incitación de apoyar la cabeza y todos los pasos posteriores del cortejo. Sin embargo sí que se pudo observar y describir un comportamiento reproductivo normal en grupos mezcla de machos salvajes y hembras G1, con la descripción de 2 cortejos completos en este grupo tan solo 3 meses después de su formación, obteniendo un total de 30 ml de huevos flotantes con un 50% de fecundación, lo que a pesar de ser valores bajos, demuestra que con esta composición de individuos no hay disfunción reproductiva, lo que centra el problema en los machos G1. En los ensayos de inducción hormonal de lenguados G1, usando distintos tipos de hormonas, hormona liberadora de gonadotrofina (GnRH), gonadotrofina coriónica humana (HCG), y prostaglandina (PGF2α) se observó también una ausencia total de cortejo y/o de los comportamientos asociados, observándose incluso una menor actividad en los animales inducidos. Considerando el nulo efecto de las hormonas exógenas (GnRH, HCG y PGF2α), para inducir el comportamiento reproductivo normal bajo condiciones experimentales del presente estudio, se examinaron a continuación las posibles vías de comunicación química implicadas en el control del comportamiento reproductivo. Mediante el uso del electroolfatograma, se estudió el efecto de una serie de sustancias/aromas a la hora de inducir una respuesta en individuos juveniles de lenguado. Así se pudo observar que orina y heces produjeron un aumento estadísticamente significativo de respuesta mediante la cual los juveniles podían distinguir no sólo el sexo (P, [eng] The present doctoral thesis has described for the first time the reproductive behaviour of wild Senegalese sole (Solea senegalensis) held in captivity based on a total of 15 observed courtships. Senegalese sole courtship was initiated with a series of contacts between males and females followed by a series of competitive type behaviours observed exclusively between males. After these behaviours a male focused on a particular female, resting his head on the dorsal area, caudal fin and ovary, until the female began to swim, at which time the male would situate below the female. The male and female then swam in synchrony to the surface and after a few seconds began to release the gametes. The behaviours considered most relevant to the courtship were named "support the head," "trembling", "follow", "followed by", "separate", "still", "swim alone," and "stay quiet with actions on it". In addition to the description of the reproductive behaviour of wild sole, the present thesis has studied other groups of fish: the first generation of captive-bred G1 sole, mixed G1 and wild (wild males with G1 females and G1 males with wild females) and G1 fish that were induced with hormones, all with the aim to study the existence or not of behaviours similar to those previously described for wild Senegalese sole. These studies established for the first time that the reproductive problem of G1 Senegalese sole was based in behavioural aspects and in particular the complete absence of reproductive behaviour in the Senegalese sole hatched and reared in captivity (G1). A number of behaviours essential for Senegalese sole courtship were absent, including "follow", "followed by" incidence of support the head and all the subsequent steps of courtship. However, normal reproductive behaviour was observed and described in the mixed group wild males and G1 females, with the description of two complete courtship sequences only 3 months after the mixed group was formed. This mixed group produced a total of 30 ml of floating eggs with 50% fertilization, which despite being low values demonstrated that this mix of organs (G1 females and wild males) did not exhibit total reproductive dysfunction and, therefore, focused the problem in G1 males. In trials with hormonal induction of G1 Senegalese sole, using different types of hormones, gonadotropin-releasing hormone (GnRH), human chorionic gonadotropin (HCG) and prostaglandin (PGF2a), there again was a complete absence of courtship and / or associated behaviours, with a reduction in activity in the induced animals. Considering the null effect of exogenous hormones (GnRH, HCG and PGF2a), under the present experimental conditions to induce normal reproductive behaviour, a study was undertaken to examine the possible pathways of chemical communication involved in the control of behaviour. The electroolfatograma was used to study the effect of a number of substances / aromas for inducing a response in individual juvenile Senegalese sole. Thus it was observed that urine and faeces produced a significant increase (P = 0.05) in response by which juveniles could distinguish not only sex but also gonadal maturity (P

El incremento de la esperanza de vida ha dado lugar a un aumento de las enfermedades relacionadas con la edad y un mayor número de personas dependientes. El objetivo principal de nuestro estudio fue determinar si el ejercicio físico espontáneo realizado durante toda la vida afecta a la longevidad y al retraso de la fragilidad en un modelo murino. Nuestro principal problema ha sido la falta de una prueba de fragilidad en animales de experimentación. Hemos desarrollado una prueba para determinar la fragilidad en ratones, que hemos denominado el “Valencia Test”. Utilizamos ratones C57BL/6J machos, estabulados individualmente y asignados de manera aleatoria a uno de los siguientes grupos: Sedentario(n=72) y Ejercicio espontáneo(n=72). Se comparó una vida sedentaria frente a una vida activa en términos de longevidad y aplicamos el “Valencia Test” para cuantificar la fragilidad mediante la evaluación de la pérdida no intencional de peso, fatiga y lentitud de la marcha, la debilidad y la baja actividad física. Los animales sedentarios se convertían en frágiles a medida que envejecían. A pesar de que realizar ejercicio espontáneo durante toda la vida no prolonga la longevidad, sí que observamos una significativa prevención de la fragilidad. Esta mejora se acompañó de un aumento significativo en la biogénesis mitocondrial en el músculo esquelético y en los niveles del Factor Neurotrófico Derivado del Cerebro(BDNF) en el cerebro de los ratones. Los radicales libres juegan un importante papel en el envejecimiento. En nuestro estudio el envejecimiento se asoció a un aumento en la peroxidación lipídica en plasma determinada mediante la cuantificación de los niveles de malondialdehído(MDA). Este ejercicio no previno el aumento, asociado al envejecimiento, en el estrés oxidativo. El estado antioxidante de un individuo puede ser importante en la determinación de la aparición de enfermedades dependientes de la edad y en el mantenimiento de la salud. Nos planteamos estudiar la inducción de dos genes de longevidad, la enzima antioxidante Manganeso Superóxido Dismutasa(Mn-SOD) y la Glutatión Peroxidasa(GPx) mediante: la RT-PCR y la determinación de sus actividades enzimáticas. Encontramos un aumento en la actividad de las dos enzimas antioxidantes a medida que los ratones envejecían, en ambos grupos. Los ratones corredores mostraron un aumento significativo en la actividad de la Mn-SOD en el último periodo estudiado (28 meses). Finalmente se estudió el perfil metabólico en plasma en ratones de 20 meses de edad mediante la Resonancia Magnética Nuclear. El ejercicio espontáneo se asoció con diferencias significativas en el metaboloma circulante. El lactato, la alanina y la glucosa en plasma fueron menores en los ratones que tenían libre acceso a la rueda de correr con respecto a los ratones sedentarios. Por el contrario, el glicerol, el citrato y los ácidos grasos fueron más altos en el plasma de los ratones activos en comparación con los ratones inactivos. Estas diferencias indican una mejor salud metabólica en el grupo activo que en los roedores inactivos. Nuestros resultados muestran que el ejercicio físico espontáneo durante toda la vida es una intervención muy prometedora para la modulación de la calidad de vida. The increase in life expectancy has resulted in an increase in age-related diseases and a larger number of dependent people. The major aim of our study was to determine whether life-long spontaneous exercise affects lifespan and the retardation of frailty in mice. Our major problem was the lack of a frailty test in experimental animals. Thus, we had to develop a new test to determine frailty in mice that we have termed the "Valencia Test”. Male C57BL/6J mice, individually caged, were randomly assigned to one of two groups, sedentary (n=72) or spontaneous wheel-runners (n=72). We compared the sedentary vs active lifestyle in terms of longevity and developed the "Valencia Test" to quantify frailty by evaluating unintentional weight loss, exhaustion and slowness, weakness, and low physical activity. Sedentary animals became frail as they aged. Although life-long spontaneous exercise did not prolong longevity, it prevented frailty. This improvement was accompanied by a significant increase in the mitochondrial biogenesis cell signaling pathway in skeletal muscle and the levels of the Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) in the brain. Free radicals have a role in causing aging. In our study, aging was associated with a significant increase in plasma lipid peroxidation determined as malondialdehyde (MDA). Spontaneous wheel-running did not prevent the aging-associated increase in oxidative stress. The antioxidant status of an individual can be important in determining the frequency of age-dependent diseases and the duration of general health maintenance. Thus, we also aimed to study the induction of two well-known longevity genes, the antioxidant enzymes manganese superoxide dismutase and glutathione peroxidase. For this purpose we used two different approaches: RT-PCR and the determination of their enzymatic activities. We found an increase in the activity of the antioxidant enzymes as mice grew older in both experimental groups. Those mice that had free access to the running-wheels showed a significant increase in the Mn-SOD activity during the last period of time studied (28 month-old). Finally, we studied the effect of spontaneous wheel-running on plasma metabolic profile in 20 month-old mice using nuclear magnetic resonance. Life-long spontaneous exercise was associated with significant differences in the circulating metabolome. Lactate, alanine, and glucose were lower in those mice that had free access to the running wheels than in the sedentary mice. On the contrary, plasma glycerol, citrate and fatty acids were higher in the plasma of the active mice when compared to the inactive ones. These differences indicate a better metabolic health in the physically active than in inactive mice. A concern of health providers is whether increasing longevity will increase disability and health costs. Thus, maximizing health span and preventing dysfunction are at least as important, as extending lifespan. Our results show that spontaneous exercise is a very promising intervention for the modulation of healthspan.

La enfermedad de Alzheimer (EA) no tiene una etiología perfectamente definida. Una de las teorías que se barajan como causa de la EA es la del péptido β-amiloide (βA). Esta molécula es neurotóxica y es capaz de producir estrés oxidativo. Se forma principalmente en el cerebro y se acumula formando placas extracelulares. Se ha sugerido que el βA es el eje principal de la EA, y por tanto que a partir de esta molécula se desencadenan todos los procesos asociados a la EA, lo que se ha llamado la cascada amiloidea. Otra de las hipótesis es la que la relaciona con el estrés oxidativo. Este factor sería el agente que realmente provoca toda la serie de cambios descritos en los tejidos nerviosos, a través de las moléculas relacionadas con la EA, como el βA. La acumulación progresiva del daño oxidativo a lo largo de los años podría explicar que sea una enfermedad asociada al envejecimiento. El hígado tiene, entre otras, la función de servir como un agente detoxificante de la sangre, por lo que será muy importante para eliminar restos nocivos que se encuentren en el sistema sanguíneo, como el βA característico de esta patología neurológica. El βA puede llegar a la sangre por mediación del transportador LRP-1, que lo saca del cerebro a la sangre, y desde aquí lo introduce en el hígado. El transportador RAGE tiene la particularidad de que es capaz de sacarlo de la sangre e introducirlo de nuevo en el cerebro. Por evidentes razones éticas no es posible realizar ciertos estudios en humanos, como el análisis de órganos, por lo que se emplean modelos animales. El modelo elegido por nuestro grupo de investigación es el ratón transgénico APPswe/PS1dE9 para la EA, porque es un modelo que desarrolla particularidades de la patología asociada a la EA en humanos, como es el depósito y posterior aparición de las placas de βA en el ratón. El objetivo principal de la presente tesis es estudiar el estrés oxidativo hepático y los efectos del tratamiento con bexaroteno y/o genisteína asociados a la enfermedad de Alzheimer en un modelo animal. En la 1ª parte de esta tesis hemos analizado la relación entre el cerebro y el hígado. Trabajamos con machos y hembras wild type y APP/PS1 de diferentes edades, 3-5 meses, 10-13 meses y más de 20 meses, para ver la evolución de la patología asociada. Hemos analizado parámetros de estrés oxidativo en hígado, como la tasa de producción de peróxido de hidrógeno mitocondrial, oxidación proteica (medida como carbonilación), y lipoperoxidación (medida como malondialdehído). Para determinar esta relación medimos los transportadores LRP1, tanto en hígado como en cerebro, y RAGE solo en cerebro. También hemos determinado la concentración de βA en sangre. Los resultados muestran cómo en los ratones APP/PS1 disminuyen los diferentes parámetros de estrés oxidativo en hígado con la edad, mientras que la concentración de βA en sangre aumenta. Trabajamos con la hipótesis de que el hígado está detoxificando el βA y en este proceso está generando radicales libres. Esta capacidad de degradación disminuiría progresivamente con la edad, lo que explicaría por qué hay menos estrés oxidativo y más βA. Los resultados muestran que el transportador RAGE no cambia entre los diferentes grupos. Respecto al LRP1, disminuye con la edad en cerebro en ratones wild type y APP/PS1. En hígado disminuye con la edad solo en APP/PS1, y vemos que hay más en el ratón APP/PS1 que en el wild type en las edades de 3-5 meses y 10-13 meses. En resumen, vemos que el βA se forma en el cerebro, que es capaz de salir a la circulación sistémica por mediación del LRP1, en mayor medida en edades jóvenes. A pesar de esto vemos que hay un mayor nivel en sangre en el animal viejo. Puede volver al cerebro por mediación del RAGE, pero no parece ser importante ya que no hay cambios en las edades estudiadas. La diferencia fundamental viene en el flujo hacia el hígado. En el animal joven hay un flujo mucho mayor que en el viejo, al haber más βA, también se degradará en mayor medida y provocará los cambios en el estrés oxidativo. El estudio del mecanismo de aclaramiento cerebral del βA nos llevó a interesarnos por elementos que sean capaces de contribuir a este proceso. Al disminuir la patología amiloidea asociada a la EA, se espera contribuir a la mejora de los síntomas de la enfermedad. Recientemente se ha publicado un innovador tratamiento para la EA, que parece tener un efecto positivo al menos en modelos animales. Este tratamiento consiste en la administración de bexaroteno, que es un medicamento usado en el tratamiento del linfoma cutáneo. La particularidad que lo relaciona con la EA se da por 2 vías. Por un lado incrementa la fagocitosis del βA por la microglía. Por otro se une al dímero RXR-PPARg, lo que va a hacer que se sobreexprese la apolipoproteína E (apoE), que mediará la degradación del péptido del cerebro. Hace unos años nuestro grupo publicó que la genisteína incrementa los niveles de PPARg. Por tanto, pensamos que si la administración de este fitoestrógeno aumenta la disponibilidad del factor de transcripción puede incrementar la eficacia del fármaco. A parte de este efecto, la genisteína por sí sola puede tener efectos antioxidantes y neuroprotectores muy beneficiosos para la EA. En la 2ª parte de esta tesis, para probar un nuevo tratamiento para la EA diseñamos un experimento en el que hemos usado hembras ovariectomizadas, ya que la EA tiene una incidencia mayor en hembras a partir de la menopausia. Solo hemos usado APP/PS1 porque lo que nos interesa es el posible aclaramiento cerebral de βA. Usamos ratones de 8 meses porque a esta edad ya presentan placas de βA. Hemos determinado los niveles de βA en cerebro y sangre, las placas amiloideas en cerebro, y los niveles de PPARg y apoE en cerebro. También los niveles de transaminasas en sangre. Se ovariectomizó los animales al principio del experimento. Los tratamientos administrados son los siguientes: • Control con agua. • Genisteína durante todo el experimento a la concentración de 0,022 mg/kg/día. • Bexaroteno durante 3 días a la concentración de 100 mg/kg/día. • Tratamiento conjunto, primero con genisteína durante 3 días para que sobreexprese PPARg, y durante 3 días más con bexaroteno. Al medir los niveles de βA en cerebro se ve que los tratamientos reducen la patología amiloidea. Incluso se aprecia un cierto efecto sinérgico en el tratamiento conjunto. En conclusión podemos decir que el transportador LRP1 disminuye con el envejecimiento en cerebro e hígado. Ello hace que el flujo de βA que entra al hígado sea menor, y por tanto se degradará en menor medida y disminuirá el estrés oxidativo hepático con la edad. Los tratamientos con bexaroteno y/o genisteína son efectivos para reducir la patología amiloidea, en el modelo animal APP/PS1 para la enfermedad de Alzheimer. The etiology of Alzheimer's disease (AD) is not clearly defined, but one theory under consideration is that the cause of AD is amyloid β peptide (AB). This molecule is neurotoxic and is able to produce oxidative stress. It is produced mainly in the brain and forms extracellular plaques. It has been suggested that AB is the main cause of AD, that this molecule triggers all the processes associated with the AD; this has been called the amyloid cascade hypothesis. Another hypothesis is related to oxidative stress. This factor could be the agent that actually causes the entire series of changes described in the nervous tissues, through related molecules like AB. Progressive accumulation of oxidative damage over the years could explain why this disease is associated with aging. The liver has, inter alia, the function of serving as a detoxifying agent of the blood. It is very important to remove harmful residues that are in the bloodstream, such as the AB characteristic from this neurological pathology. It can reach the bloodstream by means of transporter LRP-1, driving it out of the brain into the blood and from there it enters the liver. The transporter RAGE is able to get AB out of the blood and put it back into the brain. For obvious ethical reasons it is not possible to perform certain human studies, such as analysis of organs, so we used an animal model. The model chosen by our research group was AD transgenic mice APPswe/PS1dE9, because it develops characteristics of the pathology associated with AD in humans, such as the deposition and subsequent emergence of AB plaques. The main objective of this thesis is to study hepatic oxidative stress and the effects of treatment with bexarotene and/or genistein associated with Alzheimer’s disease in an animal model. In the first part of this thesis we analyzed the relationship between the brain and the liver. We worked with male and female wild type and APP/PS1 mice of different ages, 3-5 months, 10-13 months, and over 20 months to see the evolution of the associated pathology. We analyzed parameters of oxidative stress in the liver, like the mitochondrial rate of hydrogen peroxide production, protein oxidation (measured as carbonylation) and lipid peroxidation (measured as malondialdehyde). To determine this relationship we measured transporter LRP1 in both liver and brain, and RAGE only in brain. We also determined the concentration of blood AB. The results show how in APP/PS1 mice the different oxidative stress parameters decrease in liver with age, whereas AB concentration in blood increases. We work with the hypothesis that the liver detoxifies AB and in this process generates free radicals. This ability to degrade may progressively decrease with age, which could explain why there is less oxidative stress and more AB. The brain results show that RAGE does not change in the different groups, but LRP1 decreases with age in wild type and APP/PS1 mice. In liver it decreases with age only in APP/PS1 mice, and we saw more in the APP/PS1 than in the wild type mice at the age of 3-5 months and 10-13 months. In summary, we found that AB is formed in the brain, and can enter the systemic circulation by means of LRP1, more so at younger ages. Despite this we saw that there is an increased blood level in the older animal. AB can return to the brain by means of RAGE, but this may not be important since there was no change at any of the ages studied. The fundamental difference is in the AB flow to the liver. In the young animal there is a much greater flow than in the old, as it has more AB and undergoes further degradation thereby causing the changes in oxidative stress. The study of the brain AB clearance mechanism led us to be interested in items that may contribute to this process. Decreasing the amyloid pathology associated with AD was expected to contribute to the improvement of the symptoms of the disease. There is a recent publication for an innovative treatment for AD, which seems to have a positive effect, at least in animal models. This treatment involves the administration of bexarotene, a drug used in the treatment of cutaneous lymphoma. The characteristic that relates it to AD is manifested in two ways. On the one hand it enhances AB phagocytosis by microglia. On the other side it binds to the RXR-PPARg dimer, which will make overexpressing apolipoprotein E (apoE), which mediates the degradation of AB. A few years ago our group reported that genistein increased PPARg levels. Therefore, we believe that if this phytoestrogen administration increases the availability of the transcription factor, it can increase the effectiveness of the drug. Apart from this effect, genistein alone may have antioxidant and neuroprotective effects on AD. In the second part of this thesis, in order to test a new treatment for AD, we designed an experiment in which we used ovariectomized females, because there is a higher incidence of AD in females after menopause. We have only used APP/PS1 because what interests us is the possible brain AB clearance. We used eight-month-old mice because at this age they already have AB plaques. We determined AB levels in brain and blood, amyloid plaques in the brain, and PPARg and apoE levels in brain, as well as transaminase levels in blood. Ovariectomy was performed at the beginning of the experiment. The treatment provided was: • Control group with water. • Genistein group throughout the experiment at a concentration of 0.022 mg/kg/day. • Bexarotene group for 3 days at the concentration of 100 mg/kg/day. • Combination treatment group, first with genistein for 3 days to overexpress PPARg, and then bexarotene for 3 days, at the same concentration that the other groups. AB levels in brain showed that the treatment was effective reducing amyloid pathology. We even saw a synergistic effect in the combination treatment group. In conclusion, we can say that transporter LRP1 decreases with aging in brain and liver. This makes the AB flow that enters the liver decrease with aging, and therefore there is less degradation and reduces hepatic oxidative stress with aging. Treatment with bexarotene and/or genistein is effective in reducing amyloid pathology in the APP/PS1 animal model for AD.

Aunque la causa exacta de la enfermedad de Crohn (EC) es desconocida, la teoría más aceptada es que se produce por la activación inadecuada y perpetuada del sistema inmune frente a un patógeno intraluminal, probablemente la propia flora bacteriana comensal, que acontece en sujetos genéticamente predispuestos. El mecanismo específico que provoca el daño en la mucosa sigue siendo desconocido, sin embargo en los últimos años se ha implicado al estrés oxidativo como un posible factor en la etiopatogenia de la enfermedad. Se ha descrito un aumento de daño oxidativo así como un desequilibrio en las defensas antioxidantes. Objetivos: Caracterizar la producción basal y estimulada de especies reactivas de oxígeno (ERO) en las células inmunes de sangre periférica (CMSP) de los pacientes con EC, así como el estado de las enzimas antioxidantes (EAOs) y la presencia de daño oxidativo. En el presente trabajo se ha analizado el estado de las principales EAOs (catalasa (CAT), superóxido dismutasa manganeso (SOD-Mn) y SOD cobre-zinc (SOD-Cu/Zn) y glutation peroxidasa (GPx) a diferentes niveles (actividad, expresión de ARNm y concentración de proteína) en las CMSP de pacientes con EC. Se ha analizado también si existe alguna mutación (polimorfismo genético (SNPs)) que limite la actividad de las EAO y otros genes relacionados con la EC. La función mitocondrial ha sido analizada como posible origen de la producción de ERO. Además se ha relacionado la actividad de las EAOs con la capacidad apoptótica de los linfocitos T en sangre periférica de pacientes con EC. Métodos: Se obtuvieron muestras de sangre periférica de pacientes con EC al debut de la enfermedad, antes de administrarles cualquier tratamiento que pudiese interferir en las determinaciones (EC-A). Los experimentos se repitieron cuando el paciente alcanzó remisión clínica (EC-R). Otros experimentos se llevaron a cabo en pacientes inactivos de forma mantenida, con remisión clínica y morfológica (EC-I). Los controles fueron voluntarios sanos que no tomaban ningún tipo de medicación. La generación de superóxido, peróxido de hidrógeno y potencial de membrana mitocondrial así como la capacidad apoptótica fueron medidos por citometría de flujo. El daño oxidativo cuantificado por las concentraciones de malondialdehído (MDA) y 8-oxo-diguanosina (8-oxo-dG) fueron medidos por HPLC. Los niveles de TNF-α fueron cuantificados por real-time PCR (ARNm). Las actividades y los niveles de proteína de las EAOs fueron medidos por espectofotometría y western blot respectivamente, usando los respectivos anticuerpos monoclonales. La expresión de ARNm y el análisis del genotipado fueron llevados a cabo en las respectivas aplicaciones de la plataforma Sequenom MassArray®. Resultados: La producción de peróxido de hidrógeno estaba significativamente aumentada cuando en el paciente con EC-A y regresó a los niveles control cuando el paciente alcanzó remisión (EC-R). El potencial de membrana mitocondrial se encontró inhibido en el paciente con EC-A y aunque retornaba a niveles control cuando el paciente estaba en remisión (EC-R), sólo se recuperó cuando el paciente estaba inactivo de forma mantenida (EC-I). Se observó una correlación negativa entre el potencial de membrana mitocondrial y la concentración de TNF-α, estando éste aumentado en los EC-A y recuperándose a valores control sólo cuando el paciente estaba inactivo. Los niveles de MDA y 8-oxo-dG permanecieron elevados permanentemente. La actividad CAT se encontró inhibida permanentemente, independientemente de la actividad de la enfermedad. La actividad de SOD-Mn y GPx estaba significativamente aumentada en el paciente con EC-A. La actividad SOD-Cu/Znno mostró diferencias estadísticamente significativas respecto a los controles. Los niveles de proteína CAT permanecieron reducidos en los pacientes activos e inactivos, mientras que los niveles de proteína de SOD-Cu/Zn, SOD-Mn y GPx fueron superiores en los pacientes con EC-A que en los controles. La baja expresión del gen de CAT fue persistente en EC-A y EC-I, mientras que la expresión de SOD-Mn estaba sólo aumentada durante el brote de la enfermedad. Los niveles de expresión de SOD-Cu/Zn no mostraron diferencias significativas entre los pacientes con EC-A, EC-I y controles. La EC se asoció al SNP de CAT rs1001179 (p= 0.038), mientras que no se encontró ninguna asociación con los SNPs de SOD-Mn estudiados. Los linfocitos de los pacientes EC mostraron una resistencia a la apoptosis mantenida, a pesar de la activación con CD3/CD28 y de la adición de Fas. Además al inhibir la actividad CAT en células control éstas mostraron una menor capacidad para iniciar el proceso de apoptosis. Conclusiones: Los pacientes con EC presentan un estrés oxidativo permanente en sangre periférica, que depende de un exceso de producción de peróxido de hidrógeno. La inhibición del potencial de membrana mitocondrial apunta al posible origen mitocondrial de las ERO. La inhibición de la actividad CAT es secundaria a una disminución de la concentración de proteína que depende de una menor expresión génica del gen correspondiente. El polimorfismo para la CAT rs1001179 se asocia significativamente con la enfermedad. La elevación significativa de la enzima SOD-Mn sitúa a la mitocondria como organela participante en la génesis del estrés oxidativo detectado. El incremento de GPx en los pacientes con EC-A es insuficiente para mantener las concentraciones de peróxido de hidrógeno, por lo que el papel de esta enzima es adicional en la respuesta contra el estrés oxidativo. La permanente inhibición de la actividad de CAT, podría estar relacionada con la persistente resistencia a la apoptosis observada en los linfocitos de sangre periférica de los pacientes con EC. The cause of Crohn’s Disease (CD) remains uncertain. It is generally hypothesized that inflammatory bowel disease is triggered by the enteric microflora in genetically predisposed patients with an immune dysregulation in the gastrointestinal tract. The specific pathways leading to mucosa damage are not completely understood. In recent years, the role of oxidative stress as a potential etiological and/or triggering factor for IBD has been the subject of increasing interest. The chronic gut inflammation in CD has been associated with an increase in oxidative stress and an imbalance in antioxidant enzymes (AOEs). Aims: We have characterized the reactive oxygen species (ROS) generated in immune cells (peripheral white mononuclear cells (PWMCs)) of CD patients, as well as their antioxidant enzyme status and the presence of oxidative damage. We have analyzed the status of the main AOEs (catalase (CAT), manganese SOD (MnSOD) and copper-zinc SOD (CuSOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) at multiple levels (activity, mRNA expression and protein concentration) in PWMCs of CD patients. We have also analyzed whether single nucleotide polymorphisms (SNPs) of CAT and MnSOD genes were associated with CD. Mitochondrial function has been analyzed for a possible origin of ROS. In addition, we have tried to relate the activity of the AOEs with the apoptotic capacity in the peripheral blood lymphocytes T in CD patients. Methods: Peripheral blood was obtained from patients at onset of disease, prior to any treatment (A-CD). Experiments were repeated in clinical remission (R-CD). A set of experiments was carried out in a group of CD patients with persistent morphological remission (I-CD). Controls were healthy volunteers who were not under any treatment. The generation of superoxide, hydrogen peroxide, nitric oxide and the mitochondrial membrane potential as well as the apoptosis capacity was measured by cytometric assays. The oxidative damage was assessed by the concentration of malondyaldehyde (MDA) and 8-oxo-deoxyguanosine (8-oxo-dG) measured by HPLC.The mRNA levels of TNF-α was determined by quantitative real-time PCR. Enzymatic activity and protein levels of the AOEs were measured spectrophotometrically by enzymatic assays and western blot respectively with the use of suitable monoclonal antibodies. The expression of mRNA and genotyping analysis was carried out using the appropriate applications of the Sequenom MassArray® platform. Results: Hydrogen peroxide production was significantly increased during aCD but they return back to controls levels in remission. Mitochondrial membrane potential was inhibited during active CD and although it returns back to control, its recovery takes longer that clinical remission. The level of TNF-α was increased in aCD and was negatively correlated to mitochondrial membrane potential. The levels of MDA and 8-oxo-dG were permanently elevated. CAT activity was permanently inhibited during CD, independently of disease activity. MnSOD and GSH-Px activity were significantly higher in active CD compared to control subjects. CuSOD activity did not display statistically significant differences among CD and healthy subjects. Protein levels of CAT were permanently reduced in active and inactive disease, whereas protein levels of CuSOD, MnSOD and GSH-Px were greater in active CD compared to control patients. The down-regulation of CAT gene expression was persistent in both active CD and inactive CD. MnSOD was specifically up-regulated during flare. The mRNA levels of CuSOD did not show significant differences among aCD, iCD and control patients. CD was found to be associated with the CAT gene rs1001179 SNP (p= 0.038), whereas no association was observed with MnSOD polymorphism. The addition of CD3/CD28 and Fas Ab significantly increased the percentage of apoptotic control lymphocytes vs CD (P

La diabetes está asociada a una mayor prevalencia de hipertensión, ictus, enfermedades cardiovasculares y nefropatía. El péptido atrial natriurético (ANP) juega un papel importante en la fisiopatología cardiovascular y podría tener acciones protectoras cardiovasculares y nefrovasculares en pacientes diabéticos. En este trabajo hemos estudiado las modificaciones producidas por la diabetes en los mecanismos que regulan la respuesta de las arterias carótida y renal de conejo al ANP. La concentración plasmática de ANP en conejos diabéticos fue mayor que en conejos control. ARTERIA CARÓTIDA. El ANP indujo una relajación de la arteria carótida, que fue menor en conejo diabético que en conejo control. La eliminación del endotelio aumentó la acción relajante del ANP. En ambos grupos de animales, el isatin inhibió la relajación inducida por el ANP, tanto en arterias con endotelio como en arterias sin endotelio. La arteria carótida de conejo diabético tiene una menor expresión del receptor NPR-A y una mayor expresión del NPR-C que la arteria de conejo control. La inhibición de la síntesis de óxido nítrico no modificó la relajación al ANP de arterias de conejos control, pero sí que la inhibió en arterias de conejos diabéticos. La indometacina aumentó la relajación arterial al ANP en conejos control, pero no la modificó en conejos diabéticos. En arterias sin endotelio, la indometacina inhibió la relajación arterial al ANP, tanto en conejos control como en conejos diabéticos. En arterias despolarizadas, la relajación al ANP quedó prácticamente abolida en ambos grupos de animales. La incubación con tetraetilamonio inhibió la relajación arterial al ANP, pero esta inhibición fue mayor en conejos control que en conejos diabéticos. Estos resultados indican que la diabetes produce hiporreactividad de la arteria carótida de conejo al ANP, que puede estar relacionada, por un lado, con una menor expresión del receptor NPR-A muscular y una mayor expresión del NPR-C endotelial y, por otro, con una menor participación de los canales de potasio activados por calcio. Esta hiporreactividad está parcialmente amortiguada por una mayor liberación de óxido nítrico endotelial y una disminución del cociente tromboxano A2/prostaciclina. ARTERIA RENAL. El ANP indujo una relajación de la arteria renal, que fue menor en conejo diabético que en conejo control. La eliminación del endotelio disminuyó la acción relajante del ANP, pero la inhibición de la síntesis de óxido nítrico no modificó dicha relajación. En ambos grupos de animales, el isatin disminuyó la potencia relajante del ANP. La arteria renal de conejo expresa el receptor NPR-A y el NPR-C, sin diferencias entre ambos grupos de animales. La indometacina potenció la relajación arterial al ANP, más en conejos control que en conejos diabéticos. En arterias incubadas con ANP la arteria renal liberó tromboxano A2 y prostaciclina, pero la liberación de prostaciclina fue menor en conejos diabéticos. En arterias despolarizadas, la relajación al ANP quedó prácticamente abolida en ambos grupos de animales. La incubación con tetraetilamonio inhibió la relajación arterial al ANP en conejos control pero no en conejos diabéticos. La glibenclamida y la 4-aminopiridina inhibieron la relajación arterial al ANP, siendo estas inhibiciones menores en conejos diabéticos. Estos resultados indican que la diabetes produce hiporreactividad de la arteria renal de conejo al ANP por mecanismos que, al menos, incluyen una disminución de la modulación por prostaciclina y una menor participación de los canales de potasio dependientes de ATP (KATP), dependientes de voltaje (KV) y activados por calcio (KCa). Diabetes is associated with increased prevalence of hypertension, cardiovascular and renal disease. Atrial natriuretic peptide (ANP) plays an important role in cardiovascular pathophysiology and is claimed to have cardioprotective and renoprotective effect in diabetic patients. The aim of the present work was to study diabetes-induced changes in the vascular effects of ANP in isolated rabbit carotid and renal arteries and the mechanisms involved in such actions. Plasma ANP levels were higher in diabetic rabbits than in control rabbits. CAROTID ARTERY. ANP (10-12-10-7 M) induced a relaxation of precontracted carotid arteries, which was lower in diabetic than in control rabbits. In arteries from both groups of animals, endothelium removal increased the ANP-induced relaxation. Isatin inhibited the relaxation to ANP both in arteries with and without endothelium. Carotid arteries from diabetic rabbits showed a decreased natriuretic peptide receptor (NPR)-A expression and an enhanced NPR-C expression. Inhibition of NO-synthesis did not modify ANP-induced relaxation in control rabbits but inhibited it in diabetic rabbits. In arteries with endothelium indomethacin enhanced the relaxation to ANP in control rabbits but did not modify it in diabetic rabbits. In endothelium-denuded arteries indomethacin inhibited the relaxation to ANP in both groups of animals. In KCl-depolarised arteries, relaxation to ANP was almost abolished both in control and diabetic rabbits. Tetraethylammonium (TEA) inhibited the relaxation to ANP, and this inhibition was higher in diabetic than in control rabbits. These results suggest that diabetes produces hyporeactivity of the rabbit carotid artery to ANP by a mechanism that at least includes a reduced expression of NPR-A, an enhanced expression of NPR-C and a reduced participation of K+-channels. Furthermore, diabetes enhances endothelial NO release and diminishes the ratio thromboxane A2/prostacyclin. This increase of vasodilators could result from compensatory mechanisms counteracting the arterial hyporeactivity to ANP. RENAL ARTERY. ANP (10-12-10-7 M) induced a relaxation of precontracted renal arteries, which was lower in diabetic than in control rabbits. In arteries from both groups of animals, endothelium removal decreased the ANP-induced relaxation but inhibition of NO-synthesis did not modify ANP-induced relaxations. In KCl-depolarised arteries, relaxation to ANP was almost abolished both in control and diabetic rabbits. TEA partly inhibited the relaxation to ANP in control rabbits but did not modify it in diabetic rabbits. Glibenclamide and 4-aminopyridine inhibited the relaxation to ANP, and these inhibitions were lower in diabetic than in control rabbits. Indomethacin potentiated the relaxation to ANP, more in control than in diabetic rabbits. In the presence of ANP the renal artery released thromboxane A2 and prostacyclin, and the release of prostacyclin resulted decreased in diabetic rabbits. The present results suggest that diabetes produces hyporeactivity of the rabbit renal artery to ANP by mechanisms that at least include the reduced modulation by prostacyclin and a lower participation of ATP-sensitive K+ channel (KATP), voltage-sensitive K+ channels (KV) and TEA-sensitive K+ channels (KCa).

[spa] En esta tesis se ha estudiado la reproducción y el cultivo larvario de la corvina. En el primer capítulo se abordan los estudios realizados sobre reproducción y optimización de protocolos de inducción a la puesta mediante tratamientos hormonales para que la corvina (tanto de origen salvaje como de cultivo) se reproduzca en cautividad a fin de obtener huevos y larvas de buena calidad estudiándose además los parámetros que determinan la calidad de las puestas obtenidas. Por último se han comparado los resultados en cuanto a inducción y calidad de puesta de los reproductores salvajes y de cultivo. En la segunda parte se abordan aspectos relacionados con el cultivo larvario. Se han determinado diferentes parámetros que influyen en el crecimiento y la supervivencia larvaria, como la intensidad de luz y el fotoperiodo óptimos y la desinfección de las presas vivas y larvas con Ox-Aquaculture® (50% de peróxido de hidrógeno). Por otro lado también se ha estudiado el desarrollo del esqueleto de las larvas de corvina con el fin de determinar posibles deformaciones esqueléticas, la selección de presas por parte de las larvas mediante el marcaje de nauplios de Artemia con microesferas fluorescentes y los requerimientos nutricionales y el nivel adecuado de ácido docosahexanoico (DHA) en las presas vivas para obtener un mayor crecimiento y supervivencia de las larvas de corvina., [eng] In this thesis, a study about several aspects of the reproduction and larval rearing of meagre is presented. In the first chapter about reproduction the adequate hormonal treatments for meagre (wild and cultured fish) to obtain enough quantity and quality of spawnings were optimized, and the quality parameters of the eggs established. A comparison of the results obtained from wild and cultured broodstocks is also presented. In the second chapter on larval rearing different parameters that have a high influence on larval growth and survival, such as light intensity and photoperiod, and disinfection of the live prey and larvae with Ox-Aquaculture® (50% of hydrogen peroxide) were studied. The development of the skeleton of meagre larvae in order to determine possible skeletal deformities prey selection by the larvae using labeled Artemia with fluorescent microspheres and the nutritional requirements and appropriate level of docosahexaenoic acid (DHA) in live prey for a proper growth and survival of meagre larvae are also presented.

Esta tesis aborda el estudio molecular de la respuesta antioxidante y su relación con la inestabilidad genética en la Disqueratosis congénita (DC) ligada al cromosoma X, una enfermedad considerada rara por su baja incidencia. La DC es un síndrome hereditario, muy heterogéneo y en el que los pacientes suelen morir principalmente por fallo medular (BMF). El gen DKC1 mutado en la Disqueratosis congénita ligada al cromosoma X está involucrado en el mantenimiento del telómero, ya que este gen codifica para la proteína disquerina que forma parte del complejo telomerasa. A parte del problema propio de la replicación se han sugerido otros mecanismos que contribuyen al acortamiento telomérico como es el estrés oxidativo (alteración del equilibrio entre las especies prooxidantes y las antioxidantes, a favor de las primeras), ya que este favorece la formación de radicales libres e induce las roturas de doble hebra del ADN. El objetivo principal de la tesis es confirmar si existe alguna relación o conexión molecular entre la actividad telomerasa, la expresión de enzimas antioxidantes, los sistemas de reparación del ADN y la regulación epigenética mediante modelos de pacientes con disqueratosis congénita ligada al cromosoma X y un modelo de células de pacientes con DC en el que se ha restaurado la actividad telomerasa mediante transfección con un inserto GSE24.2 (genetic supresor element 24.2) que codifica para el dominio pseurouridina sintasa de DKC. En esta tesis concluimos que los pacientes con disqueratosis congénita ligada al cromosoma X presentan una disminución de la defensa antioxidante y por lo tanto mayor susceptibilidad de éstos al estrés oxidativo, esta disminución de la defensa antioxidante junto con la menor actividad telomerasa contribuye a la aceleración del acortamiento telomérico. La recuperación de la actividad telomerasa mediante el inserto GSE24.2 rescata la defensa antioxidante celular y la capacidad de reparación del daño producido al ADN en estas células. Aquellas células en las que no se recuperó la actividad telomerasa (pLNCX) presentaron una alteración en la regulación epigenética respecto a las células con la activi¬dad recuperada (24.2). Estos cambios sugieren que la cromatina de los pacientes adquiere una conformación similar a la de las células senescentes y se encuentra desregulada, hecho que debe afectar al control génico y también contribuir a la sensibilidad al daño inducido por estrés oxidativo. Además el incremento de la carbonilación de la histona H1 en las células con déficit en actividad telomerasa, indica un defecto en la detoxificación nuclear de las histonas o un aumento en el estrés oxidativo nuclear lo cual contribuiría a una menor compactación de la cromatina y al aumento de la inestabilidad genómica.

[CAT] La panerola Blattella germanica és un insecte de metamorfosi incompleta (hemimetàbol) i anautògen. Aquesta és una estratègia reproductiva per la qual les femelles no es poden reproduir fins que no han menjat. D'alguna manera els senyals nutricionals han d'arribar als diferents teixits i cèl•lules per informar-los que s'ha assolit un estat nutricional adequat per iniciar els processos reproductius. Tant la via de TOR com la via del receptor d'insulina (InR) semblen formar part conjunta d'aquesta senyalització nutricional. A B. germanica la vitel•logènesi s'activa mitjançant l'hormona juvenil (HJ), que es fabrica i secreta per unes glàndules retrocerebrals anomenades corpora allata (CA). Quan falta l'aliment, els CA no sintetitzen HJ i aquesta no pot activar la síntesi de vitel•logenina (Vg) en el cos gras (CG), que no pot ser incorporada als ovaris, impedint que aquests es desenvolupin correctament. Prèviament havia estat clonada la seqüència de TOR de B. germanica (BgTOR). En aquest treball s'han clonat les de BgInR, BgS6K i de BgPepck. Gràcies al dsRNAi s'ha estudiat la funció del InR com a regulador del creixement, veient que no només afecta a la maduresa sexual de les femelles sinó també la seva mida quan s'injecta en estadis nimfals. La interferència del InR també produeix problemes en el correcte desenvolupament i desplegament de les ales i les tegmines. Així mateix, s'ha comprovat que la interferència del InR fa baixar els nivells dels trànscrits de HMG-S1, HMG-S2, HMG-R i epoxidasa en els CA, implicats en la síntesi d'HJ, així com de la Vg en CG , independentment de l'efecte de la HJ sobre aquesta. També s'ha vist que la interferència del InR produeix una major longevitat en les femelles, a causa que aquestes no es reprodueixen, evitant el desgast que això produeix. Alhora, l'aplicació de dsInR confereix certa protecció davant situacions de dejuni. Altres resultats suggereixen que l'activació d'S6K, tal com succeeix en altres organismes, es realitza per modificacions post-transcripcionals, probablement per fosforilació de la proteïna. S'ha començat a posar a punt un sistema de western-blot per usar-lo per a la detecció de l'estat de fosforilació de S6K i per tant del seu estat d'activació. Mitjançant la tècnica del RNAi s'ha comprovat que la interferència per S6K fa baixar els transcrits de HMG-S1, HMGS2, HMG-R i epoxidasa en els CA, implicats en la síntesi d'HJ, així com la Vg en CG, indicant que està implicat en la transmissió del senyal nutricional als teixits implicats en la vitel•logènesi. Finalment s'ha establert Pepck com a marcador de l'estat nutricional, ja que s'incrementa la seva expressió en situacions de dejuni. No s'ha observat, però, que augmenti quan es redueixen els nivells de S6K o InR mitjançant RNAi, la qual cosa ens indica que la influència de la situació de dejuni sobre la transcripció de PEPCK es pot realitzar per vies alternatives a S6K i InR, si bé sembla que necessita de la presència de InR funcional, [EN] The cockroach Blatella germanica is a hemimetabolous insect with anautogenous reproduction. TOR and Insulin Receptor (InR) pathways are responsible of the nutritional signaling and to control reproductive processes. In B. germanica the yolk protein synthesis is activated by juvenile hormone (JH), which is secreted by retrocerebrals glands known as corpora allata (CA). In starvation, CA are not able to synthesize JH and it can’t activate the synthesis of vitelogenin (Vg) in the fat body (FB), and it can’t be incorporated by the ovaries, preventing their proper development. In this work we have cloned the sequences of BgInR, BgS6K and BgPepck. Using RNAi, InR has been studied as a regulator of growth, affecting not only sexual maturity of females, but also their size when RNAi is injected at nymphs. InR interference also produces problems for the proper development and deployment of wings and elytra. It has also been observed that InR interference lowers the levels of HMG-S1, HMG-S2, HMG-R and epoxidase transcription in CA, involved on the synthesis of JH by CA, and consequently, reducing Vg levels. Independently of JH, InR has a direct effect on Vg expression. Besides, InR interference confers greater longevity in females and protection in front of fasting. We have also begun to implement western-blot technique to detect phosphorylation of S6K. The S6K interference reduce transcription levels of HMG-S1, HMG-S2, HMG-R and epoxidase in CA, and Vg in the CG , indicating that it is involved in nutritional signal transmission to the tissues involved in vitelogenesis. Finally, we established Pepck as a marker of the nutritional status, as its expression is increased in starvation. However, it has not been observed any increase when reducing the levels of S6K or InR using RNAi, indicating that the influence of starvation on Pepck transcription can be performed in alternative ways to S6K and InR, but needs the presence of functional InR.

Uno de los retos actuales de las cirugías odontológicas es la regeneración ósea, especialmente del hueso alveolar para la realización del implante dental. En los últimos años, las células madre mesenquimales derivadas la pulpa dental (CMPDs), se han convertido en un objetivo de estudio prometedor para la regeneración ósea gracias a su potencial de diferenciación a odontoblastos y osteoblastos así como sus propiedades inmunológicas. Sin embargo, su aplicación sigue siendo limitada por el gran número de células y el tiempo requerido para su obtención. Para ello, nos propusimos el objetivo de optimizar el tiempo de obtención de las CMPDs en la condición fisiológica de oxígeno (3-6% O2) así como estudiar el efecto de la condición ambiental de oxígeno (21% O2), ampliamente utilizada in vitro, frente a la condición fisiológica, sobre los parámetros de estrés oxidativo y de proliferación. Los resultados que obtuvimos fueron que la adhesión y la tasa de proliferación celular fueron significativamente menores en la condición ambiental de oxígeno frente a la fisiológica, y el estrés oxidativo está implicado en las diferencias observadas. Además, propusimos una vía p38/p21/Nfr2 que puede ser un posible mecanismo regulador del ciclo celular y de las defensas antioxidantes como respuesta de las CMPDs a los efectos dañinos de la condición ambiental de oxígeno. One of the current challenges in the odontological surgeries is the bone regeneration, especially of the alveolar bone for the accomplishment of the dental implant. In the last years, the mesenchymal stem cells derived from the dental pulp (DPSCs) have become one of the most promising candidates for the bone regeneration mostly due to their differentiative potential to odontoblasts and osteoblasts and their immunologic properties. Nevertheless, their clinical application is still limited due to the high cells number and the time required for its obtention. Therefore, we focused our study on the optimization of DPSCs obtention at physiological oxygen tension, and we studied the effect of environmental oxygen tension, widely used in vitro, compared to the physiological on the parameters of oxidative stress and proliferation. The obtained results were that the adhesion and the proliferation rate of the cells were significantly lower under the environmental oxygen tension compared to the physiological and the observed differences are oxidative stress dependent. Moreover, we proposed a p38/p21/Nrf2 pathway by which the DPSCs may regulate the cell cycle and the antioxidant defense in response to the environmental oxygen tension.

La pancreatitis aguda es un proceso inflamatorio agudo del páncreas con afectación variable de otros tejidos y sistemas orgánicos alejados. La incidencia de la pancreatitis aguda en la Unión Europea y Estados Unidos varía de 5 a 30 casos/100.000/año (Ellis y cols., 2009). La mortalidad en pacientes con pancreatitis aguda es alrededor del 5%, pero este porcentaje aumenta al 17-20% en pacientes con pancreatitis necrotizante (Pandol y cols., 2007). La participación del estrés oxidativo en la pancreatitis aguda se ha podido demostrar en la depleción precoz de glutatión reducido (GSH) y su precursor, la cisteína, que se mantiene y precede a la formación de edema pancreático. Este descenso en los niveles de glutatión supondría, además de la pérdida de la capacidad de defensa antioxidante, una alteración en la integridad del citoesqueleto y en la membrana de las organelas intracelulares, lo que permitiría la prematura activación de las enzimas digestivas en el interior de las células acinares y el consiguiente desarrollo del proceso inflamatorio (Schulz y cols., 1999). En los efectos sistémicos de la enfermedad se ha demostrado la implicación del estrés oxidativo. En el modelo de PA grave por perfusión de taurocolato se ha demostrado la presencia de un incremento en la actividad XO plasmática y un descenso en los niveles de GSH, que se acompaña de un importante infiltrado inflamatorio a nivel pulmonar (Folch y cols., 1998). En definitiva, los radicales libres parecen actuar en la pancreatitis aguda de manera similar a cualquier otro proceso inflamatorio, es decir, amplificando la lesión y manteniendo el proceso inflamatorio (Pereda y cols, 2006; Escobar y cols., 2012). La obesidad es la enfermedad crónica de origen multifactorial que se caracteriza por acumulación excesiva de grasa o hipertrofia general del tejido adiposo en el cuerpo; es decir, cuando la reserva natural de energía de los humanos y otros mamíferos, almacenada en forma de grasa corporal, se incrementa hasta un punto donde está asociada con numerosas complicaciones como ciertas condiciones de salud o enfermedades y un incremento de la mortalidad. La obesidad se caracteriza por presentar un incremento en los niveles séricos y tisulares de citoquinas proinflamatorias, tales como el TNF-α y la IL-6, tanto en humanos como en modelos experimentales (Perreault y Marette, 2001), así como un incremento de la IL-18 (Senello y cols., 2008). Estas citoquinas se encuentran elevadas en pacientes con pancreatitis aguda. El aumento del TNF-α y la consiguiente inducción de la iNOS se consideran responsables, al menos en parte, de la resistencia a la insulina asociada a la obesidad (Perreault y Marette, 2001). Se ha observado que los pacientes que padecen pancreatitis aguda y son obesos han sufrido mayores complicaciones sistémicas (Martínez y cols., 1999). Por esto, se afirma en un metaanálisis realizado por Martínez y cols., que la obesidad constituye un factor de riesgo para el desarrollo de complicaciones locales y sistémicas en pancreatitis aguda (Martínez y cols., 2004). Un segundo metaanálisis más actualizado demuestra que la asociación entre pancreatitis aguda y obesidad aumenta la morbilidad y mortalidad de la pancreatitis aguda (Martínez y cols., 2006). El líquido ascítico asociado a la pancreatitis juega un papel clave en la patogénesis de la pancreatitis aguda, ya que aumenta la producción de TNF-α por las células acinares pancreáticas (Ramudo y cols., 2005), promueve la activación de los macrófagos (Satoh y cols., 1999; Gutiérrez y cols., 2008) e induce lesión pulmonar (Fujita y cols., 2001). De hecho, el líquido ascítico provocó la activación de NF-κB e incrementó la producción de TNF-α en macrófagos peritoneales (Satoh y cols., 1999).

La activación del factor de transcripción NF-kB juega un papel importante en el proceso de la oncogénesis. El propósito del presente estudio fue determinar si NF-kB se encuentra activado en cáncer de mama e identificar la correlación de su actividad con las características clínico-patológicas del tumor. Además, se analizaron aquellos genes cuya expresión está regulada por NF-kB en tejido tumoral, tejido adyacente al tumor y tejido normal procedente de reducciones mamarias. Finalmente se estudio si NF-kB o alguno de sus genes diana podría tener un papel en el tratamiento del cáncer de mama. Para el estudio de la activación de NF-kB se utilizaron muestras de tejido congelado procedentes de cirugía que fueron incluidas en OCT (compuesto para la temperatura óptima de corte) y a las que se les realizó un análisis histopatológico para comprobar la calidad. De las 450 muestras que analizamos, seleccionamos 148 muestras de carcinoma mamario y 16 de tejido adyacente no tumoral. Se obtuvieron los extractos proteicos de todas ellas y la determinación de la activación de las cinco subunidades de NF-kB se realizó mediante ELISA y se validó mediante western blot. Para la determinación de la expresión génica utilizamos tejido parafinado. Se extrajo el ARN y se realizó la transcripción inversa. La calidad de la muestra se determinó mediante el kit comercial “RT2 RNA QC PCR array”. El perfil génico se realizó con “RT2 Profiler PCR Array Human NF-kB Signaling Targets”. La sensibilidad al tratamiento con el fármaco quimioterápico doxorubicina se realizó con las líneas celulares derivadas de carcinoma mamario MCF7, MDAMB231, MDAMB468, SKBR3 y BT474. La activación de NF-kB inducida por la doxorubicina se evaluó dichas líneas celulares, realizándose también la comparación de la expresión génica antes y después del tratamiento. Se observó que las subunidades de NF-kB p65, p50, p52 y relB se encuentran activadas de forma significativa en tejido tumoral frente a tejido no tumoral, siendo el valor-p ≤ 0,005 en todos los casos. Además, en carcinoma ductal invasivo la activación de relB estaba asociada al tamaño tumoral (p=0,004), la invasión de tejidos adyacentes (p=0,01) y afectación ganglionar (p= 0,003) mientras que el aumento de la activación de la subunidad p65 estaba asociado a invasión linfática (p=0,033). Asimismo los niveles de activación de p52 y c-rel fueron más altos en carcinoma ductal invasivo que en carcinoma ductal in situ con valores-p de 0,008 y p=0,019 respectivamente. Por otra parte, valores de activación altos para p52 y relB en tumores positivos para receptores de estrógenos estuvieron significativamente asociados a recidiva tras el tratamiento. Respecto al análisis de expresión de genes diana de NF-kB, encontramos diferencias significativas entre la expresión de tejido normal/adyacente y tumoral en los genes CXCL10, CXCL9, MMP9 y LTA cuya expresión fue mayor en tejido tumoral y MYC, EGFR y MAP2k6 cuya expresión disminuía. También observamos que la expresión de MMP9, CXCL9 y MYC en tejido adyacente al tumor estaba aumentada respecto a tejido normal. En líneas celulares observamos que el tratamiento con doxorubicina producía la activación de NF-kB y de la expresión de genes asociados a actividades quimocina y citocina, señalización intercelular y respuesta inflamatoria mientras que la expresión de genes relacionados con actividades anti-apoptóticas y transducción de señales estaba disminuída. Estos datos indican que NF-kB está constitutivamente activado en cáncer de mama y sugiere que la actividad de NF-kB está asociada con la progresión tumoral y la supervivencia libre de enfermedad. Por otro lado, algunos genes asociados a NF-kB con expresión diferente entre tejido tumoral y normal podrían actuar como dianas terapeuticas potenciales en cáncer de mama ya que su expresión se modifica tras el tratamiento con doxorubicina. Finalmente se sugiere que el microambiente tumoral podría tener un papel destacado en la progresión del cáncer y la resistencia a fármacos. Activation of transcription factor NF-kB has been shown to play a role in oncogenesis. The purpose of the study was to determine whether NF-kB is activated in breast tumour carcinoma tissues and to identify any correlation between its activity and the clinical-pathological features of tumours. Besides we analyse genes whose expression is regulated by NF-kB in tumoral tissue, adjacent tumoral tissue and normal breast tissue. Finally we studied if NF-KB or its target genes could have a role in the treatment of breast cancer. For the study of activation of NF-kB we used frozen breast tissues from surgery. For quality control the frozen tissues were included in optimal cutting temperature compound (OCT) and a histopathological analysis was performed. Of them, we select 148 human breast carcinoma tissues and 16 adjacent non-tumour tissues. Nuclear protein extracts were obtained and NF-kB activation was determined by ELISA analysis and data were validated by western blot. To determine gene expression we used paraffin-embedded breast cancer tissues. The RNA was extracted and reverse transcription performed. The quality of samples was determined with RT2 RNA QC PCR array. The RNA profile was identified with RT2 Profiler PCR Array Human NF-kB Signaling Targets. Sensibility to doxorubicin was tested in MCF7, MDAMB231, MDAMB468, SKBR3 and BT474 breast cancer-derived cell lines. Doxorubicin-induced NF-kB activation was assessed in cells lines and a comparison between gene expression before and after the treatment with doxorubicin was performed. NF-kB study showed that p65, p50, p52 and relB subunits activation was significantly higher in breast tumours than in normal adjacent tissues (p≤0.005 in all cases). In invasive ductal carcinoma (IDC) relB activation was related to tumor size (p=0.004), invasion of adjacent tissues (p=0.01) and lymph nodes invasion (p= 0.003) and p65 increased levels were associated with lymph nodes invasion (p=0.033). p52 and c-rel levels were higher in invasive ductal carcinoma (IDC) than in ductal carcinoma in situ (DCIS) with p=0.008 and p=0.019 respectively. Higher p52 and relB activation levels in oestrogen receptor-positive tumour tissues were significantly related to patients relapse. On the other hand we detect significant differences in the expression between normal/adjacent and tumoral tissues in genes CXCL10, CXCL9, MMP9 and LTA whose levels were higher in tumoral tissue and MYC, EGFR and MAP2k6 whose levels were lower. We also found that MYC, CXCL9 and MMP9 expression was higher in adjacent tissue than normal tissue, pointing the importance of microenvironment in cancer. In cell lines we found that doxorubicin treatment enhanced NF-kB activation and expression of genes related to chemokine and cytokine activities, cell-cell signalling and inflammatory response whereas gene expression associated with anti-apoptosis activity and signal transduction was decreased. These data indicate NF-kB is constitutively activated in human breast carcinoma tissues and suggest NF-kB activity is related to tumour progression and disease-free patient survival. On the other hand, some genes related to NF-KB with differential expression between tumor and normal tissue could be a potential target in breast cancer as its expression is modified by doxorubicin. Finally our data suggest microenvironment could have a role in cancer progression and drugs’ resistance.

[spa] En la tesis presentada se pretendió de desarrollar nuevas herramientas para investigar los efectos de contaminantes ambientales sobre organismos acuáticos. Por esto se eligió el mejillón cebra como organismo centinela del ecosistema de agua dulce. Se realizaron estudios de caracterización para obtener el conocimiento básico sobre el sistema reproductivo y los factores implicados en su control. En este contexto se ejecutaron estudios de campo para detectar las variaciones anuales de los esteroides sexuales (testosterona y estradiol) así como cambios en los niveles de lípidos y de la composición de ácidos grasos. Las investigaciones demostraron que el ciclo reproductivo del mejillón cebra está bien relacionado con cambios de la temperatura del agua que determina la progresión de la gametogénesis y el comienzo de la puesta. Además, se detectó una conexión entre las variaciones de los esteroides sexuales y los diferentes eventos reproductivos. Asimismo, los cambios de los niveles de lípidos indicaron una progresión anual en consonancia con las diferentes fases de la reproducción. A través del análisis multivariante de la composición de los ácidos grasos se detectaron tres pautas principales que explicaron 99% de las variaciones anuales de los 33 ácidos determinados. Estas pautas temporales de los ácidos grasos coincidieron con las tres fases principales de la reproducción (gametogénesis, puesta y descanso gonadal). Los estudios fisiológicos se acompañaron con estudios toxicológicos in vivo con el objetivo de investigar los efectos de tres contaminantes ambientales sobre el mejillón cebra: la fluoxetina, el clofibrato y el TBT. La fluoxetina modificó la homeostasis hormonal alterando significativamente los niveles del estradiol. También indujo efectivamente la puesta en mejillones expuestas a concentraciones bajas de ng/L demostrando su potencial de afectar la reproducción. El TBT interfirió con el sistema hormonal y la homeostasis lipídica del mejillón cebra a través del aumento significativo de la testosterona total y de los triglicéridos totales. Además el TBT alteró la composición de los ácidos grasos además de tener un fuerte efecto citotóxico sobre el hepatopáncreas sobre las células de los túbulos y de los conductos primarios y secundarios. El clofibrato alteró la composición lipídica a concentraciones ambientalmente relevantes. La exposición de clofibrato a corto plazo mostró un aumento significativo de los ácidos grasos libres que fue acompañado de una reducción acentuada de los triglicéridos. Por último, se realizó un estudio de campo para detectar alteraciones en el sistema endocrino y en el ciclo reproductivo de una población de mejillones cebra situado en una zona fuertemente contaminada del río Ebro (Flix). Los efectos se evaluaron en comparación con una población de referencia (Riba Roja). El estudio demostró cambios en el ciclo reproductivo que indicaron un desplazamiento temporal de la fase del desarrollo gametogénico, una reducción del periodo de la puesta y una prolongación significativo de la fase de descanso gonadal. Además se detectó un retraso en el desarrollo gonadal y una disminución del tamaño total de la gónada en animales de la zona de Flix. Se observaron también cambios en la composición de los ácidos grasos, sobre todos en los esenciales que tienen papel en procesos fisiológicos importantes, que puede tener su relación con las alteraciones observadas en la reproducción., [eng] Modern science is challenged with an overwhelming amount of potentially toxic compounds which are omnipresent in aquatic ecosystems. This calls for the development of new tools which can be integrated into toxicological investigations that would allow a reliable estimation of the effects of environmental pollution on aquatic organisms. In this context, the present thesis aimed to investigate the toxicity of a selected number of chemicals on the freshwater mussel Dreissena polymorpha as well as to develop new toxicological endpoints to be included in future biomonitoring programs using the zebra mussel as sentinel organism. To this end, the reproductive cycle, annual variations of sex steroids and activities of steroid metabolizing enzymes as well as changes in lipid levels and fatty acid composition were investigated in zebra mussels from the Ebro River. Changes in sex steroids, enzymatic activities (17β-HSD and ATAT), total lipids and some fatty acids were successfully related with key reproductive events such as gametogenesis and spawning. Moreover, a series of exposure experiments to environmentally relevant concentrations of fluoxetine, clofibrate and TBT were performed and evidenced: (a) significant changes in triglycerides and total fatty acids following exposure to clofibrate; (b) that fluoxetine acts as a spawning inducer in both males and females, and (c) the ability of TBT to increase testosterone titers and total lipids in females of zebra mussel, among other effects. Finally, the health status of a zebra mussel population from a historically polluted area of the Ebro River was assessed by determining endogenous levels of testosterone and estradiol, lipids and gonadal development as markers of endocrine alteration.

Les poliamines (PAs) putrescina (Put), espermidina (Spd) i espermina (Spm) són mol•lècules policatiòniques de baix pes molecular, presents en els microorganismes, animals i plantes. Les PAs han estat implicades en diversos processos cel•lulars importants, incloent la resposta de les plantes a l'estrès. No obstant això, el seu mode d'acció està es desconeix. En les plantes, es van acumulant evidències de que les PAs interactuen amb macromolècules i estructures cel•lulars, com ara proteïnes de membrana, i la seva possible participació en transducció de senyals s'ha convertit en una creixent i interessant àrea d'estudi. En aquesta tesi, la possible interacció entre les poliamines i les vies de senyalització de fosfolípids és investigada. Resultats previs, han posat de manifest que alteracions en els nivells endògens de poliamines (PAs), per sobreexpressió gènica o pèrdua de funció de gens de biosíntesi, redueixen o milloren, respectivament, la capacitat de les plantes d'Arabidopsis per tolerar agressions per estrès abiòtic, produint en alguns casos notables alteracions en el desenvolupament. En aquestes plantes amb nivells alterats de PAs s'han detectat canvis importants en l'expressió gènica i s'ha trobat una connexió entre el contingut de PAs ii la biosíntesi / senyalització d'àcid abscísic (ABA). La hipòtesi actual de treball és que aquestes alteracions en l'expressió gènica poden estar mediades, si més no en part, pel catabolisme de PAs, i l’acció directa o indirecta de les espècies reactives d'oxigen (ROS) que se’n deriven. The polyamines (PAs) putrescine (PUT), spermidine (SPD) and spermine (SPM) are low-molecular-weight polycationic molecules present in microorganisms, animals and plants. PAs have been implicated in several important cellular processes, including plant responses to stress. However, their mode of action is still under study. In plants, evidence is accumulating that PAs interact with macromolecules and cellular structures, such as membrane proteins, and their possible involvement in signal transduction has become an interesting area of study. Here, the possible interaction between polyamines and phospholipid signalling pathways is investigated. On the other hand, previous results obtained in our research group, revealed that alterations in the endogenous poliamine (PAs) levels by over-expressing or knocking-down biosynthetic genes, reduce or improve, respectively, the tolerance capacity of Arabidopsis plants in front of abiotic stresses, with consequences in some cases in plant development. In these plants with altered PAs levels, have been detected important changes in gene expression revealing a connection between PAs content and acid abscisic (ABA) signalling/biosynthesis.The current hypothesis is that this alterations in gene expression may be mediated, at least in part, by the catabolism of PAs, and de direct or indirect role of the derived reactive oxigen species (ROS).

[spa] El receptor nuclear LXR es un factor de transcripción dependiente de ligando. Los ligandos activadores de LXR son formas derivadas del colesterol. Esta tesis se ha elaborado en dos grandes bloques. En el primero, hemos caracterizado el papel antiinflamatorio que LXR ejerce en células espumosas, un tipo celular predominante en la placa aterosclérotica, activadas por la citoquina Interferon-gamma (IFN-γ) y por el componente bacteriano lipopolisacárido (LPS). Así mismo, hemos observado que la conversión de macrófagos en células espumosas, per se, tiene un efecto inhibitorio de la señal inflamatoria inducida por LPS, pero no de la inducida por IFN-γ. Estos efectos inhibitorios de la respuesta a LPS en células espumosas no están mediados por la inhibición de la activación de las vías de MAPKs ERK-1/2 o p38, ni tampoco por una inhibición de la degradación de IκBα. También hemos comparado los efectos antiinflamatorios de los ligandos de LXR con los de otro miembro de la familia de los receptores nucleares, PPAR-γ, en macrófagos peritoneales y hemos encontrado subgrupos de genes que son específicamente inhibidos por PPAR-γ en ausencia de LXR, y otros que son inhibidos únicamente por LXR. En el segundo bloque de esta tesis hemos determinado el papel de LXR sobre la activación alternativa de los macrófagos (inducida por IL-4). Los marcadores de activación alternativa de macrofagos mejor caracterizados no se ven afectados por los agonistas de LXR. Sin embargo, hemos observado que LXR ejerce efectos inhibitorios específicos sobre un subgrupo de quimioquinas asociadas a enfermedades inflamatorias pulmonares como el asma. Hemos caracterizado el efecto de un agonista de LXR sobre un modelo murino de asma inducida por alérgeno y hemos observado que LXR es capaz de mejorar la capacidad respiratoria tras la inducción de la respuesta asmática, y de inhibir la expresión de mediadores proinflammatorios en el pulmón de ratones asmáticos. Además, ratones deficientes para ambas isoformas de LXR tienen una peor respuesta pulmonar en comparación con los wild type en este tipo de ensayos. En este trabajo también hemos observado que IL-4 ejerce efectos negativos recíprocos sobre la actividad de LXR, de forma dependiente de STAT-6; esta inhibición mediada por IL-4 es selectiva y solo afecta a un subgrupo de genes diana de LXR., [eng] Nuclear receptor LXR is a ligand dependent transcription factor. The activating ligands of LXR are specific oxidized forms of cholesterol (oxysterols) and intermediate products of the cholesterol biosynthetic pathway. This thesis has been developed in two main parts. In the first part, we have characterized the anti-inflammatory role of LXR in foam cells, a predominant cell type in atherosclerotic plaques, activated by the endogenous cytokine Interferon-gamma (IFN-γ) and the bacterial component lipopolysaccharide (LPS). We have observed that the conversion of macrophages to foam cells itself has an inhibitory effect on the inflammatory response to LPS, but not to IFN-γ. These inhibitory effects on the LPS response in foam cells do not seem to be mediated by impairing activation of ERK and p38 MAPK pathways, nor by inhibiting IκBα degradation. We also compared the antiinflammatory effects of the LXR ligands with the effects mediated by ligands of another member of the nuclear receptors superfamily, PPAR-γ, in peritoneal macrophages. We have found subsets of genes that are specifically repressed by PPAR-γ in the absence of LXR, and another group that is only repressed by LXR. In the second part of this work we have determined the role of LXR on the (IL-4-induced) alternative activation of macrophages. The expression of the main markers of alternative activation of macrophages is not affected by LXR agonists. However, we have observed that LXR exerts specific inhibitory effects over a group of chemokines associated to inflammatory lung diseases such as asthma. We have characterized the effect of an LXR agonist in a murine model of allergic asthma and we observed that LXR ameliorates the respiratory capacity upon induction of the asthmatic response. Moreover, LXR deficient mice developed significantly worsened airway responses in comparison with the wild type animals in this type of test. Finally, in this work we have also observed that IL-4 exerts negative reciprocal effects on the induction of selective LXR target genes in a STAT-6 dependent manner. This IL-4-mediated inhibition is selective and only affects a subset of targets of LXR.

Encontrar buenos modelos de envejecimiento es un objetivo importante de la Gerontología. La diferencia de género en la longevidad, es decir, el hecho de que las hembras viven alrededor del 10% más que los machos en muchas especies, incluida la especie humana, ofrece una oportunidad única para estudiar los aspectos fundamentales del envejecimiento. En el contexto de la teoría mitocondrial de radicales libres en el envejecimiento, estudios realizados por nuestro grupo de investigación han encontrado que la producción de especies reactivas de oxígeno es aproximadamente el doble en los machos en comparación con las hembras (Borras et al., 2003). Así, dichas diferencias de longevidad entre machos y hembras, en parte, podrían ser debidas a los estrógenos, puesto que inducen la expresión de enzimas antioxidantes, como la glutatión peroxidasa selenio-dependiente y la manganeso superóxido dismutasa, al activar vías de señalización intracelular, y ello protege a las hembras frente al estrés oxidativo, y por tanto les confiere una mayor longevidad (Borras et al., 2005). Este hecho hizo plantearnos la posibilidad de intervenir mediante la administración de moléculas miméticas de los estrógenos para reproducir sus efectos favorables sobre la longevidad pero que no presenten el poder feminizante y los inconvenientes atribuidos a los estrógenos. Así pues, elegimos la soja por su composición rica en fitoestrógenos. El papel beneficioso de estas sustancias sobre parámetros de estrés oxidativo y enzimas antioxidantes se ha demostrado previamente por nuestro grupo, tanto in vitro como in vivo (Mahn et al., 2005; Borras et al., 2006). Así, como objetivo principal de la presente tesis, nos planteamos determinar el efecto del consumo de soja sobre la longevidad en ratones OF1 machos. Asimismo, nos planteamos si la modulación de la expresión de “genes antioxidantes” se asocia a cambios reales en la longevidad. Determinar también, si las modulaciones de los “genes antioxidantes” se asocian a cambios reales en la longevidad. Para ello, realizamos una curva de longevidad en ratones OF1 machos, divididos en dos grupos experimentales, 76 alimentados con dieta rica en soja y 81 sin soja. Los animales se controlaron diariamente, y se registró su consumo diario de alimento y su peso semanal. Puesto que la única variable de nuestro estudio es la ingesta o no de soja en la dieta, determinamos la concentración de isoflavonas en el plasma de ambos grupos experimentales mediante cromatografía líquida de alto rendimiento. Se sacrificaron 5 ratones de cada grupo experimental al 100, 80, 50 y 10% de supervivencia, representando las edades de 5, 12, 17.5 and 23.5 meses, respectivamente. Extrajimos las mitocondrias hepáticas mediante centrifugación diferencial para determinar el daño oxidativo, midiendo la producción mitocondrial de peróxido de hidrógeno mediante fluorimetría, la peroxidación lipídica midiendo los niveles de malondialdehído mediante HPLC y la oxidación proteica detectando los grupos carbonilos mediante westen blotting. Como contrapartida a ese daño oxidativo, medimos la defensa antioxidante en tejido hepático, en este caso los genes asociados a la longevidad, manganeso superóxido dismutasa (Mn-SOD) y glutatión peroxidasa (GPx), medimos sus niveles de mRNA mediante RT-PCR, su expresión proteica mediante western blotting y su actividad enzimática por espectrofotometría. También realizamos una serie de pruebas metabólicas, por un lado, estudiamos el perfil metabólico general mediante resonancia magnética nuclear, en plasma y en suspensión mitocondrial. Y por otro lado, estudiamos el consumo cerebral de glucosa in vivo mediante tomografía por emisión de positrones (PET). Los resultados que obtuvimos fueron los siguientes: Cuando determinamos la concentración de isoflavonas en plasma observamos, que los ratones del grupo alimentados con dieta rica en soja mostraron niveles significativamente más altos de genisteína, daidzeína y equol en comparación con el grupo control (alimentado con dieta sin soja). Lo cual demuestra que en efecto, los ratones alimentados con dieta rica en soja habían sido capaces de absorber y metabolizar dichas isoflavonas, y por ello podemos atribuirles los posibles cambios que se produzcan en el resto de la pruebas. Así mismo, cabe destacar que la concentración total de las isoflavonas fue similar a las concentraciones encontradas en la sociedad oriental consumidora de dieta rica en soja de forma habitual como es el caso de los japoneses. Observamos también que el consumo de soja no tiene ningún papel favorable sobre la reducción del peso corporal ni como supresor del apetito, que el perfil metabólico a nivel sérico no cambia con la edad ni con el consumo de soja. Sin embrago, a nivel de las mitocondrias hepáticas sí cambia tanto con la edad como con el consumo de soja. Además, encontramos una correlación positiva entre el envejecimiento y la producción mitocondrial de peróxidos de hidrógeno, y el consumo de soja palía el efecto de la edad sobre dicha producción por las mitocondrias hepáticas. El envejecimiento aumenta los niveles de peroxidación lipídica. No obstante, el consumo de soja evita dicho aumento e incluso lo disminuye al 10% de supervivencia, en las mitocondrias hepáticas. Con el envejecimiento aumenta la oxidación proteica de las mitocondrias hepáticas. El consumo de soja previene dicha oxidación al 80% de supervivencia, sin embargo, la aumenta al 10% de supervivencia. El envejecimiento no afecta ni los niveles de mRNA ni la actividad enzimática de GPx, pero sí incrementa sus niveles proteicos, y el consumo de soja induce su expresión e incrementa su actividad enzimática. Con el envejecimiento disminuyen los niveles de mRNA, pero aumentan los niveles proteicos y la actividad enzimática de MnSOD. El consumo de soja aumenta su expresión al 10% de supervivencia, y su actividad enzimática al 80% de supervivencia. El consumo cerebral de glucosa aumenta con la edad y el consumo de soja sólo lo aumenta al 100% de supervivencia. Finalmente, puesto que no hemos observado diferencias en la longevidad, podemos concluir que el consumo de una dieta rica en soja no alarga ni la vida media ni la vida máxima de ratones OF1 machos, bajo condiciones óptimas de vida, a pesar del aumento de la expresión y la actividad de enzimas antioxidantes. Finding good models of ageing is a major aim in Gerontology. The different longevity between genders, i.e. females live around 10% longer than males in many species, including humans, offers a unique opportunity to study fundamental aspects of ageing. In the context of the mitochondrial theory of ageing, studies performed by our research group shows that mitochondrial oxidant production is approximately double in males than to females (Borras et al., 2003). We believe this advantage of females is due to the presence of oestrogens, which act via a pathway that comprises membrane oestrogen receptors, MAP kinases, NFkappaB signaling, and the up-regulation of the expression of the antioxidant enzymes MnSOD and GPx (Borras et al., 2005). It is remarkable that oestrogens activate proliferation genes (related to their feminising function and also to their cancer-promoting effects) by binding to oestrogen receptor alpha whereas longevity-related genes, in particular the antioxidant ones, are mediated by binding to oestrogen receptor beta. Furthermore, oestrogen administration after the menopause has clinical problems and, obviously, cannot be given to males. On the other hand, phytoestrogens, which almost all cases bind to the oestrogen receptor beta, promote longevity-related genes without increasing the rate of cell division or promoting feminisation. These substances offer an interesting alternative to oestrogens. In our laboratory, we observed that at concentrations found in plasma of people fed a traditional diet with soya, there was an increase in the expression of antioxidant enzymes (Borras et al., 2006). Thus, the possibility of using these compounds to increase the longevity of males to reach the longevity of females should be seriously considered. In the current study, we performed a longevity curve of 157 male Swiss mice (OF1), divided into two groups. Depending on the type of diet the animals were consuming, either a soya-free diet (similar to the Western diet for humans) or a soya-rich diet (equivalent to the Eastern type diet), since weaning. Here we studied possible differences in longevity, the occurrence of oxidative damage, and antioxidant defence in mice at ages 5, 12, 17.5 and 23.5 months; their survival rate was 100, 80, 50 and 10%, respectively. These represent a broad range of ages, from very young to very old OF1 mice. To obtain blood and organs, five mice were sacrificed in each group at 100, 80, 50, and 10% survival. To test that soya feeding did indeed affect the concentration of isoflavones in plasma of mice fed a soya-rich diet, we measured the concentration of genistein, daidzein, and equol by UPLC. Furthermore, we extracted liver and isolated mitochondria by differential centrifugation to measure parameters of oxidative damage, such as hepatic mitochondrial peroxide production by fluorimetry, lipid peroxidation (determined as malondialdehyde) and oxidised proteins (measured as carbonylation).As antioxidant defence, we measured the expression of longevity-related genes, such as manganese superoxide dismutase (Mn-SOD) and glutathione peroxidase (GPx) by real time-qPCR. In addition, we determined their protein expression by Western blotting and enzymatic activity by spectrophotometry. We also performed some metabolic tests: on the one hand, we studied the metabolic profile by nuclear magnetic resonance (1H NMR) in plasma and mitochondrial suspension; on the other, we studied the cerebral glucose consumption in vivo using positron emission tomography (PET). Our results show the following: As expected, the plasmatic concentration of these isoflavones was directly correlated; mice fed on the soya-rich diet displayed significantly higher levels of genistein, daidzein, and equol compared with mice fed with the soya-free diet. This means that OF1 mice are able to metabolise soya isoflavones and these concentrations are similar to those obtained in Eastern populations consuming a traditional soya-rich diet. Soya consumption has no effect on reducing body weight or as an appetite suppressant. The serum metabolic profile does not change with age or with soya consumption. However, the metabolic profile in liver mitochondria does change with age and with soya intake. There is a positive correlation between ageing and mitochondrial production of hydrogen peroxide, however soya intake may mitigate the effect of age on this production by liver mitochondria. Ageing increases the levels of lipid peroxidation in hepatic mitochondria. However, soya intake prevents this increase and even lowers it when survival is 10%. Ageing increases protein oxidation in hepatic mitochondria. Soya consumption protects against this oxidation when survival is 80%, however it has a pro-oxidant effect when survival is 10%. Ageing affects neither mRNA levels nor the enzymatic activity of GPx, but increases its protein levels. Soya intake induces its overexpression and increases its enzymatic activity. Ageing decreases mRNA levels but increases protein levels and enzymatic activity of MnSOD. Soya intake induces overexpression of this gene when survival is 10%; however it increases its enzymatic activity when survival is 80%. Cerebral glucose consumption increases with age and soya intake increases this when survival is 100%. The most relevant result is that soya feeding does not increase lifespan (neither maximum nor average) in a controlled population of male OF1 mice, despite the increase in the expression and activity of antioxidant enzymes.

[eng] The deep-sea has long been considered the last region one Earth to be untouched from anthropogenic disturbances. However, studies have shown that the deep-sea is not as pristine as once assumed and it has been suggested that it may actually act as a sink for persistent organic pollutants (POPs). POPs are ubiquitous in the environment and of particular concern due to their high persistence, toxicity, bioaccumulation potential and long-range transport. Although POPs have been detected in a range of deep-sea organisms from around the world, little is known on the potential impact anthropogenic contamination may have on deep-sea ecosystems. Thus, the present thesis aimed to investigate the bioaccumulation of POPs and potential adverse effects in deep-sea organisms resulting from exposure to these contaminants. To this end, a range of different contaminants, including legacy (e.g. polychlorinated biphenyls [PCBs], dichlorodiphenyltrichloroethane [DDTs], hexachlorocyclohexanes [HCHs]) and emergent (e.g. polybrominated diphenyl ethers [PBDEs]) POPs, as well as other contaminant classes such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), alkylphenols (APs) and mercury (Hg) were determined in different Mediterranean deep-sea organisms. Results showed that Mediterranean deep-sea organisms are potentially exposed to a wide range of contaminants, some of them potentially causing a risk for the deep-sea ecosystem as well as for human health. In this context, the present work presents one of the few studies and the first in the Mediterranean to simultaneously determine the bioaccumulation of legacy POPs and emergent PBDEs in deep-sea organisms. Moreover, the presence of APs in deep-sea fauna has not been previously investigated and this thesis thus provides novel information on the presence of these contaminants in remote marine environment. Also, Hg contamination could be of particular concern for deep-sea environments as levels appeared to increase with increasing habitat depth of the analyzed species. Furthermore, almost all species, including the commercially exploited fish Mora moro and the highly valuable red shrimp Aristeus antennatus, exhibited Hg levels exceeding the recommended consumption value of 0.5 μg/g wet weight and thus potentially pose a risk for human health. In addition to chemical analyses, biomarkers of pollution including enzymatic activities and gene expression profiles were used to determine the potential negative effects contaminant exposure may have on deep-sea biota. The biomarkers applied include enzymes involved in the xenobiotic metabolism such as the cytochrome P450 enzymes (CYPs), carboxylesterase (CbE) and glutathione-S-transferase (GST) as well as antioxidant responses such as catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPX), glutathione reductase (GR) and superoxide dismutase (SOD). The present work has shown that despite the lack of seasonal fluctuations of abiotic factors such as temperature and salinity in the Mediterranean deep-sea, organisms exhibit significant seasonal variability in enzymatic responses related to reproductive processes and food availability. Additional findings of the present work include the differential accumulation of POPs among fish species and compared to the crustacean Aristeus antennatus. Apart from factors such as habitat and feeding strategies, results indicated that differential CYP-mediated xenobiotic metabolism capacities between fish and crustacea may influence the variations in bioaccumulation patterns of POPs such as PCBs. Furthermore, novel biomarkers such as the gene expression of vitellogenin as indicator of endocrine disruption in male fish was applied for the first time to a deep-sea fish species, namely Alepocephalus rostratus. Furthermore, a major objective of this work was to investigate the particular case of submarine canyons, which are thought to act as natural conduits for particles and associated contaminants from surface waters to the deep ocean. In this sense, the present study showed that deep-sea organisms dwelling within the head of Blanes canyon, NW Mediterranean, might be particularly at risk from experiencing detrimental effects from exposure to anthropogenic pollutants., [spa] Durante mucho tiempo, el mar profundo se consideraba como el único medio exento de impacto antropogénico. Sin embargo, en las últimas décadas varios estudios han demostrado que el mar profundo no es tan prístino como se había pensado y que podría de hecho actuar como sumidero para contaminantes persistentes. Esta tesis tiene como objetivo de estudiar la bioacumulación de contaminantes orgánicos persistentes (COPs) en organismos del mar Mediterráneo profundo y los posibles efectos adversos que les pueden ocasionar. Con este fin, se determinaron los niveles de COPs legados como los bifenilos policlorados (PCBs), diclodifeniltricloroetano (DDTs), hexaclorociclohexanos (HCHs), y el penta- y hexaclorobenzeno (PeCB, HCB) y también de COPs emergentes como los polibromodifenil éteres (PBDEs). Además, se analizaron otros tipos de contaminantes como el mercurio (Hg) en musculatura y los metabolitos de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) y alquilfenoles (APs) en bilis. Los posibles efectos negativos asociados con la exposición a estos contaminantes se determinaron mediante biomarcadores enzimáticos y de expresión génica, incluyendo enzimas de citocromo P450 (CYPs), glutatión-S-transferasa (GST), carboxilesterasa (CbE), glutatión peroxidasa (GPX), glutatión reductasa (GR) y catalasa (CAT). Los resultados obtenidos indicaron que los organismos de las zonas profundas del Mediterráneo están potencialmente expuestos a múltiples tipos de contaminantes de los cuales algunos pueden causar efectos adversos. En este contexto, este estudio es el primero en investigar los niveles de COPs legados y los emergentes PBDEs en organismos de gran profundidad del Mediterráneo. Además, se analizó por primera vez la presencia de metabolitos de APs en una especie abisal aportando información relevante respeto a la presencia y destino de estos contaminantes en el medio marino. Un objetivo importante de esta tesis consistía en investigar la contaminación del cañón de Blanes, ya que los cañones submarinos podrían actuar como vía de transporte preferencial de contaminantes asociados a partículas debido a su proximidad de la costa y su estructura geomorfológica. En este sentido, los resultados sugirieron que los organismos que habitan la zona de la cabecera del cañón de Blanes presentan un riesgo mayor de sufrir efectos adversos asociados a la exposición a COPs.

[eng] The aim of this thesis was to study the function and regulation of two of the major players in the carbohydrate metabolism regulated by insulin, the facilitative glucose transporters GLUT2 and GLUT4, in teleost fish. In order to investigate the role of factors exerting a control on the transcription of the GLUT4 gene, we cloned the GLUT4 promoter in Fugu. The 5 ́-flanking region of the Fugu GLUT4 gene showed similar features to that in mammals. Structurally, comparative analysis between the cloned promoter sequence and that of other fish promoters revealed a high degree of conservation among teleost species. Furthermore, we demonstrated the functionality of the cloned Fugu GLUT4 promoter, and by generating several deletion constructs we were able to determine the minimal promoter. In this study, we have observed that the activity of the Fugu GLUT4 promoter is inhibited by insulin in a dose- and time-dependent manner. Furthermore, all the deletion constructs were repressed by insulin, suggesting the presence of regulatory elements downstream of the TSS. Next, we investigated the effects of PPARγ activation in L6 murine muscle cells transfected with the cloned Fugu GLUT4 promoter. Our results showed that stimulation with PG-J2 significantly stimulated the activity of the Fugu GLUT4 promoter and that this effect was abolished in the Fugu GLUT4 promoter deletions lacking the PPAR/RXR motifs. Finally, we investigated the in vitro effects of experimentally controlled muscle fiber contraction using C2C12 contractile cells expressing the construct containing the Fugu GLUT4 promoter. Using this system to mimic the effects of exercise in vitro in differentiated myotubes we showed an increase in the transcriptional activity of the Fugu GLUT4 promoter. Next studying the function of GLUT2 at early developmental stages we investigated the expression pattern of GLUT2 during embryonic development in zebrafish by ISH, observing transcripts in the liver, pronephric tubules, anterior intestine, endocrine pancreas and neurons surrounding the hindbrain region. To study its function during the early developmental stages in zebrafish we knocked down GLUT2 using antisense morpholinos. Our results showed that embryos lacking GLUT2 display a delay of the whole body development with severe alterations in the midbrain and hindbrain ventricles. Next, by studying the functional alterations triggered by the lack of GLUT2 we observed that morphant embryos displayed an impairment of glucose uptake in the whole body but especially in the head region. Interestingly, a similar pattern was found when assaying cell viability in these embryos, showing a significant increase in apoptotic cell death, mainly located in the cephalic area. Furthermore, blocking the expression of GLUT2 resulted in alterations in the asymmetric distribution of some endoderm-derived organs shown to express this glucose transporter, namely the liver and the endocrine and exocrine pancreas. Additionally, we studied the transcriptional alterations in these embryos by microarray analysis. Finally, we set out to establish an in vitro system using the mammalian β-cell line MIN6 in order to further study the physiological function of zebrafish GLUT2. Our results showed that we were able to knockdown endogenous GLUT2 leading to a loss of glucose-stimulated insulin secretion in MIN6 cells. Furthermore, we successfully established the conditions for the expression of zebrafish GLUT2 in MIN6 and observed a significantly increase in the basal glucose uptake in the pancreatic cells. In addition, preliminary results point to a possible increase in the glucose uptake in cells expressing the rat GLUT2 construct., [spa] El objetivo de esta tesis fue estudiar la función y regulación de dos de los principales implicados en el metabolismo glucídico regulado por la insulina, los transportadores de glucosa GLUT2 y GLUT4, en los peces teleósteos. En vertebrados no mamíferos, GLUT2 ha sido poco caracterizado hasta la fecha. Se ha demostrado en varias especies de teleósteos que GLUT2 se expresa en los principales tejidos sensibles a la insulina, similar a lo que se describe en los mamíferos. Sin embargo, las propiedades funcionales y el papel fisiológico de GLUT2 apenas han sido descritos en peces. En vista de ello, se ha caracterizado GLUT2 en el pez cebra, ya que dicha especie es uno de los modelos más reconocidos para el estudio de la fisiología, el desarrollo y el metabolismo. En cuanto a GLUT4, nuestro grupo ha sido pionero en la investigación de este transportador en peces teleósteos desde que Planas et al. caracterizaron el primer homologo de GLUT4 en vertebrados inferiores. A pesar de que se ha estudiado más este transportador de glucosa que GLUT2, la información sobre los factores que intervienen en la regulación de la transcripción del gen GLUT4 han sido escasamente caracterizados en mamíferos, mientras que no hay datos disponibles en los vertebrados inferiores. Para ello, en este estudio hemos analizado la regulación de un promotor de GLUT4 de teleósteos bajo la acción de estímulos con conocida capacidad para modular la transcripción y la expresión de GLUT4 en los mamíferos, como la insulina, la contracción de fibras musculares y PPARs.

[eng] Stable isotopes, as tracers of the food chain, have been used to characterize the relationship between consumers and their food since isotopic fractionation implies discrimination against certain isotopes. But stable isotope analyses (SIA) can also be carried out in fish reared with artificial diets, as gilthead sea bream (Sparus aurata), the species most cultivated in the Mediterranean. Changes in natural abundance of stable isotopes (13C and 15N) in tissues and its reserves may reflect changes in the use and turnover of nutrients as the catabolic enzymes involved in the processes of decarboxylation and deamination show a preference for the lighter isotopes. Therefore these analyses can provide us useful information about the nutritional and metabolic status of fish. The aim of this project was to determine the capacity of stable isotopes to be used as potential markers of growth capacity and rearing conditions in sea bream. In this sense, stable isotope analyses have been combined with other metabolic (cytochrome-c-oxidase, COX, and citrate synthase, CS, activities) and growth parameters (RNA, DNA). The set of results obtained from the different studies conducted in this project shows that SIA, in combination with other metabolic parameters, can serve as an effective tool in discriminating fish with better growth potential as well as sensitive marker of nutritional status and fattening. Moreover, combination of stable isotopes analysis with emerging tools such as proteomic techniques (2D-PAGE), provide new insights on the metabolic changes occurring in fish muscles during exercise induced growth., [spa] Els isòtops estables com a traçadors de la cadena alimentària s'han utilitzat per caracteritzar la relació entre els consumidors i els seus aliments, ja que el fraccionament isotòpic implica una discriminació en contra de certs isòtops. Però les anàlisis d'isòtops estables (SIA), també es poden dur a terme en peixos cultivats amb dietes artificials, com la orada (Sparus aurata), la especie més cultivada a la Mediterrània. Canvis en l'abundància natural d'isòtops estables (13C i 15N) en els teixits i les seves reserves poden reflectir els canvis en l'ús i reciclatge dels nutrients ja que els enzims catabòlics implicats en els processos de descarboxilació i desaminació mostren una preferència pels isòtops més lleugers. Per tant, aquestes anàlisis ens poden proporcionar informació útil sobre l'estat nutricional i metabòlic dels peixos. L'objectiu d'aquest projecte va ser determinar la capacitat dels isòtops estables per ser utilitzats com a marcadors potencials de la capacitat de creixement i condicions de cria de l'orada. En aquest sentit, les anàlisis d'isòtops estables s'han combinat amb altres metabòlics (activitats citocrom-c-oxidasa, COX, i citrat sintasa, CS) i els paràmetres de creixement (ARN/ADN). El conjunt de resultats obtinguts en els diferents estudis realitzats en aquest projecte demostra que el SIA, en combinació amb altres paràmetres metabòlics, pot servir com una eina eficaç per discriminar els peixos amb millor potencial de creixement, així com a marcador sensible de l'estat nutricional i d'engreix. D'altra banda, la combinació de l'anàlisi d'isòtops estables amb les eines emergents, com ara tècniques de proteòmica (2D-PAGE), ens proporciona nous coneixements sobre els canvis metabòlics que ocorren en els músculs dels peixos durant l’increment del creixement muscular induït per l'exercici.

[cat] INTRODUCCIÓ: L'estandardització de mesures d’hemoglobina glicada A(1c) (HbA(1c)) ha estat una de les principals preocupacions en el camp de la bioquímica clínica des de la publicació dels estudis DCCT i UKPDS. Des del desenvolupament del mètode de referència per a mesurar específicament hemoglobina glicada A(1c) en sang humana, s’han publicat equacions per a la transformació de resultats traçables al sistema de referència de la IFCC a resultats traçables als sistemes d’estandardització japonès (JDS/JSCC) i nord-americà (NGSP). Existeixen alguns inconvenients en l’ús d’equacions com el baix nombre de mostres utilitzat en el seu desenvolupament. L’objectiu principal d’aquest estudi fou elucidar dues equacions per a la transformació de resultats traçables al sistema de referència IFCC a resultats traçables als esquemes japonès i nord-americà. Estudiar les implicacions clíniques dels resultats obtinguts, la relació entre, por una banda, de la concentració basal de glucosa en sang amb la concentració de glucosa mitjana estimada a partir del resultat de HbA(1c) i, per altra, de la relació entre la mitjana de les concentracions basals de glucosa i el valor de HbA(1c) i, per últim, l’estudi de la capacitat diagnòstica de la concentració basal de glucosa respecte la HbA(1c). MATERIAL I MÈTODES: Es mesurà el percentatge d’hemoglobina glicada A(1c) en 3000 mostres de sang total per al desenvolupament de cadascuna de les equacions (2000 per a l’elucidació de cada equació i 1000 per a estudiar les diferències entre diferents valors d’hemoglobina A(1c) obtinguts) en dos analitzadors, un calibrat traçable al sistema de referència de la JDS/JSCC o al sistema de referència de la NGSP i un altre calibrat de forma traçable al mètode de referència de la IFCC. S’obtingueren les dues equacions mitjançant mètodes de regressió lineal simple. RESULTATS: Les equacions obtingudes foren: JDS/JSCC(%) = 1,0545*IFCC(%) + 1,129(%) (R^2 = 0,9972) i NGSP(%) = 0,9293*IFCC(%) + 2,1054(%) (R^2 = 0,9979). S’observaren diferències estadísticament significatives entre els resultats obtinguts mitjançant l'utilizació tan de les equacions anteriorment publicades como de les desenvolupades en el present treball i els resultats obtinguts directament de l’analizador. En quant a l’estudi de les seves implicacions clíniques, no s’observà relació lineal entre la concentració basal de glucosa en sang i el valor de la concentració mitjana de glucosa en sang estimada a partir dels valors de HbA(1c), així com tampoc s’observà cap tipus de relació lineal entre el valor de la concentració basal mitjana de glucosa en sang i el valor d’HbA(1c). No s’observaren millors resultats en els paràmetres diagnòstics en l’ús de la concentració basal de glucosa respecte de la mesura d’HbA(1c). CONCLUSIONS: Es possible realitzar la transformació de resultats d’HbA(1c) traçables al sistema de referència de la IFCC a valors traçables als esquemes d’estandardització japonès i nord-americà mitjançant les equacions desenvolupades en el present estudi. L’elevat nombre de mostres utilitzat en el desenvolupament de les equacions proporciona una notable robustesa a les mateixes, garantint-se la qualitat dels resultats obtinguts mitjançant la seva utilització. No s’observà cap tipus de relació lineal entre la concentració de glucosa basal en sang i la glucosa mitjana estimada a partir de l’HbA(1c), ni entre la mitjana de les concentracions basals de glucosa i el valor d’hemoglobina glicada, pel que no es poden obtenir equacions lineals per a l’estimació d’aquestes variables. La HbA(1c) segueix essent la millor prova de laboratori per a el diagnòstic de diabetis mellitus i l’avaluació del control metabòlic dels pacients diabètics., [eng] INTRODUCTION: HbA(1c) measurements are the cornerstone in diabetic patient’s control. Master equations have been published to transform values from the reference method to values traceable to national standardization systems. There are diverse inconveniences in these equations like low sample number use and heterogeneity of methods used to develop equations. The aim of this study was to obtain two equations for reference method values transformation to values traceable to the JDS/JSCC and the NGSP standardization schemes and to compare it with the already published equations. A secondary objective was to study the clinical implications of the obtained results and the relationship between fasting plasma glucose and average estimated glucose concentrations derived from HbA(1c) values and, on the other hand, the relationship between mean values of fasting plasma glucose and HbA(1c) values. MATERIAL AND METHODS: HbA(1c) was measured in 3000 blood samples in two analyzers calibrated traceably to the JDS/JSCC and the NGSP schemes and to the reference method. Two equations for value transformation were developed by simple linear regression methods with use of 2000 paired values and compared with the already published equation using 1000 HbA(1c) values. RESULTS: The equations obtained were JDS/JSCC(%) = 1,0545*IFCC(%) + 1,129(%) (R^2 = 0,9972) i NGSP(%) = 0,9293*IFCC(%) + 2,1054(%) (R^2 = 0,9979). Statistically significant differences were found between the results obtained using these equations, the results obtained with the published equations and those obtained directly from the analyzer. No linear relationship were found neither between fasting plasma glucose and average estimated glucose concentrations derived from glycohemoglobin values nor between mean values of fasting plasma glucose and glycohemoglobin values. Fasting plasma glucose does not provide better diagnostic parameters than HbA(1c) CONCLUSIONS: These new developed master equations are useful tools to transform reference method values to the JDS/JSCC and NGSP schemes values. The elevated nunber of values used in its development provides high robustness to the equations. HbA(1c) remains as the best laboratory test for the evaluation of diabetic patients.

[spa] En la actualidad la proteómica es una de las herramientas más utilizadas en el estudio de diferentes patologías. Los recientes avances en la proteómica incluyen desde la preparación de la muestra, la espectrometría de masas (MS) y el análisis de datos; convirtiendo esta tecnología en un método básico para la investigación biomédica. La espectrometría de masas (MS) es la base de la proteómica, este campo ha evolucionado muy rápido, permitiendo en la actualidad realizar análisis cualitativos y cuantitativos de las proteínas, además de poder evaluar sus modificaciones post-, la localización subcelular y las interacciones de proteínas. En el desarrollo de este trabajo hemos introducido de manera muy sencilla algunas técnicas de proteómicas para abordar las preguntas diferentes preguntas relacionadas con la patología de las enfermedades neuromusculares. • Las enfermedades neuromusculares (ENM) comprenden un grupo heterogéneo de patologías que pueden afectar a la médula espinal del motor, y las raíces sensoriales, los nervios periféricos, unión neuromuscular y músculo esquelético. Las (ENM) constituyen un grave problema sanitario y social porque en un elevado porcentaje de casos producen invalidez por debilidad muscular progresiva y crónica. Estas enfermedades afectan tanto a personas adultas y ancianos como a jóvenes y niños y además de su efecto personal y familiar devastador tienen un elevadísimo coste económico. El diagnóstico de estas enfermedades se basa en el examen neurológico, pruebas electrofisiologícas, la resonancia magnética, biopsia del músculo y nervio y la detección de autoanticuerpos en el suero y liquido cefalorraquídeo del paciente. La técnica de proteómica que nos ha permitido identificar nuevas moléculas candidatas en alguna de la patologías neuromusculares estudiadas es la electroforesis bidimensional (2D-E) que dependiendo de nuestros objetivos la aplicamos con diversos esquemas, como lo describiremos: • Utilizamos la electroforesis bidimensional como una herramienta de estudio para identificar los cambios en la expresión de las proteínas en la muestra del paciente durante la progresión de la enfermedad y después de una intervención terapéutica. Hemos estudiado un paciente con escleromixedema, una mucinosis dérmica que en algunos casos también afecta al músculo esquelético. Incremento de la proliferación de fibroblastos de la piel asociada frecuentemente a una gammapatía monoclonal. El análisis de esta se ha realizado apartir de cultivos primarios de los fibroblastos del paciente antes enfermo y después del tratamiento. • Identificación de los antígenos diana de nuevos autoanticuerpos en el suero de pacientes con neuropatías inmunomediadas. Hemos combinado la electroforesis bidimensional y Western-blot con suero de paciente para identificar nuevos autoanticuerpos. En este trabajo se encontró una fuerte reactividad contra la P2, una proteína de la mielina. Los resultados fueron validados por ELISA. Nuestros datos amplían el espectro en las neuropatías disinmunes adquiridas y sugieren que la reactividad contra las proteínas de la mielina pueden estar relacionados con una implicación, sobre todo radicular, de una presentación clínica de ataxia sensitiva y alteración motora que se asemeja clínicamente CIDP. • El uso de geles de electroforesis bidimensionales, en un estudio comparativo del perfil de expresión proteica en músculos esqueléticos de controles sanos y pacientes afectos con distintas distrofias musculares (disfelinopatia, calpainopatia, facioescapulohumeral), para identificar proteínas diferencialmente expresadas y específicas en cada una de ellas. Este estudio nos mostro proteínas que eran comúnmente expresadas en todas las distrofias estudiadas y diferencialmente del musculo control. Nosotros centramos nuestros resultados a evaluar las proteínas que eran especificas de la disferlinopatia, y encontramos Incremento en la expresión de las proteínas contráctiles fosforiladas específicas de las fibras tipo I (TPN1, TPM1) lo que sugiere un proceso de transición de tipo de fibra en los pacientes con disferlinopatía. Una sobreexpresión de Rho GDI afecta los niveles de expresión de miogenina proteína necesaria para la diferenciación celular. Lo más relevante de este trabajo fue el hallazgo de una nueva proteína la TRIM 72 incrementada en los pacientes con disferlinopatia, proteína que no se conocía en ese momento su función y que un año más tarde salieron 2 artículos en las indican que esta participa en la reparación de la membrana al igual que la disferlina de hecho estas proteínas forman parte de un mismo complejo implicado en procesos de reparación. Por lo tanto un incremento de la expresión de TRIM 72 en nuestro trabajo sugiere un mecanismo compensatorio por la ausencia de disferlina., [eng] Proteomic techniques application to study neuromuscular diseases Nowadays, proteomics constitutes one of the most frequently used tools to study human diseases. Recent advances in proteomics, including sample preparation, mass spectrometry and data analysis, make this technology a central approach for biomedical research. Mass spectrometry is the basis for proteomics. This field has evolved very fast in terms of development of qualitative and quantative analysis of proteins, dissection of post-translational modifications and unravelling subcellular location and interactions between proteins. Neuromuscular diseases encompass a heterogeneous group of pathologies that can affect from the spinal cord, motor and sensory roots, peripheral nerves, neuromuscular junction and skeletal muscle. Neuromuscular diseases have a high impact on the health system and society because in many cases they lead to patient’s disability due to a progressive muscle weakness. The diagnosis of these diseases is based on neurological examination, electrophysiology, muscle MRI, nerve or muscle biopsy and detection of autoantibodies in patient’s sera. In this thesis we have applied different proteomic strategies to address questions related to the pathophysiology of the neuromuscular diseases studied: • The use of bidimensional electrophoresis as a tool to identify changes in protein expression in patient’s sample during the progression of the disease and after a therapeutic intervention. We have studied a patient with scleromyxedema, a dermic mucinosis that in some cases also affects skeletal muscle. Analysis of fibroblasts proliferation has been analyzed before and after treatment. • Identification of new target antigens of autoantibodies in the sera of patients with immune-mediated neuropathies. We have combined bidimensional electrophoresis and Western-blot and found autoantibodies against P2, a myelin protein. Results were validated by ELISA • The use of bidimensional electrophoresis gels stained with different dyes to perform a qualitative and quantitative analysis of different muscular dystrophies. We found changes common to all dystrophic samples and differential expression of some proteins specific for each muscular dystrophy.

[cat] L’àcid 3-nitropropiònic (3NP) és una toxina d’origen vegetal la ingesta de la qual produeix, en humans, una síndrome neurològica que presenta una simptomatologia similar a la de la malaltia de Huntington (MH). Injectada a rosegadors o primats, la toxina s’ha utilitzat per desenvolupar models animals de la MH, ja que els produeix lesions similars a les observades a l’esmentada malaltia, consistents en una afectació específica del cos estriat del seus cervells. A nivell bioquímic, aquesta molècula inhibeix de forma irreversible la succinat deshidrogenasa mitocondrial, i per tant el complex II de la cadena respiratòria. Això provoca una disminució a la producció d’ATP, punt de posada en marxa dels mecanismes d’excitotoxicitat secundària i de producció d’espècies reactives d’oxigen i per tant, de l’estrès oxidatiu, que porten a l’activació de diferents vies metabòliques de la neurona responsables de la seva mort, com són la necrosi o l’apoptosi mediades per l’activació de calpaïnes i caspases respectivament. Pel que fa a l’apoptosi, es pensa que la reactivació del cicle cel•lular podria estar involucrada en la seva activació. Reforçant aquesta idea, nombrosos estudis han detectat activació de diferents proteïnes reguladores del cicle cel•lular en teixit post mortem de pacients afectats de malalties neurodegeneratives. Per altra banda, el 3NP produeix alteracions a la permeabilitat de la barrera hematoencefàlica (BHE) dels rosegadors tractats i, recentment, s’ha vist que un dels mecanismes que pot estar implicat en aquest fet és la digestió per part de la gelatinasa MMP-9. Així, els objectius d’aquesta tesi consisteixen en estudiar la possible participació de la reactivació del cicle cel•lular en la neurodegeneració induïda en rates per l’administració del 3NP, i per altra banda caracteritzar les alteracions de la permeabilitat de la BHE i el paper que les gelatinases MMP-2 i MMP-9 i altres tipus cel•lulars com astròcits i micròglia hi poden jugar. Pel que fa al primer objectiu, s’ha vist que, tot i que s’ha detectat l’activació d’elements del cicle cel•lular a la lesió dels animals tractats, la reactivació del cicle cel•lular no intervé en la posada en marxa de la neurodegeneració provocada per la toxina, i s’ha arribat a la conclusió que l’expressió d’aquests elements pot estar relacionada amb una resposta tardana encaminada a la supervivència cel•lular. A partir d’aquí, s’han estudiat diferents proteïnes que poden estar relacionades amb la mort neuronal, com ATM, p53, Akt i GSK3beta. Els resultats que s'han obtingut en aquest cas indiquen que la pèrdua de la forma activa de l’Akt i la inhibició de la GSK3beta poden estar relacionades amb la neurodegeneració induïda pel 3NP. Pel que fa a l’estudi de les alteracions de la BHE, s’ha observat que, a la zona lesionada dels animals tractats amb 3NP, hi ha una gran alteració dels seus components com són les cèl•lules endotelials, la proteïna de les unions estretes ZO-1 i la laminina, component bàsic de la membrana basal dels vasos. Finalment, s’ha comprovat que la MMP-9 i la micròglia reactiva juguen un paper destacat a la degradació de la microvasculatura cerebral afectada per l’administració del 3NP., [eng] 3-nitropropionic acid (3-NPA) is a natural toxin that provokes, in humans, a neurological symptomatology which is similar to that observed in Huntington’s disease (HD). When injected to rodents or primates, it produces cerebral lesions, mainly located in their striata, which are similar to those observed in the brains of HD patients. 3-NPA irreversibly inhibits mitochondrial succinate dehidrogenase, which in turn causes a decrease in ATP production that triggers secondary excitotoxicity and reactive oxygen species production. These events lead neurons to their death by necrosis or apoptosis. It has been suggested that cell cycle re-entry may be involved in the activation of the apoptotic cascade. Reinforcing this, the activation of different cell cycle elements has been detected in post mortem brains of pacients affected by neurodegenerative diseases. Furthermore, blood brain barrier (BBB) disfunction has been detected in rodents administrated with 3-NPA, and it has been recently proposed that matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) is involved in this process. The main objectives of this work were to study the role of cell cycle re-entry in the striatal neurodegeneration induced by 3-NPA and to characterize the alterations of BBB permeability. Regarding BBB impairment, the role of MMP-2 and MMP 9 and other cellular types such as astrocytes and microglia was considered. Although activation of G1 phase cell cycle elements was detected in the striatal lesion of 3-NPA treated rats, it was concluded that cell cycle re-entry was not involved in the activation of the neurodegenerative process, but it might be related to a late survival response. Moreover, it was shown that the loss of the active form of Akt and the inhibition of GSK3beta might be linked to the striatal neurodegeneration induced by 3-NPA. Furthermore, severe alterations in the permeability of the BBB and in the staining pattern of some of its components such as endothelial cells, tight junctions and basement membrane were detected in the striatal lesion of treated rats. Finally, gelatinolytic activity, which was mainly attributed to MMP-9, and reactive microglia were profusely detected around the injured vessels in the striatal lesion of 3-NPA, indicating that they might play a determinant role in BBB disruption in this model

[cat]Les hormones del sistema renina-angiotensina-aldosterona i la vasopressina són essencials pel manteniment de l’homeòstasi del Na+ i del volum del líquid extracel•lular. En el còlon distal de rata, l’aldosterona regula l’expressió del canal apical de Na+ (ENaC) i l’activitat de l’ATPasa depenent de Na+ i K+, i també té efectes tròfics, estimulant la proliferació dels miofibroblasts de la beina pericriptal. Els objectius principals d’aquest treball són aprofundir en els mecanismes implicats en la funció del còlon en reabsorbir Na+ i aigua, conèixer el paper de l’aldosterona i de la vasopressina i establir la funció reguladora d’aquestes hormones a nivell dels colonòcits i dels miofibroblasts. Els estudis s’han fet en un model in vitro emprant colonòcits humans de la línia T84 i miofibroblasts de la línia CCD-18Co. L’aldosterona estimula la proliferació cel•lular dels miofibroblasts, augmenta l’expressió de l’mRNA de l’EGF i la seva concentració al medi de cultiu al cap de 24 h. L’addició exògena de l’EGF estimula els miofibroblasts de forma similar al tractament amb l’hormona. A més, quan els CCD-18Co són pre-incubats amb l’anticòs anti-EGF o amb l’inhibidor del receptor de l’EGF i, posteriorment, tractats amb l’aldosterona s’inhibeix la proliferació cel•lular, fet que indica que els efectes de l’aldosterona sobre la proliferació són mediats per l’EGF mitjançant les vies reguladores PI3K/AKT i Ras/Raf/MAPK. La incubació dels colonòcits amb medi provinent dels CCD-18Co tractats amb aldosterona (medi condicionat), incrementa la proliferació cel•lular i l’expressió de proteïnes de les unions estretes. Aquests efectes no s’han observat amb l’addició directe de l’aldosterona als colonòcits. Experiments realitzats in vivo suggereixen que l’EGF també hi té un paper mediador donat que s’observa un increment en la fosforilació del receptor d’EGF en els animals que presenten hiperaldosteronisme secundari. Pel que fa a la vasopressina, el tractament dels miofibroblasts amb aquesta hormona estimula la proliferació cel•lular i l’expressió de l’mRNA del PDGFA al cap de 24 h. El PDGFA afegit de forma exògena estimula les cèl•lules CCD-18Co de forma similar a l’observada amb la vasopressina. A més, quan les cèl•lules es pre-incuben amb l’anticòs anti-PDGFA o amb l’inhibidor del receptor del PDGFA i són tractats amb vasopressina, s’inhibeixen els efectes hormonals. La proliferació cel•lular dels CCD-18Co tractats amb vasopressina té lloc a través de l’activació de les vies PI3K/AKT i Ras/Raf/MAPK. Els colonòcits incubats amb el medi condicionat provinent dels CCD-18Co tractats amb vasopressina, incrementen la proliferació cel•lular i l’expressió de proteïnes del complex d’unió. Mentre que l’addició directa de la vasopressina sobre els colonòcits no ha modificat cap variable. L’addició del PDGFA modifica la proliferació dels colonòcits. Aquest estudi indica que l’aldosterona i la vasopressina cooperen en la regulació de l’estructura i funció de les criptes del còlon en resposta a canvis en la ingestió de Na+ i d’aigua, com part del mecanisme de regulació general de l’osmolalitat del líquid extracel•lular., [eng]The hormones of the renin-angiotensin-aldosterone system and vasopressin are essential for maintaining Na+ homeostasis and extracellular fluid volume. In the rat distal colon, aldosterone regulates the expression of apical Na+ channel, and the activity of the ATPase-dependent Na+ and K+, and also has trophic effects by stimulating the proliferation of myofibroblasts of the pericryptal sheath. The main objectives of this study are to deepen the understanding of the mechanisms involved in the function of the colon to reabsorb Na+ and water, as well as the role of aldosterone and vasopressin and establish the regulatory effects of these hormones at the colonocytes and myofibroblasts. Experiments were conducted in vitro, using human colonocytes T84 and myofibroblasts CCD-18Co cell lines. The results indicate that aldosterone stimulates the proliferation of CCD-18Co, increases the expression of EGF mRNA and EGF concentration in the culture medium at 24h. Moreover, when the CCD-18Co cells were preincubated with anti-EGF or the EGFR inhibitor and subsequently treated with aldosterone, cell proliferation is inhibited, showing that the effects of aldosterone are mediated by the EGF through regulatory PI3K/AKT and Ras/Raf/MAPK pathways. The colonocytes incubation with media previously treated with CCD-18Co cells and aldosterone (conditioned medium) increases cellular proliferation and expression of junctional complex proteins. The results of in vivo experiments suggest that EGF plays a role as mediator because the rats with secondary hyperaldosteronism have an increase in the phosphorylation of EGFR. On the other hand, the treatment of myofibroblasts with vasopressin for 24h augmented the cellular proliferation and PDGFA expression. When myofibroblasts were pre-incubated with the anti-PDGF antibody or PDGFR inhibitor, hormonal effects were inhibited. These results indicate that cellular proliferation of CCD-18Co treated with vasopressin occurs through the activation of the PI3K/AKT and Ras/Raf/MAPK pathways. When colonocytes were treated with conditioned medium in the presence of vasopressin increased cellular proliferation and expression of junctional complex proteins. This study suggests that aldosterone and vasopressin cooperate in regulating the structure and functions of the crypts of the colon in response to changes in intake of Na+ and water as part of the mechanism of regulation general osmolarity of extracellular fluid.

Els isòtops estables com a traçadors de la cadena alimentària, s'han utilitzat per caracteritzar la relació entre els consumidors i els seus aliments, ja que el fraccionament isotòpic implica una discriminació en contra de certs isòtops. Però les anàlisis d'isòtops estables (SIA), també es poden dur a terme en peixos cultivats amb dietes artificials, com la orada (Sparus aurata), la especie más cultivada en el Mediterráneo. Canvis en l'abundància natural d'isòtops estables (13C i 15N) en els teixits i les seves reserves poden reflectir els canvis en l'ús i reciclatge dels nutrients ja que els enzims catabòlics implicats en els processos de descarboxilació i desaminació mostren una preferència pels isòtops més lleugers. Per tant, aquestes anàlisis ens poden proporcionar informació útil sobre l'estat nutricional i metabòlic dels peixos. L'objectiu d'aquest projecte va ser determinar la capacitat dels isòtops estables per ser utilitzats com a marcadors potencials de la capacitat de creixement i condicions de cria de l'orada. En aquest sentit, les anàlisis d'isòtops estables s'han combinat amb altres metabòlics (activitats citocrom-c-oxidasa, COX, i citrat sintasa, CS) i els paràmetres de creixement (ARN/ADN). El conjunt de resultats obtinguts en els diferents estudis realitzats en aquest projecte demostra que el SIA, en combinació amb altres paràmetres metabòlics, pot servir com una eina eficaç per discriminar els peixos amb millor potencial de creixement, així com a marcador sensible de l'estat nutricional i d'engreix. D'altra banda, la combinació de l'anàlisi d'isòtops estables amb les eines emergents, com ara tècniques de proteòmica (2D-PAGE), ens proporciona nous coneixements sobre els canvis metabòlics que ocorren en els músculs dels peixos durant l‟increment del creixement muscular induït per l'exercici. Stable isotopes, as tracers of the food chain, have been used to characterize the relationship between consumers and their food since isotopic fractionation implies discrimination against certain isotopes. But stable isotope analyses (SIA) can also be carried out in fish reared with artificial diets, as gilthead sea bream (Sparus aurata), the species most cultivated in the Mediterranean. Changes in natural abundance of stable isotopes (13C and 15N) in tissues and its reserves may reflect changes in the use and turnover of nutrients as the catabolic enzymes involved in the processes of decarboxylation and deamination show a preference for the lighter isotopes. Therefore these analyses can provide us useful information about the nutritional and metabolic status of fish. The aim of this project was to determine the capacity of stable isotopes to be used as potential markers of growth capacity and rearing conditions in sea bream. In this sense, stable isotope analyses have been combined with other metabolic (cytochrome-c-oxidase, COX, and citrate synthase, CS, activities) and growth parameters (RNA, DNA). The set of results obtained from the different studies conducted in this project shows that SIA, in combination with other metabolic parameters, can serve as an effective tool in discriminating fish with better growth potential as well as sensitive marker of nutritional status and fattening. Moreover, combination of stable isotopes analysis with emerging tools such as proteomic techniques (2D-PAGE), provide new insights on the metabolic changes occurring in fish muscles during exercise induced growth.

Investigar en un modelo de corazón aislado de conejo, el efecto de la realización regular de ejercicio físico sobre las modificaciones que la oclusión arterial coronaria aguda ejerce sobre las propiedades miocárdicas ventriculares relacionadas con la mayor o menor facilidad para la instauración de arritmias por re-entrada, esto es, la refractariedad, la velocidad de conducción, la longitud de onda, la frecuencia dominante y la heterogeneidad electrofisiológica. Asimismo, constituye objetivo de la investigación, determinar en situación de normoxia, la inducibilidad de la fibrilación ventricular (FV), y realizar el análisis cuantitativo de la energía necesaria para revertir el proceso de la fibrilación en los corazones aislados durante isquemia regional aguda y procedentes de animales sometidos a un protocolo de ejercicio físico. Toda esta investigación ha ido encaminada a tratar de aportar nuevos datos que intenten explicar mecanismos por los cuales el ejercicio físico regular ejerce un efecto protector frente a la muerte súbita cardíaca. MÉTODOS: Aplicamos a un grupo de conejos (n = 23) un protocolo de entrenamiento físico en cinta rodante, mientras que a otro grupo (n = 27) lo estabulamos durante el mismo período sin someterlo a ejercicio. Finalizado el proceso de entrenamiento (durante el que determinamos la concentración de lactato venosa) y/o de estabulación, procedimos a la extracción y posterior aislamiento del corazón (método tipo Langendorff). Situamos electrodos de estimulación y registro en ventrículo izquierdo. Determinamos los siguientes parámetros: la longitud del ciclo sinusal básico, el período refractario efectivo ventricular (PREV) y el período refractario funcional ventricular (PRFV) determinados en ritmo sinusal, el período refractario funcional determinado durante la fibrilación ventricular inducida (PRFFV), la velocidad de conducción ventricular (VC), la longitud de onda del proceso de activación miocárdica ventricular (LO), el análisis espectral de la fibrilación ventricular inducida para la determinación de la frecuencia dominante media (FD), y el coeficiente de variación (CV) de ésta última como índice de heterogeneidad electrofisiológica miocárdica ventricular. Los parámetros se determinaron en condiciones de normal perfusión y tras la oclusión aguda de la arteria coronaria circunfleja. También analizamos la inducibilidad de la FV y cuantificamos la energía necesaria a aplicar mediante choques eléctricos, para revertir el proceso fibrilatorio. RESULTADOS: Los parámetros que se modificaron en situación de perfusión normalmente oxigenada fueron: El PREV y el PRFV tendieron al aumento en el grupo entrenado. Fue mayor en el animal entrenado, el PRFFV, y menor el CV de la FD y la inducibilidad de la FV. Tras la oclusión coronaria aumentó el PRFFV (más en el control); disminuyó la VC y LO, siendo menor la disminución de la LO en el grupo entrenado, y tendiendo a ser menor la disminución de la VC en los entrenados. Tras la oclusión coronaria la FD de la FV disminuyó en el grupo control, mientras que en el grupo entrenado se mantuvo en los momentos más prematuros de la isquemia; El CV de la FD de la FV aumentó en los controles y se mantuvo sin modificaciones significativas en los entrenados. La energía mínima necesaria requerida para interrumpir el proceso de fibrilación, durante isquemia regional aguda, fue menor en los animales entrenados frente a los controles. CONCLUSIONES: A la vista de los resultados obtenidos concluimos que: El ejercicio físico crónico podría: en el miocardio normalmente perfundido: 1) aumentar la refractariedad; 2) disminuir la heterogeneidad electrofisiológica miocárdica ventricular; y 3) disminuir la vulnerabilidad a la fibrilación ventricular. En el miocardio sometido a isquemia regional aguda, el ejercicio físico crónico podría: 4) proteger frente al deterioro morfofuncional debido a la isquemia; 5) disminuir la heterogeneidad electrofisiológica miocárdica ventricular; 6) aumentar la longitud de onda del proceso de activación: y 7) creando mejores condiciones electrofisiológicas que facilitarían la reversión mediante choques eléctricos, del proceso de la fibrilación ventricular y dificultarían la instauración de FV. Se contribuye a asentar que el ejercicio físico regular ejerce un efecto depresor sobre el cronotropismo sinusal intrínseco, no sometido a influencias nerviosas centrales ni humoro-hormonales. La realización de ejercicio físico crónico podría producir modificaciones electrofisiológicas de carácter protector, tanto en el miocardio ventricular normal, como en el sometido a isquemia regional aguda. To investigate in a model of isolated rabbit heart the effect of regular exercise on changes that acute coronary artery occlusion has on ventricular myocardial properties, related to the degree of ease for the establishment of reentrants arrhythmias that are, refractoriness, conduction velocity, the wavelength, the dominant frequency and electrophysiological heterogeneity. Likewise, it is the aim of this research to determine, in normoxia, the inducibility of ventricular fibrillation (VF), and to perform the quantitative analysis of the energy required to reverse the fibrillation in isolated hearts during acute regional ischemia of animals subjected to a physical exercise protocol. All this research has been aimed at trying to provide new data that attempt to explain mechanisms by which regular exercise exerts a protective effect against sudden cardiac death. METHODS: We applied to a group of rabbits (n = 23) a protocol of physical training on treadmill, while another group (n = 27) was housed in the animal quarters during the same period but without physical exercise. After the training process (during which we determined the venous lactate concentration) and/or the housing period, we proceeded to the extraction and subsequent isolation of the heart (Langendorff’s Method). We placed stimulation and recording electrodes in the left ventricle. The following parameters were determined: the basal sinus cycle length, ventricular effective refractory period (VERP) and ventricular functional refractory period (VFRP) determined in sinus rhythm, functional refractory period determined during induced ventricular fibrillation (FRPVF) , the ventricular conduction velocity (CV), the wavelength of the ventricular myocardial activation process (WL), the spectral analysis of induced ventricular fibrillation for the determination of mean dominant frequency (DF), and the variation coefficient (VC) of this last as an index of electrophysiological heterogeneity of ventricular myocardium. The parameters were determined under conditions of normal perfusion after acute occlusion of the circumflex coronary artery. We also quantified the energy required to apply to reverse the process of VF by electric shock. RESULTS: The parameters that were modified in a normal perfusion were: VERP and VFRP tended to increase in the trained group. It was higher in the trained animal, the FRPVF, and was lower, the VC of the DF and the inducibility of VF. After coronary occlusion it increased the FRPVF (more in control), it decreased the VC and WL, with less decrease in the trained group, and tending to a lower decrease of the VC in the trained group. After coronary occlusion DF of VF decreased in the control group, whereas in the trained group was maintained; the CV of the DF of VF increased in controls and remained without significant changes in the trained group. The minimum energy required to disrupt the process of fibrillation during acute regional ischemia was lower in trained animals comparing to controls. CONCLUSIONS: In view of these results, we conclude that the chronic physical exercise could: In myocardium normally perfused: 1) increase the refractoriness, 2) decrease the ventricular myocardial electrophysiological heterogeneity, and 3) decrease the vulnerability to ventricular fibrillation. In the myocardium subjected to acute regional ischemia, the chronic physical exercise may: 4) protect against morphofunctional deterioration due to ischemia, 5) reduce ventricular myocardial electrophysiological heterogeneity, 6) increase the wavelength of the activation process, and 7) create better electrophysiological conditions which would facilitate the reversal of the process of ventricular fibrillation through electric shock, and would hamper the onset of VF. We contribute to establish that regular exercise has a depressant effect on the intrinsic sinus chronotropism, not subjected to central nervous influence or humoral and hormonal influences. The chronic physical exercise may produce electrophysiological changes of protective character in both the ventricular normal myocardium, and in the submitted to acute regional ischemia.

Liver X receptors (LXRs) son miembros de la superfamilia de receptores nucleares que ejercen un papel clave en la homeaostasis lipídica y en la regulación negativa de la inflamación. Los macrófagos tienen funciones esenciales como reguladores de la inmunidad y la homeostasis, y su proliferación contribuye a la patogénesis de ciertos desórdenes. En este trabajo, mostramos que la inducción de la proliferación de los macrófagos en respuesta al factor de crecimiento M-CSF está modulada negativamente por agonistas que activan a LXR, tanto in vitro como in vivo. Ambas isoformas de LXR, alfa y beta, están implicadas en las acciones antiproliferativas de los agonistas de LXR en macrófagos. En cambio, M-CSF no ejerce efectos negativos sobre la expresión de genes regulados por este receptor nuclear. El tratamiento con los agonistas de LXR da lugar a una acumulación de macrófagos en la fase G0/G1 del ciclo celular, sin afectar la fosforilación de ERK-1/-2. El uso de siRNA o de ratones modificados genéticamente muestra que, en contraste con otros modelos celulares, la expresión funcional del inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas p27KIP1 o de los transportadores de colesterol ABCA1 o ABCG1 no se requiere para los efectos antiproliferativos de los agonistas de LXR en macrófagos. El análisis de la expresión a nivel de proteína de moléculas clave en la regulación del ciclo celular, como las ciclinas D1 y B1 y las quinasas dependientes de ciclina 2 y 4, estaba reprimida por la activación de LXR. Estas observaciones sugieren un papel de los agonistas de LXR en la disminución de la respuesta proliferativa de los macrófagos en desórdenes patogénicos. Además de estos efectos sobre la proliferación de macrófagos de los agonistas de LXR, exploramos el impacto de la activación de LXR en la respuesta de los macrófagos a la citoquina inflamatoria endógena IFN-gamma. Un estudio masivo de la regulación génica mediante el uso de microarrays de expresión demuestra que aproximadamente un 38% de la respuesta transcripcional inducida por IFN-gamma está reprimida por la activación de LXR en macrófagos. Los LXRs también median efectos inhibitorios sobre ciertos genes inducidos por IFN-gamma en células de microglía primarias y en un modelo in vivo de neuroinflamación inducida por IFN-gamma. La activación de LXR resulta en una reducción del reclutamiento de STAT1 a los promotores analizados en este estudio sin afectar a la fosforilación de STAT1. También analizamos como la señalización de IFN-gamma ejercía efectos recíprocos sobre genes diana de LXR. El tratamiento con IFN-gamma interfiere negativamente, de manera dependiente de STAT1, con la capacidad de LXR de inducir determinados genes diana, incluyendo Abca1 y Srebp1c. La represión de la expresión de Abca1 correlaciona con una disminución del eflujo de colesterol específico de la apolipoproteína A1 en macrófagos estimulados con IFN-gamma. Los efectos inhibitorios de IFN-gamma en la señalización de LXR no implicaron una reducción de la unión de LXR en el promotor de los genes diana. Los resultados mostrados en este estudio sugieren un importante nivel de bidireccionalidad negativa entre IFN-gamma/STAT1 y LXR con implicaciones tanto en el control de la respuesta inmunológica mediada por IFN-gamma como en la regulación del metabolismo lipídico., Liver X receptors (LXRs) are members of nuclear receptor superfamily that exert key functions in lipid homeostasis and in the negative control of inflammation. Macrophages serve essential functions as regulators of immunity and homeostasis, and their proliferation contributes to pathogenesis of certain disorders. In this work, we show that induction of macrophage proliferation by the growth factor M-CSF is negatively modulated by agonists that activate LXR, both in vitro and in vivo. Both isoforms LXR a and β are involved in the antiproliferative actions of LXR ligands in macrophages without affecting ERK-1/2 phosphorylation. In contrast, M-CSF does not exert negative effects on LXR-mediated gene expression. The use of siRNA or genetically modified mice revealed that, in contrast to other cellular models, functional expression of either the cyclin-dependent kinase inhibitor p27KIP1 or the cholesterol transporters ABCA1 or ABCG1 was not required for the antiproliferative effects of LXR in macrophages. Western blot analysis revealed that protein expression of key molecules that regulate progression through the cell cycle, such as cyclins D1 and B1 and cyclin-dependent kinases 2 and 4, was downregulated upon LXR activation. Additionally to these effects on macrophage proliferation we have explored the impact of LXR activation on the macrophage response to the endogenous inflammatory cytokine IFN-g. Transcriptional profiling studies demonstrate that approximately 38% of the IFN-g-induced transcriptional responses are repressed by LXR activation in macrophages. LXRs also mediated inhibitory effects on selected IFN-γ-induced genes in primary microglia and in a model of IFN-γ-induced neuroinflammation in vivo. LXR activation resulted in reduced STAT1 recruitment to the promoters tested in this study without affecting STAT1 phosphorylation. Treatment with IFN-γ interfered negatively, in a STAT1-dependent manner, with the capability of LXRs to upregulate selective targets, including Abca1 and Srebp1c without affecting the recruitment of LXR on their promoters.

La transición de la vida fetal a la neonatal es un momento muy importante en el que se producen grandes cambios fisiológicos rápidos y complejos. Supone un rápido incremento en la presión parcial de O2 (PaO2). Esta “hiperoxia relativa” fisiológica, da lugar a un aumento en la producción de radicales libres. El feto, se prepara para esta transición aumentado la producción de sustancias antioxidantes durante las últimas semanas de gestación. A pesar de esto, existe un ligero disbalance a favor de la producción de radicales libres. Esta situación da lugar a un estado pro-oxidante que es beneficioso para el recién nacido porque contribuye a la activación de numerosas vías metabólicas necesarias para la adaptación a la vida extrauterina. Sin embargo, en condiciones patológicas este estado pro-oxidante aumentará dando lugar a un estrés oxidativo que producirá daño tisular. La concentración óptima de oxígeno durante la reanimación, está actualmente en debate. Tradicionalmente las recomendaciones incluían la utilización de oxígeno al 100%. En la actualidad existen numerosos estudios que demuestran que la reanimación con altas concentraciones de O2 puede causar efectos adversos que derivan entre otros del daño tisular producido por la formación de radicales libres y que la utilización de concentraciones más bajas de O2 e incluso aire ambiente pueden ser igual de eficaces. Por tanto en las últimas recomendaciones del año 2010 sobre reanimación neonatal se aconseja que en recién nacidos a término que precisen reanimación después del nacimiento con presión positiva en la vía aérea es mejor comenzar con aire en vez de oxígeno al 100%. En cuanto a la reanimación del recién nacido extremadamente prematuro existe poca evidencia científica en la literatura médica en relación con la administración de O2 durante la reanimación. Sabemos que los recién nacidos prematuros tienen dificultades para adaptarse a esta transición y a menudo necesitan asistencia ventilatoria y O2 suplementario para lograrlo. Sin embargo, estas maniobras pueden producir daño pulmonar, siendo la exposición al O2 un componente significativo de su patogénesis. En el año 2006 el ILCOR, a la vista de los resultados de los estudios que comparan aire ambiente con oxígeno nos dice que “hay insuficiente información para recomendar o contraindicar una concentración específica de oxígeno durante la reanimación” del recién nacido extremadamente prematuro. Los objetivos de la tesis son: • Demostrar que el estrés oxidativo generado durante la re-oxigenación en un modelo experimental en animales recién nacidos podría estar en relación directa con la concentración de oxígeno utilizado en la reanimación. • Demostrar la fiabilidad de biomarcadores de estrés oxidativo de carácter no invasivo que podrían utilizarse para monitorizar la evolución del estado oxidativo en el período neonatal. • Demostrar que el uso de fracciones inspiratorias de oxígeno iniciales bajas (≤ 0.3) podrían ser seguras y eficaces en la reanimación de recién nacidos extremadamente prematuros (< 28 semanas de gestación). • Demostrar que el ajuste individualizado de la fracción inspiratoria de oxígeno basado en la frecuencia cardiaca y la lectura de la saturación de oxígeno en sangre arterial medida por oximetría de pulso en recién nacidos extremadamente prematuros (

[cat] El concentrat de plasma assecat per polvorització (SDP) i el d’immunoglobulines (IC) són suplements dietètics que han estat àmpliament utilitzats en l’alimentació dels animals de granja i que han estat proposats com alternativa a l’ús dels antibiòtics com a promotors del creixement, especialment durant el període posterior al deslletament. Aquests suplements incrementen la taxa de creixement degut, en part, a que atenuen la resposta del sistema immunitari. Per exemple, s’ha pogut observar que la suplementació dietètica amb proteïnes plasmàtiques redueix la sobreestimulació immunitària en un model de malaltia inflamatòria intestinal. El sistema immunitari mucosal comú connecta els llocs inductors (en aquest cas la mucosa intestinal) amb els llocs efectors (com les mucoses naso- i broncoalveolar o la genito-urinària), que facilita el moviment de cèl•lules immunitàries entre teixits allunyats anatòmicament i permet que la dieta moduli la resposta associada a infeccions extraintestinals. Així doncs, ens hem plantejat si la suplementació dietètica amb proteïnes plasmàtiques podia modular la resposta immunitària en una inflamació pulmonar aguda. Primerament es va establir una pauta adequada per obtenir un model d’inflamació pulmonar robust i reproduïble. Seguidament s’han estudiat els efectes dels suplements SDP i IC sobre la resposta immunitària en aquest model d’inflamació, en ratolins acabats de deslletar. S’han analitzat cèl•lules i mediadors inflamatoris involucrats tant en la resposta innata, com en la resposta adaptativa. Finalment, també s’han estudiat els efectes dels pinsos experimentals sobre diferents elements que intervenen en la resolució de la resposta inflamatòria, com les cèl•lules reguladores i les citocines antiinflamatòries. L’administració de LPS produeix una migració de leucòcits i un alliberament massiu de citocines i quimiocines proinflamatòries, que recluten i activen monòcits i neutròfils a l’espai alveolar i al teixit pulmonar. A més estimula la immunitat adaptativa, en la que hi ha un increment considerable de limfòcits Th activats, així com una gran producció de citocines. Ambdues dietes disminueixen el reclutament de leucòcits, sobretot els neutròfils i els monòcits. Tot i que la resposta innata és més extensa, les dietes són més efectives sobre la resposta adaptativa, on redueixen les poblacions limfocitàries estimulades per l’LPS tant a pulmó com a sang. Els suplements també atenuen de forma notable l’efecte de l’LPS sobre l’expressió de citocines i quimiocines proinflamatòries a l’espai alveolar. Els efectes de l’SDP i l’IC estan mediats per canvis en l’expressió de citocines antiinflamatòries, ja que augmenten la concentració de IL-10 a pulmó i a jejú, i la del TGF-β a pulmó. Ambdues dietes redueixen el balanç entre els limfòcits Th activats i els limfòcits T reguladors, d’aquesta manera atenuen la magnitud de la resposta inflamatòria i augmenten la concentració de mediadors essencials per la reparació del teixit. Els resultats d’aquest estudi indiquen que els suplements amb proteïnes plasmàtiques poden limitar la resposta immunitària pulmonar i podrien ser útils en la prevenció i atenuació de les malalties inflamatòries extraintestinals., [eng] The concentrated spray-dried plasma (SDP) and immunoglobulin (IC) are dietary supplements that have been widely used in the diet of farm animals and proposed as an alternative to the use of antibiotics as growth promoters, especially in the subsequent weaning period. These supplements increase the growth rate, in part because they attenuate the response of the immune system. The common mucosal immune system connects the inductive sites (in this case the intestinal mucosa) with the effector sites (as nasopharyngeal and bronchoalveolar mucosa or genito-urinary), which facilitates the movement of immune cells between anatomically distant tissues and allows the diet to modulate the associated response to intestinal infections. Consequently, the aim of the present thesis was to evaluate whether the dietary supplementation with plasma proteins could modulate the immune response in an acute lung inflammation. First, a suitable pattern was established in order to obtain a robust and reproducible inflammatory lung model. Next, the effects of SDP and IC supplementation on the immune response in this inflammation model were studied in newly weaned mice. Cells and inflammatory mediators, involved either in innate response as in adaptive response, have been analyzed. Finally, the effects of experimental feed on different elements involved in the resolution of the inflammatory response, such as regulatory cells and inflammatory cytokines, have also been assessed. Both diets decreased the recruitment of leukocytes. Although the innate response is more extensive, the diets are more effective on the adaptive response. The supplements also significantly attenuated the effect of LPS on the expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines in the alveolar space. The effects of SDP and IC are mediated by changes in the expression of anti-inflammatory cytokines. Both diets reduced the balance between activated Th cells and regulatory T cells, in such a way that, the magnitude of the inflammatory response is attenuated and the concentration of essential mediators for tissue reparation is increased. In conclusion, the results of this study indicate that plasma protein supplementation is able to limit the pulmonary immune response and could be useful in the prevention and attenuation of the extraintestinal inflammatory diseases.

[CAT]El desenvolupament post-embrionàri dels insectes està controlat per dos hormones, les esteroidals i l’hormona juvenil (HJ). La 20-hidroxiecdisona (20E), és la principal hormona esteroidal dels insectes, indueix i controla el procés de la muda. En canvi, l’HJ determina la naturalesa d’aquesta muda. En presencia d’HJ, el pic de 20E produeix una muda entre estadis juvenils. En canvi, quan desapareix l’HJ, la 20E indueix una muda a l’estadi adult. A nivell molecular, la 20E actua mitjançant la unió a un heterodímer format per dos membres de la família dels receptors nuclears, el receptor d'ecdisona (EcR) i ultraespiracle (USP). El receptor activat inicia una cascada gènica de resposta a la 20E coneguda com a model d’Ashburner. Els gens activats per la 20E són principalment receptors nuclears, com ara E75, HR3, HR4 i Ftz-F1 i factors de transcripció, E74 o BR-C., Aquest via de senyalització ha estat àmpliament estudiada en insectes holometàbols com D.melanogaster, pel contrari, la caracterització dels mecanismes moleculars d'acció dels ecdisteroides en els insectes hemimetàbols, o de desenvolupament directe, és pràcticament inexistent. La caracterització de la funció i mecanismes d’acció d’aquestes hormones en insectes hemimetàbols permetrà entendre els canvis que s’han produït en aquestes vies que han permès l’evolució fins a una metamorfosi completa. La panerola Blattella germanica s'utilitza com a model per estudiar el desenvolupament, hemimetàbol. Prèviament, i amb l'objectiu d'estudiar la cascada gènica de resposta a la 20E a B. germanica, s'han clonat i caracteritzat els dos membres del receptor de la 20E en aquest insecte (BgEcR-A i BgRXR) i els receptors nuclears BgE75, BgHR3, BgHR4 i BgFTZ-F1 i el factor de transcripció Br-C. Gràcies al silenciament de l'expressió gènica mitjançant RNAi in vivo s'han pogut estudiar les funcions d'aquests gens, i s'ha demostrat l’existència d’un eix gènic que regula els processos controlats per la 20E. En la present tesi doctoral s’ha clonat i caracteritzat l’últim gens primerenc que manca a B.germanica, el factor de transcripció E74. A més, també s’ha clonat i caracteritzat Seven Up, un receptor nuclear que regula la via de senyalització de la 20E en insectes holometàbols., Així, s’ha clonat dos isoformes d’E74 anomenades BgE74A i BgE74B i s’ha demostrat que són necessàries per tal que es produeixi correctament l’ècdisi. La interferència d’aquest factor durant la darrera fase nimfal produeix problemes greus en el desplegament de les ales i tegmines, en la integritat de les quetes i en les estructures d’adhesió i afecta el procés de pigmentació. L’enzim dopa decarboxilasa (BgDdc) està implicat en pigmentació i la seva interferència durant la sisena fase nimfal fa que emergeixin adults amb pigmentació més clara. BgE74 és necessari perquè BgDdc s’expressi correctament. S’han clonat dos isoformes del receptor nuclear Seven up: BgSvpA i BgSvpB. Les seves funcions no són redundants. BgSvpB regula la síntesi d’HJ en els corpora allata durant l’estadi adult de B.germanica a traves de la regulació de dos gens claus de la via, BgHMG-S i BgHMG-R. A més, BgSvpB és necessari per al desenvolupament dels corpora allata durant la darrera fase nimfal. La interferència del receptor nuclear produeix una clara disminució en la divisió cel•lular dels corpora allata durant la darrera fase nimfal. Aquestes dues funcions de BgSvpB s’ha demostrat que són independents., [EN]In insects, post-embryonic development is under the control of ecdysteroids and juvenile hormones. At the molecular level, 20-hydroxyecdysone (20E) acts through binding to its receptor, a heterodimer of the ecdysone receptor (EcR) and Ultraspiracle (USP). Both proteins belong to the nuclear receptor family. Once 20E binds to its receptor, activates a subset of genes that mediate and amplify the hormonal response. The mechanism of action of ecdysteroids in hemimetabolan insects is poorly understood. To study at the molecular level the 20E response, the Ecdysone receptor (BgEcR-BgRXR), and the nuclear receptors, BgHR3, BgFTZ-F1, BgHR4 and E75A-D of the hemimetabolan insect Blattella germanica have been cloned and characterized using RNAi in vivo. Here, first we report the cloning of two isoforms of E74 from the hemimetabolous direct developing insect Blattella germanica, namely BgE74A and BgE74B. Although BgE74 knockdown nymphs ecdysed properly into adults, they all showed clear deficiencies in the extension of the fore- and hindwings, as well as malformations in their leg bristles and locomotor structures. In addition to the described morphological abnormalities, all BgE74 knockdown nymphs that molted into adults presented defects in the cuticle pigmentation., The expression of BgDdc, an enzyme involved in insect cuticle pigmentation, was reduced in the BgE74 knockdowns. Secondly, we have cloned and characterized two isoforms of Seven-up, another nuclear receptor involved in 20E response in Drosophila, and named them BgSvpA and BgSvpB. Surprisingly, using RNAi in vivo we show that BgSvpB is not related with 20E action but is necessary to produce juvenile hormone (JH) in the corpora allata during the adult stage, through the regulation of two key enzims of JH biosynthesis, BgHMG-S and BgHMG-R. Moreover, BgSvpB is required for cell proliferation of the corpora allata during nymphal development.

[spa] La respuesta inflamatoria es una reacción fisiológica ante una agresión con el fin de recuperar la homeostasis del organismo. Sin embargo, esta respuesta puede llegar a mermar la calidad de vida de las personas que la padecen de forma crónica, como es el caso de la artritis reumatoide. En este contexto resulta interesante hallar productos no farmacológicos que ayuden a paliar las consecuencias de la respuesta inflamatoria o que actúen como coadyuvantes de terapias antiinflamatorias. El cacao es un alimento que proporciona una cantidad relativamente elevada de flavonoides, compuestos polifenólicos con reconocida actividad antioxidante, antiproliferativa, protectora de los sistemas cardiovascular y nervioso e inmunomoduladora. La hipótesis de partida de este estudio ha sido que la actividad inmunomoduladora de los flavonoides del cacao puede mantenerse tras su metabolismo y llegar a modular la respuesta inflamatoria in vivo. En base a esta hipótesis, el objetivo general de esta tesis ha sido establecer el efecto de la ingesta de cacao sobre la respuesta inflamatoria experimental. Para alcanzar este objetivo, el diseño experimental ha contemplado la inducción de diferentes modelos experimentales de inflamación local aguda (inducidos por carragenina, histamina, serotonina, bradicinina y prostaglandina E2) y también de inflamación crónica sistémica (artritis adyuvante y artritis inducida por colágeno). En todos los casos, la ingesta de cacao se ha realizado de forma previa y durante el desarrollo del proceso inflamatorio. Para establecer el efecto del cacao sobre la respuesta inflamatoria in vivo, se han evaluado variables clínicas (como el edema articular) e inmunológicas (respuesta en anticuerpos, subpoblaciones linfocitarias, secreción de citocinas, etc.). Asimismo, se ha estudiado la capacidad antioxidante que confiere la ingesta de flavonoides de cacao. Los resultados de este estudio han puesto de manifiesto que la dieta rica en cacao es capaz de reducir el edema articular inducido por carragenina. Este efecto puede atribuirse, al menos parcialmente, a la acción reguladora del cacao sobre el mediador inflamatorio bradicinina y sobre el potencial inflamatorio y prooxidante de los macrófagos. Por otra parte, la ingesta de cacao antes y durante el desarrollo de artritis adyuvante o inducida por colágeno, si bien no modifica la evolución clínica del edema articular, ejerce un efecto beneficioso ya que modula la producción de mediadores proinflamatorios (como TNF-¿), la respuesta humoral, la proporción de células efectoras de la respuesta inflamatoria crónica (linfocitos Th, Tc, Treg y NK) y el estrés oxidativo asociado a esta patología (ROS y NO). En resumen, la acción beneficiosa de la ingesta de cacao sobre la respuesta inflamatoria, conjuntamente a sus propiedades antioxidantes, confieren al cacao potencial como coadyuvante en el tratamiento antiinflamatorio y en procesos autoinmunes.

En este trabajo hemos estudiado las modificaciones producidas por la diabetes inducida por el aloxano en los mecanismos que regulan la respuesta de las arterias carótida y renal de conejo a la testosterona. La concentración plasmática de testosterona libre y total de los conejos diabéticos fue significativamente menor que la de los conejos control. ARTERIA CARÓTIDA. En la arteria carótida, la testosterona produjo una relajación de magnitud dependiente de la concentración, que fue mayor en conejos diabéticos que en conejos control. En conejos control, ni la eliminación del endotelio ni la incubación con el inhibidor del enzima óxido nítrico sintasa (NOS), NG-nitro-L-arginina, modificó la relajación arterial a la testosterona, pero el inhibidor de la ciclooxigenasa (COX), indometacina, aumentó dicha relajación. En contraste, en arteria carótida de animal diabético la eliminación del endotelio, NG-nitro-L-arginina e indometacina inhibieron la relajación a la testosterona. En arterias carótidas de conejo diabético tanto la expresión de eNOS, iNOS y COX-2 como la liberación de prostaciclina en respuesta a la testosterona fue mayor que en arterias de conejo control. La testosterona inhibió la contracción arterial inducida por CaCl2, tanto en animales control como animales diabéticos. Estos resultados sugieren que la testosterona relaja la arteria carótida al bloquear la entrada de calcio extracelular. La diabetes aumenta la respuesta vasodilatadora de la testosterona por un mecanismo que al menos incluye un aumento de la actividad moduladora del óxido nítrico endotelial y un aumento de la liberación del vasodilatador COX-2, prostaciclina, más que la ausencia de vasoconstrictor COX-1 tromboxano A2. ARTERIA RENAL. La testosterona relajó la arteria renal de conejo control y diabético, sin diferencias significativas entre ambos. Tanto en arteria renal de conejo control como de diabético, la eliminación del endotelio inhibió la relajación arterial a la testosterona. En arterias con endotelio, la incubación con indometacina, NG-nitro-L-arginina, o con el inhibidor de los canales de K+ tetraetilamonio, no modificó significativamente la relajación arterial a la testosterona en ambos grupos de animales. En arterias sin endotelio, la indometacina aumentó la relajación a la testosterona, tanto en conejos control como en conejos diabéticos. La expresión de eNOS, iNOS y COX-1 y la liberación de tromboxano A2 y prostaciclina en respuesta a la testosterona fue similar en arterias de conejo control y de conejo diabético. Sin embargo, la expresión de COX-2 fue significativamente menor en arteria renal de conejo diabético que en conejo control. La testosterona inhibió la contracción de la arteria renal inducida por CaCl2 en ambos grupos de conejos. Estos resultados sugieren que la testosterona relaja la arteria renal de conejo. Esta relajación está modulada por tromboxano A2 de origen muscular, y está mediada parcialmente por prostaciclina endotelial, e implica el bloqueo de la entrada de Ca2+ al interior celular. A diferencia de lo observado en arteria carótida, la diabetes no modifica los mecanismos implicados en la relajación de la arteria renal a la testosterona., Cardiovascular disease is the major cause of morbidity and mortality in diabetic patients, which in turn is also associated with low levels of serum testosterone. CAROTID ARTERIES Testosterone induced a relaxation of carotid arteries, which was higher in diabetic than in control rabbits. In control rabbits neither endothelium-removal nor the nitric oxide synthase (NOS) inhibitor NG-nitro-L-arginine (LNA) modified relaxations to testosterone, and the COX inhibitor indomethacin enhanced this relaxation. In diabetic rabbits endothelium removal, LNA or indomethacin inhibited testosterone-induced relaxation. In arteries from diabetic rabbits, eNOS, iNOS and COX-2 expression and testosterone-induced release of prostacyclin resulted enhanced in comparison with control rabbits. Testosterone inhibited CaCl2 contractions of carotid artery both in control and diabetic rabbits. These results suggest that testosterone relaxes carotid artery by blocking extracellular calcium entry. Diabetes enhances the vasodilator response of the carotid artery to testosterone by a mechanism that at least includes an increased modulatory activity of endothelial nitric oxide and an augmented release of COX-2 vasodilator, prostacyclin rather than the absence of COX-1 vasoconstrictor, thromboxane A2. RENAL ARTERIES Testosterone induced relaxation of arteries, without significant differences between control and diabetic rabbits. Both in control and diabetic rabbits endothelium-removal inhibited testosterone relaxant action. In arteries with endothelium, incubation with indomethacin, LNA or tetraethylammonium did not modify relaxations to testosterone neither in control nor in diabetic rabbits. In endothelium-denuded arteries indomethacin enhanced the relaxations to testosterone, both in control and diabetic rabbits. In arteries from diabetic rabbits, eNOS, iNOS and COX-1 expression and testosterone-induced release of thromboxane A2 and prostacyclin were not different from those observed in control rabbits. However, COX-2 expression was lower in diabetic rabbits that in control rabbits. In Ca2+-free medium, addition of CaCl2 contracted previously depolarized arteries. Testosterone inhibited CaCl2 contractions both in control and diabetic rabbits. These results show that testosterone relaxes the renal artery both in control and diabetic rabbits. This relaxation is modulated by muscular thromboxane A2, it is partially mediated by endothelial prostacyclin, and it involves the blocking of extracellular Ca2+ entry. Diabetes does not modify the mechanisms involved in the relaxant action of testosterone in the renal artery.

La esperanza de vida se dobló en Europa en el siglo XX. En cualquier etapa de la historia reciente, las mujeres superan en longevidad media a los hombres (hasta un 9.9%). Aunque la base es desconocida, no es atribuible exclusivamente a diferencias sociales, ya que por ejemplo las ratas Wistar hembras viven un 16% más que los machos y en este caso ambos están sometidos a las mismas “condiciones sociales”. Este hecho ha interesado desde hace años a la comunidad científica, publicándose numerosos artículos que han demostrado que estas diferencias de longevidad se fundamentan en parte en diferencias de estrés oxidativo. Los machos poseen un mayor estrés oxidativo que las hembras, pues éstas están protegidas frente al mismo por los estrógenos. Además, se han utilizado los estrógenos como prevención y tratamiento ante diversas patologías (cardiovasculares, neurodegenerativas, etc.) y por su efecto antioxidante, tanto in vivo como in vitro, pero que, en las mujeres, se pierde al aparecer la menopausia. Estudiar las bases moleculares de estas diferencias en relación con la teoría del envejecimiento de los radicales libres y los efectos positivos de la reposición de estrógenos en distintos períodos post-menopausia ha sido el objetivo de la investigación realizada. Para realizar el estudio se planificaron varios protocolos y métodos que se explican a continuación. Se utilizaron ratas hembras Wistar jóvenes (3-4 meses) y viejas (24 meses). Se realizó la ovariectomía de 39 ratas (jóvenes) con un grupo control incluido (SHAM operated) siguiendo un diseño que consistió en: grupo Operación SHAM (n=5) de 3 semanas. OVX 3, 6 ó 9 (semanas tras Ovariectomía), OVX 3E, 3+3E ó 6+3E (semanas tras Ovariectomía más semanas de administración diaria de Estradiol disuelto en vehículo) y OVX 3V, 3+3V ó 6+3V (semanas tras Ovariectomía más semanas de administración diaria de vehículo). Posteriormente, se estudiaron mediante tomografía por emisión de positrones (PET) su metabolismo cerebral de glucosa (diferenciando, además entre un grupo de animales jóvenes y viejos para ver el efecto del envejecimiento) y se sacrificaron, tras los periodos anteriores, los distintos grupos. Entre las medidas realizadas están la determinación de parámetros de estrés oxidativo en diferentes órganos y en mitocondrias aisladas de hígado (MDA, GPx, producción de peróxidos) mediante técnicas de Western Blotting, espectrofotometría y HPLC. Con el plasma sanguíneo se realizó un estudio de los metabolitos presentes por Resonancia Magnética Nuclear (RMN) y obtuvimos el perfil metabólico. En ratas ovariectomizadas disminuye significativamente la actividad de la enzima Glutatión Peroxidasa (GPx) a las 3 semanas, mientras que se revierte con la reposición con estrógenos y no al administrar el vehículo solo (control). Este hecho se repite también cuando el periodo de reposición con estrógenos es más grande (6 y 9 semanas) aunque la disminución en la actividad de la enzima no disminuye tanto como en las semanas siguientes a la ovariectomía (3 semanas primeras) y su recuperación hasta niveles normales también decrece, obteniendo valores similares en la oxidación a lípidos (MDA) y en la producción de peróxido de hidrógeno. En cuanto al consumo de glucosa mediante PET, los resultados indican una disminución con el envejecimiento y ponen de manifiesto el beneficio del tratamiento con estrógenos, solamente si se inicia el tratamiento inmediatamente tras instaurarse la menopausia (ovariectomía). Igualmente ocurre en el perfil metabólico analizado mediante metabolómica (RMN). El tratamiento con estradiol parece ser sólo efectivo si la reposición se produce inmediatamente tras la instauración de la menopausia, y deja de serlo si esperamos varias semanas para comenzarlo. Se hacen necesarios más estudios con animales de laboratorio para extrapolar sus resultados correctamente a los tratamientos en humanos y, así, poder extraerse conclusiones de aplicación clínica., Females live longer than males in many mammalian species, including humans. This natural phenomenon can be explained on the basis of the mitochondrial theory of aging. Mitochondria are a major source of free radicals in cells. Mitochondria from female rats generate half the amount of hydrogen peroxide than those of males and have higher levels of mitochondrial reduced glutathione. The results of this thesis show that the mitochondria from ovariectomized rats (sacrificed at 3, 6, and 9 weeks -OVX 3, 6 and 9- after surgery) generate higher hydrogen peroxide levels than controls (Sham) but are diminished only if estrogen replacement therapy (ERT) is initiated immediately after induced menopause [there were groups which were given 1 μg/kg/day subcutaneously of 17β-estradiol for three weeks, starting the day after surgery (OVX 3E) or three or six weeks later, for the same period of three weeks (OVX 3+3E and OVX 6+3E)]. The same pattern occurs with glutathione peroxidase (GPx) enzymatic activity in mitochondria showing an increase in this antioxidant enzyme and a recovery of oxidative damage to lipids in heart and plasma after the negative effects produced by ovariectomy. Aging and induced menopause decrease the brain glucose uptake in vivo measured by Positron Emission Tomography (PET) and ERT is only relatively beneficial in the immediate treatment group. This “critical time” to initiate the treatment after ovariectomy reflects similar metabolomic profiles (by Nuclear Magnetic Resonance, NMR) compared with control and young rat groups. The challenge for the future is to find a molecular mechanism that can explain the beneficial effects of ERT and to discover if there are molecules which mimic these effects too.

En la presente Tesis Doctoral hemos querido estudiar, en primer lugar, el efecto que tendría el incremento artificial de la capacidad de transporte de oxígeno, a través del tratamiento con rHuEpo, sobre distintos parámetros musculares así como su implicación en la mejora del rendimiento físico. Son muchos los autores que, tanto en el ámbito clínico (Winearls, Oliver y cols. 1986; Bommer, Muller-Buhl y cols. 1987) como en el ámbito deportivo (Berglund y Ekblom 1991; Lundby, Robach y cols. 2008), han destacado que los beneficios alcanzados con los tratamientos con Epo desbordan con creces su papel como estimuladora de la eritropoyesis. Los posibles efectos de la hormona, a nivel del músculo esquelético, se fundamentan en el reciente descubrimiento de receptores de Epo en este tejido (Scoppetta y Grassi 2004; Lundby, Hellsten y cols. 2008). En el primer estudio de la presente Tesis Doctoral nos planteamos determinar si el tratamiento con rHuEpo podría mediar los procesos de mitocondriogénesis, miogénesis y angiogénesis en el músculo esquelético, así como sus efectos sobre el rendimiento deportivo en animales de experimentación. Los resultados negativos obtenidos en este primer estudio en el que no observamos ninguna modificación en los procesos anteriormente descritos a nivel del músculo esquelético, ni sobre el rendimiento físico, en animales tratados con rHuEpo, a pesar de encontrar un aumento significativo en las diversas variables hematológicas determinadas, nos llevó a diseñar un segundo estudio. En éste nos planteamos determinar el efecto del aumento en la producción endógena de Epo (por la exposición a altitud simulada), en combinación con entrenamiento anaeróbico, sobre distintas adaptaciones musculares y hematológicas y sobre el rendimiento físico. De nuevo, en este caso, no observamos ningún efecto ni a nivel muscular, ni sobre el rendimiento, de la combinación de un protocolo de hipoxia intermitente con entrenamiento anaeróbico, a pesar de encontrar un significativo aumento en las variables hematológicas estudiadas. Los resultados obtenidos en los dos estudios anteriores nos planteron la necesidad de diseñar un tercer estudio conducente a comparar el efecto del tratamiento con rHuEpo con un protocolo de hipoxia intermitente normobárica, sobre las variables hematológicas determinadas por las autoridades antidopaje. Nuestro principal objetivo al plantear este estudio era demostrar que los protocolos de hipoxia intermitente producen modificaciones hematológicas comparables a los tratamientos con rHuEpo. Los resultados obtenidos confirmaron nuestra hipótesis y fundamentaron el diseño experimental del cuarto estudio desarrollado en la presente Tesis Doctoral. En él nos planteamos determinar el efecto de un protocolo de hipoxia intermitente, tras la administración de rHuEpo, con el objetivo de comprobar un posible efecto enmascarador de la policitemia asociada a la hipoxia. Tras confirmar dicho efecto, diseñamos un nuevo protocolo experimental que constituye el quinto estudio de esta Tesis. En este trabajo nos planteamos, en seres humanos, estudiar el efecto hemodiluyente de la administración oral de desmopresina, un análogo de la hormona antidiurética, con un potencial efecto enmascarador del dopaje sanguíneo. Los resultados obtenidos en el segundo estudio planteado en la presente Tesis Doctoral en relación al efecto del entrenamiento anaeróbico, en combinación con la hipoxia, sobre la expresión muscular de PGC-1α y MnSOD, nos condujo a diseñar toda una nueva serie de experimentos (in vitro) en los que determinamos el papel de la electroestimulación en la activación de PGC-1α y MnSOD en animales silvestres y deficientes en PGC-1α. Del mismo modo quisimos estudiar el papel de las ERO en dicho proceso. Estos experimentos, desarrollados en el laboratorio de la Profesora Ylva Hellsten (Departamento de Ciencias del Deporte y del Ejercicio de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Copenhague, Dinamarca) conforman el sexto y último estudio que nos plateamos en esta Tesis., In this Doctoral Thesis our first aim was to determine the effect of the artificial increment of the oxygen delivery capacity on different muscular parameters and on performance, by using rHuEpo. In our first study we proposed to determine whether rHuEpo treatment could be involved in mitochondrial biogenesis, myogenesis, or angiogenesis in skeletal muscle. We also wanted to test the effects of the hormone on exercise performance in experimental animals. None of the results obtained in this first study presented any changes in the processes described above at the level of skeletal muscle, or in physical performance in animals treated with rHuEpo. In the second study we found no effect on either the skeletal muscle or performance, as a result of the combination of intermittent hypoxia and anaerobic training, despite finding a significant increase in the hematological variables analyzed. The results from these studies led us to devise our third experimental design in which we wanted to demonstrate that an intermittent hypoxic protocol can induce the same hematological modifications as Epo treatments. Results confirmed our hypothesis and underpinned the experimental design of the fourth study developed in this Doctoral Thesis. In this we proposed to determine the effect of intermittent hypoxia on hematological parameters after rHuEpo administration in an animal model. After confirming the role of hypoxia as a masking strategy, we designed the fifth experimental study of this Doctoral Thesis. This is the only human study in the Thesis and we aimed to determine whether administration of desmopressin, a synthetic analogue of vasopressin, could be associated with a significant hemodilution and thus be considered as a masking agent in sports. The results in the second study of this Doctoral Thesis led us to develop a new series of experiments (in vitro) constitute the sixth and last study of the present Doctoral Thesis, in which we proposed to determine the role of reactive oxygen species and PGC-1α in the contraction-induced expression of MnSOD in primary skeletal muscle cells from wild type and knock-out for PGC-1α mice.

The effects of partial (75%; diet PP75) and total (100%; diet PP100) replacement of fish meal by plant protein sources on the intestinal nutrient absorption of gilthead sea bream and rainbow trout were examined over a 12-week growth trial. The diets comprised a mixture of plant ingredients (corn gluten meal, wheat gluten, extruded peas and rapeseed meal) and met the amino acid requirements of the fish. A third group of fish on a fish meal diet was used as a control for comparative purposes. Diets were tested in triplicate and fish were fed twice a day until visual satiation. At the end of the trial, we measured amino acid (l-leucine, l-lysine, l-phenylalanine, l-alanine and l-proline) and d-glucose absorption at short-term (6. h) and long-term (36. h and 48. h in rainbow trout and sea bream respectively) post-feeding by means of brush border membrane vesicles obtained from pyloric caeca, proximal intestine and distal intestine. The absorption pattern at 6. h post-feeding was modified in both species in response to fish meal replacement. In PP75-fed trout absorption was delayed from pyloric caeca to proximal and/or distal intestinal segments, thus total absorption capacity was maintained in this group. On the contrary, total uptake was significantly decreased in trout fed the PP100 diet and in sea bream on both PP75 and PP100 diets. Glucose transport capacity was increased in both experimental sea bream groups and in PP75 trout. Long-term transport capacity was up-regulated for both species. Our results show that intestinal nutrient absorption is modified in response to the use of high levels of plant protein sources and that these changes are species-specific. © 2011 Elsevier B.V., This research was funded by the EU (Q5RS-2000-30068; “Perspectives of Plant Protein Use in Aquaculture”, PEPPA).

[eng] The Chemical Ecology of four insect pests was investigated in this work. Eavesdropping of their intraspecific communication by means of pheromones or other volatile organic compounds provide important details that could be used to control them in a environmentally-friendly way. With the aim to find possible pheromones of three pest species of the Iberian Peninsula, analytical studies of the emitted volatiles were accomplished. In behavioral and electrophysiological bioassays the activity of the identified compounds was determined, and additionally, field trapping experiments were initiated. The two jewel beetles, Coreobus undatus and C. florentinus (Coleoptera: Buprestidae), represent serious threats to the cork oak, Quercus suber, causing severe damage to the cork, exclusively produced by this endemic tree. Further pest species investigated include the Moroccan locust, Dociostaurus maroccanus, (Orthoptera: Acrididae). This polyphagous pest of crops and pastures causes high economic damage in many countries of the Mediterranean Basin. In addition, this work filled a knowledge gap of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae), one of the most destructive crop pests in Africa and Asia, concerning the maturation response of gregarious nymphs to the presence of pheromone producing conspecific mature adults. Altogether, this study provides the basis for following research and may be helpful to curtail the reproduction and spread of these pests., [spa] En el presente trabajo se han investigado varios aspectos de la de la comunicación química y del comportamiento de cuatro especies de insectos plaga para encontrar estrategias que permitan el manejo selectivo de los mismos sin la utilización de tratamientos químicos agresivos con el entorno. En general, los insectos perciben el mundo a través de moléculas pequeñas (semioquímicos), las cuales llevan información sobre parejas potenciales, posibles depredadores y características específicas del medio ambiente, como fuentes de alimento, sitios para la oviposición, etc. Se puede decir que la olfacción es de crucial importancia para la supervivencia de los insectos, por lo que el aprovechamiento o la interrupción de este proceso representan una alternativa prometedora en el control de plagas. Entre los semioquímicos más importantes utilizados actualmente en la lucha contra plagas se encuentran las feromonas. Las feromonas son sustancias que los organismos emiten al ambiente y que actúan sobre otros individuos de la misma especie (intraespecífico) alterando el comportamiento de los mismos. Por todo ello se han iniciado estudios dirigidos a la identificación de feromonas en tres insectos plagas de la península ibérica mediante análisis de los volátiles emitidos, bioensayos de comportamiento y electrofisiológicos para confirmar la actividad de los compuestos detectados, así como pruebas de campo para la captura. Hasta el presente no se había establecido ningún método de control efectivo y no contaminante contra esas tres especies. Los bupréstidos, Coreobus undatus y C. florentinus (Coleoptera: Buprestidae) son dos insectos plaga del alcornoque, Quercus suber, una especie endémica del mediterráneo occidental con una importancia económica enorme por su producción de corcho. El daño causado por las larvas de las dos especies provoca pérdidas económicas importantes por impedir la producción de corcho de buena calidad. Los diferentes estudios han revelado la presencia de varios compuestos con actividad atrayente sobre estos insectos, los cuales representan las primeras posibles feromonas de estas dos especies. La langosta marroquí, Dociostaurus maroccanus (Orthoptera: Acrididae), a su vez, es una plaga polífaga de cultivos y pastizales que provoca grandes daños económicos en muchos países de la cuenca mediterránea. Los análisis de los volátiles de las ninfas y los adultos han demostrado la presencia de varios compuestos activos en pruebas electrofisiológicas, exclusivamente emitidos por machos adultos. Se considera que estos compuestos están involucrados en la comunicación química de la langosta marroquí y representan posibles componentes feromonales. Adicionalmente se ha estudiado un aspecto desconocido de la langosta del desierto, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae), una de las plagas agrícolas más graves en África y Asia, en referencia a la maduración de las ninfas gregarias en presencia de adultos maduros. Se ha confirmado una de las teorías existentes acerca de la maduración sincronizada en la langosta del desierto, es decir, un retraso en la maduración de adultos inmaduros y la maduración acelerada de ninfas en una población mixta de ninfas y adultos.

[cat] El trans-resveratrol (trans-3,5,4’-trihidroxiestilbè) és un polifenol que es troba a diferents components de la dieta amb propietats beneficioses per a la salut. Per aquesta raó, ha estat considerat com un compost bioactiu i, recentment, com un nutracèutic. En el present treball s’ha aprofundit en l’estudi d’aquest compost per tal de conèixer nous aspectes metabòlics i terapèutics del trans-resveratrol. En primer lloc, s’han estudiat els canvis que pateix durant el seu trànsit intestinal així com el seu metabolisme a l’enteròcit al ser administrat per via oral a la rata. S’ha demostrat que el trans-resveratrol és metabolitzat a l’enteròcit formant els seus conjugats glucurònid i sulfat. Aquests compostos retornen majoritàriament a la llum intestinal mitjançant les proteïnes transportadores ABC. El trans-resveratrol no absorbit i que arriba a l’intestí gruixut és convertit en dihidroresveratrol per acció de la microbiota que redueix el doble enllaç del trans-resveratrol. També el dihidroresveratrol és conjugat i convertit en els seus respectius glucurònid i sulfat. Per determinar aquests compostos, s’ha posat a punt una tècnica per a la determinació del dihidroresveratrol a plasma per extracció en fase sòlida i el resveratrol a contingut intestinal mitjançant una extracció líquid-líquid seguides de l’anàlisi per HPLC. Els mètodes que s’han descrit són exactes, precisos i tenen recuperacions superiors al 95%. En una segona part, s’ha posat a punt un model d’inducció de càncer de còlon en rata per tal d’avaluar l’efecte del trans-resveratrol sobre les lesions preneoplàstiques induïdes per 1,2-dimetilhidrazina. L’administració de 60 mg/kg durant 49 dies, ha demostrat que el trans-resveratrol, el sulfat, el glucurònid i el dihidroresveratrol es troben en el contingut intestinal i que es produeix una reducció del 52% dels focus de criptes aberrants i del 45% dels focus amb depleció de mucines. S’observa una correlació directa entre la disponibilitat del trans-resveratrol a còlon i la reducció de les lesions preneoplàstiques. A continuació s’ha fet un estudi de la biodisponibilitat en ratolins modificats genèticament que no expressen la glicoproteïna P (Mdr1a-/-) i, per últim, en ratolins sense la breast cancer resistance protein (Bcrp1-/-), comparant-la amb la dels ratolins control. Els resultats indiquen similar biodisponibilitat en els controls i Mdr1a-/- mentre que es modifica en els ratolins Bcrp1-/- indicant que aquesta proteïna participa en l’absorció i la distribució del trans-resveratrol i els seus derivats. Finalment, s’ha desenvolupat un model farmacocinètic per al trans-resveratrol i els seus conjugats glucurònid i sulfat seguint una aproximació poblacional. El model que millor descriu les concentracions plasmàtiques en rata vincula els models bicompartimentals del trans-resveratrol, del glucurònid i del sulfat. Aquest model és robust i capaç de predir adequadament les concentracions plasmàtiques, possibilitant així la planificació de futurs estudis PK-PD per tal d’establir la contribució relativa dels conjugats en l'eficàcia del trans-resveratrol., [eng] trans-Resveratrol (trans-3,5,4'-trihydroxystilbene) is a polyphenol found in several components of the diet with beneficial health properties. Therefore, it has been considered a bioactive compound, and most recently as a nutraceutical. This work has studied this compound in-depth to meet new therapeutic and metabolic aspects. Firstly, we evaluated the changes that occur during intestinal transit and metabolism in the enterocyte when it is orally administered in the rat. trans-Resveratrol is metabolized in the enterocyte forming its glucuronide and sulfate conjugates that mostly return back into the intestinal lumen by ABC transporters. Unabsorbed trans-resveratrol reaches the colon where microbiota converts this polyphenol in dihydroresveratrol by its double bond reduction which is also conjugated in its glucuronide and sulfate in the intestine. Two techniques have been developed to determine dihydroresveratrol in plasma by a solid-phase extraction and trans-resveratrol in the intestinal content by a liquid-liquid extraction followed by HPLC analysis. The methods are accurate, precise with recoveries exceeding 95%. Secondly, a colon cancer model in rats has been developed to evaluate the effect of trans-resveratrol on preneoplastic lesions induced by 1,2-dimethylhydrazine. After 49 days of administration, trans-resveratrol, its sulfate and glucuronide, and dihydroresveratrol are found in the intestinal content and produce a reduction of aberrant crypt foci and mucin-depleted foci. There is a direct correlation between the availability of trans-resveratrol in colon and the reduction of preneoplastic lesions. Afterward a study of the bioavailability has been carried out in mice lacking P-glycoprotein (Mdr1a-/-) and in knockout mice for breast cancer resistance protein (Bcrp1-/-) as compared with that in wild-type mice. The results indicate similar bioavailability in controls and Mdr1a-/- mice while it is altered in Bcrp1-/- mice indicating that only BCRP is involved in the absorption and distribution of trans-resveratrol and its metabolites. Finally, we have developed a pharmacokinetic (PK) model for trans-resveratrol and its glucuronide and sulfate conjugates following a population PK approach. A three-linked two-compartment model was built for trans-resveratrol, glucuronide and sulfate which describes the plasmatic concentration profile in rat. This model is robust and able to accurately predict plasmatic concentrations, thus enabling future PK/PD studies to establish the relative contribution of the conjugates in the efficiency of trans-resveratrol.

El envejecimiento humano está asociado a una pérdida de masa muscular que se inicia en la cuarta década de la vida con una pérdida de fuerza de un 1% al año y que se acelera con el transcurso de los años. Las causas del envejecimiento del organismo son complejas. Una amplia variedad de procesos se considera que están implicados en el declive de los distintos aparatos y sistemas con el paso de los años. Dentro los factores implicados en la pérdida de la funcionalidad del músculo esquelético podemos destacar: la muerte celular programada, el estrés oxidativo, las alteraciones en la síntesis de proteínas, la inflamación, las alteraciones hormonales, el desuso y las disfunción mitocondrial. El objetivo general de la presente tesis es determinar el posible papel de PGC- 1 (un coactivador transcripcional descubierto en 1998) en la prevención de los efectos del envejecimiento sobre la masa muscular, el contenido mitocondrial y la defensa antioxidante en animales de experimentación. Para el desarrollo de la presente tesis doctoral utilizamos un total de 24 ratas Wistar (12 jóvenes y 12 viejas) y 20 ratones C57BL/6J (10 silvestres y 10 deficientes de PGC-1 ). Los animales fueran divididos en dos grupos experimentales: entrenados y no entrenados. Los animales jóvenes y viejos realizaron un entrenamiento aeróbico de 3 semanas de duración, mientras que los ratones silvestres y deficientes PGC-1 realizaron un entrenamiento aeróbico de 5 semanas de duración. Transcurrido el período de entrenamiento los animales fueron sometidos a una prueba de resistencia y sacrificados. Los tejidos (distintos tipos musculares) y la sangre fueron extraídos y congelados. Se analizaron: la expresión de factores de transcripción relacionados con la biogénesis mitocondrial (PGC-1 , NRF-1 y Tfam), la expresión de proteínas marcadoras de contenido mitocondrial (citocromo c y citocromo c oxidasa), la expresión de factores miogénicos en el músculo esquelético (MioD y miogenina), la expresión de proteínas oxidadas en el músculo esquelético y en el plasma, la expresión de enzimas antioxidantes (catalasa y Mn-SOD) y el rendimiento físico de los animales. Nuestros resultados demuestran que el proceso de biogénesis mitocondrial se encuentra bloqueado en los animales viejos y deficientes en PGC-1 , lo que se manifiesta en una disminución del rendimiento aeróbico de estos animales. Las similitudes observadas entre el modelo de animales deficientes en PGC-1 y el modelo de animales viejos, indican que la disfuncionalidad de PGC-1 podría ser la causa de las alteraciones mitocondriales que se producen en el músculo esquelético durante el envejecimiento. En relación al proceso de miogénesis, nuestros resultados muestran un aumento en la expresión de la miogenina en el grupo de animales viejos, lo que consideramos se puede interpretar como una respuesta compensatoria para minimizar las pérdidas de células musculares asociadas al envejecimiento. En relación a la expresión de enzimas antioxidantes, la catalasa se encuentra aumentada en los músculos de animales viejos y deficientes en PGC-1 como respuesta al aumento de estrés oxidativo (en forma de proteínas carboniladas) encontrado en los músculos de ambos grupos experimentales. El principal hallazgo de nuestra investigación es que el entrenamiento de corta duración no supone un estímulo suficiente para la activación del proceso de biogénesis mitocondrial en el músculo esquelético de los animales viejos. La escasa reactividad de PGC-1 al estímulo del ejercicio, requiere del estudio de estrategias alternativas (nutricionales y/o farmacológicas) para mejorar la inducción de este importante coactivador transcripcional y su aplicación en el tratamiento y prevención de la sarcopenia senil., Human aging is associated with a loss of muscle mass that begins in the fourth decade of life with a loss of strength of 1% per year and is accelerated over the years. The causes of aging of the body are complex. A wide variety of processes are considered to be implicated in the decline of the various devices and systems over the years. Among the factors involved in the loss of skeletal muscle function can include: programmed cell death, oxidative stress, alterations in protein synthesis, inflammation, hormonal changes, disuse and mitochondria ldysfunction. The overall objective of this thesis is to determine the possible role of PGC- 1& (a transcriptional coactivator discovered in 1998) in preventing the effects of aging on muscle mass, mitochondrial content and antioxidative defense in experimental animals. The main finding of our research is that the short-term training is not a sufficient stimulus to activate the process of mitochondrial biogenesis in skeletal muscle of old animals. The low reactivity of PGC-1& to the stimulus of exercise, requires the study of alternative strategies (nutritional and / or pharmacological) to improve the induction of this important transcriptional coactivator and its application in the treatment and prevention of senile sarcopenia.

[cat] La malaltia d'Alzheimer (MA) es caracteritza per la presència a l'hipocamp i l'escorça de plaques senils de la proteïna β-amilode (Aβ), cabdells neurofibrilars de la proteïna tau hiperfosforilada i pèrdua de sinapsis. La hipòtesi neurovascular de la MA dóna una especial importància a les alteracions de la Barrera Hematoencefàlica (BHE) i els increments de la proteïna β-amilode (Aβ). Els ratolins modificats genèticament són els models animals més utilitzats en la investigació de la MA. Tanmateix, aquests ratolins imiten aspectes de la MA de tipus familiar, on alteracions genètiques predisposen a patir la malaltia. Els ratolins d'edat avançada poden ajudar a discernir la frontera entre l'envelliment normal i el patològic. En aquest context prenen especial rellevància els ratolins amb senescència accelerada SAMP8. Aquesta soca ja ha estat descrita com a model de MA i presenta vàries característiques de la MA com dèficits en l'aprenentatge i la memòria, alteracions emocionals, nivells elevats d'APP i Aβ, patologia neuronal associada a tau, alteracions en el sistema colinèrgic, neurodegeneració i estrès oxidatiu entre d'altres. En aquesta tesi hem investigat: 1-Les alteracions i l'evolució temporal de les modificacions en la integritat de la BHE en escorça i hipocamp de ratolins SAMP8; 2-La presència de dipòsits amiloides en aquests ratolins a les zones cerebrals abans esmentades així com el seu increment amb l'edat i 3-La relació temporal i en la localització de les alteracions de la BHE i els dipòsits d'Aβ d'aquests ratolins. Les conclusions que hem estret són que en ratolins SAMP8: 1- Presenten alteracions de la BHE a partir dels 9 mesos d'edat. 2- Presenten acumulacions d'Aβ a partir de 6 mesos d'edat. 3- Presenten nivells més elevats d'angiopatia amiloïdal cerebral (CAA) a partir dels 3 mesos d'edat. 4- Tots els vasos amb CAA mostren també alteracions de la BHE, tot i que hi ha altres basos amb la BHE alterada sense CAA. 5- No hi ha relació directa entre la localització dels dipòsits amiloides i la localització dels vasos sanguinis, els vasos amb CAA ni amb els vasos amb la BHE alterada.

Se plantea el problema por la falta de trabajos en la historia tanto en la medicina española como a nivel internacional que tratan el deporte como causa y como tratamiento de la enfermedad. Como objetivo general nos planteamos conocer la evolución histórica de los estudios sobre el deporte como causa y como tratamiento de la enfermedad en las revistas médicas españolas entre 1900 y 1975. Como objetivos específicos planteamos: conocer los deportes que fueron objeto de estudio y su variación a lo largo del periodo estudiado, los tipos de enfermedades que produjeron, en qué enfermedades se utilizaron como tratamiento, el perfil profesional de los autores de los trabajos recogidos, las revistas médicas que recogieron los trabajos objeto de estudio y estudiar las características de la relación entre la evolución cronológica y temática observada y el desarrollo de la práctica de los deportes estudiados en España. Se ha tratado el marco histórico: Medicina y deporte, su relación histórica; La historia del deporte en España; La Medicina Deportiva en España El material y método empleados es el siguiente: Se han vaciado fuentes impresas, artículos de revistas impresas en España entre 1900 y 1975 dirigidas a profesionales de la Medicina cuyo tema fuera el deporte como causa y como tratamiento de enfermedad (20 de Medicina General y 2 de Medicina Deportiva). El material encontrado han sido 102 artículos originales y 42 reseñados. Se ha realizado un estudio estadístico descriptivo: distribución de artículos por año, autor, revista, tipo de referencia, producción de autores y materia. Se han estudiado los deportes con mayor presencia en las revistas médicas españolas y obtenido un perfil biográfico de los autores de mayor producción y analizado el contenido de sus artículos., A problem has arisen due to the lack of work and papers throughout history, both within Spanish medicine and internationally, dealing with the sport as a cause and as disease treatment. The main purpose of the present study is to aknowledge the historical evolution of studies dealing with sport as a cause and treatment of diseases in Spanish medical journals between 1900 and 1975. As specific objectives we aim to determine the sports that were the object of studies and their variation along the above mentioned period, the kinds of diseases they caused, in which diseases they were used as treatments, the professional profile of the authors of the works gathered and to study the features of the relationship between the chronological evolution and subject matter observation and the practice development of the studied sports in Spain. As a historical frame we have dealt with; Medicine and sport, its historical relationship, the history of sport in Spain, Sport medicine in Spain. The methodology and materials used are the following: written sources have been consulted, as well as journal papers printed in Spain between 1900 and 1975 addressed to medicine experts whose topic was the sport as a cause and treatment of diseases (20 related to general medicine and 2 related to sports medicine). The result has been 102 original articles and 42 reports found. A descriptive statistics analysis has been carried out: annual article distribution by year, author, journal, kind of reference, author production and topic. The sports that have been the object of the present study have been those with major presence in Spanish medical journals and a biographical profile of the authors of higher production has been carried out together with an analysis of their papers' content.

[cat] Un programa de quatre setmanes d'exposició intermitent a hipòxia hipobàrica (HHI) de quatre hores per sessió, s'ha demostrat com un estímul eficaç per induir hematopoesi en rata, influir de manera variable en l'efecte angiogènic de diversos músculs (miocardi, tibialis anterior i diafragma) i preservar la pèrdua de massa corporal. Quatre grups experimentals van ser estudiats: hipòxic, Post-hipòxic 20 dies, Post-hipòxic 40 dies i els seus corresponents Controls, els quals s’uniren en un sol grup en no diferir entre si. Degut a l’augment de massa eritrocitària, seria d’esperar un increment de la viscositat de la sang. Tot i que s’observà una tendència coherent, les propietats hemoreològiques no van ser substancialment alterades, quan es van comparar els quatre grups entre si. Es proposen certs mecanismes compensatoris com serien el descens de la viscositat del plasma i possibles canvis microreològics eritrocítics (deformació i agregació). Malgrat l'increment del volum d'eritròcits i hemoglobina, els índexs indicadors de transport d'oxigen van ser similars per als grups experimentals. Es van estudiar paràmetres histoquímics-morfomètrics (tipus de fibra, capil.larització, densitat de fibres musculars, etc.), bioquímics (enzim lactat deshidrogenasa, enzim citrat sintasa, mioglobina i proteïnes totals) i indicadors d'estrès oxidatiu (enzims CAT i SOD, i TBARS) per a cada un dels músculs a dalt esmentats. Per contrastar els resultats obtinguts després d'aplicar el protocol HHI amb unes condicions d’hipoxèmia sostinguda, es va dissenyar un procediment d’anemització que provoqués també una limitació en el subministrament d'oxigen als teixits. Es va dissenyar aquest protocol amb l'objectiu de no sotmetre els animals als efectes deleteris que indueix la hipòxia hipobàrica crònica. S’estudiaren paràmetres histoquímics (tipus de fibra, capil.larització, densitat de fibres musculars, etc.) i bioquímics dels músculs soleus i extensor digitorum longus. Una situació d'hipòxia provoca un estat d'estrès en la majoria d'animals que la pateixen. Per tal d’afrontar aquesta baixa disponibilitat d'oxigen, l'organisme desenvolupa respostes compensatòries per fer front a aquesta nova situació. D’aquesta manera, és capaç de dur a terme ajustaments fisiològics i morfològics per tal de mantenir un mínim nivell de metabolisme aeròbic durant aquestes condicions de transport limitat d'oxigen als teixits. Aquests ajustaments segueixen el principi de simmorfosi, mitjançant el qual la formació d'elements estructurals en els organismes animals s'orienta a aconseguir una reestructuració equilibrada amb l'objectiu d'adaptar-se a les noves situacions, però mai sense excedir els requeriments funcionals necessaris. En els nostres estudis aquest principi significaria que, les respostes perifèriques (hemàtiques i reològiques) i centrals (ventilació i control cardíac) induïbles per una situació hipòxica, han estat acompanyades d'uns ajustaments en el bescanvi de gasos i en la capacitat oxidativa, especialment en múscul esquelètic i miocardi. Després de dur a terme els nostres protocols HHI i d’anemització podem concloure que, els reajustaments fisiològics i morfològics desencadenats en les dues condicions, poden ser utilitzats com a procediments que permetin orientar aquestes respostes adaptatives cap a canvis transitoris o permanents. Tots aquests canvis fisiològics tindrien múltiples aplicacions en medicina de muntanya, de l'esport i en d’altres futures aplicacions biomèdiques., [eng] An intermittent hypobaric hypoxia (IHH) program consisting of a daily 4-h sessions during four weeks of hypoxia exposure, has been proven as an effective stimulus to induce hematopoiesis in rats, influence in a variable way the angiogenic effect of various muscles (myocardium, tibialis anterior and diaphragm) and preserve the body mass loss. Four experimental groups were studied: hypoxic, post-hypoxic 20 days, post-hypoxic 40 days and their corresponding Controls. Due to the increase of red cell mass, an increase in blood viscosity would be expected. Although there was a consistent trend, the hemorheological properties were not substantially modified, when comparing the four groups. Some compensatory mechanisms are proposed such as the plasma viscosity decrease and microrheological erythrocyte changes. Despite the increase of volume of erythrocytes and hemoglobin, oxygen transport indicators rates were similar for the experimental groups. Histochemical, morphometric and biochemical parameters, as well as indicators of oxidative stress were studied for each muscle above mentioned. To compare the results obtained after applying the IHH protocol with sustained hypoxemia conditions, an anaemization procedure was designed to lead limitation in oxygen supply to tissues. This protocol was used in order to not submit the animals to the deleteric effects induced by chronic hypobaric hypoxia. Histochemical and biochemical parameters were also studied in soleus and extensor digitorum longus muscles. Hypoxia is a stressful situation for most animals. To cope with the oxygen requirements, the organism is able to perform physiological and morphological adjustments to maintain a minimum level of aerobic metabolism under conditions of poor oxygen delivery to the tissues. These adjustments follow the symmorphosis principle, which states that structural elements are formed to satisfy functional requirements without excess. In our studies, this principle would mean that peripheral and central responses, induced by a hypoxic situation, have been accompanied by some adjustments in gas exchange and oxidative capacity. After conducting our protocols IHH and anemia, we conclude that physiological and morphological adjustments triggered in the two different conditions can be used as procedures to lead these adaptive responses to transient or permanent changes. All these physiological changes would have multiple applications in mountain and sport medicine, and in other future biomedical applications.

En esta Tesis Doctoral estudiamos el efecto de la diabetes tipo 1 sobre la memoria de color. Los observadores con diabetes se clasifican en 3 grupos: 31 sujetos con fondo de ojo normal, (GDFON) 25 sujetos con retinopatía no proliferatíva, (GDRNP), y 29 sujetos con retinopatía proliferativa sometidos al tratamiento de fotocoagulación con laser, (GDTL). Determinamos, en el espacio CIELAB, las variaciones medias entre una muestra presente (test de referencia) y otra yuxtapuesta (igualación cromática simultánea) o que se recuerda (igualación cromática por memoria), correspondientes a las componentes de la diferencia de color (diferencia de claridad, ΔL*, diferencia de croma, ΔC*ab, y diferencia de tono, ΔH*ab), y a la diferencia total de color, ΔE*ab. A partir de aquí, comparamos los resultados obtenidos con cada uno de los tres grupos, entre sí y con los de un grupo control, GC, formado por 31 observadores -no diabéticos. Finalmente, medimos y comparamos los tiempos medios que precisan cada una de estos cuatro grupos en escoger, con ambos métodos de igualación cromática, la muestra que más se asemeja al test de referencia (tiempo de respuesta). Para realizar la experiencia seleccionamos 5 muestras de color, tests de referencia, de un Atlas de color Munsell. Para el estudio con cada uno de los tests utilizamos 20 muestras de comparación escogidas de un Atlas Munsell semejante al primero. De los resultados obtenidos se concluye lo siguiente: 1) Hemos comprobado que, también en el caso de los diabéticos, la igualación del color por memoria es peor que la simultánea (p ≤ 0.005). 2) Independientemente del color del test original, el grupo GDTL iguala el color del test peor que el grupo GC. Asimismo, el grupo GDTL iguala peor que los grupos GDFON (para rosa y naranja), y GDRNP (para violeta, rosa y naranja). 3) El grupo GDFON recuerda mejor el naranja original que los grupos GC (p=0.026) y GDTL (p=0.040). 4) Las diferencias entre grupos con los descriptores perceptuales del color (claridad, tono y croma) recordados no son significativos para violeta, verde azulado y rosa. 5) El grupo GDTL recuerda el verde amarillento original más claro que los grupos GC (p=0.008), GDFON (p=0.007), y GDRNP (p=0.004). 6) El grupo GC recuerda el croma del verde amarillento y del naranja más cromático que los grupos GDFON Y GDRNP; para el naranja, el croma es el descriptor perceptual que más contribuye a la diferencia de color media entre los grupos GDFON y GC. 7) Mientras el grupo GDFON recuerda el tono del verde amarillento mejor, aunque más amarillento, los grupos GC, GDRNP y GDTL lo recuerdan más verdoso. Para el naranja, el grupo GDRNP recuerda el tono original peor, más amarillento, que el de GC (p=0.015), que además, lo recuerda más rojizo. 8) Para verde azulado y naranja todos los grupos tardan el mismo tiempo en igualar. Los grupos más lentos son el GDTL para violeta, y el GC para rosa; el grupo GDFON es el más rápido tanto con verde amarillento como con rosa. Observamos que, independientemente del color del test original, los tres grupos de diabéticos tardan en igualar por memoria la mitad de tiempo que el grupo GC (p≤0.005). Según estas conclusiones diseñamos 2 tests basados en la igualación cromática simultánea y por memoria, que se podrían utilizar en atención primaria y controles médicos rutinarios. Con ellos detectaríamos si el sujeto padece o no diabetes, y en su caso, el tipo de retinopatía que presenta. Sería un test fácil de utilizar, barato, inocuo y muy útil ya que evitaría las visitas al oftalmólogo de pacientes que realmente no lo necesitan y detectaría antes la enfermedad., Effect of type 1 diabetes on the memory of colour. The observed diabetic subjects are classified in three groups: 31 subjects with healthy rear of the eye, (GDFON), 25 subjects suffering from non-proliferative retinopathy, (GDRNP), and 29 subjects suffering from proliferative retinopathy treated with laser photocoagulation, (GDTL). We determine, on CIELAB space, the average change between a present sample and a yuxtaposed or remembered one, corresponding to the components of the change in colour (ΔL*, ΔC* ab, ΔH* ab), and to the total difference in colour, ΔE*ab. From this point, we compare the results obtained in each of the three groups, among them and with the results obtained in a control group, (CG), 31 observed non diabetic subjects. To perform the experiment we select 5 reference tests, from a Munsell colour system. To conduct the study, with every test we use 20 matching samples selected from a Munsell colour system. Conclusions: 1) The balancing of colour done by memory is worse than the one which occurs simultaneously (p ≤ 0.005). 2) GDTL balances the colour on the test worse than GC. GDTL balances colour worse than GDFON (concerning pink and orange) and GDRNP (violet, pink and orange). 3) GDFON recalls original orange better than GC (p=0.026) and GDTL (p=0.040). 4) Concerning orange, the chroma is the perceptual descriptor that contributes the most to the average change of colour between GDFON and GC. 5) Concerning orange, GDRNP recalls the original hue worse, more yellowish, than GC (p=0.015), which in spite of everything, recalls it more reddish. According to these conclusions we design two tests based on the chromatic balancing, simultaneous and by memory, which could be used in routine medical checkups.We would detect if the subject suffers from diabetes or not, and in case the tests were positive, we could establish the kind of retinopathy. It would not only be an easy to use test but it also would be cheap, harmless and really useful as it would save appointments at the ophthalmologist to pacients who really don't need it and we would detect the disease earlier.