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Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Nous avons étudié le rôle de l' α-actinine dans le développement de "Neurospora crassa". A l'aide des outils bioinformatiques, nous avons trouvé un gêne codant pour l'α-actinine puis nous avons caractérisé ce dernier biochimiquement. Nous avons déterminé sa localisation "in situ" et "in vivo" pendant la germination et pendant la croissance hyphale. Bien que le rôle exact de l'α-actinine n'ait pas pu être totalement élucidé, l'étude phénotypique du transformant ("knock-out" partiel de l'α-actinine) nous amène à penser que cette protéine participe avec l'actine à la coordination de la germination, la formation des septa et l'établissement des ramifications hyphales lors de la croissance du champignon. En outre, nous avons pu déterminer que l'α-actinine est la seule protéine appartenant à la superfamille des spectrines chez les champignons filamenteux, les levures et les Oomycètes et représente un membre "primitif" de cette superfamille.

During wound healing and in a variety of fibrocontractive diseases, fibroblasts differentiate into contractile myofibroblasts by acquiring stress fibers and by expressing α-smooth muscle actin (α-SMA). Myofibroblasts of wound granulation tissue, in contrast to dermal fibroblasts, join stress fibers at sites of cadherin-type intercellular adherens junctions (AJs). However, the function of myofibroblast AJs, their molecular composition, and the mechanisms of their formation are largely unknown. We demonstrate here that fibroblasts change cadherin expression from N-cadherin in early wounds to OB-cadherin in contractile wounds, populated with α-SMA-positive myofibroblasts. A similar shift occurs during myofibroblast differentiation in culture and seems to be responsible for the homotypic segregation of α-SMA-positive and -negative fibroblasts in suspension. By measuring the adhesion strength between suspended cells with a laser tweezers, we show that fibroblast adhesion is cadherin-mediated since anti-OB-cadherin and anti-N-cadherin peptides reduce the adhesion of both myofibroblasts and fibroblasts respectively. The switch from N- to OB-cadherin expression results in 1.3-fold increased adhesion strength despite reduced cadherin expression levels. Moreover, AJs of plated myofibroblasts are reinforced by α-SMA-mediated contractile activity, resulting in high mechanical resistance as demonstrated by subjecting cell pairs to hydrodynamic forces in a flow chamber. A peptide that inhibits α-SMA-mediated contractile force causes the reorganization of large stripe-like AJs to belt-like contacts as shown for enhanced green fluorescent protein-α-catenin-transfected cells and is associated with a reduced mechanical resistance. Anti-OB-cadherin but not anti-N-cadherin peptides reduce the contraction of myofibroblast-populated collagen gels, suggesting that AJs are instrumental for myofibroblast contractile activity. Using atomic force microscopy we further investigate the difference between N- and OB-cadherin adhesion strength on the single molecule level and show that part of the stronger adhesion of myofibroblasts is accomplished because single OB-cadherin bonds resist 2-fold higher forces compared with single N-cadherin junctions. By assessing the adhesion force between recombinant cadherin dimers and between native cadherins in the membrane of spread fibroblasts, we demonstrate that cadherin bonds are reinforced over time, displaying a hierarchy of three distinct adhesion forces. By modulating the degree of lateral cadherin diffusion and of F-actin organization we can attribute this resulting three force states to the single molecule bond rather than to cadherin cluster formation; this is consistent with a new model of homotypic cadherin ectodomain interaction. Notably, association with actin filaments enhances cadherin adhesion strength on the single molecule level by up to 3-fold; actin depolymerization reduces single bond strength to the level of cadherin constructs missing the cytoplasmic domain. Hence, fibroblasts reinforce intercellular contacts by: 1) switching from N- to OB-cadherin expression, 2) increasing the strength of single molecule bonds in three distinct steps, and 3) actin-promoted intrinsic activation of cadherin extracellular binding. We propose that this plasticity adapts fibroblast adhesions to the changing mechanical microenvironment of tissue under remodeling.

International audience; Root-knot nematodes are plant parasitic worms that establish and maintain an intimate relationship with their host plants. RKN induce the redifferentiation of root cells into multinucleate and hypertrophied giant cells essential for nematode growth and reproduction. Major rearrangements of the cytoskeleton occur during giant cell formation. We characterized the first plant candidate genes implicated in giant cell actin and microtubule cytoskeleton reorganization. We showed previously that formins may regulate giant cell isotropic growth by controlling the assembly of actin cables. Recently we demonstrated that a Microtubule-Associated Protein, MAP65-3, is essential for giant cell development. In the absence of functional MAP65-3, giant cells started to develop but failed to fully differentiate and were eventually destroyed. In developing giant cells, MAP65-3 was associated with a novel kind of cell plate — the giant cell mini cell plate — that separates daughter nuclei. Despite karyokinesis occurs without cell division in giant cell, we demonstrated that cytokinesis is initiated and required for successful pathogen growth and development.

When switching from green to yellow, a leaf undergoes both morphological and metabolic changes. This process is known as senescence and improved understanding of its mechanisms is important both from a fundamental scientific perspective but also for biotechnological applications. The present thesis reports on several important aspects regarding the cellular and metabolic mechanisms occurring during leaf senescence with an emphasis on the mitochondrial contribution to this process. As a first step, we developed methods to isolate either highly functional crude mitochondria or highly purified mitochondria from leaves of Arabidopsis thaliana. These methods were further used to study mitochondrial contributions to cellular redox homeostasis and to estimate the mitochondrial capacities in leaves undergoing senescence. In particular, we compared the induction of senescence by different dark treatments in Arabidopsis. The comparison between individually darkened leaves and leaves from whole darkened plants revealed different metabolic strategies in response to darkness. Integrating data from measurements of photosynthesis, respiration and confocal laser microscopy with transcriptomic and metabolomic profiling, we suggested that metabolism in leaves of the whole darkened plants enter a ?stand-by mode? with low mitochondrial activity in order to maintain the photosynthetic machinery for as long as possible. In contrast, mitochondria from individually darkened leaves are more active and may provide energy and carbon skeletons for the degradation of cell constituents, facilitating the retrieval of nutrients. We also investigated the dynamics of the microtubular cytoskeleton during dark-induced senescence. Mitochondrial mobility was affected by an early disruption of the microtubules in individually darkened leaves but not in whole darkened plants. In addition, several microtubules associated proteins (MAPs) seemed to be involved in the bundling of the microtubules around the chloroplasts. Altogether, the work presented in this thesis highlights several important steps regarding the metabolic adjustments and the cellular mechanisms in Arabidopsis leaves submitted to prolonged darkness. In particular, we suggest the mitochondria to fulfill specific and important functions during leaf senescence since the role of mitochondria in leaves experiencing prolonged darkness appears very dependant on the whole metabolic status of the plant.; Lors de son jaunissement, une feuille subit aussi bien des modifications morphologiques que métaboliques. Ce processus est appelé « sénescence ». Une meilleure compréhension des mécanismes de la sénescence représente un challenge très important non seulement pour la recherche fondamentale mais aussi pour de futures applications en biotechnologie. La thèse présentée ici porte sur d?importants aspects relatifs aux mécanismes cellulaires et métaboliques rencontrés lors de la sénescence foliaire et ce, en apportant une attention particulière à l'implication des mitochondries lors de ce processus. Dans un premier temps, nous avons développé deux méthodes pour isoler, à partir de feuilles d'Arabidopsis, soit des mitochondries conservant leurs fonctionnalités, soit des mitochondries hautement purifiées. Ces méthodes furent utilisées afin d'étudier le rôle des mitochondries dans l'équilibre redox des cellules mais aussi dans le but de déterminer les capacités mitochondriales lors de la sénescence foliaire. Plus précisément, nous avons comparé l'induction de la sénescence foliaire grâce à différents traitements à l'obscurité. Cette comparaison entre des feuilles individuellement placées à l'obscurité et des feuilles provenant d'une plante entièrement disposée à l'obscurité révéla des stratégies métaboliques très différentes. En intégrant des mesures de l'activité photosynthétique, de la respiration et de microscopie laser confocale avec des analyses de transcriptomique et de métabolomique, nous suggérons que le métabolisme d'une feuille provenant d'une plante placée longuement à l'obscurité entre dans un état de « veille » dans le but de maintenir la machinerie photosynthétique fonctionnelle le plus longtemps possible; dans ce cas, les capacités mitochondriales diminuent. A contrario, les mitochondries issues de feuilles individuellement soumises à l'obscurité sont beaucoup plus actives et peuvent par conséquent fournir l'énergie et les squelettes carbonés nécessaires à la dégradation des constituants cellulaires facilitant ainsi la remobilisation des nutriments. Par ailleurs, nous avons aussi mené des investigations sur la dynamique du cytosquelette lors d'une sénescence induite par l'obscurité. La mobilité mitochondriale fut affectée dans les feuilles individuellement soumises à l'obscurité par la dégradation précoce des microtubules ce qui ne fut pas le cas dans les feuilles issues d?une plante entièrement placée à l'obscurité. De plus, un certain nombre de MAPS (microtubules-associated proteins) semblent être impliquées dans l'agrégation des microtubules autour des chloroplastes. Dans son ensemble, cette thèse apporte d?importantes informations quant aux ajustements métaboliques ainsi qu'aux mécanismes cellulaires prenant place lorsque des feuilles d'Arabidopsis sont soumises à une obscurité prolongée. En particulier, nous pensons que les mitochondries ont un rôle prépondérant lors de la sénescence foliaire et que selon le statut métabolique de la plante, les régulations mitochondriales peuvent apparaître divergentes.

Talin is a multifunctional cytoskeletal protein that plays a critical role in linking the actin cytoskeleton to the integrin family of transmembrane cell adhesion receptors. Two distinct integrin binding sites have been identified in talin, one present in the globular head domain (IBS1) and involved in integrin activation, and a second (IBS2), that has been delineated to a 130 residue fragment of the talin rod domain, but whose functional role is still elusive (Tremuth et al.2004). The objective of the present study was to define the minimal structure of talin IBS2 and to investigate its functional role in the integrin-cytoskeleton connection.In the first part of this study, we used a combination of three different experimental approaches to define the minimal structure of talin IBS2: 1) an in silico bioinformatics approach to analyse sequence conservation of talin IBS2, 2) an in vivo cell biology approach to study the subcellular localization of recombinant talin fragments covering IBS2 in CHOáIIbâ3 cells, and 3) an in vitro biochemical approach consisting in protein overlay, pull down and Surface Plasmon Resonance (SPR) assays, to study the direct interaction between talin IBS2 and the integrin â3 subunit. We delineated IBS2 to a single amphipathic á-helical repeat of 23 residues within the talin rod domain. We further provided evidence that a two amino acid mutation(L2094I2095/AA) was sufficient to inactivate the IBS2 site, due to a disruption of the á helix structure, as demonstrated by infrared spectroscopy. In addition, we identified 2 lysine residues (K2085, K2089) exposed on the solvent face of á helix 50, which are directly involved in the talin IBS2-integrin interaction.In the second part of this study, we investigated the functional role of talin IBS2 in spreading defective talin (-/-) cells and showed that in contrast to full-length wild type talin, an IBS2 LI/AA mutant talin was unable to fully rescue the spread phenotype of these cells. These results provide the first direct evidence that IBS2 in the talin rod is essential to link integrins to the actin cytoskeleton., Doctorat en Sciences, info:eu-repo/semantics/nonPublished

Actin is one of the major constituents of the cytoskeleton. By dynamically assembling in cells, actin filaments are able to push the membrane out, and deform the cell leading to force generation and movement. In the last ten years, biochemical studies have unveiled many different biochemical pathways that lead to actin polymerization and assembly. However, the mechanism of force generation is still under debate. The main issue is how the microscopic properties of individual filaments are integrated at the scale of a cell to produce forces. In addition, little is known about the dynamic formation and disassembly of actin filaments cables (an organisation of actin filaments in parallel/or antiparrallel bundles). Recently, formins have been shown to be an essential family of proteins for the initiation of such actin-based structures. This manuscript highlights the work that we conduct to understand the mechanism of action of formins at a molecular level. Most of formins are processive nucleators; indeed they are promoting fast actin filament elongation while remaining attached to the growing end of the filament. We have shown by the original evanescent wave microscopy technique that Arabidopsis Thaliana FORMIN1 represents a new kind of formin, which moves to the side of the actin filament after nucleation. From the side of the pre-existing filament, FORMIN1 is able to nucleate a new filament, promoting the assembly of actin filaments into actin cables. We next combine biomimetic assays with TIRF microscopy, to address the mechanism of the dynamic of polymerization and depolymerization of actin filaments induced by ADF/cofilin. We visualized for the first time individual actin filament stochastic dynamics in real time, and proposed a selection process for the formation of large actin based structures initiated by formin.; L'exercice de forces est indispensable au bon fonctionnement de nombreux processus cellulaires. Chez les eucaryotes, une majorité de ces phénomènes motiles est assurée par la polymérisation et la dépolymérisation spatialement et temporellement contrôlée du cytosquelette d'actine. Le cytosquelette est composé de microfilaments d'actine qui s'associent en structures complexes aux propriétés mécaniques particulières. Au cours des dix dernières années, beaucoup d'efforts ont été menés pour comprendre la dynamique des réseaux branchés de filaments d'actine initiés par le complexe Arp2/3. En revanche, peu de choses sont connues à propos de la dynamique de formation et de désassemblage des câbles de filaments d'actine. Récemment, il fut montré que les formines représentent une famille de protéines essentielles à l'initiation de ces structures.Cette thèse résume dans un premier temps le travail accompli pour comprendre le mécanisme d'action des formines à l'échelle moléculaire. La plupart des formines sont des nucléateurs processifs, c'est-à-dire qu'ils permettent la formation et l'élongation de nouveaux filaments d'actine, tout en restant liées à l'extrémité du filament qui polymérise. Nous avons montré par la technique originale de microscopie à onde évanescente que Arabidopsis Thaliana FORMIN1 représente un nouveau type de formine, qui se déplace sur le côté des filaments d'actine après les avoir formés. Depuis le côté d'un filament préexistant, FORMIN1 est capable de nucléer un autre filament, initiant la formation de câbles de filaments d'actine. Dans un deuxième temps, cette thèse s'intéresse au mécanisme moléculaire mis en jeu par l'ADF/cofiline pour accélérer la dynamique d'assemblage/désassemblage des filaments d'actine, et traite pour la première fois de la dynamique de l'actine en temps réel à l'échelle du filament individuel ou à l'intérieur de structures organisées de filaments d'actine.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Neurofilaments (NFs) are the major and specific Intermediate Filaments (IF) of neurons. They are required for the maintenance and proper function of axons. Among the three subunits, the high molecular NFH, is the last to appear during neurogenesis and synaptogenesis. However its precise role is unknown. Accumulation of cytoskeleton components is a fundamental event in neurodegenerative diseases, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), or in peripheral neuropathies, including Neurofilaments. Their aggregation in the cytoplasm or in axon may perturb the axonal flow. We develop a cellular and molecular tool through a fusion protein, NFHGFP, which allows us to follow the metabolism of NFH using the fluorochrome eGFP. The expression of NFHGFP, in cell culture experiments or in transgenic mice, does not modify the metabolism of IF, nor NFHGFP aggregation induced with specific IF toxic drugs or in double transgenic mice (NFHLacZ/NFHGFP). NFHGFP appears to be a new tool that could help to dissect the mechanisms of neuronal differentiation, intracellular and axono-myelinic interactions, neurotoxicity? We also show that regulatory elements are present in the second intron of NFH. These results are in accordance with those described for NFM and NFL. After having described, in mice, that a microtubule associated protein, STOP, is also associated with Neurofilaments, we demonstrated that STOP is also present in human nervous tissues and is associated with Neurofilaments. The protein is also aggregated in pathological neuronal structures known to be enriched in NFs, the spheroids. Finally, in axonal peripheral neuropathies of unknown aetiology, we point up that expression of Tubulin and NFs, is the same as in axonal growth and we postulate that chronic failure of regeneration may explain the pathophysiology of these neuropathies.; Le cytosquelette des neurones matures est majoritairement composé de Neurofilaments. Ils sont nécessaires à la mise en place et au maintien de l'axone. Parmi les trois sous unités qui composent le neurofilament, celle de haut poids moléculaire (NFH) apparaît le plus tardivement lors de la différentiation de la synapse et sa fonction précise est mal connue. Une perturbation du métabolisme des Neurofilaments (à l'échelon de la protéine et/ou du gène) est impliquée dans certaines pathologies du système nerveux. Dans les maladies neurodégénératives, en particulier dans la Sclérose Latérale Amyotophique (SLA) ou dans des neuropathies périphériques, l'agrégation de NFs dans le corps cellulaire et dans l'axone, avec perturbation du flux axonal, est un événement fondamental. Nous avons développé un outil cellulaire et moléculaire, utilisant une protéine de fusion NFHGFP, permettant, grâce à un fluorochrome (eGFP), de suivre le métabolisme de NFH. En culture de cellules ou chez des souris transgéniques, l'expression de cette protéine de fusion ne modifie pas leur fonctionnement ni leur comportement en présence notamment de drogues susceptibles d'entraîner leur agrégation. L'utilisation de cet outil, en particulier en association avec l'expression de la protéine NFHLacZ, ouvre la voie pour de nouvelles études en situation physiologique et pathologique : différentiation neuronale, interactions intracellulaires et axonomyéliniques, études de neurotoxicité... Les travaux présentés portent également sur les mécanismes de régulation intragénique de NFH. Nous avons montré que, comme pour les deux autres sous unités (NFL et NFM), les séquences introniques, en particulier le second intron, permettaient de contrôler dans le temps et dans l'espace l'expression d'un rapporteur. Dans un objectif de transposition des résultats de la recherche fondamentale et expérimentale à la recherche clinique, nous avons démontré qu'une protéine initialement décrite comme associée aux microtubules (STOP) était également associée aux neurofilaments dans les tissus humains normaux et pathologiques (SLA). Enfin nous avons pu établir que le profil d'expression de la tubuline et des Neurofilaments dans des neuropathies périphériques de cause indéterminée reproduisait celui de la croissance axonale, et qu'une régénération inefficace pouvait également être à l'origine de certaines neuropathies.

Neurofilaments (NFs) are the major and specific Intermediate Filaments (IF) of neurons. They are required for the maintenance and proper function of axons. Among the three subunits, the high molecular NFH, is the last to appear during neurogenesis and synaptogenesis. However its precise role is unknown. Accumulation of cytoskeleton components is a fundamental event in neurodegenerative diseases, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), or in peripheral neuropathies, including Neurofilaments. Their aggregation in the cytoplasm or in axon may perturb the axonal flow. We develop a cellular and molecular tool through a fusion protein, NFHGFP, which allows us to follow the metabolism of NFH using the fluorochrome eGFP. The expression of NFHGFP, in cell culture experiments or in transgenic mice, does not modify the metabolism of IF, nor NFHGFP aggregation induced with specific IF toxic drugs or in double transgenic mice (NFHLacZ/NFHGFP). NFHGFP appears to be a new tool that could help to dissect the mechanisms of neuronal differentiation, intracellular and axono-myelinic interactions, neurotoxicity? We also show that regulatory elements are present in the second intron of NFH. These results are in accordance with those described for NFM and NFL. After having described, in mice, that a microtubule associated protein, STOP, is also associated with Neurofilaments, we demonstrated that STOP is also present in human nervous tissues and is associated with Neurofilaments. The protein is also aggregated in pathological neuronal structures known to be enriched in NFs, the spheroids. Finally, in axonal peripheral neuropathies of unknown aetiology, we point up that expression of Tubulin and NFs, is the same as in axonal growth and we postulate that chronic failure of regeneration may explain the pathophysiology of these neuropathies., Le cytosquelette des neurones matures est majoritairement composé de Neurofilaments. Ils sont nécessaires à la mise en place et au maintien de l'axone. Parmi les trois sous unités qui composent le neurofilament, celle de haut poids moléculaire (NFH) apparaît le plus tardivement lors de la différentiation de la synapse et sa fonction précise est mal connue. Une perturbation du métabolisme des Neurofilaments (à l'échelon de la protéine et/ou du gène) est impliquée dans certaines pathologies du système nerveux. Dans les maladies neurodégénératives, en particulier dans la Sclérose Latérale Amyotophique (SLA) ou dans des neuropathies périphériques, l'agrégation de NFs dans le corps cellulaire et dans l'axone, avec perturbation du flux axonal, est un événement fondamental. Nous avons développé un outil cellulaire et moléculaire, utilisant une protéine de fusion NFHGFP, permettant, grâce à un fluorochrome (eGFP), de suivre le métabolisme de NFH. En culture de cellules ou chez des souris transgéniques, l'expression de cette protéine de fusion ne modifie pas leur fonctionnement ni leur comportement en présence notamment de drogues susceptibles d'entraîner leur agrégation. L'utilisation de cet outil, en particulier en association avec l'expression de la protéine NFHLacZ, ouvre la voie pour de nouvelles études en situation physiologique et pathologique : différentiation neuronale, interactions intracellulaires et axonomyéliniques, études de neurotoxicité... Les travaux présentés portent également sur les mécanismes de régulation intragénique de NFH. Nous avons montré que, comme pour les deux autres sous unités (NFL et NFM), les séquences introniques, en particulier le second intron, permettaient de contrôler dans le temps et dans l'espace l'expression d'un rapporteur. Dans un objectif de transposition des résultats de la recherche fondamentale et expérimentale à la recherche clinique, nous avons démontré qu'une protéine initialement décrite comme associée aux microtubules (STOP) était également associée aux neurofilaments dans les tissus humains normaux et pathologiques (SLA). Enfin nous avons pu établir que le profil d'expression de la tubuline et des Neurofilaments dans des neuropathies périphériques de cause indéterminée reproduisait celui de la croissance axonale, et qu'une régénération inefficace pouvait également être à l'origine de certaines neuropathies.

The p21-activated kinase 3 (PAK3) codes for a serine threonine protein kinase implicated in non syndromique mental retardation. PAK kinases are activated by the GTPases Cdc42 and Rac1 and regulate neuronal plasticity through actin cytoskeleton. In order to understand the specific role of PAK3 in cognitive functions, we studied the mutations responsible for mental retardation and characterized new splice variants. We show that: 1) PAK3 is selectively activated by Cdc42; 2) two mutations totally abolish the kinase activity and profoundly alter dendritic spine morphology; 3) a third mutation decreases the binding of PAK3 to the GTPase Cdc42 and drastically reduces spine density. These results suggest that Cdc42/PAK3 is a key module in dendritic spine formation and synaptic plasticity. We also identified two new constitutively active PAK3 splice variants and propose a new regulation model of their kinase activity, based on the formation of heterodimers., La p21-activated kinase 3 (PAK3) code pour une sérine/thréonine kinase dont la mutation est responsable de retard mental non syndromique. Les kinases PAK sont activées par les GTPases Rac1 et Cdc42 et régulent la plasticité neuronale en agissant sur le cytosquelette d'actine. Afin de comprendre le rôle spécifique de PAK3 dans les processus cognitifs, nous avons étudié les mutations responsables de retard mental et caractérisé des nouveaux variants d'épissage. Ainsi, nous avons montré: 1) que PAK3 est activé préférentiellement par Cdc42 ; 2) que deux mutations suppriment totalement l'activité kinase et entraînent de fortes anomalies de morphologie des épines dendritiques de neurones d'hippocampe ; 3) qu'une autre mutation diminue fortement la liaison de la kinase à la GTPase Cdc42 et induit une forte réduction de la densité des épines. Ces résultats montrent que le module Cdc42/PAK3 joue un rôle clé dans la formation des épines dendritiques et la plasticité synaptique. Par ailleurs, nous avons identifié deux nouveaux variants d'épissage de PAK3 qui sont constitutivement actifs. Nous proposons un nouveau modèle de régulation de leur activité kinase, basé sur la formation d'hétérodimères.

Cellular processes, including morphogenesis, polarization, and motility, rely on a variety of actin-based structures. Although the biochemical composition and filament organization of these structures are different, they often emerge from a common origin. This is possible because the actin structures are highly dynamic. Indeed, they assemble, grow, and disassemble in a time scale of a second to a minute. Therefore, the reorganization of a given actin structure can promote the formation of another. Here, we discuss such transitions and illustrate them with computer simulations.

The general topic of this work is the actin cytoskeleton. The dynamic polymeric arrangement is directly related to the cell morphology but also to the cell adhesion and motility. Its disruption is characteristic of cancerization, leading actin to be a pharmacological target.Studying and imaging actin are the main goals of this work.The first part of the manuscript deals with the development and characterization of a new in vitro screening test of actin polymerization. The polymerization is correlated with the enhancement of the fluorescence anisotropy of Alexa488 used as a tracer in cell extracts samples.The second aspect is the development of a new FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) and trFAIM (time-resolved Fluorescence Anistropy Imaging Microscopy) set-up. This set-up has been successfully used for actin imaging as well as for other topics developed in PPSM (organic nanocrystals, nanolatexs ...).The last aspect exposes an original technology to study in vivo actin polymerization. After a femtosecond assisted nano-dissection, we were able to monitor the realignment of an actin stress fiber.; L'objet de l'étude présentée ici est le cytosquelette d'actine. Cet arrangement polymère dynamique est très impliqué à la fois dans la morphologie cellulaire mais aussi dans les phénomènes d'adhérence et de motilité cellulaires. La perturbation de cette dynamique et des fonctions qui lui sont associées est caractéristique de la transformation tumorale, ce qui fait de l'actine une cible pharmacologique anti-cancéreuse.La thématique générale de ce manuscrit est l'étude et l'imagerie de la polymérisation de l'actine. La première partie de ce manuscrit est consacrée au développement et à la validation théorique et expérimentale d'un test de mesure de la polymérisation in vitro de l'actine à partir d'extraits cellulaires. La polymérisation de l'actine est suivie grâce à l'augmentation de l'anisotropie de fluorescence d'un marqueur fluorescent, l'Alexa488, utilisé comme traceur dans les échantillons.La deuxième partie présente le montage et la caractérisation d'un nouveau système d'imagerie de la durée de vie de fluorescence (FLIM) sous microscope par comptage monophotonique ainsi qu'un développement de cet instrument pour faire l'imagerie de l'anisotropie de fluorescence résolu dans le temps (trFAIM). Cet instrument, qui nous a déjà permis de faire l'imagerie de polymères d'actine, ouvre également des perspectives pour de nombreuses autres applications à la fois dans l'imagerie cellulaire (polymérisation de l'actine in vivo, calcium intracellulaire3, ...) mais également dans d'autres thématiques développées au PPSM (cristaux organiques fluorescents, nanolatex, ...).Enfin, le troisième chapitre propose une technologie originale pour faire l'étude in vivo de la polymérisation de l'actine mettant en oeuvre une instrumentation de pointe issue de la physique appliquée des lasers. L'emploi d'un laser femtoseconde permet la nano-dissection, dans une cellule vivante, d'une fibre de stress d'actine dont on peut ensuite étudier le rétablissement.

La migration cellulaire est une étape clé intervenant à un stade précoce de la dissémination des cellules cancéreuses dans l’organisme, et est donc responsable de la formation des métastases qui tuent environ nonante pourcent des patients atteints de cancer. De plus, ces cellules migrantes résistent à l’apoptose grâce à l’activation constitutive de voies de signalisation anti-apoptotiques, et développent donc une résistance vis-à-vis des traitements anti-cancéreux actuels qui sont généralement pro-apoptotiques. Nous avons pris pour cible ce processus de migration cellulaire dans l’espoir d’identifier des agents anti-migratoires qui permettraient de lutter contre la formation des métastases et de restaurer chez les cellules migrantes une certaine sensibilité aux traitements pro-apoptotiques.Dans la première partie de notre travail, nous avons analysé les effets anti-angiogéniques et anti-migratoires des agents anti-tubuline. Nous avons confirmé que le Taxol® présentait une action anti-angiogénique à des concentrations non-cytotoxiques. Nous avons ensuite démontré que d’autres agents anti-tubuline exerçaient la même action que le Taxol®, et que cette action leur était spécifique. Nous avons montré que certains de ces agents étaient également capables de réduire la migration de lignées cellulaires tumorales, toujours à des concentrations non-cytotoxiques, et que cette action pouvait s’exercer via une affectation du cytosquelette d’actine.Dans la deuxième partie du présent travail, nous avons démontré l’importance de la mise au point d’une approche pharmacologique originale permettant l’identification de composés à action anti-migratoire puisque l’outil utilisé par le U.S. National Cancer Institute pour le criblage de nouvelles molécules anti-cancéreuses ne permet pas de discerner l’activité anti-migratoire des molécules testées.Enfin dans la troisième partie de ce travail, après avoir souligné la raison du choix de l’actine comme cible pour inhiber la migration cellulaire, nous avons développé une stratégie pharmacologique in vitro originale de découverte de composés anti-actine à activité anti-migratoire. Grâce à une approche divisée en plusieurs étapes, à savoir un essai de cytotoxicité, une étude de la dynamique de la polymérisation d’actine en tubes ou sur cellules entières, et des essais de migration bidimensionnelle sur cellules individuelles ou sur population cellulaire, nous avons montré d’une part que des molécules connues pour affecter le cytosquelette actinique étaient capables d’affecter la migration cellulaire, et d’autre part que la méthodologie que nous avons développée permettait bien l’identification de composés affectant l’actine et capables de réduire la migration de cellules tumorales. En conclusion, cette stratégie in vitro pourrait être utilisée dans l’identification de nouvelles molécules à activité anti-migratoire pour lutter contre le cancer., Doctorat en sciences pharmaceutiques, info:eu-repo/semantics/nonPublished

we used fibronectin micro-patterns imposing cells to spread upon adhesive and non-adhesive areas. The relative positioning of these areas was used to impose asymmetric adhesive environment to cells.Therefore we showed that cells develop large stress fibres upon non-adhesive areas and protrusions upon adhesive ones. This polarity of the actin cytoskeleton induced a specific recruitment of APC, a molecules interacting with both actin and microtubules. Thereby the polarity of the actin network was transmitted to the microtubules which keep growing along stress fibres whereas they stop when contacting adhesive edges. The internal polarity of cells as revealed by the relative positioning of nucleus and centrosome was thus harmonised with the geometry of the extracellular matrix. Furthermore, we showed that this geometry impinge on spindle orientation and cell division axis independently of cell shape., Les travaux effectués au cours de cette thèse et présentés dans ce manuscrit consistent en l'utilisation de micro-patrons adhésifs pour l'étude de l'organisation spatiale des organites intracellulaires. Nous avions comme modèle de travail la compartimentation et la polarisation des cellules au sein des tissus. Dans cette situation, les cellules n'adhèrent pas de façon homogène et isotrope à leur environnement. Au contraire, elles s'attachent à leur voisines et à la matrice extracellulaire, en des endroits particuliers, grâce à des complexes transmembranaires, les adhésions. Ces adhésions sont une des bases structurales de la construction du cytosquelette. Leur distribution spatiale peut être anisotrope, et parfois asymétrique, ce qui guide la polarité intrinsèque des cellules. Nous avons utilisé la technique d'impression par micro-contact pour manipuler la forme des cellules et la distribution de leurs adhésions. Les cellules adoptent l'enveloppe convexe du patron adhésif quelle que soit sa géométrie. Si, par exemple, les cellules sont contraintes de s'attacher à un T ou un V, sans pouvoir établir de contact en dehors de ce patron, elles adopteront dans les deux cas la même forme triangulaire. Nous avons utilisé cette propriété pour imposer aux cellules des formes identiques sur des patrons adhésifs différents afin d'analyser le rôle spécifique de la distribution des adhésions sur l'organisation du cytosquelette et des compartiments intracellulaires. Nos mesures montrent que les cellules développent des tensions élevées dans les filaments d'actine, assemblés en fibres de stress, au-dessus des zones non adhésives. Sur les zones adhésives, la tension est plus faible, et la polymérisation de l'actine en un réseau branché induit la formation de protrusions membranaires. La localisation des protrusions est donc complémentaire de celle des zones contractiles.Cette polarisation du système actine dirige le recrutement de certaines protéines dont l'activité influence la dynamique des microtubules. La croissance des microtubules en contact avec le cortex cellulaire est modulée différemment selon que l'actine forme des fibres de stress ou un réseau branché. Cependant, quel que soit le comportement des extrémités du réseau de microtubules à la périphérie, le centre du réseau, le centrosome, se maintient toujours au centre de la cellule. Le noyau est exclu de ce centre et se positionne vers les zones de contraction. Ainsi, à l'intérieur de la cellule, l'orientation de l'axe noyau-centrosome répond à l'asymétrie établie en périphérie.La polarité du cortex est conservée pendant la division cellulaire ou mitose. Le corps cellulaire, qui s'est arrondi à l'entrée en mitose, est maintenu en contact avec le substrat adhésif par des fibres de rétraction riches en actine. Les mesures expérimentales de l'orientation des divisions, sur différents patrons adhésifs, révèlent que la distribution spatiale des ancrages de ces fibres sur la cellule guide l'orientation du fuseau mitotique, et par conséquent, le plan de division des cellules. En effet, les pôles du fuseau se positionnent en face des zones corticales où sont arrimées les fibres de rétraction, indépendamment de la forme qu'avait la cellule avant l'entrée en mitose. Il existe des moteurs moléculaires ancrés dans le cortex des cellules et capables de tirer sur les microtubules astraux émanant des pôles du fuseau. En faisant l'hypothèse que ces moteurs ne sont activés que dans les zones où se situent les fibres de rétraction, on peut établir un modèle physique permettant de rendre compte de toutes les observations expérimentales effectuées.

Our present description of the plasma membrane includes heterogeneities or mechanisms that may hinder the diffusion of membrane particles. Indeed, the diffusion of transmembrane proteins may be impeded by the actin-based membrane skeleton, whereas lipid microdomains are thought to transiently sequester molecules which are involved in signaling pathways.Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a mature and powerful technique for measuring diffusion coefficients. However, the study becomes uneasy when the diffusion is not free as it is the case for the cell membrane components. We have shown that doing FCS measurements at different sizes of observation volumes gives access to the diffusion laws of molecules in live cell membranes. Our method enables to distinguish between different mechanisms responsible for the confinement of particles in the plasma membrane and to measure different characteristics of these confining structures, such as their size or the average confinement time. It has also been possible to study the reorganization of the cell membrane during a signaling event., Dans la description actuelle de la membrane plasmique, des hétérogénéités ou des mécanismes sont supposés empêcher la libre diffusion des particules membranaires. La diffusion des protéines transmembranaires serait ainsi ralentie par le réseau d'actine du cytosquelette, alors que les microdomaines lipidiques confineraient transitoirement les molécules impliquées dans les voies de signalisation.La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) est une technique puissante permettant de mesurer des coefficients de diffusion. L'étude devient cependant malaisée lorsque la diffusion n'est pas libre, comme c'est le cas des composantes de la membrane cellulaire. Nous avons montré que la réalisation de mesures FCS à différentes tailles de volumes d'observation permet de tracer les lois de diffusion des molécules dans les membranes des cellules vivantes. Notre méthode permet ainsi de distinguer entre différentes structures de confinement des particules de la membrane plasmique et de mesurer certaines de leurs caractéristiques, comme leur taille ou le temps de confinement moyen. Il a également été possible d'étudier la réorganisation de la membrane cellulaire au cours d'un événement de signalisation.

Our present description of the plasma membrane includes heterogeneities or mechanisms that may hinder the diffusion of membrane particles. Indeed, the diffusion of transmembrane proteins may be impeded by the actin-based membrane skeleton, whereas lipid microdomains are thought to transiently sequester molecules which are involved in signaling pathways.Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a mature and powerful technique for measuring diffusion coefficients. However, the study becomes uneasy when the diffusion is not free as it is the case for the cell membrane components. We have shown that doing FCS measurements at different sizes of observation volumes gives access to the diffusion laws of molecules in live cell membranes. Our method enables to distinguish between different mechanisms responsible for the confinement of particles in the plasma membrane and to measure different characteristics of these confining structures, such as their size or the average confinement time. It has also been possible to study the reorganization of the cell membrane during a signaling event., Dans la description actuelle de la membrane plasmique, des hétérogénéités ou des mécanismes sont supposés empêcher la libre diffusion des particules membranaires. La diffusion des protéines transmembranaires serait ainsi ralentie par le réseau d'actine du cytosquelette, alors que les microdomaines lipidiques confineraient transitoirement les molécules impliquées dans les voies de signalisation.La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) est une technique puissante permettant de mesurer des coefficients de diffusion. L'étude devient cependant malaisée lorsque la diffusion n'est pas libre, comme c'est le cas des composantes de la membrane cellulaire. Nous avons montré que la réalisation de mesures FCS à différentes tailles de volumes d'observation permet de tracer les lois de diffusion des molécules dans les membranes des cellules vivantes. Notre méthode permet ainsi de distinguer entre différentes structures de confinement des particules de la membrane plasmique et de mesurer certaines de leurs caractéristiques, comme leur taille ou le temps de confinement moyen. Il a également été possible d'étudier la réorganisation de la membrane cellulaire au cours d'un événement de signalisation.

Background Laminin (LN) is one of the most abundant extracellular matrix components of the basal lamina and granulosa cell layers of ovarian follicles. Culture of ovine granulosa cells (GC) on LN substratum induces cell spreading, enhances cell survival and proliferation, and promotes luteinization. Previous investigations have shown that these effects are mostly mediated by the alpha6beta1 integrin, but its signalization pathways have not been investigated. This study aimed to assess the importance of the cytoskeleton in the alpha6beta1 integrin-mediated actions of laminin on survival, proliferation and steroidogenesis of ovine GC. Methods The relationships between morphology and functions of ovine GC cultured on substrata containing LN or/and RGD peptides were investigated. The effects of (1) cytochalasin D, an actin cytoskeleton-disrupting drug, (2) a specific function-blocking antibody raised against alpha6 integrin subunit (anti-alpha6 IgG), and (3) an inhibitor of the ERK1/2 signalization pathway (PD98059) were assessed for GC shape, pyknosis and proliferation rates, oestradiol and progesterone secretions. Results Cytoskeleton disruption by cytochalasin D induced cell rounding, inhibited proliferation, promoted pyknosis, inhibited progesterone secretion and enhanced oestradiol secretion by GC cultured on LN. When GC were cultured on various substrata containing LN and/or RGD peptides in the presence or absence of anti-alpha6 IgG, both the existence of close correlations between the percentage of round cells, and the GC proliferation rate (r = -0.87) and pyknotic rate (r = 0.76) were established, but no relationship was found between cell shape and steroidogenesis. Inhibition of the ERK1/2 signalization pathway by PD98059 had no effect on GC shape, proliferation or pyknotic rates. However, it dramatically reduced progesterone secretion, expression of cytochrome P450 cholesterol side-chain cleavage and 3beta-hydroxysteroid deshydrogenase enzymes, and enhanced oestradiol secretion, thereby reproducing all the effects of the anti-alpha6 IgG on steroidogenesis of GC cultured on LN. Conclusion LN may participate in the paracrine control of follicular development through different mechanisms. It could enhance proliferation and survival of GC through its alpha6beta1 integrin-mediated actions on cytoskeleton. In contrast, its stimulating action on GC luteinization could be partly mediated by the ERK1/2 pathway, irrespective of cell shape.

Numéro national de thèse : 2005CLF1MM02 Diplôme : Dr. d'Universite

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Soutenue le 5 juillet 2005 Diplôme : Dr. d'Universite

The aim of this manuscript is to determine the influence of proteic factors on cytoskeleton dynamics using a micromanipulation tool. We have determined the microrheological response of the actin network for individual cells. We applied with an optical tweezer oscillating forces to a micrometric bead specifically bound to the actin network of C2 myoblasts, and measured the amplitude and phase shift of the induced cell deformation. For a non-perturbated single cell, we have shown that the elastic and loss moduli G' and G" behave as power laws fΑ et fΒ of the frequency f (0.01 < f < 50 Hz), Α and Β being in the range 0.15 - 0.30. This demonstrates that the dissipation mechanisms in a single cell involve a broad and continuous distribution of relaxation times. After adding blebbistatin, an inhibitor of myosin II activity, the exponent of G' decreases to about 0.10, and G" becomes roughly constant for 0.01 < f, L'objectif de cette thèse est de caractériser l'influence de facteurs protéiques sur la dynamique du cytosquelette cellulaire au moyen d'outils de micromanipulation contrôlés. Nous avons déterminé la réponse microrhéologique du réseau d'actine pour des cellules uniques. Nous avons appliqué grâce à un système de pinces optiques des forces statiques et oscillantes à des microbilles de verres attachées de manière spécifique au réseau d'actine de divers types cellulaires. Dans le cas statique nous avons mesuré des modules élastiques dans la gamme 29

Les petites protéines G de la famille Rho sont des régulateurs importants de la fonction cellulaire. Elles lient les signaux extracellulaires à l'activation de diverses voies de signalisation telles que celles menant à la phagocytose, la mitogénèse, l'adhésion cellulaire, l'expression génique, Toutefois leur fonction principale est l'assemblage et l'organisation du cytosquelette d'actine. Ces GTPases fonctionnent comme des interrupteurs moléculaires, actifs lorsque liés au GTP et inactifs sous la forme liée au GDP. Le but de notre thèse est d'investiguer, dans les cellules thyroïdiennes de chien en culture primaire, l'implication des protéines de la famille Rho et de l'organisation du cytosquelette d'actine dans les actions diverses que la TSH exerce, via l'AMPc, sur la morphologie, la prolifération, la différenciation et la fonction des thyrocytes de chien en culture primaire.Trois cascades conduisant à la mitogénèse coexistent dans la cellule thyroïdienne de chien: la voie de l'AMPc stimulée par la TSH ou la forskoline (activateur direct de l'adénylate cyclase), la voie des facteurs de croissance (tels que l'EGF, l'HGF) activant leur récepteur à activité tyrosine kinase et la cascade dépendante de la protéine kinase C activée par les esters de phorbol (TPA). Contrairement aux voies indépendantes de l'AMPc qui répriment l'expression des caractéristiques de différenciation, la cascade de l'AMPc stimule à la fois la prolifération, l'expression des gènes de l'état différencié et la fonction (iodation, formation d'H2O2, sécrétion hormonale).Dans la cellule thyroïdienne de chien, les agents activant les cascades dépendantes et indépendantes de l'AMPc ont des effets différents sur l'organisation du cytosquelette d'actine. La TSH/AMPc et le TPA induisent une destruction des microfilaments d'actine et un "ruffling" membranaire, tandis que les autres agents (insuline, EGF, HGF, sérum) ne modifient pas le réseau de fibres d'actine (fibres de stress) présent dans les cellules quiescentes.Parmi les protéines de la famille Rho, RhoA, Rac1 et Cdc42 sont les premières à avoir été identifiées et sont actuellement les mieux caractérisées. Nous montrons que la TSH, via l'AMPc, induit une diminution de la concentration de la forme active des protéines Rac1, Cdc42 et RhoA. En revanche, les autres agents mitogènes, tels que l'EGF et le TPA, qui activent des voies indépendantes de l'AMPc, n'affectent pas les taux de Rac1 et Cdc42 activés, mais augmentent le taux de RhoA-GTP. L'activation ou l'inactivation des protéines RhoA, Rac1 et Cdc42 est donc un nouvel élément distinguant les voies dépendantes et indépendantes de l'AMPc.Grâce à deux toxines bactériennes, la toxine B qui inactive les protéines Rho et la toxine CNF1 qui au contraire les active, nous montrons que, dans les thyrocytes, celles-ci jouent un rôle critique dans l'organisation du cytosquelette, dans la transition G1-S, dans l'expression des gènes de différenciation Tg, ThOXs, NIS et TPO, mais pas dans la génération d'H2O2. En effet, l'activité d'un ou plusieurs membres de cette famille est nécessaire à l'entrée des thyrocytes en phase S et à la phosphorylation de la protéine pRb, étape pré-requise à la transition G1-S. L'activation de ces protéines n'induit cependant pas, à elle seule, la prolifération. Nous mettons également en évidence l'existence d'un nouveau mécanisme par lequel ces protéines contrôleraient l'activité des complexes cycline D3-CDK4 indépendamment de leur assemblage. Par l'utilisation de la dihydrocytochalasine B, qui comme la toxine B via l'inactivation des Rhos, désorganise le cytosquelette, nous démontrons que l'intégrité de celui-ci n'est pas requise pour la progression des thyrocytes en phases G1 et S. L'inactivation des protéines Rho est par contre nécessaire à l'induction, par l'AMPc, de l'expression des gènes de différenciation incluant Tg, ThOXs, NIS et TPO, puisque ce processus est inhibé par la toxine CNF1. De plus, l'inactivation des Rhos par la toxine B, ainsi que le désassemblage des fibres de stress et du cytosquelette induit par la dihydrocytochalasine B, suffisent à imiter l'induction dépendante de l'AMPc de Tg et ThOXs, mais pas de NIS et TPO. La toxine B et la dihydrocytochalasine B imitent aussi l’effet de la voie TSH/AMPc sur l’accumulation de p27kip1. Enfin, nous montrons que l'augmentation de la production d'H2O2, nécessaire à la synthèse des hormones thyroïdiennes, ne requiert pas l'activité de la protéine Rac (ni des autres protéines de la famille Rho) alors que celle-ci joue un rôle déterminant dans la génération d'H2O2 dans le leucocyte., Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire, info:eu-repo/semantics/nonPublished

Vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) is a member of the proline rich Ena/VASP protein family that links the cell membrane proteins, signal transduction pathways, and the actin cytoskeleton. VASP is associated, in different cell types, with micro filaments, focal adhesions, cell-cell contacts, and highly dynamic membrane regions. It is supposed to have an important role in the regulation of actin dynamics. ln this study the expression, redistribution, and the phosphorylation of VASP under flow conditions were examined. After treatment by shear stresses, a double labeling was used to visualize the relationship between the actin organisation and the distribution of VASP. Western blotting was used to detect the phosphorylation of VASP. Under different shear stresses, VASP in different cell types (ECV304, primary HUVEC, HUVEC cellline) always located at the ends of stress fibers. The shear stress of O.2Pa elevated the quantity of the phosphorylated VASP, reached a peak and then decreased. The shear stress of 1.OPa bas similar tendency as that of O.2Pa. On the contrary, the shear stress of 1.5Pa caused a lower level phosphorylation of VASP. These results show that shear stress induces the phosphorylation of VASP in endotheliale cells, and this phosphorylation depends on the intensity and the duration of shear stress., La phosphoprotéine vasodilatrice stimulatée (VASP) appartient à la famille des protéines riches en prolines (ENANASP) qui est impliquée dans les changements du cytosquelette et la transduction du signal. La VASP s'associe avec les microfilaments, les points focaux d'adhésion, et les régions dynamiques de la membrane. Dans cette étude, l'expression, la phosphorylation et la redistribution des VASP dans les cellules endothéliales soumises à des contraintes de cisaillement ont été examinées. Après traitement par la contrainte de cisaillement, un double marquage a été utilisé pour montrer la relation entre l'organisation des fibres d'actine et la distribution des VASP. La technique du western blotting a été utilisée pour déterminer)e taux de phosporylation de la VASP. Dans les différentes types de cellules étudiés (ECV304, HUVEC primaire, lignée HUVEC), les ASP sont toujours localisées aux extrémités des fibres de stress. En condition statique les cellules contiennent un taux faible de VASP phosphorylées. Les cellules soumises à une contrainte de O,2Pa pour une durée de 1 heure présentent un pourcentage plus élevé de VASP phosphorylées. La contrainte de 1,OPa présente pratiquement le même taux de phosphorylation que les CEs à O,2Pa. Au contraire, la contrainte de 1,5Pa provoque une faible augmentation par rapport à celle observée en condition statique. De plus, cette phosphorylation montre un caractère transitoire et paraît réversible. Ces résultats suggèrent que la contrainte de cisaillement provoque la phosphorylation des VASP dans la CEs, mais cette phosphorylation dépend de l'intensité et de la durée de la contrainte.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Vasodilator stimulated phosphoprotein (VASP) is a member of Ena/VASP protein family that links to the regulation of actin filaments and to signal transduction during cell morphological modification and migration. VASP tightly associates with microfilament, in particular at focal adhesions and celllamellipodia. ln this study, we examined the expression, phosphorylation and redistribution of VASP in HUVECs under flow conditions. And the mechanism of VASP phosphorylation was further studied with the enzyme inhibitors. We found by double immunofluoreseent staining that after exposure to a shear of 1,0 Pa for 24h, spots of VASPwere concentrated at the two extremities ofthick stress fibres. RT-PCR results indicated that the shear could induce VASP mRNA increase. Western blotting results showed that there was only non-phosphorylated VASP in static cells.The VASP phosphorylation appeared as a transient phenomenon with peak values after Ih and 4h exposures to thesame shear stress. The shear stress of 1,5 Pa had similar tendencyas that of 1,0 Pa while the shear stress of 0,2 Pa showed a lower effect. Additionally, inhibition of the actin polymerization by cytoehalasin D blocked VASP expression and phosphorylation. H89, à PKA inhibitor, inhibited shear-induced increase of VASP expression and phosphorylation, while L-NNA, an NOS inhibitor showed adverse effects.These results show that shear stress induces the phosphorylation of VASP in endothelial cells, and this phosphorylation depends on the actin integrity and via a cAMP/PKA pathway., La phosphoprotéine vasodilatatrice stimulée (VASP) appartient à la famille des protéines ENA/VASP qui est impliquée dans les modifications du cytosquelette et la transduction du signal lors de changements morphologiques et de migration cellulaire. La VASP s'associe avec les microfilaments d'actine, particulièrement aux points focaux d'adhésion, et aux lamellipodes. Dans cette étude, nous avons étudié l'influence des contraintes de cisaillement sur l'expression, la phosphorylation et la distribution des VASP dans les cellules endothéliales (HUVECs). Par ailleurs, nous avons également exploré deux voies de signalisation possibles pour expliquer la voie de régulation des VASP. Après stimulation par la contrainte de cisaillement, un double marquage immunofluorescence a été utilisé pour démontrer la relation entre l'organisation des fibres d'actine et la distribution des VASP. On observe que dans les HUVECs, après une contrainte de 1,0 Pa pendent 24h, les VASP sont concentrés aux extrémités des fibres de stress.Les résultats de RT-PCR montrent une augmentation significative de la taille du fragment de 482 bp après une exposition d'une heure. La technique de western blotting a été utilisée pour déterminer le taux de l'expression et la phosphorylation de la VASP. En condition statique, les cellules contiennent uniquement des VASP déphosphorylées. Les cellules soumises à une contrainte de 1,0 Pa pour une durée d'une heure présentent le pourcentage de VASP phosphorylées le plus élevé. La contrainte de 1,5 Pa conduit à un taux plus faible dephosphorylation que celle de 1,0 Pa, et la contrainte de 0,2 Pa provoque une augmentation en retard. De plus, cette phosphorylation montre un caractère transitoire et parait réversible. Par ailleurs, la cytochalasine D (inhibiteur des fibres d'actine) et H89 (un inhibiteur de la PKA) empêchent l'augmentation des VASP provoquée par le cisaillement ([tau] = 1,0 Pa, 1h), tandis que la L-NNA (un inhibiteur de la NOS) présente un effet inverse. Ces résultats suggèrent que la contrainte de cisaillement provoque la phosphorylation des VASP dans la CE, mais cette phosphorylation dépend l'intégrité du cytosquelette et le taux de l'AMPc intracellulaire.

A viscoelastic tensegrity model (VTM) composed of 6 quasi-rigid bars and 24 viscoelastic cables is developed and its mechanical response is studied in both time and frequency domains in order to understand the role of the cytoskeleton structure in the cellular response during small and large deformations. Numerical simulations of both creep tests and forced oscillations are performed to determine the governing laws relating the global normalised viscoelastic properties (elasticity modulus E*, viscosity modulus 'eta'* and time constant 'tau'*) of the VTM to (i) the level of global deformation ('epsilon'), (ii) the local parameters defined at the reference state (normalised length L* and internal tension T*) and (iii) the imposed oscillatory frequency (f). When T* increases, the elasticity modulus (E*) increases while the time constant (tau*) decreases, the VTM behaviour being characterized by stiffening (E* proportional to T*0,5 ) and solidifying (tau* proportional to T*-0,4 ) processes, whereas the normalised viscosity modulus appears not significantly dependent on T* (eta* proportional to T*0,1 ). Moreover, increasing forced frequency results in stiffening (E* proportional to f*0,2 ), watering (eta* proportional to f*-0,2 ) and solidifying (tau* proportional to f*-0.4 ) processes. These numerical results are in satisfactorily agreement with the experimental results reported in living cells; in particular, the non significant role of the internal tension on the cellular viscosity could be related to eta* proportional to T*0,1 while the scale effect (probe size) appears in agreement with both softening and watering processes (E* proportional to L*-2 and eta* proportional to L*-2). When applied at the microcellular level by including the properties of the cytoskeletal biopolymers, the present viscoelastic tensegrity model seems to provide a consistent predictive evaluation of the contribution of the spatial reorganisation of CSK elements to the mechanical properties of the cellular architecture, Un modèle de tenségrité viscoélastique (MTV) composé de 6 barres quasi-rigides et de 24 câbles viscoélastiques est développé et son comportement mécanique est étudié dans les domaines temporel et fréquentiel pour comprendre le rôle joué par la déformation structurale du cytosquelette dans la réponse cellulaire en petites et grandes déformations. Des simulations numériques de tests de fluage ainsi que d'oscillations imposées sont effectuées, permettant d'établir des lois de dépendance entre d'une part les propriétés viscoélastiques normalisées globales (modules d'élasticité E*, de viscosité 'eta'* et constante de temps 'tau'*) du MTV et, d'autre part, le niveau de déformation globale ('epsilon'), des paramètres locaux définis à l'état de référence (longueur L* et tension interne T* normalisées) et la fréquence imposée d'oscillations (f). L'augmentation de T* induit une augmentation du module d'élasticité (E*) et une diminution de la constante de temps normalisée (tau*), le MTV étant l'objet de processus de rigidification (E* 'proportionnel à' T*0,5 ) et de solidification (tau* proportionnel à T*-0,4 ) tandis que le module de viscosité normalisé apparaît peu dépendant de T* (eta* proportionnel à T*0,1 ). De plus, l'augmentation de la fréquence imposée entraîne des processus de rigidification (E* proportionnel à f*0,2 ), de dilution (eta* proportionnel à f*-0,2 ) et de solidification (tau* proportionnel à f*-0.4 ). Ces résultats numériques sont en accord avec les résultats expérimentaux obtenus sur cellules vivantes notamment le faible rôle du tonus cellulaire sur la viscosité cellulaire est à rapprocher de eta* proportionnel à T*0,1 alors que l'effet d'échelle (taille de sonde) est en accord avec les processus d'assouplissement et de dilution (E* proportionnel à L*-2 et tau* proportionnel à L*-2). Appliqué à l'échelle microcellulaire en utilisant les propriétés des biopolymères qui composent le cytosquelette, le présent modèle de tenségrité viscoélastique apporte une évaluation prédictive du rôle de la redistribution spatiale des éléments sur les propriétés mécaniques de l'architecture cellulaire.

The red blood cell (RBC) is able to undergo great shear deformations, mainly when it passes through capillaries with a diameter smaller than its own. This resistance to shear deformations is attributed to its membrane. This membrane is made of a flexible bidimensional protein network which reinforces the inner face of the lipid bilayer. This skeleton is mainly composed of long spectrin filaments (~200 nm) linked together and to the bilayer by junction complexes. In the first part of this work, we measured the shear modulus µ of the intact membrane (lipid bilayer and skeleton) using optical tweezers micromanipulations. Two silica beads bound to the membrane are trapped and used to apply calibrated forces to the membrane. The shear modulus is inferred from the measured deformations and the applied stresses. We found µ = 2.5 +/- 0.4 µN/m, a value comparable but smaller than the ones obtained by other methods. In a second part, the area expansion KC and the shear moduli µC of the free spectrin skeleton - freshly extracted from the membrane - are measured. A RBC is trapped by three silica beads bound to its membrane and the lipid bilayer is dissolved by injection of a detergent. The skeleton remains attached to the beads and is deformed by applying calibrated forces to the beads. The elastic moduli of the two-dimensional spectrin network are inferred from the deformations and the applied stresses. Ones found KC = 4.8 +/- 2.7 µN/m and µC = 2.4 +/- 0.7 µN/m for a 25 mOsm/kg buffer. From this measurements, we can infer the spectrin persistence length, here 5 nm. The measured values are consistent with estimates deduced from experiments carried out on the intact membrane, and agree with theoretical and numerical predictions concerning two-dimensional networks of entropic springs. The influence of the ionic strength and the aging of the skeleton after its extraction are studied in the last part.; Le globule rouge a une grande faculté à se déformer, notamment lorsqu?il traverse des capillaires dont le diamètre peut être inférieur au sien. Cette résistance au cisaillement est attribuée à sa membrane particulière. Celle-ci est constituée d?une bicouche lipidique sur laquelle est fixé un réseau bidimensionnelle de protéines : le squelette. Ce squelette est principalement constitué de longs filaments de spectrine (~200 nm) reliés entre eux et à la bicouche lipidique par des complexes de jonction. Dans la première partie de ce travail, nous avons mesuré le module de cisaillement µ de la membrane (bicouche lipidique + squelette) à l?aide de deux pinces optiques. Deux billes de silice attachées à la membrane sont utilisées pour lui appliquer des forces connues. Le module de cisaillement est déduit de la déformation mesurée en fonction de la contrainte appliquée. Nous avons trouvé µ = 2.5 +/- 0.4 µN/m, valeur du même ordre de grandeur, mais inférieure, à celles obtenues par d?autres techniques. Dans une seconde partie, nous mesurons les modules d?extension KC et de cisaillement µC du squelette seul. Un globule rouge avec trois billes un piégé, et une solution de détergent est injectée afin de dissoudre la bicouche lipidique. Le squelette reste attaché aux billes et il est ensuite déformé en déplaçant les billes les unes par rapport aux autres. Les modules élastiques sont déduits de la mesure des contraintes et des déformations. Nous trouvons KC = 4.8 +/- 2.7 µN/m et µC = 2.4 +/- 0.7 µN/m dans une solution d?osmolarité égale à 25 mOsm/kg. De ces mesures, nous pouvons déduire la longueur de persistance de la spectrine, ici 5 nm. Ces valeurs sont en bon accord avec des prédictions théoriques et numériques réalisées sur des réseaux bidimensionnels de ressorts. L?influence de la force ionique et du vieillissement du squelette après l?extraction sont étudiés dans la dernière partie.

Microtubules play a crucial role in cellular organisation and function. Microtubule assembly display puzzling non-linear features, like dynamic instability. Here, we intended first to determine the limiting factors of microtubule assembly, and second to identify new effectors of this process. The kinetics of the reaction were studied in simple experimental conditions, allowing simultaneous and precise measurement of all the parameters of the reaction. Our results indicate that the microtubule nucleation occurs in two steps : rapid and irreversible formation of tubulin oligomers then aggregation of these oligomers into a microtubule. The elongation rate of the microtubule appears to be independent of the GTP-tubulin concentration : this elongation rate is probably limited by structural properties of the microtubules. Finally, microtubule disassembly would occur through catastrophes, and would be triggered by tubulin oligomers. The tubulin oligomers controlling disassembly could possibly be the same as those controlling microtubule nucleation. We then produced tubulin oligomers triggering microtubule nucleation by a moderate covalent crosslinking of microtubules. These oligomers are constituted by lateral interactions of 10 tubulin dimmers, four of which aggregate to form a microtubule. Microtubules assembled in our conditions in the presence of nucleating tubulin oligomers do not spontaneously disassemble : these conditions are suitable to look for catastrophe factors. Finally, we developed an affinity chromatographic procedure to purify tubulin-binding proteins in a native state. Thus, these tubulin partners are amenable to functional tests. Peptide mapping and mass spectrometry allowed us to identify the purified proteins. Some are known to control microtubule assembly, but others are possibly new effectors of microtubule dynamics.; Les microtubules jouent un rôle central dans l'organisation et la vie cellulaire. L'assemblage des microtubules présente des comportements non linéaires et mal compris comme l'instabilité dynamique. Nous avons voulu déterminer les paramètres limitant la réaction d'assemblage des microtubules, puis isoler des effecteurs de cette réaction. Des études cinétiques ont été réalisées dans des conditions expérimentales simples où tous les paramètres de la réaction ont été mesurés. D'après nos résultats, la nucléation des microtubules se produirait en deux étapes : formation rapide et irréversible d'oligomères de tubuline puis assemblage de ces oligomères en microtubules. La vitesse d'élongation des microtubules est indépendante de la concentration en tubuline-GTP : cette vitesse d'élongation est sans doute limitée par les propriétés structurales des microtubules. Enfin, le désassemblage des microtubules se produirait par catastrophes et serait stimulé par des oligomères de tubuline se formant au cours de la réaction. Dans une seconde partie, nous avons produit des oligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubules par pontage covalent modéré des microtubules. Ces oligomères sont constitués par assemblage latéral de 10 dimères de tubuline et s'agrègent par quatre pour former un microtubule. Les microtubules formés dans nos conditions en présence d'oligomères de nucléation ne désassemblent pas spontanément : ces conditions permettront de rechercher des facteurs de catastrophe. Enfin, nous avons développé une procédure chromatographique pour isoler des protéines liant la tubuline. Les partenaires de la tubuline sont isolés à l'état natif et se prêtent à des tests fonctionnels. L'utilisation des techniques de cartographie peptidique a permis d'identifier les protéines par spectrométrie de masse. Nous avons ainsi isolé des protéines connues pour contrôler la dynamique des microtubules, mais d'autres, inconnues restent à étudier.

The cytoskeleton is a dynamic three-dimensional structure, occurring mainly in the cytoplasm. It is involved in various cell processes such as signal transduction. In my research I study the architectural variations of cytoskeletal networks which are associated with signal transduction. This study is twofold. First, a step of characterization of the cytoskeletal architecture. Then, in a modeling step I consider the establishment of this architecture. My research focuses on the intermediate filament networks, because of their physical properties and their sub-cellular organization. The first aim of my work was to develop a characterization of the cytoskeletal networks, more specifically of the architecture of cytokeratin networks (intermediate filaments) in the epithelial cells of the MCF7 human breast cancer cell line. Two approaches, using image analysis procedures, have been developped to account for two different geometry levels. The first approach, based on classical methods of mathematical morphology, takes into account the topology of networks. The second approach, is meant to account for the morphology of filaments. These two approaches were used to segment cytoskeleton networks visualized by immunofluorescence and confocal microscopy. Furthermore, topological and morphological parameters have been computed in order to quantify of the network architecture. This methodology has allowed the characterization of at least three types of architectural patterns which can be associated with specific intracellular locations. These intracellular locations are characterized by whether or not a specific force acts upon the zone: junction related force or nucleus integrity preservation related force. The specific architecture of cytoplasmic intermediate filament network suggests its role in the transfer of signals from the cell environment to the nucleus and in the maintenance of nuclear and cellular integrity. Futhermore, this methodology was used to identify the effect of microgravity weightlessness on the cytoskeleton architecture. Also, it can be generalized to apply to other curvilinear object networks, like angiographies or road networks. The results of the characterization of the cytokeratin architecture have showed that the cytokeratin network is a mechanical environment-dependent structure. Under this issue, I have proposed a mathematic model which describes the morphogenesis and the organization of the cytokeratin network driven by the extracellular mechanical conditions acting on an epithelial cell. The main hypothesis of this model is that the regulation of the cytoskeletal protein synthesis is managed by the mechanical environment. The cytokeratin network responds to the extracellular mechanical environment by specific architectural organization, as a reinforcement mechanism, in order to preserve the cell integrity and mediate the extracellular forces to the nucleus. The model governs simultaneously two processes occurring in the cell: the extracellular mechanical environment and its effects on the intracellular domain, and the building up of cytoskeletal network. Each of them is associated with a system of integro-differential equations. In conclusion, this model proposes the establishment of the cytokeratin network in specific structural organization driven by mechanical conditions. Also, the model has been implemented in order to accomplish three-dimensional simulations and visualizations of specific cytokeratin network architecture for a given set of mechanical conditions., L'objet de cette thèse est l'étude de l'implication des filaments intermédiaires (cytosquelette) dans une fonction mécanique, et plus particulièrement, dans la fonction de mécanotransduction s'exerçant via un mécanisme de réorganisation de la structure du réseau en réponse aux changements mécaniques extracellulaires. Cette problématique est appréhendée selon deux optiques complémentaires, l'une déductive et l'autre inductive. La première traite de la caractérisation structurale des réseaux cytosquelettiques par des méthodes d'analyse d'images. La caractérisation de l'architecture des réseaux cytosquelettiques se définit comme une représentation simplifiée des réseaux suivie d'une quantification de leur architecture. Cette méthodologie, développée pour spécifier l'architecture de réseaux d'objets curvilignes, se compose de trois approches découlant d'une observation hiérarchisée des réseaux. Elle est utilisée, pour caractériser d'une part la variabilité intracellulaire de l'architecture des réseaux cytosquelettiques, et d'autre part les variations architecturales des réseaux cytosquelettiques de cellules exposées à des conditions mécaniques différentes. La seconde présente un modèle intégro-différentiel d'édification du réseau de cytokératine, s'appuyant sur l'hypothèse selon laquelle l'organisation structurale d'un réseau spécifique de cytosquelette dépend de sa fonction biologique. Ce modèle a été conçu dans le but de valider l'hypothèse, émise et observée lors de l'étape de caractérisation, d'implication des réseaux de filaments intermédiaires dans la mécanotransduction par variations architecturales. Du modèle mathématique d'organisation structurale du réseau de cytokératine d'une cellule épithéliale induite par les contraintes mécaniques est dérivé un modèle de simulation tridimensionnel. Ce modèle de simulation permet d'obtenir des exemples d'architecture de réseau de cytokératine pour des contraintes mécaniques données.

Microtubules play a crucial role in cellular organisation and function. Microtubule assembly display puzzling non-linear features, like dynamic instability. Here, we intended first to determine the limiting factors of microtubule assembly, and second to identify new effectors of this process. The kinetics of the reaction were studied in simple experimental conditions, allowing simultaneous and precise measurement of all the parameters of the reaction. Our results indicate that the microtubule nucleation occurs in two steps : rapid and irreversible formation of tubulin oligomers then aggregation of these oligomers into a microtubule. The elongation rate of the microtubule appears to be independent of the GTP-tubulin concentration : this elongation rate is probably limited by structural properties of the microtubules. Finally, microtubule disassembly would occur through catastrophes, and would be triggered by tubulin oligomers. The tubulin oligomers controlling disassembly could possibly be the same as those controlling microtubule nucleation. We then produced tubulin oligomers triggering microtubule nucleation by a moderate covalent crosslinking of microtubules. These oligomers are constituted by lateral interactions of 10 tubulin dimmers, four of which aggregate to form a microtubule. Microtubules assembled in our conditions in the presence of nucleating tubulin oligomers do not spontaneously disassemble : these conditions are suitable to look for catastrophe factors. Finally, we developed an affinity chromatographic procedure to purify tubulin-binding proteins in a native state. Thus, these tubulin partners are amenable to functional tests. Peptide mapping and mass spectrometry allowed us to identify the purified proteins. Some are known to control microtubule assembly, but others are possibly new effectors of microtubule dynamics., Les microtubules jouent un rôle central dans l'organisation et la vie cellulaire. L'assemblage des microtubules présente des comportements non linéaires et mal compris comme l'instabilité dynamique. Nous avons voulu déterminer les paramètres limitant la réaction d'assemblage des microtubules, puis isoler des effecteurs de cette réaction. Des études cinétiques ont été réalisées dans des conditions expérimentales simples où tous les paramètres de la réaction ont été mesurés. D'après nos résultats, la nucléation des microtubules se produirait en deux étapes : formation rapide et irréversible d'oligomères de tubuline puis assemblage de ces oligomères en microtubules. La vitesse d'élongation des microtubules est indépendante de la concentration en tubuline-GTP : cette vitesse d'élongation est sans doute limitée par les propriétés structurales des microtubules. Enfin, le désassemblage des microtubules se produirait par catastrophes et serait stimulé par des oligomères de tubuline se formant au cours de la réaction. Dans une seconde partie, nous avons produit des oligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubules par pontage covalent modéré des microtubules. Ces oligomères sont constitués par assemblage latéral de 10 dimères de tubuline et s'agrègent par quatre pour former un microtubule. Les microtubules formés dans nos conditions en présence d'oligomères de nucléation ne désassemblent pas spontanément : ces conditions permettront de rechercher des facteurs de catastrophe. Enfin, nous avons développé une procédure chromatographique pour isoler des protéines liant la tubuline. Les partenaires de la tubuline sont isolés à l'état natif et se prêtent à des tests fonctionnels. L'utilisation des techniques de cartographie peptidique a permis d'identifier les protéines par spectrométrie de masse. Nous avons ainsi isolé des protéines connues pour contrôler la dynamique des microtubules, mais d'autres, inconnues restent à étudier.

LIM proteins have been described as developmental regulators of eucaryotic organisms. They are characterized by the presence of one or several double zinc finger motifs, called LIM domains, in their sequence, which function by mediating protein-protein interactions. LIM proteins have the ability to interact with multiple protein partners. The majority of LIM proteins have been characterized in animal cells where they have been localized in the nucleus and in the cytoplasm. Nuclear LIM proteins, owing to their capacity to mediate numerous interactions, play an important role in the regulation of transcription. These proteins are involved in the control of key developmental processes, like cell division and embryonic development. Cytoplasmic LIM proteins are generally associated to actin cytoskeleton, and could regulate cytoskeleton dynamic. Several LIM proteins have been described to date in plants, but the biological functions of these proteins remained to be determined. To study the function of LIM proteins in sunflower, sunflower hypocotyl protoplasts were used as experimental model, as theirdevelopment can be modulated by varying culture conditions.Using primer sets specific for each of the previously described LIM genes from sunflower, we have studied their expression in sunflower protoplasts by RT-PCR. We detected a transcript only for the gene HaWLIM-1, but not for the other two genes HaPLIM-1 and HaPLIM-2. On immunowestern blots, polyclonal antibodies directed against HaWLIM-1 protein recognized two proteins of 52 and 78 kDa respectively, indicating that the protein is not present as the 21 kDa monomer but rather as stable higher molecular structures. Immunocytolocalization studies showed that HaWLIM-1 is located in the nucleus and in the cortical cytoplasm. In the nucleus, it concentrated mainly in the nucleolus and could therefore play a role in the transcription of rRNA genes or the assembly of ribosomes. In the cytoplasm, different approaches, including double labelling and drug application, showed a strong colocalization of HaWLIM-1 with microtubules, suggesting a role in cytoskeleton organization.HaWLIM-1 gene expression decreases during protoplast culture. Immunoblot experiments showed that antibodies directed against HaWLIM-1 recognized new proteins during culture, indicating that HaWLIM-1 protein could interact with other high molecular structures during protoplast development. Moreover, HaWLIM-1 protein showed a strong colocalization with microtubules during all the steps of cell division., Les protéines LIM constituent une famille de molécules régulatrices possédant dans leur séquence protéique un ou plusieurs motifs en doigts de zinc – les domaines LIM – dont la fonction principale est de diriger les interactions protéine-protéine. Les protéines LIM ont ainsi la capacité d'interagir avec de multiples partenaires protéiques, et participent à l'assemblage et au maintien de certains des complexes macromoléculaires présents au sein de la cellule. La plupart des protéines LIM ont été caractérisées dans les cellules animales, où elles sont impliquées dans l'organisation du cytosquelette d'actine, ainsi que dans la régulation de la transcription. A ce jour, seules quelques protéines LIM ont été décrites chez les végétaux. La fonction de ces protéines LIM végétales reste encore à identifier. Afin de préciser le rôle des protéines LIM chez le tournesol, nous avons choisi comme modèle expérimental le protoplaste d'hypocotyle de tournesol, en raison de la possibilité de moduler son développement en fonction des conditions de culture.Nous avons étudié l'expression des gènes LIM précédemment décrits chez le tournesol dans les protoplastes par RT-PCR. Nous avons détecté un transcrit pour le gène HaWLIM-1, mais pas pour les deux autres gènes HaPLIM-1 et HaPLIM-2. Des anticorps polyclonaux spécifiques de la protéine HaWLIM-1 reconnaissent en immunoblot deux polypeptides distincts, dont les masses moléculaires sont respectivement de 52 kDa et 78 kDa. Ces masses moléculaires sont nettement supérieures à la taille attendue pour la protéine HaWLIM-1. Ces résultats indiquent que la protéine n'est pas présente sous forme de monomères dans les protoplastes, mais qu'elle participe à la formation de complexes protéiques stables.L'étude par immunocytologie de la localisation intracellulaire de la protéine HaWLIM-1 révèle que cette protéine est présente simultanément dans deux compartiments distincts : le noyau et le cytoplasme. Dans le noyau, elle s'accumule préférentiellement dans le nucléole, et pourrait jouer un rôle dans la régulation de la transcription des gènes des ARNr, ou dans l'assemblage des ribosomes. Dans le cytoplasme, différentes approches, incluant des expériences de double-marquage et de déstructuration de composants du cytosquelette, ont permis de mettre en évidence une très forte colocalisation de la protéine HaWLIM-1 avec les microtubules, ce qui suggère un rôle pour cette protéine dans l'organisation du cytosquelette.Lors de la culture des protoplastes, le gène HaWLIM-1 s'exprime constamment, avec cependant des variations dans le niveau d'expression. Des expériences d'immunoblot utilisant les anticorps spécifiques de la protéine HaWLIM-1 indiquent que de nouveaux polypeptides, de masses moléculaires égales à 35 kDa, 42 kDa et 64 kDa, apparaissent au cours de la culture. Cette observation suggère que la protéine HaWLIM-1 possède la capacité de s'associer et de se dissocier avec de nouveaux complexes protéiques au cours du développement. La protéine HaWLIM-1 est associée aux microtubules pendant tous les stades de la division : elle est présente au niveau de la bande préprophasique à la fin de l'interphase, au niveau du fuseau mitotique pendant la mitose, et au niveau du phragmoplaste pendant la cytokinèse. Ces observations semblent indiquer que la protéine HaWLIM-1 occupe une fonction importante au niveau des microtubules.

Non disponible / Not available, L'endothélium vasculaire est l'interface entre le sang et les tissus dans les vaisseaux sanguins. Les conditions hémodynamiques locales peuvent affecter, à travers le phénomène de mécanotransduction, des fonctions des cellules endothéliales (CE). Les variations du comportement des CE soumises à des contraintes mécaniques peuvent intervenir dans différents troubles cardio-vasculaires, notamment dans l'athérosclérose, la thrombose et l'inflammation. L'objectif de ce travail était d'étudier l'influence des contraintes mécaniques sur trois marqueurs des CE impliqués dans l'athérosclérose et la mécanotransduction, le vWF, la molécule d'adhésion ICAM-l, et la cavéoline-l à l'aide des réalisations de culture d'HUVEC et d'un système en flux. Parallèlement, les effets d'une cytokine, le TNF-a sur l'expression et la distribution de ces molécules ont été étudiés afin de préciser les différences entre facteurs biochimiques et facteurs mécaniques. La technique de microscopie à fluorescence à sectionnement optique nous a permis de visualiser la distribution de molécules cellulaires en trois dimensions sur une monocouche de CE. Nos résultats expérimentaux ont montré que les contraintes de cisaillement provoquaient des variations de la libération et de la synthèse du vWF, de l'expression de l'ICAM-l et de celle de la cavéoline-1. Par ailleurs, les distributions de ces molécules à la surface ou/et à l'intérieur des CE ont été également modifiées. L'ensemble de ces études suggère que la variation de la contrainte de cisaillement, tel que dans des sténoses ou bifurcations vasculaires in vivo, joue un rôle important dans l'athérogenèse, la thrombose et l'inflammation.