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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) 5a and STAT5b proteins are latent cytoplasmic transcription factors that translocate to the nucleus upon activation by cytoplasmic Jak tyrosine kinases. They participate in elemental cell biologie processes including cellular growth, cell cycle progression and apoptosis. STAT5 has been described as a common target molecule for several tyrosine kinase oncogenes associated with myeloproliferative disease, including Bcr-Abl in CML. We analyzed the sub cellular distribution of the STAT5 proteinsin 70 primary AML and pointed out a nucleolar STAT5 localization associated withAML5 and CML phenotypes. The STAT5 nucleolar localization was corroborated in the K562 cell line. We demonstrated a nucleolar localization restricted to STAT5[beta] proteins. Neither Bcr-Abl activation nor proteasome-mediated protein degradation can explain the STAT5 nucleolar localization in CML as STI561/MG132-inhibition treatments do not contribute toSTAT nucleolar delocalization. This is, to our knowledge, the first evidence of a nucleolar translocation of STAT transcription factors in hematological malignancies. Moreover, because the STAT5 nucleolar distribution is restricted to AML5 and CML it could be hypothesized that it might be part of these leukaemic phenotypes., Les facteurs de transcription STAT5a et STAT5b (Signal Transducer and Activator of Transcription) sont impliqués dans la régulation de la prolifération, de la différenciation et/ou de la résistance à l'apoptose, dans les cellules hématopoïétiques, via leur activation par un large panel de cytokines. En outre les protéines STAT5 sont la cible de nombreuses tyrosines kinases oncogéniques associées à des désordres myéloprolifératifs. En particulier l'activationconstitutive de la protéine STAT5b a été mise en évidence dans la lignée érythroleucérnique K562 et des études ont montré le rôle central joué par STAT5 dans la leucémogenèse induite par la protéine de fusion BCR-ABL responsable de la genèse de la LMC. D'autre part on il existe une activation constitutive des facteurs STAT5 dans une proportion de LAM allant jusqu'à 80%.Durant ce travail de thèse, nous avons entrepris une étude de la distribution sub-cellulaire des facteurs de transcription STAT5a et b dans les cellules blastiques de 70 patients (majoritairement des LAM) par une méthode immunocytochimique. Nous avons mis en évidence l'existence d'une localisation nucléolaire des formes [bêta] tronquées en C-terminal des protéines STAT5 restreinte aux LAM5 et aux LMC et retrouvée dans les cellules de la lignée K562. D'autre part nous avons montré que cette localisation n'était pas le fait d'une activation par l'oncoprotéine de fusion BCR-ABL, et qu'elle n'était pas affectée par une inhibition de ladégradation protéique dépendante du protéosorne. Il s'agit, à notre connaissance, de la première description d'une localisation nucléolaire d'une protéine de la famille STAT. Celle-ci étant restreinte aux LAM5 et aux LMC, on peut supposé qu'elle puisse prendre part au phénotype leucémique.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), including the multipotent progenitors (MPPs), are responsible for replenishing immune cells. They reside in bone marrow (BM) endosteal and (peri)-vascular niches, which provide all cellular and molecular components required for their lifelong maintenance and fate. Among them, the CXCL12 chemokine and one of its receptor, CXCR4, exert a dominant role in promoting HSPC retention and quiescence. These processes are deregulated in the WHIM Syndrome (WS), a rare immunodeficiency caused by inherited heterozygous autosomal gain-of-function CXCR4 mutations that affect homologous desensitization of the receptor. Clinically, WS is notably characterized by severe, chronic circulating lymphopenia whose mechanisms remain to be elucidated. Using a mouse model carrying a naturally occurring WS-linked Cxcr4 mutation as well as human BM and blood samples, we explored the possibility that the lymphopenia in WS originates from defects at the HSPC level in BM. We reported that Cxcr4 desensitization is required for lymphoid differentiation of HSPCs and further identified the MPP stage as defective in mutant mice. The divergence between lymphoid and myeloid lineages occurs at the MPP stage, which is composed of distinct subpopulations, i.e., MPP2 and MPP3 are reported as distinct myeloid-biased MPP subsets that operate together with lymphoid-primed MPP4 to control blood leukocyte production. Our understanding of how cell-extrinsic niche-related and cell-intrinsic cues drive the lymphoid versus myeloid fate decision of MPPs is still fragmentary. Therefore, my PhD project aimed at determining whether and how CXCR4 signaling regulates bioenergetics demands of MPPs and at understanding how these metabolic pathways shape the lympho-myeloid fate of MPPs. We unraveled a myeloid skewing of the HSPC compartment in BM of WS mice and patients. In mutant mice, this partly relied on the contraction of the MPP4 pool and on cell-autonomous molecular and metabolic changes that reprogramed MPP4 away from lymphoid differentiation. Interestingly, chronic treatment with the CXCR4 antagonist AMD3100 normalized mitochondrial metabolism and fate of MPP4, while correcting circulating lymphopenia in WS mice. This study provides evidence that CXCR4 signaling acts as an essential gatekeeper for integrity of the mitochondrial machinery, which in turn controls lymphoid potential of MPP4., Les cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSPHs), incluant les progéniteurs multipotents (MPPs), sont responsables de la production des cellules immunes circulantes. Ils résident dans la moelle osseuse (MO) au sein de structures spécialisées, les niches endostéale et (péri)-vasculaire, qui régulent la spécification et l'engagement lymphoïde versus myéloïde des CSPHs. Dans la MO, le couple formé par la chimiokine CXCL12 et l’un de ses récepteurs, CXCR4, exerce un rôle clé dans la régulation de la rétention et la quiescence des CSPHs. Ces processus sont dérégulés dans le Syndrome WHIM (SW), une maladie immuno-hématologique rare liée à des mutations autosomiques dominantes du gène codant CXCR4, qui altèrent la désensibilisation du récepteur et conduisent à un gain de fonction en réponse à CXCL12. Cliniquement, le SW se caractérise notamment par une profonde leucopénie circulante qui affecte les lignages lymphoïde et myéloïde et dont les mécanismes restent à déterminer. Grâce à un modèle murin génétiquement modifié du SW et à l'accès à des prélèvements biologiques de patients atteints du SW, nous avons testé l'hypothèse que la lymphopénie circulante associée au SW résultait de défauts hématopoïétiques dans la MO. Nous avons révélé un rôle clé de la désensibilisation de CXCR4 dans la différenciation lymphoïde des CSPHs et identifié les MPPs comme étant le stade défectueux dans le SW. La divergence entre les lignages lymphoïde et myeloïde se produit précisément à ce stade au sein duquel règne une hétérogénéité : les MPP2/3 sont biaisés myéloïde et les MPP4 sont orientés lymphoïde. Notre compréhension de la façon dont les signaux extrinsèques (niches) et intrinsèques aux MPPs déterminent leur devenir lymphoïde versus myéloïde est encore parcellaire. Dans ce contexte, l’objectif de ma thèse a été de déterminer si et comment la signalisation de CXCR4 régule la dépendance énergétique des MPPs et à comprendre comment les voies métaboliques façonnent leur spécification lympho-myéloïde. Dans la MO des souris porteuses de la mutation gain de fonction de Cxcr4, nous avons observé une diminution du nombre de MPP4 qui contrastait avec l'augmentation des MPP2/3. L’analyse de prélèvements médullaires de patients a également permis de rapporter une diminution de la fréquence des progéniteurs lymphoïdes et une augmentation de celle des progéniteurs myéloïdes. Chez la souris mutantes, ce biais myéloïde du compartiment de MPPs s'avèrait associé à une expansion anormale et une reprogrammation moléculaire et métabolique des MPP4. Fait marquant, un traitement chronique par l’AMD3100, un antagoniste de CXCR4, permettait de normaliser le nombre de MPP4 dans la MO, de restaurer leurs propriétés métaboliques, et de corriger la lymphopénie des souris mutantes. Par conséquent, nos résultats suggèrent que l’axe CXCL12/CXCR4 est requis au maintien du potentiel lymphoïde des MPP4 au travers de la modulation de leur activité métabolique mitochondriale.

Este trabalho tem por objetivo verificar se a matriz extracelular (MEC) obtida da medula óssea de camundongos com desnutrição protéica energética sustenta a sobrevivência, se induz proliferação de células mielóides, bem como avaliar a capacidade desta MEC de interagir com citocinas hematopoiéticas in vitro. Camundongos machos "Swiss" foram submetidos à desnutrição protéica (4% de caseína) até que perdessem 20% do peso inicial e o grupo-controle foi mantido com uma dieta contendo 14% de caseína. A medula óssea foi extraída com tampão PBS suplementado com 1 mg de aprotinina/mL. Os ensaios de proliferação foram realizados com a linhagem mielóide FDC-P1, pelo método colorimétrico de redução do MTT. A MEC obtida tanto do grupo-controle como do desnutrido induziu proliferação celular in vitro. Os ensaios de interação foram realizados com IL-3 e GM-CSF na concentração de 10 ρg e 500 ρg/mL, que demonstraram efeito sinérgico e efeito regulatório, respectivamente. A MEC obtida de animais do grupo desnutrido quando submetida ao ensaio de ligação ao GM-CSF mostrou maior proliferação celular do que a MEC obtida de animais do grupo-controle (p The aim of this study was to verify the capacity of the extracellular matrix (ECM) obtained from bone marrow of malnourished mice to sustain survival and to induce the proliferation of myeloid cells. We also verified the capacity of the tests to interact with in vitro hematopoietic cytokines. Male "Swiss" mice were submitted to protein malnutrition with a diet content of '4% casein until they lost 20% of the original weight, while the group-control was kept with a diet content of 14% of casein. The bone marrow was extracted with 1.0 mg of aprotinin/mL in PBS. The proliferation tests were carried out with myeloid cell line FDCP-1, by the colorimetric method of reduction of the MTT. The obtained ECM from nourished and undernourished mice induced cellular proliferation invitro. Tests performed with Il-3 and GM-CSF cytokines in a concentration of 10 and 500 ρg/mL displayed synergic and regulatory effects respectively. The ECM obtained from the malnourished group submitted to the binding to GM-CSF demonstrated higher cellular proliferation than the ECM obtained from the control group (p

In chronic myeloid leukemia (CML), the activity of the constitutively active tyrosine kinase BCR-ABL1 drives the activation of the PI3K/AKT, JAK/STAT, and RAS/RAF/MEK/ERK pathways. Among other consequences, activated or inhibited transcription factors induce important modifications of the CML cells gene expression pattern that could impact cell cycle control, apoptosis and genetic instability, leading to the expansion of the oncogene-transformed cells and to the acquisition of potentially harmful de novo mutations. However, indirect BCR-ABL1-dependant regulations might also occur, for instance through the action of microRNAs (miRNAs). Among the ~2000 miRNAs reported in humans, numerous species are up- or down-regulated in various cancer models. In the context of CML however, there is no clear consensus regarding the role of specific miRNAs, despite several studies. The first aim of this thesis was to study the effects of a clinically relevant concentration of imatinib, a tyrosine-kinase inhibitor (TKI) that blocks BCR-ABL1, on the CML cell line K562: both the microRNA expression profile and the cells proteome were analyzed. Using microarray hybridization, RT-qPCR experiments and a functional assay, we identified miR-21 as one of the most significantly down-regulated microRNA in cells that were treated with imatinib. In parallel, a semi-quantitative proteomic approach identified the tumor suppressor programmed cell death protein 4 (PDCD4) as the most over-expressed protein in imatinib-treated cells. We showed that miR-21 can bind to PDCD4 3'UTR and decrease its expression. The STAT5 - miR-21 - PDCD4 pathway was conserved in CML primary CD34+ cells, and to some extent in acute myeloid leukemia (AML) models as well; the known functions of miR-21 and PDCD4 suggest that their regulation by BCR-ABL1 could participate in the antileukemic response triggered by tyrosine kinase inhibitors. In the second part of this manuscript, we was interested in the immature stem cells population that cannot be eliminated by TKI. The underlying mechanisms of this resistance are not fully understood. The TKI-resistant CML stem cells reside in the CD34+/CD38low subpopulation, that can be sorted from the mononuclear cells fraction using FACS. In this project, we propose to describe the microRNA repertoire of the CML CD34+/CD38low cells to highlight the potential role of microRNA in the resistance mechanisms by identifying some of their targets, using bioinformatic and experimental approaches. This combination of miRNome and functional analysis would allow to increase the knowledge of the biology of the TKI-resistant CML stem cells. Our results have shown that the cellular fraction enriched in stem cells (CD34+CD38low) expressed specifically four microRNA: miR-10a, miR-146, miR-150 and miR-155. It is also interested to notice that only two of them, miR-150 and miR-155, are highly expressed in CML-patient CD34+CD38low cells compared to normal cells., La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une hémopathie maligne causée par l‘apparition du chromosome Philadelphie dans la cellule souche hématopoïétique (CSH), conduisant à l‘expression de la protéine de fusion BCR-ABL1. L‘activité tyrosine kinase dérégulée de cette oncoprotéine provoque l‘activation de plusieurs voies de signalisation critiques dans la leucémogenèse. Si les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) ciblant BCR-ABL1 représentent des traitements dans l'ensemble très efficaces, plusieurs études montrent que les cellules leucémiques les plus immatures de la moelle osseuse y sont insensibles. Cette thèse propose de compléter les connaissances relatives aux effets de BCR-ABL1 dans la cellule, et plus généralement aux propriétés des CSH de LMC. Notre intérêt s‘est focalisé sur le rôle potentiel des microARN. Dans un premier travail, nous nous sommes intéressés à l‘effet de l‘activité BCR-ABL1 sur le protéome et sur l‘expression des microARN dans la lignée cellulaire K562. Les résultats montrent que BCR-ABL1 régule l'expression d'un microARN fréquemment surexprimé dans les cancers, miR-21. Cet effet dépend du facteur de transcription STAT5, cible bien connue de l'activité kinase de BCR-ABL1. Dans une seconde partie, nous avons montré que dans la moelle osseuse des patients LMC, la fraction cellulaire enrichie en cellules souches (les cellules CD34+CD38low) exprime quatre microARN particuliers: mir-10a, mir-150, miR-155 et miR-146a. Deux de ces microARN (miR-150 et miR-155) sont trouvés spécifiquement dans les cellules des patients, et pas dans celles des individus sains.