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Cardiovascular diseases are the leading cause of death, representing more than 30% of all global deaths. Risk factors for developing atherosclerotic alterations are hypertension, diabetes, obesity, nicotine or alcohol abuse, which are widespread among industrial nations. Atherosclerotic alterations concern human arteries, where infiltration of modified lipids triggers an immune response, initiating the transmigration of monocytic cells and smooth muscle cells to remove this subendothelial accumulated lipids. In this context, autophagic processes were found highly active in atherosclerotic plaques, especially in lesional macrophages (MΦ). Supporting the MΦ reverse cholesterol transport, autophagy aids to resolve the subendothelial lipid accumulation, promoting plaque reduction and plaque stability. Furthermore, the cytokine Growth-Differentiation-Factor-15 (GDF-15) was found strongly expressed in lesional MΦ, where it is implicated in reverse cholesterol transport as well. These findings suggest a potential link between autophagy and GDF-15 in MΦ lipid homeostasis. This possible implication of GDF-15 in macrophages autophagy and lipid homeostasis was investigated in the present work. Therefore, we diminished or increased GDF-15 protein levels in human THP-1 MΦ, using small interfering RNAs and recombinant GDF-15 protein. Exposing THP-1 MΦ to oxLDL was used to induce foam cell formation. Subsequently, intracellular lipid accumulation and cholesterol levels, autophagy-relevant proteins, as well as autophagic and lysosomal activity were investigated. Aiming to investigate the basal autophagy in macrophages, we altered the GDF-15 protein level without exposing THP-1 MΦ to oxLDL. Diminishing the GDF-15 protein level in THP-1 MΦ led to decreased intracellular lipid accumulations, whereas cholesterol levels remained unaltered. Furthermore, the ATG5 and p62 protein levels decreased, as well as the ATG12 / ATG5-complex levels. Additionally, the p62 accumulation and the autophagy activity were diminished. Since ATG5 and ATG12 are mandatory for the autophagosome formation and p62 accumulation represents autophagic vesicles, these observations indicated to a diminished autophagosome formation, which explained the observed reduction in the autophagy activity. An increased GDF-15 protein level did not influence ATG5 and p62 protein levels or the ATG12 / ATG5-complex. However, it enhanced the p62 and Lamp-1 accumulations and increased the autophagy activity, whereas the lysosome activity remained unaltered. Thus, we concluded that GDF-15 possibly stabilizes the ATG5 protein level or facilitates the ATG12 / ATG5-complex assembly, leading to enhanced build-up in autophagic vesicles and thereby increasing the autophagy activity. To test, whether GDF-15 may operate further upstream in the autophagy signaling pathway, we investigated the Beclin-1 protein level and phosphorylation status of mTOR. Amplified GDF-15 protein levels did not influence Beclin-1 or phosphorylation status of mTOR, which confirmed our conclusion about the impact of GDF-15 on MΦ autophagy being linked to ATG5 protein and/or ATG12 / ATG5-complex. In exposing THP-1 MΦ to oxLDL, we induced foam cell formation. Upon oxLDL-exposure, THP-1 MΦ showed increased lipid accumulation, whereas the cholesterol levels remained unaltered. The p62 and Lamp-1 accumulation were increased, whereas the autophagic and lysosomal activities were diminished. These results were in line with already published data, where oxLDL was reported to induce lipid accumulation and to lead to lysosome expansion and to disturb lysosomal activity. Likewise, our observations of impaired autophagy activity and accumulation of autophagic vesicles have already been described. In proceeding to investigate GDF-15-depending autophagy in foam cells, we exposed THP-1 MΦ with altered GDF-15 protein levels to oxLDL. The combination of an enhanced GDF-15 protein level in THP-1 MΦ and exposure to oxLDL increased the ATG5 and p62 protein levels and the ATG12 / ATG5-complex. Furthermore, increased GDF-15 protein levels in foam cells amplified the p62 and Lamp-1 accumulation, compared to oxLDL-exposure alone. Whereas an enhanced or diminished GDF-15 protein level in combination with oxLDL-exposure had no additional influence on the autophagy and lysosome activity, which remained repressed just like after exposure to oxLDL alone. Conclusively, we found that increased GDF-15 protein levels aggravated the oxLDL-induced accumulation of autophagic vesicles, whereas vice versa decreased GDF-15 protein levels diminished the oxLDl-induced accumulation of autophagic vesicles. This work is the first one to reveal the crucial role of GDF-15 on MΦ autophagy: GDF-15 acts protective during basal autophagy, whereas during excess lipid stimuli, this GDF-15 influence on autophagosome formation aggravates the lipid-induced accumulation of autophagic vesicles. These observations identify GDF-15 as an important regulator in macrophage autophagy and lipid homeostasis, revealing its potential for new therapeutic strategies e.g. in atherosclerosis and cardiovascular diseases or stroke., Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Todesursache mit mehr als 30% aller Todesfälle weltweit. Risikofaktoren für die Entwicklung arteriosklerotischer Veränderungen sind Bluthochdruck, Diabetes, Fettleibigkeit, Nikotin- oder Alkoholmissbrauch, welche in den Industrie-Nationen weit verbreitet sind. Arteriosklerotische Veränderungen betreffen menschliche Arterien, bei denen die Infiltration modifizierter Lipide eine Immunantwort auslöst. Diese Immunantwort führt zur Transmigration monozytärer Zellen und glatter Muskelzellen, um diese subendothelialen Lipidansammlungen zu entfernen. In diesem Zusammenhang wurde eine erhöhte Autophagie-Aktivität in arteriosklerotischen Plaques, insbesondere in Plaque-Makrophagen (MΦ) nachgewiesen. Diese erhöhte Autophagie-Aktivität trägt unter anderem zum Export von Cholesterin und somit zur Auflösung der subendothelialen Lipidansammlungen bei. Dadurch fördert Autophagie die Plaque-Reduktion und die Plaque-Stabilität. Darüber hinaus ist das Zytokin Wachstums-Differenzierungs-Faktor-15 (GDF-15) in Plaque- MΦ stark exprimiert, wo es am Export von Cholesterin beteiligt ist. Diese Beobachtungen deuten auf eine mögliche Verbindung zwischen Autophagie und GDF-15 in der Lipidhomöostase der MΦ hin, welche in der vorliegenden Arbeit untersucht wurde. Dazu wurde das GDF-15-Proteinlevel in humanen THP-1-Makrophagen vermindert oder erhöht. Erreicht wurde dies durch die Verwendung von small interfering RNAs oder rekombinantem GDF-15-Protein. Die Bildung von Schaumzellen wurde dabei durch Stimulation der THP-1- MΦ mit oxLDL induzieren. Anschließend wurden die intrazelluläre Lipidakkumulation und der Cholesterinspiegel, Autophagie-relevante Proteine sowie die Autophagie- und Lysosomen-Aktivität untersucht. Zur Untersuchung der basalen Autophagie in MΦ wurde das GDF-15-Proteinlevel modifiziert, ohne zunächst die Schaumzellbildung durch oxLDL zu induzieren. Die Verminderung des GDF-15-Proteinlevels führte zu einer verminderten intrazellulären Lipidanreicherung, während der Cholesterinspiegel unverändert blieb. Darüber hinaus erniedrigte sich das ATG5-Proteinlevel, das ATG12 / ATG5-Komplex-Level, sowie das p62-Proteinlevel, die p62-Akkumulationen und eine Verminderung in der Autophagie-Aktivität waren messbar. Da ATG5 und ATG12 essentiell für die Autophagosomenbildung sind und p62-Akkumulationen die Bildung von Autophagie-Vesikeln widerspiegeln, deuteten diese Beobachtungen auf eine verminderte Autophagosomenbildung hin, was wiederum die gemessene Verminderung in der Autophagie-Aktivität erklärt. Eine Erhöhung des GDF-15-Proteinlevels in THP-1- MΦ hatte keinen Einfluss auf das ATG5- und p62-Proteinlevel, oder die Bildung des ATG12 / ATG5-Komplex. Allerdings verstärkte es die p62- und Lamp-1-Akkumulationen und erhöhte die Autophagie-Aktivität, während die Lysosomen-Aktivität unverändert blieb. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass GDF-15 möglicherweise das ATG5-Proteinlevel stabilisiert oder die Bildung des ATG12 / ATG5-Komplex erleichtert, was die verstärkte Bildung und Anreicherung von Autophagie-Vesikeln, sowie die erhöhte Autophagie-Aktivität erklären würde. Ein erhöhtes GDF-15-Proteinlevel zeigte keine Auswirkungen auf das Beclin-1 Proteinlevel oder den Phosphorylierungsstatus von mTOR. Somit festigte sich die Schlussfolgerung bezüglich des Einflusses von GDF-15 auf die Stabilisierung von ATG5 und/oder die Komplexbildung von ATG12 / ATG5. Durch die oxLDL-Stimulation wurde die Schaumzellbildung in THP-1 MΦ induziert. Nach oxLDL-Stimulation zeigten THP-1 MΦ eine erhöhte Lipidakkumulation, während die Cholesterinwerte unverändert blieben. Die p62- und Lamp-1-Akkumulation nahm zu, während die Autophagie- und Lysosomen-Aktivität abnahm. Diese Ergebnisse standen im Einklang mit bereits publizierten Daten, in denen oxLDL eine Lipidakkumulation induzierte und zu einer Ausdehnung der Lysosomen führte, sowie die lysosomale Aktivität störte. Ebenso ist die hier nachgewiesene, gestörte Autophagie-Aktivität und die Akkumulation von Autophagie-Vesikeln bereits publiziert. Zur Untersuchung der GDF-15-abhängigen Autophagie in Schaumzellen, wurden THP-1-MΦ mit modifiziertem GDF-15-Proteinlevel ebenfalls oxLDL-exponiert. Die Kombination eines erhöhten GDF-15 Proteinlevels führte in oxLDL-exponierten THP-1 MΦ zu einer Erhöhung des ATG5- und p62-Proteinlevels, sowie einer vermehrten ATG12 / ATG5-Komplex-Bildung. Darüber hinaus führte ein erhöhtes GDF-15 Proteinlevel in Kombination mit oxLDL zu vermehrten p62- und Lamp-1-Akkumulationen, verglichen mit alleiniger oxLDL-Stimulation. Eine Erhöhung oder Verminderung des GDF-15 Proteinlevels hatte keinen weiteren Einfluss auf die Autophagie- und die Lysosomen-Aktivität, welche beide weiterhin vermindert blieben, wie bereits nach alleiniger oxLDL-Stimulation feststellbar. Zusammenfassend konnten wir nachweisen, dass ein erhöhtes GDF-15 Proteinlevel die oxLDL-induzierte Akkumulation von Autophagie-Vesikeln verschlimmert, während umgekehrt ein erniedrigtes GDF-15 Proteinlevel die oxLDL-verursachte Akkumulation von Autophagie-Vesikeln erniedrigt. Somit wurde in der vorliegenden Arbeit erstmals die entscheidende regulatorische Rolle von GDF-15 in der MΦ-Autophagie nachgewiesen. Durch Beeinflussung der Autophagosomen-Bildung wirkt GDF-15 während der basalen Autophagie schützend. Bei überschüssigem Lipid-Stimulus verschärft GDF-15 jedoch die lipidinduzierte Akkumulation von Autophagie-Vesikeln. Diese Erkenntnisse lassen sich möglicherweise für neue therapeutische Strategien z.B. bei Arteriosklerose, kardiovaskulären Erkrankungen oder Schlaganfällen nutzen.

Frontotemporal Dementia (FTD) and Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) are two neurodegenerative diseases from the same clinical, genetic and neuropathological spectrum. In order to identify a common biological pathway for FTD and ALS, we examined the microglial activation mechanisms in FTD and mixed forms of FTD-ALS. Murine models mimicking GRN and C9ORF72 loss of expression, genes that are mutated in familial forms of FTD and FTD-ALS (C9ORF72 only), develop immune phenotypes. Thus, this thesis was composed by two main lines of study: 1/ Is the TDP-43 protein, which is the main component of inclusions in FTD-ALS, capable of activating microglial cells? By which mechanisms? 2/ Does C9ORF72 and PGRN loss of function have consequences on microglial reactivity to TDP-43? Using in vitro models of primary microglial cultures, we show that TDP-43 activates the non-canonical NLRP3 inflammasome microglial pathways. This activation occurs following the interaction of TDP-43 with TLR2/4, and its internalization in microglial cells. C9orf72-/- and GrnR493X/R493X deficient murine microglial cells are hyper-reactive to TDP-43 stimulation. This effect was also observed in an "MDMi" model consisting in microglia-like cells derived from FTD patients’ monocytes. These patients are GRN or C9ORF72 mutation carriers. Finally, we show that this effect may depend on the functions of PGRN and C9ORF72 which appear essential to the dynamics of the inflammasome-autophagy negative feedback loop regulating the activity of the inflammasome. Our data highlight a common pathway of neuroinflammation in FTD and ALS and open new insights into the neurodegenerative processes of these diseases., Les démences frontotemporales (DFT) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA) sont deux maladies neurodégénératives faisant partie d'un même spectre clinique, génétique et neuropathologique. Afin d’identifier une voie biologique commune aux DFTs et SLA, nous nous sommes intéressés aux mécanismes d’activation microgliale. Deux axes d’étude principaux ont composé cette thèse : 1/ La protéine TDP-43, qui forme les inclusions majoritaires des DFT-SLA, est-elle capable d’activer les cellules microgliales ? Par quels mécanismes ? 2/ La perte de fonction des protéines C9ORF72 et PGRN a-t-elle des conséquences sur la réactivité microgliale en présence de TDP-43? Par l’utilisation de modèles in vitro de cultures primaires microgliales nous montrons que la protéine TDP-43 active la voie non canonique microgliale de l'inflammasome NLRP3. Celle-ci se produit suite à l’interaction de TDP-43 avec les récepteurs TLR2/4, et à son internalisation dans les cellules microgliales. Les cellules microgliales murines déficientes C9orf72-/- et GrnR493X/R493X sont hyper-réactives vis-à-vis d’une stimulation par TDP-43. Cet effet est reproduit dans un modèle « MDMi » de cellules microgliales dérivées de monocytes de patients DFT porteurs de mutation GRN ou C9ORF72. Enfin, nous montrons que cet effet peut être lié aux fonctions des protéines PGRN et C9ORF72 nécessaires au bon fonctionnement de la boucle de rétrocontrôle de l’activité de l’inflammasome par la voie autophagique. Nos données mettent en évidence une voie commune de neuroinflammation dans les DFTs et la SLA, et ouvrent de nouvelles pistes sur les processus neurodégénératifs de ces maladies.

Acute myeloid leukemia (AML) represents a heterogeneous group of malignant hematopathies characterized by a clonal proliferation of hematopoietic progenitors blocked in their differentiation (blasts), which accumulate in the bone marrow, blood, and other organs. The AML causes more than 3000 death every year in France. Different genetic mutations are found in the AML, among them the ones affecting the kinase receptor activity: KIT and FLT3-ITD. The internal tandem duplication in the FLT3 receptor (FLT3-ITD), represents 30% of cases of AML, and has a poor prognosis, compared to patients expressing the wild-type receptor. Previous studies have demonstrated that autophagy regulates cytotoxicity in FLT3-ITD AML cells after proteasome inhibition. In this study proteotoxic stress conditions generated by Bortezomib (Bz) resulted in the degradation of proteasome subunits in FLT3-ITD MOLM-14 cells but not in FLT3-WT OCI-AML3 cells, suggesting ITD mutation contributes to activate autophagy-mediated proteolysis of the proteasome, known as proteaphagy. In this study, using chemical inhibition of autophagy with Bafilomycin A (BafA) we blocked proteaphagy and accumulated proteasome core subunits into autophagosomes of Bz-treated MOLM-14 cells. To investigate the role of protein ubiquitylation in proteaphagy, we used distinct TUBEs (Tandem Ubiquitin Binding Entities). While TUBE-HHR23 captures p62, proteasome subunits and ubiquitylated forms of FLT3, TUBE-p62 does not. Nevertheless, TUBE-p62 protected the unmodified form of FLT3-ITD from degradation driven by Bz. According to our results, the p62 inhibitor Verteporfin (VT) blocked proteaphagy and reduced the colocalization of p62/alpha2 core subunit but did not affected the one of p62/Rpn1. VT also protected FLT3-ITD from Bz-induced degradation and colocalized within p62 in MOLM-14 cells. Both autophagy inhibitors enhanced Bz-induced apoptosis in MOLM-14 cells suggesting that these combinatorial treatments could be a therapeutic strategy to sensitize FLT3-ITD positive cells. This study allowed us to understand that the proteasome- and autophagy-mediated proteolysis are most likely in a dynamic equilibrium and play an important role when one or the other pathway is impaired.; La leucémie myéloïde aiguë (LAM) représente un groupe hétérogène d'hématopathies malignes caractérisées par une prolifération clonale de progéniteurs hématopoïétiques bloqués dans leur différenciation (blastes), qui s'accumulent dans la moelle osseuse, le sang et d'autres organes. Le LAM fait chaque année plus de 3000 morts en France. Différentes mutations génétiques se trouvent dans le LAM, parmi lesquelles celles affectant l'activité des récepteurs de kinase : KIT et FLT3-ITD. La duplication interne en tandem dans le récepteur FLT3 (FLT3-ITD), représente 30% des cas de LAM, et a un mauvais pronostic, par rapport aux patients exprimant le récepteur de type sauvage. Les patientes atteintes de leucémie aiguë myéloïde présentant une duplication interne en tandem dans le récepteur FLT3 (FLT3-ITD), les patients atteints de FLT3-ITD représentent 30% des cas de leucémie aiguë myéloïde (LAM), et ont un mauvais pronostic de survie par rapport aux patients exprimant le récepteur de sauvage. Des études antérieures ont démontré que l'autophagie régule la cytotoxicité induite par l'inhibition du protéasome dans les cellules de LAM FLT3-ITD. Dans cette étude, les conditions de stress protéotoxique générées par le bortézomib (Bz) ont entraîné la dégradation des sous-unités du protéasome dans les cellules FLT3-ITD MOLM-14 mais pas dans les cellules FLT3-WT OCI-AML3, ce qui suggère que la mutation ITD contribue à activer la protéolyse par autophagie du protéasome, connue sous le nom de proteaphagie. L'inhibition chimique de l'autophagie avec la bafilomycine A (BafA) a bloqué la protaphagie et favorisé l'accumulation des sous-unités centrales du protéasome accumulées dans les autophagosomes des cellules MOLM-14 traitées au Bz. Pour étudier le rôle de l'ubiquitylation des protéines dans la protaphagie, nous avons utilisé des TUBE distincts (Tandem Ubiquitin Binding Entities). Alors que TUBE-HHR23 capture p62, les sous-unités de protéasome et les formes ubiquitylées de FLT3, TUBE-p62 ne le fait pas. Néanmoins, TUBE-p62 a protégé la forme non modifiée de FLT3-ITD de la dégradation provoquée par Bz. Selon nos résultats, l'inhibiteur de la p62 Verteporfin (VT) a bloqué la protaphagie et a réduit la colocalisation de la sous-unité centrale p62 avec alpha2 mais n'a pas affecté celle de p62 avec Rpn1. VT a également protégé FLT3-ITD de la dégradation induite par Bz et augmenté la colocalisation de p62 dans les cellules MOLM-14. Les deux inhibiteurs de l'autophagie ont augmenté l'apoptose induite par le Bz dans les cellules MOLM-14, suggérant que ces traitements combinatoires pourraient être une stratégie thérapeutique pour cibler les cellules positives FLT3-ITD. Ainsi, la protéolyse médiée par le protéasome et l'autophagie est très probablement dans un équilibre dynamique et joue un rôle important lorsque l'une ou l'autre voie est altérée.

Radiotherapy is a major treatment against cancer, which concerns more than 50% of the cancer patients and can lead to total remission by itself. Although technological advances considerably decreased side-effects, 5 to 15% of radiotherapy patients suffer from severe side-effects in healthy tissues, thus limiting its application. These side-effects are heterogeneous in their features (desquamation, necrosis, fibrosis etc.), in their intensity (might lead to hospitalization) and in the time they take to appear (from few days following radiotherapy to several years after). The occurence of these severe side-effects while radiotherapy protocols are standardized highlights the existence of a radiosensitivity specific to each patient named individual radiosensitivity. Unfortunately, to date, there is no consensus clinical test, applicable in routine, allowing to measure individual radiosensitivity of cancer patients in order to individualize protocol of radiotherapy. Moreover, the molecular basis responsible for these side-effects are still poorly known. Therefore, we decided to study the transcriptome and the methylome of dermal fibroblast from patients who suffered severe side-effects of radiotherapy to identify a molecular signature of individual radiosensitivity and also to better understand molecular basis beyond it. Thus, we observed in a 1st cohort that skin fibroblasts from radiosensitive patients exhibited a specific transcriptomic and methylomic pattern. Using a machine learning approach, we developed a 5-gene signature allowing the identification of patients who suffered severe side-effects in a 2nd independent cohort. Moreover, we have shown that dermal fibroblast from patients who suffered severe radiotherapy side-effects exhibited a DNA repair defect and a higher death rate after irradiation. Finally, we identified the transcription factor NFATc2 as an actor of cellular response to ionizing radiations whose deficiency could lead to DNA repair defect and increased cellular radiosensitivity. Finally, this thesis work allowed the identification of a molecular signature of cells from patients who suffered severe side-effects of radiotherapy, a first step toward the development of a new clinical test, and paves the way to better understand the mechanisms of individual radiosensivity, La radiothérapie est un traitement majeur dans la lutte contre le cancer, avec plus de 50% des patients atteints d’un cancer qui en bénéficie, et pouvant à elle seule conduire à une rémission complète. Bien que les avancées technologiques aient diminuées considérablement les effets secondaires, 5 à 15 % des patients traités par radiothérapie souffrent d’effets secondaires sévères au niveau des tissus sains, limitant ainsi l’application de ce traitement. Ces effets secondaires sévères sont variés dans leur forme (desquamation, nécrose, fibrose), dans leur intensité (certains peuvent conduire à une nouvelle hospitalisation) ainsi que dans leur temps d’apparition (de quelques jours à plusieurs années après la radiothérapie). L’apparition de ces effets secondaires sévères chez certains patients de radiothérapie alors que les protocoles sont standardisés met à jour l’existence d’une radiosensibilité propre à chacun : la radiosensibilité individuelle. Malheureusement, à ce jour, il n’existe pas de test clinique applicable en routine qui fasse consensus, permettant de mesurer la radiosensibilité individuelle des patients atteints d’un cancer afin d’individualiser les protocoles de radiothérapie. D’autre part, les mécanismes moléculaires conduisant à ces effets secondaires restent encore mal connus. Nous avons donc étudié le transcriptome et le méthylome de fibroblastes dermiques de patients ayant souffert d’effets secondaires sévères de radiothérapie afin d’identifier une signature de la radiosensibilité individuelle et également de mieux comprendre les bases moléculaires sous-jacentes. Nous avons ainsi observé dans une 1ère cohorte que les fibroblastes cutanés des patients radiosensibles présentaient un profil transcriptomique et méthylomique spécifique. A l’aide d’une approche de machine learning, nous avons pu mettre à jour, une signature composée de 5 gènes dont l’expression nous a permis d’identifier les patients ayant souffert d’effets secondaires de radiothérapie dans une 2ème cohorte indépendante. De plus, nous avons observé que les fibroblastes des patients ayant souffert d’effets secondaires de radiothérapie présentaient un défaut de réparation de l’ADN ainsi qu’une toxicité accrue après irradiation. Finalement, nous avons identifié le facteur de transcription NFATc2 comme un acteur de la réponse aux radiations ionisantes dont la déficience peut entraîner un défaut de réparation de l’ADN et augmenter la radiosensibilité cellulaire. Ce travail de thèse a donc permis de révéler une signature moléculaire des cellules de patients ayant souffert d’effets secondaires sévères de radiothérapie, une première étape vers la mise au point d’un nouveau test clinique, et ouvre la voie à une meilleure compréhension des mécanismes de la radiosensibilité individuelle

The retina and the brain are two nervous tissues rich in lipids. Aging and metabolic syndrome (MetS) are associated with functional and physiological alterations of these tissues as well as modifications in the composition of the gut microbiota. The global objective of this thesis work is to understand the lipid and homeostatic alterations in aging and MetS contexts in the retina and the brain. In a first study, we evaluated the impact of the modifications in the composition of the gut microbiota associated with aging on the lipid/fatty acid contents of the liver and the brain (cortex). We showed that colonization of germ-free mice with the gut microbiota of old mice modulated the hepatic expression levels of fatty acid biosynthesis enzymes and induced alterations in the lipid and fatty acid profiles in the liver (decrease in the cholesterol and polyunsaturated fatty acids (PUFA) of the omega-3 series contents and increase in the monounsaturated fatty acids (MUFA) content) and in the cortex (decrease in the cholesterol and PUFA contents, including docosahexaenoic acid (DHA) and increase in the MUFA content). In a second study, we evaluated the effect of chronic exposure of mice to a high fat diet (HFD) inducing a MetS on the fatty acid contents of the retina and the cortex. We showed that a HFD impacted the content of plasmalogens as well as the retinal contents of saturated fatty acids (SFA), MUFA and the relative proportion of the essential fatty acids (linoleic acid and ⍺-linolenic acid), without however modifying those of arachidonic acid (AA) and DHA, the two major retinal PUFA. Alterations in the fatty acid profile of the cortex (decrease in the content of MUFA and increase in that of PUFA including linoleic acid, AA and DHA) has also been highlighted in animals fed with a HFD. Enriching HFD with inulin, a prebiotic, helped limiting some of these cortical changes. In a third study, we characterized in the retinas of apoB100, LDLR-/- mice, a model reproducing some features of the aging retina (accumulation of lipid deposits at the basement of the retina/loss of the photoreceptor function) cellular processes involved in cellular and tissue homeostasis: autophagy and the inflammatory and antioxidant responses. We highlighted an increase in the expression of pro-inflammatory cytokines in the retinas of apob100, LDLR-/- mice from the age of 2 months and a decrease in the basal autophagic flux at the age of 12 months. In conclusion, we characterized the alterations affecting the fatty acid and/or the lipid profiles of the retina and the cortex in a MetS and aging contexts and showed that the gut microbiota is involved, at least in part, in the modifications of the lipid/fatty acid composition occurring in the cortex during aging. Finally, although our results deserve to be confirmed, our work opens perspectives on the use of apob100, LDLR-/- mice as a model to study the aging of the retina., La rétine et le cerveau sont deux tissus nerveux riches en lipides. Le vieillissement et le syndrome métabolique (SMet) sont associés à des altérations fonctionnelles et physiologiques de ces tissus ainsi qu’à des modifications de la composition du microbiote intestinal. L’objectif global de ces travaux de thèse s’est inscrit dans la compréhension des altérations lipidiques et homéostatiques en contextes de vieillissement et de SMet dans la rétine et le cerveau. Dans une première étude, nous avons évalué l’impact des modifications de la composition du microbiote intestinal liées au vieillissement sur les contenus en lipides/acides gras du foie et du cerveau (cortex). Nous avons montré que la colonisation de souris axéniques par le microbiote intestinal de souris âgées modulait les niveaux d’expression hépatique d’enzymes de la biosynthèse des acides gras et induisait des altérations des profils en lipides et en acides gras dans le foie (diminution des teneurs en cholestérol et en en acides gras polyinsaturés (AGPI) de la famille des oméga-3 et augmentation de la teneur en acides gras monoinsaturés (AGMI)) et dans le cortex (diminution des teneurs en cholestérol et AGPI, dont l’acide docosahexaénoïque (DHA) et augmentation de la teneur en AGMI). Dans une deuxième étude, nous avons évalué l’effet de l’exposition chronique des souris à un régime riche en graisses (High Fat Diet, HFD) induisant un SMet sur les contenus en acides gras de la rétine et du cortex. Nous avons montré qu’un HFD impactait le contenu en plasmalogènes ainsi que les teneurs rétiniennes en acides gras saturés (AGS), en AGMI et la proportion relative d’acides gras indispensables (acide linoléique et acide ⍺-linolénique), sans toutefois modifier celles en acide arachidonique (AA) et en DHA, les deux AGPI rétiniens majoritaires. Des altérations du profil en acides gras du cortex (diminution de la teneur en AGMI et augmentation de celle en AGPI dont l’acide linoléique, l’AA et le DHA) ont également été mises en évidence chez les animaux nourris avec un HFD. L'enrichissement du HFD avec de l’inuline, un prébiotique, a permis de limiter certaines de ces altérations corticales. Dans une troisième étude, nous avons caractérisé dans les rétines de souris apoB100, LDLR-/-, un modèle reproduisant certains traits phénotypiques de vieillissement de la rétine (accumulation de dépôts lipidiques à la base de la rétine/perte de fonctionnalité des photorécepteurs) des processus cellulaires impliqués dans l’homéostasie cellulaire et tissulaire : l’autophagie et les réponses inflammatoire et antioxydante. Nous avons mis en évidence une augmentation de l’expression de cytokines pro-inflammatoires dans les rétines des souris apob100, LDLR-/- dès l’âge de 2 mois et une diminution du flux autophagique basal à l’âge de 12 mois. En conclusion, nous avons caractérisé les altérations affectant les profils en acides gras et/ou en lipides de la rétine et du cortex en contextes de SMet et de vieillissement et montré que le microbiote intestinal est impliqué, tout au moins en partie, dans les modifications de la composition en lipides/acides gras s’opérant dans le cortex au cours du vieillissement. Enfin, bien que nos résultats méritent d’être confirmés, nos travaux ouvrent des perspectives sur l’utilisation des souris apob100, LDLR-/- comme modèle pour l’étude du vieillissement de la rétine.

Anaplastic Lymphoma Kinase positive Anaplastic Large Cell Lymphomas (ALK+ ALCL) are an aggressive pediatric disease. They are characterized by chromosomal translocations involving the ALK gene with various translocation partner genes. NPM-ALK is the most prominent fusion protein observed. It results from the t(2;5) (p23;q35) chromosomal translocation and leads to the constitutive activation of the tyrosine kinase domain, which is driving lymphomagenesis through the activation of multiple survival/proliferation pathways. Therapeutic options comprise chemotherapy, which is efficient in about 70% of the patients, and targeted therapies, such as crizotinib (an ALK tyrosine kinase inhibitor) used in refractory/relapsed cases. Efforts converged also towards the development of combined therapies to improve treatment. In this context, we studied whether autophagy could be modulated to improve crizotinib therapy. Autophagy is a vesicular recycling pathway, known to be associated either with cell survival or cell death depending on cancers and therapies. The Unc-51-like kinase-1 (ULK1) protein plays a critical role in the autophagy initiation stage and is regulated mainly through AMPK- or mTOR- mediated serine/threonine phosphorylations on key residues. In NPM-ALK+ ALCL cell lines, previous work of my host team had demonstrated that autophagy was induced upon NPM-ALK inactivation, and was endowed with cytoprotective functions. During my PhD, I first reviewed the cytoprotective, or inversely, cytotoxic roles of autophagy upon therapy in various other ALK-dependent cancers. Then, my main thesis project was to identify microRNAs (miRNAs) and their potential targets that could be therapeutically modulated, in addition to crizotinib treatment, to drive autophagy towards cytotoxic functions and the outcome of tumor cells death. Indeed, deregulation of miRNA expression levels have been extensively described in cancers, including in NPM-ALK+ ALCL, and have also been shown to modulate the autophagy responses upon therapies. My work led to the demonstration that miRNA-7-5p, known primarily to harbor tumor suppressive functions in diverse cancer types, and RAF1, one of its targets, play essential roles in NPM-ALK+ ALCL, by controlling autophagy flux and tumor cell fate. RAF1 is a serine/threonine kinase, best known to connect RAS to the MEK/ERK pathway. However, the mechanism by which RAF1 inhibition, specifically, could induce autophagy had not been described so far. Our work points out for the first time the possible phosphorylation of ULK1 on its serine757 inhibitory residue by RAF1 (and not MEK or ERK), which opens up a new therapeutic avenue to modulate the autophagy flux in ALK+ ALCL. In a second part of my project, and to better understand the potential link between RAF1 and ULK1, I gave several attempts to purify autophagosomes from NPM-ALK+ ALCL cells. While our results suggest that NPM-ALK could be detected in an autophagosome-enriched fraction, further investigations will determine whether RAF1 and ULK1 could co-localized at autophagosomal membranes. Altogether, our results strengthens that autophagy lays at a center place for NPM-ALK+ ALCL tumor cells fate upon crizotinib treatment, and stressed that NPM-ALK and RAF1 combined inactivation, by increasing autophagy flux, might be beneficial for ALK+ ALCL patients.; Le lymphome anaplasique à grandes cellules ALK positif (LAGC ALK+) est un cancer pédiatrique très agressif. Il se caractérise par des translocations chromosomiques impliquant toujours le gène ALK et différents autres gènes, partenaires de translocation. NPM-ALK (Nucleophosmine- Anaplastic Lymphoma Kinase) est la protéine de fusion à activité tyrosine kinase la plus fréquemment observée. Elle résulte de la translocation chromosomique t(2;5)(p23 ;q35) et l'activation constitutive de son domaine catalytique permet le développement du lymphome, par l'activation de nombreuses voies de signalisation de survie et de prolifération. Les thérapies actuelles sont la chimiothérapie, qui est efficace dans 70% des cas, ou une thérapie ciblant l'oncogène ALK (notamment l'inhibiteur tyrosine kinase Crizotinib), qui est utilisée chez les patients réfractaires ou en rechute. Les efforts de la communauté scientifique convergent également au développement de thérapies combinées, pour améliorer le traitement de ces lymphomes. Dans ce contexte, nous étudions si l'autophagie peut être modulée pour améliorer la réponse au crizotinib. L'autophagie est un processus vésiculaire d'autodigestion, connu pour être associé soit à la survie, soit à la mort cellulaire, selon le type de cancer et de thérapie. La protéine ULK1 (Unc-51-like kinase-1) joue un rôle majeur dans l'initiation de ce processus et est régulée principalement par des phosphorylations sur des résidus sérine ou thréonine, qui sont assurées par les kinases mTOR ou AMPK. Dans les lignées de LAGC ALK+, des travaux antérieurs de l'équipe ont montré qu'une autophagie cytoprotectrice était induite lors de l'inactivation de l'oncogène NPM-ALK. Durant ma thèse, j'ai tout d'abord répertorié le rôle cytoprotecteur ou, à l'inverse, cytotoxique de l'autophagie dans différents cancers dépendants de l'oncogène ALK, et soumis à différentes thérapies. Mon projet de thèse principal a ensuite été d'identifier des microARNs ainsi que leurs cibles potentielles, dont la manipulation thérapeutique pouvait, en association avec le crizotinib, conduire à une autophagie associée à la mort des cellules tumorales. En effet, des dérégulations du niveau d'expression des microARNs ont été abondamment décrites dans différents cancers, incluant les LAGC ALK+, et leurs capacités à moduler la réponse autophagique sous thérapie a également été démontrée. Mon travail de thèse a permis de démontrer que le microARN-7-5p, connu pour ses propriétés anti-tumorales, et RAF1, une de ses cibles, jouaient un rôle crucial dans les LAGC ALK+, en contrôlant le flux autophagique et le devenir cellulaire. RAF1 est une sérine /thréonine kinase, essentiellement connue pour connecter RAS à la voie de prolifération MEK/ERK. Cependant, le mécanisme par lequel l'inhibition spécifique de RAF1 peut influer sur l'autophagie n'a encore jamais été décrit. Nos travaux montrent pour la première fois la capacité pour RAF1 (et non MEK ou ERK) de phosphoryler ULK1 sur le résidu inhibiteur sérine 757, ce qui offre une nouvelle voie thérapeutique pour moduler le flux autophagique dans les LAGC ALK+. Dans une seconde partie de ma thèse, et afin de mieux comprendre ce lien potentiel entre RAF1 et ULK1, nous nous sommes attachés, selon deux protocoles différents, à purifier les autophagosomes à partir d'une lignée cellulaire de LAGC ALK+. Nos résultats suggèrent la présence de NPM-ALK dans nos fractions enrichies en autophagosomes, et ces travaux seront poursuivis pour détecter RAF1 et ULK1 dans ces mêmes fractions. Ainsi, nos résultats démontrent l'importance de l'autophagie dans la réponse des LAGC ALK+ au crizotinib et mettent au jour que la combinaison thérapeutique consistant à inhiber NPM-ALK et RAF1, en potentialisant le flux autophagique, pourrait être bénéfique pour les patients atteints de ce lymphome.

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L’ischémie/reperfusion (I/R) occurrente à toutes transplantations d’organe solide, constitue un stimulus pro-autophagique/pro-apoptotique pour les cellules endothéliales. Nous avons récemment démontré que les cellules endothéliales apoptotiques (CEapo) sécrètent des vésicules apoptotiques exosome like (ApoExo) qui induisent une réponse auto-immune et accélèrent le rejet vasculaire dans un modèle de greffe aortique chez la souris. Ces ApoExo qui diffèrent des corps apoptotiques classiques par leur structure et leur contenu protéique contiennent le fragment C-terminal du perlécan, LG3. Le LG3, un auto-antigène d’importance en transplantation, favorise le remodelage vasculaire et est augmenté en circulation chez les patients greffés rénaux atteints d’un rejet vasculaire. De plus, la présence d’anticorps anti-LG3 avant la transplantation est associée à un risque plus élevé de développer un rejet vasculaire chez des patients greffés du rein et à la perte du greffon à long terme. Il est connu que la génération du fragment LG3 implique la protéolyse du perlécan par la cathepsine L, une protéase lysosomiale, mais le mécanisme de transport de ce fragment au sein des ApoExo est encore inconnu. Nous avons émis l’hypothèse que l’activité lysosomiale et l’autophagie jouent un rôle important dans la maturation et le chargement du LG3 dans les vésicules ApoExo sécrétées par les CEapo. Une étude longitudinale de microscopie électronique chez les cellules endothéliales humaines carencées en sérum pendant 1h, 2h et 3h, nous a révélé la présence du perlécan / fragment LG3 au sein de compartiments autophagiques (autophagosomes et autophagolysosomes) à différentes étapes du processus autophagique. Après 3 heures de carence en sérum, nous avons identifié le fragment LG3 dans des vésicules membranaires situées au sein de grands réseaux vacuolaires s’apparentant à des autophagolysosomes. L’inhibition de la cathepsine L, de l’acidification du lysosome et de l’autophagie diminuent la présence du fragment LG3 dans les vésicules ApoExo sans affecter la sécrétion de vésicules démontrant donc le rôle de l’autophagie dans l’intégration du fragment LG3 au sein des ApoExo. Toutefois, l’injection de vésicules ApoExo LG3-, provenant de cellules murines aortiques traitées à la bafilomycine, dans un modèle murin de greffe aortique induit une réponse auto-immune anti-LG3 ainsi qu’un remodelage vasculaire à des niveaux similaires aux souris ayant reçu des ApoExo véhicule. Une analyse protéomique de ces vésicules ApoExo LG3-, nous a révélé que la bafilomycine modifie le contenu protéique des ApoExo en induisant une augmentation de la présence de protéines lysosomiales et de la matrice extracellulaire dont le perlécan. Ceci suggère que la présence du motif LG3 au sein du perlécan natif non clivé dans les ApoExo LG3- pourrait être responsable de la mise en place de la réponse anti-LG3 observées chez les souris. Les travaux de ce doctorat ont permis de mettre en évidence que l’autophagie dans les cellules endothéliales productrices d’ApoExo ne régule pas l’immunogénicité des ApoExo. Cependant, elle régule au sein des cellules endothéliales apoptotiques le transport et le clivage du perlécan qui lui est immunogène. En effet, l’autophagie module les différentes formes de perlécan natif et clivé sécrétées dans les ApoExo. L’étude chez la souris greffée nous a donc permis de considérer non plus l’implication du fragment LG3 mais l’implication du motif LG3 présent au sein du perlécan natif non clivé et de ses différentes formes intermédiaires dans la réponse auto-immune anti-LG3 et le rejet vasculaire. La modulation de la sécrétion du perlécan et du LG3 dans les ApoExo constitue une cible thérapeutique potentielle afin de diminuer la réponse auto-immune pouvant augmenter le dommage vasculaire après la greffe, Ischemia/reperfusion (I/R) occurring in all solid organ transplantation, constitute a proautophagic / pro-apoptotic stimulus on endothelial cells. We recently demonstrated that apoptotic endothelial cells (CEapo) secrete apoptotic exosome-like vesicles (ApoExo) that induce autoimmune response and accelerate vascular rejection in a mouse aortic transplant model. These ApoExo, that differ from classical apoptotic bodies in structure and protein content, contain the C-terminal fragment of perlecan, LG3. LG3, an autoantigen of importance in transplantation, promotes vascular remodeling and is increased in circulation in renal transplant patients undergoing vascular rejection. In addition, the presence of anti-LG3 antibodies prior to transplantation is associated with a higher risk of developing vascular rejection in kidney transplant patients and long-term graft loss. It is known that the generation of LG3 fragment involves the proteolysis of perlecan by cathepsin-L, a lysosomal protease, but the mechanism of export of this fragment within ApoExo is still unknown. We hypothesized that lysosomal activity and autophagy play an important role in the maturation and the secretion of LG3 in ApoExo vesicles secreted by CEapo. Longitudinal electron microscopy study after 1h, 2h and 3h in serum starved endothelial human cells revealed the presence of perlecan / LG3 fragment within autophagic compartments (autophagosomes and autophagolysosomes) at different stages of the autophagic process. After 3 hours of serum starvation, we identified LG3 fragment in membrane vesicles located within large vacuolar networks reminiscent of autophagolysosomes. Inhibition of cathepsin-L, of lysosomal acidification and of autophagy decrease the presence of LG3 fragment in ApoExo vesicles without affecting vesicle secretion thus demonstrating the role of autophagy in the secretion of LG3 fragment within ApoExo. However, Injection of ApoExo LG3- vesicles from bafilomycin-treated aortic murine cells into a murine aortic transplant model induces autoimmune anti-LG3 response and vascular remodeling at levels similar to the ApoExo vehicle mice control group. Proteomic analysis of ApoExo from bafilomycin-treated aortic murine cells has demonstrated that bafilomycin modifies ApoExo protein content by inducing an increase of the presence of lysosomal proteins and the extracellular matrix, including perlecan. This suggests that the presence of LG3 motif in uncleaved native perlecan in ApoExo LG3- could be responsible for the establishment of the anti-LG3 response as well as the vascular remodeling observed in mice. Collectively, these results demonstrate that autophagy in endothelial cells producing ApoExo does not regulate the immuogenicity of ApoExo. However, it regulates within apoptotic endothelial cells the processing and cleavage of perlecan who is immunogenic. Indeed, autophagy modulates the different forms of native and cleaved perlecan secreted in ApoExo. Grafted mice study thus allowed us to consider neither the involvement of the LG3 fragment but the implication of the LG3 motif present in the uncleaved native perlecan and its intermediate forms in the anti-LG3 autoimmune response and vascular rejection. Modulating perlecan and LG3 secretion in ApoExo vesicles is a potential therapeutic target to reduce the autoimmune response that can increase vascular damage after transplantation.

The objective of this work was to study the involvement of a mechanism of stress response, the autophagy and in particular one of the autophagy actor, GABARAPL1 during tumor progression and Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT).GABARAPL1, belong to the ATG8 family and to the GABARAP subfamily and they are all mainly involved in the autophagy process thank to the lipidation mechanism permitting their localization to the autophagosome membrane. First, the ATG8 proteins have been identified as redundant proteins during autophagy. Since, our work and other studies have shown that the ATG8 proteins and GABARAPL1 is also involved during the regulation of the autophagy initiation independently of its conjugation and in the late stage dependently of its conjugation.Moreover, the GABARAPs have been described to be dysregulated in cancer and their expression has been mostly founded as downregulated in tumors compared to the healthy tissue. Previous works have shown that the GABARAPs tumor suppressor role and also the ATG8 tumor suppressor role is permitting through their implication in the selective degradation of cellular oncogenes. However, we have showed that GABARAPL1 can inhibit tumor growth independently of its conjugation to autophagosome and therefore to selective autophagy. We have also found that GABARAPL1 might inhibit EMT, a process described to be involved in late stage of carcinogenesis and tumor aggressiveness through its implication in the selective degradation of SMAD proteins. These results suggest a complex role of GABARAPL1 in carcinogenesis.This study also permits to show that the ATG8, despite their high homology, can have different and opposite role as described for LC3 and GABARAP in the regulation of the initiation of the autophagy but also for GABARAP and GABARAPL1 in the regulation of the CDH1/E-Cadherin expression and therefore in the regulation of the EMT.Key words: GABARAPL1, autophagy, EMT and cancer., L’objectif de ces travaux de thèse était d’étudier le rôle d’un mécanisme de réponse au stress, l’autophagie et en particulier d’étudier un des acteurs de l’autophagie, GABARAPL1, lors de la progression tumorale et la Transition Epithélio-Mésenchymateuse (TEM).La protéine GABARAPL1 appartient à la famille ATG8 et à la sous-famille GABARAP dont tous les membres sont impliqués dans le processus d’autophagie majoritairement grâce à un processus appelé communément lipidation et qui permet leur localisation au niveau de la membrane des autophagosomes. Initialement, les protéines ATG8 ont été identifiées comme impliquées au cours de l’élongation du phagophore et lors de sa fermeture. De plus, les protéines ATG8 ont été décrites comme ayant des rôles redondants au cours de l’autophagie. Depuis, nos résultats et d’autres études ont permis de mettre en évidence que les protéines ATG8 et en particulier la protéine GABARAPL1, sont également impliquées dans la régulation de l’initiation de l’autophagie de manière indépendante de leur localisation au niveau des vésicules autophagiques et dans la fusion autophagosome/lysosome de manière dépendante de leur localisation au niveau des vésicules autophagiques.De plus, les protéines GABARAP ont été décrites comme dérégulées dans les cancers et leurs expressions sont généralement diminuées par rapport aux tissus sains. De précédentes études ont décrits que le rôle suppresseur de tumeur des protéines GABARAP, mais également des autres protéines ATG8, était dû à leur implication dans la dégradation sélective d’oncogènes cellulaires. Cependant, nous avons montré que GABARAPL1 inhibe la croissance tumorale indépendamment de sa localisation au niveau des autophagosomes et donc indépendamment d’une dégradation par autophagie sélective. Nous avons également montré que GABARAPL1 inhiberait la TEM, processus décrit comme impliqué dans les stades tardifs de la carcinogenèse et l’agressivité tumorale, par son implication dans la dégradation sélective des protéines SMAD. Ces résultats suggèrent un rôle complexe de GABARAPL1 dans la carcinogenèse.L’ensemble de ces travaux ont également permis de mettre en évidence que les protéines ATG8 malgré leur forte homologie pouvaient avoir des rôles différents voir même des rôles opposés comme les protéines LC3 et GABARAP dans la régulation de l’initiation de l’autophagie ou encore GABARAP et GABARAPL1 dans la régulation de l’expression de CDH1/E-Cadhérine et donc dans la régulation de la TEM.Mots clefs : GABARAPL1, autophagie, TEM et cancer.

The objective of this work was to study the involvement of a mechanism of stress response, the autophagy and in particular one of the autophagy actor, GABARAPL1 during tumor progression and Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT).GABARAPL1, belong to the ATG8 family and to the GABARAP subfamily and they are all mainly involved in the autophagy process thank to the lipidation mechanism permitting their localization to the autophagosome membrane. First, the ATG8 proteins have been identified as redundant proteins during autophagy. Since, our work and other studies have shown that the ATG8 proteins and GABARAPL1 is also involved during the regulation of the autophagy initiation independently of its conjugation and in the late stage dependently of its conjugation.Moreover, the GABARAPs have been described to be dysregulated in cancer and their expression has been mostly founded as downregulated in tumors compared to the healthy tissue. Previous works have shown that the GABARAPs tumor suppressor role and also the ATG8 tumor suppressor role is permitting through their implication in the selective degradation of cellular oncogenes. However, we have showed that GABARAPL1 can inhibit tumor growth independently of its conjugation to autophagosome and therefore to selective autophagy. We have also found that GABARAPL1 might inhibit EMT, a process described to be involved in late stage of carcinogenesis and tumor aggressiveness through its implication in the selective degradation of SMAD proteins. These results suggest a complex role of GABARAPL1 in carcinogenesis.This study also permits to show that the ATG8, despite their high homology, can have different and opposite role as described for LC3 and GABARAP in the regulation of the initiation of the autophagy but also for GABARAP and GABARAPL1 in the regulation of the CDH1/E-Cadherin expression and therefore in the regulation of the EMT.Key words: GABARAPL1, autophagy, EMT and cancer.; L’objectif de ces travaux de thèse était d’étudier le rôle d’un mécanisme de réponse au stress, l’autophagie et en particulier d’étudier un des acteurs de l’autophagie, GABARAPL1, lors de la progression tumorale et la Transition Epithélio-Mésenchymateuse (TEM).La protéine GABARAPL1 appartient à la famille ATG8 et à la sous-famille GABARAP dont tous les membres sont impliqués dans le processus d’autophagie majoritairement grâce à un processus appelé communément lipidation et qui permet leur localisation au niveau de la membrane des autophagosomes. Initialement, les protéines ATG8 ont été identifiées comme impliquées au cours de l’élongation du phagophore et lors de sa fermeture. De plus, les protéines ATG8 ont été décrites comme ayant des rôles redondants au cours de l’autophagie. Depuis, nos résultats et d’autres études ont permis de mettre en évidence que les protéines ATG8 et en particulier la protéine GABARAPL1, sont également impliquées dans la régulation de l’initiation de l’autophagie de manière indépendante de leur localisation au niveau des vésicules autophagiques et dans la fusion autophagosome/lysosome de manière dépendante de leur localisation au niveau des vésicules autophagiques.De plus, les protéines GABARAP ont été décrites comme dérégulées dans les cancers et leurs expressions sont généralement diminuées par rapport aux tissus sains. De précédentes études ont décrits que le rôle suppresseur de tumeur des protéines GABARAP, mais également des autres protéines ATG8, était dû à leur implication dans la dégradation sélective d’oncogènes cellulaires. Cependant, nous avons montré que GABARAPL1 inhibe la croissance tumorale indépendamment de sa localisation au niveau des autophagosomes et donc indépendamment d’une dégradation par autophagie sélective. Nous avons également montré que GABARAPL1 inhiberait la TEM, processus décrit comme impliqué dans les stades tardifs de la carcinogenèse et l’agressivité tumorale, par son implication dans la dégradation sélective des protéines SMAD. Ces résultats suggèrent un rôle complexe de GABARAPL1 dans la carcinogenèse.L’ensemble de ces travaux ont également permis de mettre en évidence que les protéines ATG8 malgré leur forte homologie pouvaient avoir des rôles différents voir même des rôles opposés comme les protéines LC3 et GABARAP dans la régulation de l’initiation de l’autophagie ou encore GABARAP et GABARAPL1 dans la régulation de l’expression de CDH1/E-Cadhérine et donc dans la régulation de la TEM.Mots clefs : GABARAPL1, autophagie, TEM et cancer.

Myogenesis is a biological mechanism involved in muscle formation and is induced after muscle injury. It is orchestrated by satellite cells which proliferate and become myoblasts that can differentiate and fuse to form myotubes structures that correspond to the future components of newly formed muscle fibers during tissue repair. These steps are tightly controlled by the activation and/or the inhibition of myogenic transcription factors regulated themselves by the activation of membrane receptors and downstream associated signaling pathways. The process of endocytosis regulates many cellular signaling pathways by controlling the number of functional receptors available on the cell surface. Furthermore, many studies also revealed that signaling pathways could be activated on the membranes of endosomal compartments. The ESCRT machinery (ESCRT for endosomal Sorting Complex required for Transport) is composed of four subunits called ESCRT-0 to ESCRT-III involved in various essential cellular mechanisms and in particular in the biogenesis of endosomal compartments called multivesicular bodies. It plays a major role in the transport, recycling or degradation of ubiquitinylated membrane receptors and consequently the control of their activity and their downstream signaling pathways. However, until today, the role of this machinery in the regulation of the myogenesis process remains unexplored. During these four years of PhD, I focused my attention on the HRS/HGS (Hepatocyte Growth factor Regulated tyrosine kinase Substrate) protein from the ESCRT-0 subunit and investigated its implication during the myogenesis process. Our experimental data showed that HRS/HGS is dynamically expressed and distributed during myogenesis thus suggesting a key role during differentiation. We found that silencing of HRS strongly inhibits the differentiation of myoblasts into myotube fibers. Mechanistically, our data revealed that HRS differentiation defect was associated with the activation the MEK/ERK and the GSK3b myogenesis inhibitors that collectively negatively altered myogenic transcription factors expression and distribution. Similarly, we also observed that HRS silencing impaired the autophagic flux thus correlating well with previous published data stating that an efficient autophagic process is required during myoblast differentiation. In conclusion, we found for the first time that HRS is a master regulator that controls myogenesis at different levels through the modulation of important key cellular mechanisms involved in trafficking, signaling and degradation., La myogenèse est un mécanisme biologique à l’origine de la formation des muscles, et est induite également lors d’une blessure musculaire. Elle est orchestrée par les cellules satellites qui prolifèrent et deviennent des myoblastes capables de se différencier pour fusionner et donner naissance à des structures appelées myotubes, futurs composants des fibres musculaires néoformées lors de la réparation tissulaire. Ces étapes sont finement contrôlées par l’activation et/ou l’inhibition de facteurs de transcription myogéniques régulés par l’activation de récepteurs membranaires et des voies de signalisations associées en aval. Le processus d'endocytose régule de nombreuses voies de signalisation cellulaires en contrôlant le nombre de récepteurs fonctionnels disponibles à la surface cellulaire. Par ailleurs, de nombreuses études ont aussi révélé que des voies de signalisations pouvaient être activées sur les membranes des compartiments endosomaux. La machinerie ESCRT (endosomal Sorting Complex required for Transport) est composée de quatre sous-unités baptisées ESCRT-0 à ESCRT-III impliquées dans divers mécanismes cellulaires essentiels et notamment dans la biogenèse des compartiments endosomaux appelés corps multivésiculaires. De ce fait, la machinerie ESCRT est impliquée dans le transport, le recyclage ou la dégradation de récepteurs membranaires ubiquitinylés et par conséquent le contrôle de leur activité et des voies de signalisations qui leurs sont associées. L’implication de cette machinerie dans la régulation du processus de myogenèse reste néanmoins à ce jour non explorée. Mon travail de thèse s’est justement intéressé à caractériser le rôle de cette machinerie dans le processus de différentiation des myoblastes en myotubes. Au cours de ces quatre années, je me suis plus particulièrement intéressé à la protéine HRS/HGS (Hepatocyte growth factor Regulated tyrosine kinase Substrate) de la sous unité ESCRT-0 et à son implication lors du processus de myogenèse. Nos données expérimentales ont montré que l’expression et la distribution cellulaire de la protéine HRS/HGS étaient dynamiques au cours de la myogenèse et que son inhibition bloquait drastiquement la différenciation des myoblastes en myotubes. La recherche des mécanismes moléculaires et cellulaires associés nous a permis de mettre en évidence que l’inhibition de son expression dans les myoblastes empêchait la dégradation du récepteur à l’EGF (pour Epidermal Growth Factor) et conduisait alors à l’activation constitutive de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK. Cette activation fut associée à une perturbation de la localisation et de l’expression de facteurs de transcription pro-myogéniques impliqués dans le processus de myogenèse. Nous avons également identifié que l’absence de HRS/HGS perturbait l’activité de la GSK3ß et participait à l’inhibition de ce processus. Enfin, nos résultats ont aussi montré que l’absence de cette protéine altérait négativement la voie autophagique indispensable au bon déroulement de la myogenèse. De façon collective, nos résultats montrent donc pour la première fois que la protéine HRS/HGS est un facteur central, multimodal et essentiel dans la régulation du processus de myogenèse.

Kidney cancer (Renal Cell Carcinoma, RCC) is the 6th most common cancer in adults in France. Familial RCC accounts for only 5% of cases, but their study has led to a better understanding of renal carcinogenesis and the development of new therapies. To date, a dozen predisposing genes have been discovered for RCC. However, for some families, the causal gene has not yet been identified. Therefore my project consisted in the search for new predisposing genes by exome sequencing analysis in 13 of these families. I detected mutations in several candidate genes and focused on the characterization of the NBR1 gene (Next to BRCA1). It encodes for an autophagy cargo receptor that participates in the renewal of cellular components. The studies conducted suggest that the mutation identified in NBR1 may alter its role in autophagy. However, further analyses are required to assess whether it is a new predisposing gene for familial RCC., Le cancer du rein (Renal Cell Carcinoma, RCC) est le 6ème cancer le plus fréquent chez l’adulte en France. Les RCC familiaux ne constituent que 5% des cas, mais leur étude a permis de mieux comprendre la carcinogenèse rénale et de développer de nouvelles thérapies. A ce jour, une dizaine de gènes de prédisposition aux RCC a été identifiée. Or, pour certaines familles, le gène en cause n’a pas été identifié. Mon projet consistait donc à rechercher des nouveaux gènes de prédisposition par l’analyse de séquençage d’exomes chez 13 de ces familles. J’ai détecté des mutations dans plusieurs gènes candidats et me suis focalisée sur la caractérisation du gène NBR1 (Next to BRCA1). Il code un récepteur cargo de l’autophagie qui participe au renouvellement des composants cellulaires. Les études menées suggèrent que la mutation identifiée dans NBR1 peut altérer son rôle dans l’autophagie. Cependant, des analyses complémentaires sont nécessaires afin d’évaluer s’il s’agit d’un nouveau gène de prédisposition aux RCC.

Humans are frequently exposed to bacterial genotoxins, colibactin and Cytolethal Distending Toxin (CDT), involved in digestive cancers. These toxins damage the DNA of host cells and constitute a predisposing factor for the development of cancer. Enterohepatic Helicobacters, such as Helicobacter hepaticus and Helicobacter pullorum, are associated with several intestinal and hepatic diseases. Their main virulence factor is CDT.We studied the mechanisms of action of CDT genotoxin in the activation of pro-cancerous processes and cell survival, using Helicobacter hepaticus infection, as a model. We demonstrated that the nuclear remodeling induced by Helicobacter CdtB active subunit of CDT involves MAFB oncoprotein overexpression which is subsequently associated with a strong nuclear and perinuclear localization of MAFB protein in CDT/CdtB-distended nuclei, and with the formation of large lamellipodia, corresponding to cellular extensions known to be involved in cell migration and arousal of metastases. We also showed that the nuclear remodeling induced by CDT/CdtB could be associated to the formation of transient rich-messenger ribonucleoprotein nucleoplasmic reticulum (NR). These genotoxin-induced dynamic structures may correspond to a privileged gateway for the synthesis of selected mRNA, preferentially transported from the nucleus, through pores and translated therein. CDT-induced NR may allow the cell to pause and repair DNA damage caused by bacterial genotoxins in order to maintain cell survival. Microarray-based identification of differentially-expressed genes pointed a CdtB regulation of autophagy. We showed that CdtB stimulated autophagic flux and enhanced pro-survival autophagy following CDT-induced DNA damage. CDT promoted the formation of cytoplasmic SQSTM1/P62 aggregates, sometimes deeply invaginated in distended nuclei, as well as SQSTM1/P62-positive extra-cellular like vesicles. NR formation following DNA damage induced by CDT is associated with the induction of autophagy, which plays a survival role in this context. SQSTM1/P62 have a key role in these effects.These findings offer new insights into the context of NR formation and cell survival in response to DNA damage, a common feature of many cancers, which not only appears in response to therapies-induced DNA damage, but also earlier in response to genotoxic bacteria.Further studies are required identify the cytosolic structures surrounded and engulfed by P62/SQSTM1 and to decipher the role of this cargo protein in the prosurvival of cells whose DNA is damaged, and more particularly its role in NR formation in light with its recently demonstrated RNA-binding protein function.The results of this thesis support the idea that bacterial genotoxins could cause cancer., L’homme est fréquemment exposé à des génotoxines bactériennes impliquées dans les cancers digestifs, comme la colibactine et la toxine CDT (Cytolethal Distending Toxin). Ces toxines endommagent l'ADN des cellules hôtes et constituent un facteur prédisposant au développement de cancers. Les Helicobacter entérohépatiques, tels que Helicobacter hepaticus et Helicobacter pullorum, sont associés à plusieurs maladies intestinales et hépatiques. Leur principal facteur de virulence est la toxine CDT. Nous avons étudié les mécanismes d'action de la génotoxine CDT dans l'activation des processus procancéreux et la survie cellulaire, en utilisant l'infection à Helicobacter hepaticus comme modèle. Nous avons démontré que le remodelage nucléaire induit par la sous-unité active CdtB de la CDT de Helicobacter implique la surexpression de l'oncoprotéine MAFB qui est ensuite associée à une forte localisation nucléaire et périnucléaire dans les noyaux distendus en réponse à la CDT/CdtB, ainsi qu’à la formation de gros lamellipodes, des extensions cellulaires connues pour être impliquées dans la migration cellulaire et la production de métastases. Nous avons également montré que le remodelage nucléaire induit par CDT/CdtB peut être associé à la formation de réticulum nucléoplasmique (NR) enrichi en particules ribonucléoprotéiques. Ces structures dynamiques et transitoires induites par la génotoxine pourraient correspondre à une passerelle privilégiée pour la synthèse d'ARNm sélectionnés, qui seraient préférentiellement transportés du noyau à travers les pores nucléaires et traduits à l'intérieur du NR. Le NR induit par la CDT (et aussi par la colibactine) pourrait permettre à la cellule de s'arrêter et de réparer les dommages à l'ADN causés par les génotoxines bactériennes afin de maintenir la survie cellulaire. L'identification à base de MicroArrays des gènes régulés par la CdtB a aussi montré une régulation de l'autophagie par cette toxine. Nous avons montré que la CdtB stimulait le flux autophagique et induisait une autophagie de survie suite aux dommages à l'ADN induits par la CDT/CdtB. Nous avons montré que la CDT/CdtB favorise la formation d'agrégats cytoplasmiques SQSTM1/P62 parfois profondément invaginés dans les noyaux distendus ainsi que des vésicules extra-cellulaires SQSTM1/P62-positives. La formation de NR suite aux dommages à l'ADN induits par la CDT est associée à l'induction de l'autophagie, qui joue un rôle de survie dans ce contexte. Les particules SQSTM1/P62 ont un rôle clé dans ces effets. Ces résultats offrent de nouvelles perspectives dans le contexte de la formation du NR et de la survie cellulaire en réponse aux dommages à l'ADN, une caractéristique commune à de nombreux cancers, qui apparaissent non seulement en réponse aux dommages à l'ADN induits par les thérapies mais aussi plus tôt en réponse aux bactéries génotoxiques. De nouvelles études sont nécessaires pour identifier les structures cytosoliques entourées et englouties par P62/SQSTM1 ainsi que pour déchiffrer le rôle de cette protéine cargo dans la survie des cellules dont l'ADN est endommagé et, plus particulièrement, son rôle dans la formation de NR à la lumière de sa fonction de protéine de liaison à l’ARN récemment démontrée. Les résultats issus de cette thèse confortent l’idée que les génotoxines bactériennes pourraient être à l’origine de cancers.

Immune system plays an important role in the control and destruction of cancer cells. The major effectors of antitumor immune response are Natural Killer (NK) cells and the cytotoxic T lymphocytes, which recognize et destroy tumor cells by exocytosis of perforin and granzymes contained in cytotoxic granules. It has been previously shown in the laboratory that the tumor suppressor p53 plays an important role in this apoptotic pathway. However more than 50% of human tumors have p53 inactivating mutations which favor tumor development. Consequently, frequent p53 inactivation in human tumor could enable them to escape from destruction by cytotoxic immune cells. In this context, my thesis work has shown that the pharmacological reactivation of wild type p53 function in cancer cells expressing a mutated p53 increased their susceptibility to NK cell-mediated apoptosis cells through the induction of an autophagic process. Moreover, I tried to determine the link between p53 mutations and the expression of the immune checkpoint ligand PD-L1 which prevent efficient activation of cytotoxic cells and promote immune cells exhaustion. My work suggests that the expression of p53 mutants promotes an the expression of PD-L1 at the cancer cell surface. The study of the underlying mechanisms is still in progress., Le système immunitaire joue un rôle important dans le contrôle et l'éradication du cancer. Des acteurs majeurs de la réponse immune antitumorale sont les cellules tueuses naturelles (ou cellules NK) et les lymphocytes T cytotoxiques (ou CTL), capable de reconnaitre et détruire des cellules tumorales par l’exocytose de perforine et de granzymes contenus dans leur granule cytotoxique. Il a été montré au sein du laboratoire l’implication de la protéine suppresseur de tumeur p53 dans cette voie apoptotique. Or, plus de 50% des tumeurs humaines présentent des mutations inactivatrices de p53 ce qui favorise le développement tumoral. De ce fait, l’inactivation fréquente de p53 dans les tumeurs humaines pourrait leur permettre d’échapper à la destruction par les CTL et les cellules NK.Dans ce contexte, mes travaux de thèse ont montré que la réactivation pharmacologique de la fonction de p53 sauvage dans des cellules tumorales exprimant une p53 mutée augmente leur susceptibilité à la lyse induite par les cellules NK grâce à l’induction d’un processus d’autophagie. De plus, j’ai cherché à déterminer le lien entre les mutations de p53 et l’expression à la surface des cellules tumorales de PD-L1 qui empêche l’activation optimale des cellules cytotoxiques et conduit à leur épuisement. Mes travaux actuels suggèrent que l’expression de p53 mutantes induits une surexpression de PD-L1 à la surface des cellules cancéreuses. Les mécanismes expliquant ce phénomène sont en cours d’études.

Autophagie ist ein stark regulierter Signalweg für den Abbau von Proteinen, Organellen und Mikroorganismen zur Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase. WIPI-Proteine dienen als Bindungsplattformen im Autophagie-Signalweg und können Phosphoinositide binden. WIPI4, ein Mitglied dieser Proteinfamilie, ist zunehmend ins Blickfeld der Wissenschaft gerückt, seit dessen Mutation in Verbindung mit Beta-Propeller-assoziierter Neurodegeneration (BPAN) gebracht wurde. Diese Arbeit befasst sich mit der Lokalisierung von WIPI4 bei der Inhibierung von Lysosomen, sowie durch Nährstoffmangel ausgelösten und mitochondrialen Stressbedingungen. Die Visualisierung des Proteins erfolgt durch U2OS-Zellen, die ein GFP-WIPI4-Fusionsprotein stabil exprimieren. Durch fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass WIPI4 in Methanolfixierung ER-ähnliche Strukturen aufweist und mit dem autophagosomalen Marker LC3 kolokalisiert. Inhibiert man den lysosomalen Abbau, lokalisiert WIPI4 am Rand der Lysosomen. Ein Makroautophagie analyse, durchgeführt in einer WIPI4-Knockout-Zelllinie zeigte, dass WIPI4 nicht essenziell für Autophagie ist. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass WIPI4 unter zunehmendem mitochondrialen Stress, stärker mit dem mitochondrialen Netzwerk kolokalisiert. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass WIPI4 an der Organisation des mitochondrialen Netzwerks sowie an der Regulation der Autophagie-Maschinerie beteiligt ist, obwohl das Protein keine wesentliche Rolle im Autophagie- Signalweg spielt. Autophagy is a highly conserved signalling pathway for the degradation of proteins, organelles and pathogens to maintain cellular homeostasis. Within this pathway mammalian WIPI proteins provide binding platforms for the autophagy machinery and share the capacity to bind phosphoinositides. Among this protein family, WIPI4 has become of increasing scientific interest since its mutations have been linked to beta-propeller associated neuro degeneration (BPAN). This thesis provides insight in the localization of WIPI4 under lysosomal inhibition, starvation and mitochondrial stress conditions in U2OS cells, stably expressing a GFP-WIPI4 fusion protein. Fluorescence microscopy imaging reviled, that the localization pattern of WIPI4 resembles ER-like structures under methanol fixation. WIPI4 colocalizes with autophagosomal marker LC3 and localizes to the rim of lysosomes when lysosomal degradation is blocked. Performing an assay for macroautophagy using WIPI4 knockout cells showed that WIPI4 is not essential for Autophagy. Additionally, increasing colocalization events of WIPI4 and the mitochondrial network could be shown in mitochondrial stress conditions. Altogether, these results indicate that WIPI4 is involved in mitochondrial network organization and contributes to the autophagy machinery, although it has no essential role in the autophagy pathway.

Autophagy is a process of self-digestion of intracellular material based on the formation of double membrane vesicles called autophagosomes that sequester organelles and macromolecules and then fuse with lysosomes to allow their degradation.The selective degradation of mitochondria by autophagy is named mitophagy. By eliminating superfluous or damaged mitochondria, that cause toxic and mutagenic oxidative stress, mitophagy contributes to the maintenance of cellular homeostasis. Its regulation involves signaling pathways such as the PINK1-PARKIN pathway and specific receptors called mitophagy receptors.The BAG6 protein is a co-chaperon of HSP70 and has a variety of functions such as regulation of apoptosis, epigenetic modifications, protein folding, and peptide removal by the ubiquitin-proteasome system. BAG6 is also essential for autophagy by regulating the intracellular localization of EP300 acetyltransferase responsible for ATGs protein acetylation.In this thesis, we showed that BAG6 is located in the mitochondria. More precisely, BAG6 is located in the mitochondrial matrix under basal conditions and then relocalizes in the outer membrane when the mitochondria are depolarized. In parallel, BAG6 promotes the recruitment of the mitochondrial fission complex DRP1 and the proteins PINK1 and PARKIN involved in mitophagic signalling, which gives it a pro-mitophagic effect. Finally, BAG6 also interacts with LC3 via a LIR domain (LC3 Interacting Region) and its effect on mitophagy depends on this interaction, making BAG6 a putative mitophagy receptor., L'autophagie est un processus d'autodigestion du matériel intracellulaire qui repose sur la formation de vésicules à double membrane nommées autophagosomes qui séquestrent les organites et macromolécules puis fusionnent avec les lysosomes pour permettre leur dégradation.La dégradation sélective des mitochondries par autophagie se nomme mitophagie. En éliminant les mitochondries superflues ou endommagées à l'origine d'un stress oxydant toxique et mutagène, elle contribue au maintien de l'homéostasie cellulaire. Sa régulation met en jeu des voies de signalisations telles que la voie PINK1-PARKIN et des récepteurs spécifiques appelés récepteurs de la mitophagie.La protéine BAG6 est une co-chaperonne des HSP70 et possède des fonctions variées telles la régulation de l'apoptose, les modifications épigénétiques, le repliement des protéines, ou encore l’élimination de peptides par le système ubiquitine-protéasome. BAG6 est également essentielle pour l’autophagie en régulant la localisation intracellulaire de l’acétyltranférase EP300 responsables de l’acétylation des protéines ATGs.Dans ce travail de thèse, nous montrons que BAG6 se localise dans la mitochondrie. Plus précisément, BAG6 est située dans la matrice mitochondriale en conditions basales puis se délocalise dans la membrane externe lorsque les mitochondries sont dépolarisées. En parallèle, BAG6 promeut le recrutement du complexe de fission mitochondrial DRP1 et des protéines PINK1 et PARKIN impliquées dans la signalisation mitophagique ce qui lui confère un effet pro-mitophagique. Enfin, BAG6 interagit également avec LC3 par l’intermédiaire d’un domaine LIR (LC3 Interacting Region) et son effet sur la mitophagie dépend de cette interaction, faisant de BAG6 un potentiel récepteur de la mitophagie.

Frontotemporal Dementia (FTD) and Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) are two neurodegenerative diseases from the same clinical, genetic and neuropathological spectrum. In order to identify a common biological pathway for FTD and ALS, we examined the microglial activation mechanisms in FTD and mixed forms of FTD-ALS. Murine models mimicking GRN and C9ORF72 loss of expression, genes that are mutated in familial forms of FTD and FTD-ALS (C9ORF72 only), develop immune phenotypes. Thus, this thesis was composed by two main lines of study: 1/ Is the TDP-43 protein, which is the main component of inclusions in FTD-ALS, capable of activating microglial cells? By which mechanisms? 2/ Does C9ORF72 and PGRN loss of function have consequences on microglial reactivity to TDP-43? Using in vitro models of primary microglial cultures, we show that TDP-43 activates the non-canonical NLRP3 inflammasome microglial pathways. This activation occurs following the interaction of TDP-43 with TLR2/4, and its internalization in microglial cells. C9orf72-/- and GrnR493X/R493X deficient murine microglial cells are hyper-reactive to TDP-43 stimulation. This effect was also observed in an "MDMi" model consisting in microglia-like cells derived from FTD patients’ monocytes. These patients are GRN or C9ORF72 mutation carriers. Finally, we show that this effect may depend on the functions of PGRN and C9ORF72 which appear essential to the dynamics of the inflammasome-autophagy negative feedback loop regulating the activity of the inflammasome. Our data highlight a common pathway of neuroinflammation in FTD and ALS and open new insights into the neurodegenerative processes of these diseases., Les démences frontotemporales (DFT) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA) sont deux maladies neurodégénératives faisant partie d'un même spectre clinique, génétique et neuropathologique. Afin d’identifier une voie biologique commune aux DFTs et SLA, nous nous sommes intéressés aux mécanismes d’activation microgliale. Deux axes d’étude principaux ont composé cette thèse : 1/ La protéine TDP-43, qui forme les inclusions majoritaires des DFT-SLA, est-elle capable d’activer les cellules microgliales ? Par quels mécanismes ? 2/ La perte de fonction des protéines C9ORF72 et PGRN a-t-elle des conséquences sur la réactivité microgliale en présence de TDP-43? Par l’utilisation de modèles in vitro de cultures primaires microgliales nous montrons que la protéine TDP-43 active la voie non canonique microgliale de l'inflammasome NLRP3. Celle-ci se produit suite à l’interaction de TDP-43 avec les récepteurs TLR2/4, et à son internalisation dans les cellules microgliales. Les cellules microgliales murines déficientes C9orf72-/- et GrnR493X/R493X sont hyper-réactives vis-à-vis d’une stimulation par TDP-43. Cet effet est reproduit dans un modèle « MDMi » de cellules microgliales dérivées de monocytes de patients DFT porteurs de mutation GRN ou C9ORF72. Enfin, nous montrons que cet effet peut être lié aux fonctions des protéines PGRN et C9ORF72 nécessaires au bon fonctionnement de la boucle de rétrocontrôle de l’activité de l’inflammasome par la voie autophagique. Nos données mettent en évidence une voie commune de neuroinflammation dans les DFTs et la SLA, et ouvrent de nouvelles pistes sur les processus neurodégénératifs de ces maladies.

Das Cholangiokarzinom beim Menschen zeigt ein aggressives Wachstum und ist weitgehend resistent gegen Chemotherapie und Bestrahlung. Die einzige kurative Therapiemöglichkeit ist die Resektion, wobei die Rezidivrate sehr hoch ist. Salinomycin ist ein Polyether-Antibiotikum, das in der Geflügelindustrie als Antikokzidium eingesetzt wird und eine Wirksamkeit gegen diverse solide und nicht-solide Tumorentitäten aufweist. Der zu Grunde liegende molekulare Wirkmechanismus ist noch weitestgehend unverstanden; eine Interferenz mit der Autophagie der Tumorzellen wird vermutet. Die Autophagie ist das dynamische Recyclingsystem der Zelle, das vor allem intrazelluläres Material abbaut. Das arbeitsleitende Ziel dieser Dissertation war es zum einen, Grundlagen zur Etablierung eines Cholangiokarzinom-Mausmodell zu schaffen, um die Wirksamkeit von Salinomycin in vivo analysieren zu können. Dafür wurden Versuche zur Proliferation, Migration, Invasion und Apoptoseinduktion nach Behandlung mit Salinomycin in den beiden murinen Cholangiokarzinomzelllinien p246 und p254 durchgeführt. Zum anderen sollte der Wirkmechanismus von Salinomycin in den humanen Cholangiokarzinomzelllinien TFK-1 und EGI-1 untersucht und dabei die Hypothese überprüft werden, ob Salinomycin einen Einfluss auf die Autophagieaktivität der Zellen hat. Dafür wurden die Methoden Western Blot, Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie, Polymerasekettenreaktion und WST-1 Assay verwendet. Salinomycin hemmte dosisabhängig die Proliferation, Migration, Invasion und induzierte die Apoptose in murinen Cholangiokarzinomzellen. In den humanen Cholangiokarzinomzellen hemmte Salinomycin die basale und die pharmakologisch aktivierte Autophagie. Dabei kam es in den Zellen zu einer Akkumulation dysfunktionaler Mitochondrien und reaktiver Sauerstoffverbindungen. Eine Vorbehandlung mit dem Antioxidans N-Acetylcystein verbesserte die Vitalität der Zellen nicht. Die Beeinflussung selektiver Autophagiegene (ATG) nach Behandlung mit Salinomycin war in den beiden humanen Cholangiokarzinomzelllinien unterschiedlich. In TFK-1 Zellen war die Expression einzelner ATG vermindert während bei EGI-1 Zellen eine erhöhte Expression einzelner Autophagiegene gemessen wurde. Diese Arbeit liefert Ergebnisse für die Etablierung eines Cholangiokarzinom-Mausmodells. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von humanen Cholangiokarzinomzellen mit Salinomycin zu einer Inhibition der Autophagie mit konsekutiver Akkumulation dysfunktionaler Mitochondrien und reaktiven Sauerstoffspezies und einer Beeinflussung der Autophagiegene führt.

International audience; Dans nos sociétés du spectacle, le corps est à la fois objet d’exhibition, de désir et de consommation. Les messages et injonctions sont envahis par un imaginaire du corps triomphant : il se doit d’être beau, fort, sain, puissant, flexible, tonique, sexy… Face à ce canon à images normatives, la littérature est peut-être l’espace où peut se déployer un contre-imaginaire du corps. Boulimie, mutilation, autodestruction, « consommation de soi » sont ainsi des images fréquentes dans les projections littéraires. Au sommet de cet imaginaire de la diminution de soi : l’autophagie, pulsion contradictoire par laquelle le corps se dévore lui-même. Ce sont ces gestes autodestructeurs que nous interrogeons dans l’écriture poétique et dramatique du mexicain Homero Aridjis (Contepec, Michoacán, 1940). Comment l’objet littéraire construit-il cet imaginaire du corps comme machine à se broyer lui-même ? Comment cette puissante image peut-elle aussi projeter métaphoriquement un certain état du monde au bord de l’effondrement ?

Natural products (NPs) occupy a broad diversity in bioactivity and therefore, serve as a comprehensive inspiration in drug discovery. Many design approaches for small molecule collections are based on NPs while aiming for extending nature’s chemical space to discover unexpected or novel bioactivities. Analogously, the pseudo-NP approach affords novel scaffolds by combining unrelated NP fragments in complexity-generating reactions. A collection of spirocyclic pseudo-NPs was generated via iso-oxa-Pictet-Spengler reaction, for which new conditions were developed. Cheminformatic analysis indicated the pseudo-NPs to cover chemical space sparsely represented by NPs, drugs and drug-like compounds and that they may combine favorable properties of these compound classes. Biological evaluation of indofulvins derived from 2-hydroxyethyl-indoles and the fragment-sized NP griseofulvin in different cell-based assays and the high content cell painting assay revealed them to define a new autophagy inhibitor chemotype that targets mitochondrial respiration. A new level of complexity and diversity was introduced by the dearomatization of indole-containing pseudo-NPs. The ɣ-pyrone annulation was optimized to yield structural diverse indolenines and indolines that show biological differences to their parent compounds in the cell painting assay. Morphological profiling was furthermore employed to identify relevant chemical structures for bioactivity to potentially guide future synthesis of small compound collections. These results suggest that the pseudo-NP concept in combination with the cell painting assay may be able to be used to rationally design new compound classes and therefore, further explore chemical space with biological relevance.

The main objective of this thesis was to continue the investigations carried out on the mechanisms underlying the development of foie gras in mule ducks. This process, known as hepatic steatosis and induced by overfeeding, needs to be further studied in order to contribute to overfeeding optimization.A kinetic study of the expression of genes related to hepatic steatosis, intermediate metabolism and cellular stress in mule ducks highlighted firstly the strong mobilization of carbohydrate and lipid metabolisms. Secondly a significant induction of the insulin / mTOR signalling pathway and the activation of various cellular protection mechanisms in hepatocytes were observed allowing them to fight against the increased intake of starch brought by the overfeeding. Among these are various protective mechanisms, autophagy has been the subject of extensive study in overfed ducks whose steatosis has been barely induced compared to non-overfed ducks. Autophagic flux measurements (LC3-II) showed that overfeeding induced inhibition of the autophagic process in mule ducks’ hepatocytes from the early stage of hepatic steatosis. This same study found that the mechanisms associated with cellular stress such as oxidative stress, endoplasmic reticulum stress or apoptosis did not occur early in the development of hepatic steatosis but much later. The same is true for the impact of overfeeding on mTOR signalling pathway.In addition, the kinetic study also revealed the significant induction of cholesterol metabolism correlated with the liver weight gain of ducks during overfeeding. These results aroused the interest of investigating plasma biomarkers for the development of hepatic steatosis related to cholesterol metabolism among microRNAs. Thus, duck's plasmatic miRNome was sequenced and it allowed to define the most differentially expressed microRNAs in the plasma of mule ducks but also to detect microRNAs (miR-122, miR-107 and mi-R194) as potential biomarkers that could be used for monitoring the development of fatty liver.All of this work contributes to the advancement of research on understanding the mechanisms of establishment of hepatic steatosis in mule ducks., L’objectif principal de cette thèse était de poursuivre les investigations menées sur les mécanismes sous-jacents au développement du foie gras chez le canard mulard. Ce processus appelé stéatose hépatique et induit par le gavage nécessite d’être davantage étudié afin de contribuer à l’optimisation du gavage. Une étude cinétique de l’expression des gènes en lien avec la stéatose hépatique, le métabolisme intermédiaire et le stress cellulaire chez le canard mulard a permis de mettre en évidence, outre la forte mobilisation des métabolismes glucidique et lipidique, une induction significative de la voie de signalisation de l’insuline mTOR et l’activation de mécanismes de protection cellulaire au sein des hépatocytes leur permettant de lutter contre l’apport accru d’amidon apporté par le gavage. Parmi ces différents mécanismes protecteurs, l’autophagie a fait l’objet d’une étude poussée chez des canards gavés dont la stéatose a été à peine induite comparés à des canards non gavés. Les mesures de flux autophagique (LC3-II) ont montré que le gavage induisait une inhibition du processus autophagique dans les hépatocytes de canards mulards dès la phase précoce du développement de la stéatose hépatique. Cette même étude a permis de constater que les mécanismes associés au stress cellulaires tels que le stress oxydant, le stress du réticulum endoplasmique ou encore l’apoptose ne se sont pas induits dès le début du développement de la stéatose hépatique mais bien plus tardivement. Il en est de même pour l’impact du gavage sur la voie mTOR. Par ailleurs, l’étude cinétique a également permis de mettre en évidence l’induction significative du métabolisme du cholestérol corrélé au gain de poids de foie des canards au cours du gavage. Ces résultats ont suscité l’intérêt de rechercher des biomarqueurs plasmatiques du développement de la stéatose hépatique en lien avec le métabolisme du cholestérol parmi les microARNs. Ainsi, le miRNome plasmatique du canard a été séquencé et a permis de définir les microARNs les plus différentiellement exprimés dans le plasma des canards mulards mais également de déceler des microARNs (miR-122, miR-107 et miR-194) candidats comme potentiels biomarqueurs utilisables pour le suivi du développement du foie gras.L’ensemble de ces travaux contribuent à l’avancée de la recherche sur la compréhension des mécanismes de l’établissement de la stéatose hépatique chez le canard mulard.

The main objective of this thesis was to continue the investigations carried out on the mechanisms underlying the development of foie gras in mule ducks. This process, known as hepatic steatosis and induced by overfeeding, needs to be further studied in order to contribute to overfeeding optimization.A kinetic study of the expression of genes related to hepatic steatosis, intermediate metabolism and cellular stress in mule ducks highlighted firstly the strong mobilization of carbohydrate and lipid metabolisms. Secondly a significant induction of the insulin / mTOR signalling pathway and the activation of various cellular protection mechanisms in hepatocytes were observed allowing them to fight against the increased intake of starch brought by the overfeeding. Among these are various protective mechanisms, autophagy has been the subject of extensive study in overfed ducks whose steatosis has been barely induced compared to non-overfed ducks. Autophagic flux measurements (LC3-II) showed that overfeeding induced inhibition of the autophagic process in mule ducks’ hepatocytes from the early stage of hepatic steatosis. This same study found that the mechanisms associated with cellular stress such as oxidative stress, endoplasmic reticulum stress or apoptosis did not occur early in the development of hepatic steatosis but much later. The same is true for the impact of overfeeding on mTOR signalling pathway.In addition, the kinetic study also revealed the significant induction of cholesterol metabolism correlated with the liver weight gain of ducks during overfeeding. These results aroused the interest of investigating plasma biomarkers for the development of hepatic steatosis related to cholesterol metabolism among microRNAs. Thus, duck's plasmatic miRNome was sequenced and it allowed to define the most differentially expressed microRNAs in the plasma of mule ducks but also to detect microRNAs (miR-122, miR-107 and mi-R194) as potential biomarkers that could be used for monitoring the development of fatty liver.All of this work contributes to the advancement of research on understanding the mechanisms of establishment of hepatic steatosis in mule ducks.; L’objectif principal de cette thèse était de poursuivre les investigations menées sur les mécanismes sous-jacents au développement du foie gras chez le canard mulard. Ce processus appelé stéatose hépatique et induit par le gavage nécessite d’être davantage étudié afin de contribuer à l’optimisation du gavage. Une étude cinétique de l’expression des gènes en lien avec la stéatose hépatique, le métabolisme intermédiaire et le stress cellulaire chez le canard mulard a permis de mettre en évidence, outre la forte mobilisation des métabolismes glucidique et lipidique, une induction significative de la voie de signalisation de l’insuline mTOR et l’activation de mécanismes de protection cellulaire au sein des hépatocytes leur permettant de lutter contre l’apport accru d’amidon apporté par le gavage. Parmi ces différents mécanismes protecteurs, l’autophagie a fait l’objet d’une étude poussée chez des canards gavés dont la stéatose a été à peine induite comparés à des canards non gavés. Les mesures de flux autophagique (LC3-II) ont montré que le gavage induisait une inhibition du processus autophagique dans les hépatocytes de canards mulards dès la phase précoce du développement de la stéatose hépatique. Cette même étude a permis de constater que les mécanismes associés au stress cellulaires tels que le stress oxydant, le stress du réticulum endoplasmique ou encore l’apoptose ne se sont pas induits dès le début du développement de la stéatose hépatique mais bien plus tardivement. Il en est de même pour l’impact du gavage sur la voie mTOR. Par ailleurs, l’étude cinétique a également permis de mettre en évidence l’induction significative du métabolisme du cholestérol corrélé au gain de poids de foie des canards au cours du gavage. Ces résultats ont suscité l’intérêt de rechercher des biomarqueurs plasmatiques du développement de la stéatose hépatique en lien avec le métabolisme du cholestérol parmi les microARNs. Ainsi, le miRNome plasmatique du canard a été séquencé et a permis de définir les microARNs les plus différentiellement exprimés dans le plasma des canards mulards mais également de déceler des microARNs (miR-122, miR-107 et miR-194) candidats comme potentiels biomarqueurs utilisables pour le suivi du développement du foie gras.L’ensemble de ces travaux contribuent à l’avancée de la recherche sur la compréhension des mécanismes de l’établissement de la stéatose hépatique chez le canard mulard.

Crohn’s disease (CD) is an inflammatory bowel disease with a multifactorial etiology, involving a complex interaction between environmental, genetic and microbial factors leading to a hyperactivation of the intestinal immune system and to an aberrant immune response. To date, no specific treatment is available and due to its disabling consequences, its chronic and recurrent nature and its increasing prevalence, CD represents a major public health problem. Our group and others have reported a high prevalence of pathogenic adherent-invasive Escherichia coli (AIEC) strains in the ileal mucosa of CD patients. Characterization of CD-associated AIEC strains revealed that these bacteria are able to cross the mucus intestinal layer, translocate through the epithelium across Peyer’s patches, destabilize the intestinal barrier function, colonize the gut and induce intestinal inflammation in genetically susceptible mouse models.Studies conducted in the laboratory showed that autophagy is a host key player for the elimination of intracellular AIEC and the control of intestinal inflammation induced by these bacteria. However, the autophagy receptor(s) targeting AIEC to autophagosomes and the underlying mechanism remain unknown.We recently reported that AIEC infection promotes the secretion of exosomes by infected cells, which are in turn uptaken by naïve cells, leading to increased pro-inflammatory response and impaired clearance of intracellular AIEC. The mechanisms underlying the effects of exosomes in recipient cells, however, remain unknown.This study aims at identifying (i) the molecular mechanism by which the exosomes increase AIEC intracellular replication in recipient cells and (ii) the autophagy receptor(s) involved in the targeting of AIEC to the autophagy machinery.The obtained results highlighted the transfer of specific miRNAs, mir-30c and miR-130a, from cell to cell via the exosomal shuttle to inhibit host autophagy response, thus favoring AIEC colonization. Moreover, although preliminary, our data showed that some autophagy receptors bind, on one hand, to AIEC bacteria, and on the other hand, to autophagic vesicles, allowing the recognition and thus, the degradation of bacteria by the autophagy machinery.Together, these studies will contribute to understand the interaction between the host and the pathogenic AIEC bacteria associated with CD, and will in the future help to better understand the pathogenesis of this disease to facilitate its diagnosis and treatment., La maladie de Crohn (MC) est une maladie inflammatoire chronique du tube digestif caractérisée par un état d’hyperactivation du système immunitaire intestinal. L’étiologie de cette maladie fait intervenir des facteurs environnementaux, génétiques et infectieux entraînant une réponse immunitaire aberrante. A ce jour, aucun traitement spécifique n’est disponible et de par ses conséquences invalidantes, sa nature chronique et récidivante et sa prévalence croissante, la MC représente un problème majeur de santé publique. Plusieurs groupes dont le nôtre ont rapporté une colonisation anormale de la muqueuse intestinale des patients atteints de MC par des bactéries Escherichia coli adhérentes et invasives dénommées AIEC. La caractérisation des bactéries AIEC a montré qu’elles sont capables de traverser la couche de mucus intestinal, de transloquer à travers l’épithélium au niveau des plaques de Peyer, de déstabiliser la fonction de barrière intestinale, de coloniser le tube digestif, de moduler le microbiote intestinal et d'induire une inflammation intestinale dans les modèles murins génétiquement prédisposés. Des études menées par le laboratoire ont montré que l’autophagie est un mécanisme clé de la défense de l’hôte pour l’élimination des bactéries AIEC intracellulaires et la diminution de l’inflammation intestinale induite par ces dernières. Cependant, le ou les récepteur(s) autophagique(s) impliqué(s) dans le ciblage des AIEC aux autophagosomes ainsi que le mécanisme sous-jacent restent à identifier. Il a été récemment montré au laboratoire que l’infection des cellules épithéliales intestinales par les bactéries AIEC induit la sécrétion d’exosomes capables d’activer les réponses immunes et d’augmenter la réplication intracellulaire des AIEC dans les cellules épithéliales intestinales et les macrophages receveurs. Cependant, les mécanismes sous-tendant les effets des exosomes dans les cellules réceptrices restent à identifier.Les travaux menés au cours de cette thèse visent à identifier (i) le mécanisme moléculaire par lequel les exosomes augmentent la réplication intracellulaire des AIEC dans les cellules réceptrices et (ii) le ou les récepteur(s) autophagique(s) mis en jeu dans le ciblage des AIEC à la machinerie autophagique. Les résultats obtenus ont permis de mettre en lumière le transfert de miARN spécifiques, les miR-30c et miR-130a, de cellules en cellules via les exosomes afin d’inhiber la réponse autophagique de l’hôte, favorisant ainsi la colonisation par les AIEC. De plus, bien que préliminaires, nos données ont montré que certains récepteurs autophagiques se lient d’une part aux AIEC et d’autre part aux vésicules autophagiques, permettant ainsi la reconnaissance et par conséquent la dégradation de ces bactéries par la machinerie autophagique.Ensemble, ces études contribueront à la compréhension des multiples aspects de l’interaction entre l’hôte et les bactéries AIEC pathogènes associées à MC et permettront à l'avenir de mieux comprendre la pathogenèse de cette maladie afin d’en faciliter le diagnostic et le traitement.

Lysosomal diseases caused by quantitative or qualitative hydrolase or transporter defect induce multiorgan features. Some specific symptomatic treatments are available but they do not cure patients. Pathophysiological bases of lysosomal disease are poorly understood and cannot be due to storage only. A better knowledge of these pathologies could improve their management. The first aim of this study was to apply “omics” strategies in mucopolysaccharidosis and in Fabry disease. This thesis allowed the implementation of an untargeted metabolomic methodology based on a multidimensional analytical strategy including high-resolution mass spectrometry coupled with ultra-high-performance liquid chromatography and ion mobility. Analysis of metabolic pathways showed a major remodeling of the amino acid metabolisms as well as oxidative stress via glutathione metabolism. In Fabry disease, changes were observed in expression of interleukin 7 and FGF2. The second study focused on modulation of autophagy in Fabry disease. In this work, we have shown a disruption of the autophagic process and a delay in enzyme targeting to the lysosome in Fabry disease. Autophagic inhibition reduced accumulation of accumulated substrate (Gb3) and improved the efficiency of enzyme replacement therapy. This work allowed a better knowledge of the physiopathological mechanisms implicated in lysosomal diseases and showed the complexity of lysosome. These data could ameliorate management of these disease and are associated with hope for patients., Les pathologies lysosomales sont des maladies liées au déficit quantitatif ou qualitatif d’une hydrolase ou d’un transporteur à l’origine d’une atteinte multiviscérale potentiellement sévère. Certaines de ces pathologies sont accessibles à des traitements mais ces thérapeutiques sont uniquement symptomatiques et ne guérissent pas les patients. Même si le phénomène de surcharge peut expliquer entre autres la symptomatologie observée, la physiopathologie de ces maladies est complexe et non précisément connue. Une meilleure connaissance de ces pathologies pourrait permettre d’améliorer leur prise en charge globale. L’objectif de ce travail était dans un premier temps d’appliquer des techniques « omiques » dans deux groupes de maladies : les mucopolysaccharidoses et la maladie de Fabry. Cette étude a permis la mise en place d’une méthodologie métabolomique non ciblée basée sur une stratégie analytique multidimensionnelle comportant la spectrométrie de masse à haute résolution couplée à la chromatographie liquide ultra-haute performance et la mobilité ionique. Dans les mucopolysaccharidoses, l’étude des voies métaboliques a mis en évidence des modifications dans le métabolisme de plusieurs acides aminés et du système oxydatif du glutathion. Dans la maladie de Fabry, des modifications ont été observées dans l’expression de l’interleukine 7 et du facteur de croissance FGF2. La deuxième partie du travail s’est intéressée à la modulation de l’autophagie dans la maladie de Fabry. Notre étude a montré une diminution du flux autophagique avec un retard d’adressage de l’enzyme au lysosome dans les cellules Fabry. L’inhibition de l’autophagie permet de diminuer l’accumulation du substrat accumulé (Gb3) et améliore l’efficacité de l’enzymothérapie substitutive. En conclusion ce travail a permis une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques des pathologies lysosomales et a montré la complexité du fonctionnement du lysosome. Ces données permettent d’espérer l’amélioration des stratégies thérapeutiques et diagnostiques dans ces maladies.

Lysosomal diseases caused by quantitative or qualitative hydrolase or transporter defect induce multiorgan features. Some specific symptomatic treatments are available but they do not cure patients. Pathophysiological bases of lysosomal disease are poorly understood and cannot be due to storage only. A better knowledge of these pathologies could improve their management. The first aim of this study was to apply “omics” strategies in mucopolysaccharidosis and in Fabry disease. This thesis allowed the implementation of an untargeted metabolomic methodology based on a multidimensional analytical strategy including high-resolution mass spectrometry coupled with ultra-high-performance liquid chromatography and ion mobility. Analysis of metabolic pathways showed a major remodeling of the amino acid metabolisms as well as oxidative stress via glutathione metabolism. In Fabry disease, changes were observed in expression of interleukin 7 and FGF2. The second study focused on modulation of autophagy in Fabry disease. In this work, we have shown a disruption of the autophagic process and a delay in enzyme targeting to the lysosome in Fabry disease. Autophagic inhibition reduced accumulation of accumulated substrate (Gb3) and improved the efficiency of enzyme replacement therapy. This work allowed a better knowledge of the physiopathological mechanisms implicated in lysosomal diseases and showed the complexity of lysosome. These data could ameliorate management of these disease and are associated with hope for patients.; Les pathologies lysosomales sont des maladies liées au déficit quantitatif ou qualitatif d’une hydrolase ou d’un transporteur à l’origine d’une atteinte multiviscérale potentiellement sévère. Certaines de ces pathologies sont accessibles à des traitements mais ces thérapeutiques sont uniquement symptomatiques et ne guérissent pas les patients. Même si le phénomène de surcharge peut expliquer entre autres la symptomatologie observée, la physiopathologie de ces maladies est complexe et non précisément connue. Une meilleure connaissance de ces pathologies pourrait permettre d’améliorer leur prise en charge globale. L’objectif de ce travail était dans un premier temps d’appliquer des techniques « omiques » dans deux groupes de maladies : les mucopolysaccharidoses et la maladie de Fabry. Cette étude a permis la mise en place d’une méthodologie métabolomique non ciblée basée sur une stratégie analytique multidimensionnelle comportant la spectrométrie de masse à haute résolution couplée à la chromatographie liquide ultra-haute performance et la mobilité ionique. Dans les mucopolysaccharidoses, l’étude des voies métaboliques a mis en évidence des modifications dans le métabolisme de plusieurs acides aminés et du système oxydatif du glutathion. Dans la maladie de Fabry, des modifications ont été observées dans l’expression de l’interleukine 7 et du facteur de croissance FGF2. La deuxième partie du travail s’est intéressée à la modulation de l’autophagie dans la maladie de Fabry. Notre étude a montré une diminution du flux autophagique avec un retard d’adressage de l’enzyme au lysosome dans les cellules Fabry. L’inhibition de l’autophagie permet de diminuer l’accumulation du substrat accumulé (Gb3) et améliore l’efficacité de l’enzymothérapie substitutive. En conclusion ce travail a permis une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques des pathologies lysosomales et a montré la complexité du fonctionnement du lysosome. Ces données permettent d’espérer l’amélioration des stratégies thérapeutiques et diagnostiques dans ces maladies.

Multiple system atrophy (MSA) is a rare, rapidly progressive neurodegenerative disease that affects numerous regions of the central nervous system, including the olivopontocerebellar and striatonigral systems as well as various autonomous nuclei of the brainstem. The pathological hallmark of MSA is the presence of oligodendroglial aggregates called glial cytoplasmic inclusions (GCI) whose main component is the protein ¦Á-synuclein. The neurodegenerative process leads to severe impairment of autonomic dysfunction, together with a varying degree of parkinsonian and cerebellar syndromes. There is currently no disease modifying therapy available. This PhD work focused, on the one hand, on preclinical approaches aiming to reduce the accumulation of ¦Á-synuclein in an animal model of MSA, and on the other hand, on a neuropathological analysis in patients with a slowly progressive subtype of the disease. Throughout the three years of work, we have assessed different therapeutic candidates in an animal model of MSA. Rapamycin, a drug known to enhance autophagy and protein clearance, showed only a partial neuroprotective effect against neural loss in our model. Nilotinib, a drug that had shown neuroprotective properties in a Parkinson¡¯s disease animal model, failed to modify the disease course in our study. Finally, we evaluated the combinations of two drugs that have already proven to reduce a-synuclein aggregation and protect neurons from degeneration, to assess whether they have synergistic properties.Keywords: Synuclein, Multiple system atrophy, glial cytoplasmic inclusions, post-mortem human brain study, rodent, translational approach, c-terminal truncation, phosphorylation, autophagy, protein aggregation, L'atrophie multisystematisée (AMS) est une maladie neurodégénérative rare et à évolution rapide qui affecte de nombreuses régions du système nerveux central, y compris les systèmes olivopontocérébelleux et striatonigral ainsi que divers noyaux autonomes du tronc cérébral. La caractéristique pathologique de l'AMS est la présence d'agrégats oligodendrogliaux appelés inclusions cytoplasmiques gliales dont le composant principal est la protéine a-synuclein. Le processus neurodégénératif conduit à une dysautonomie, ainsi qu'à un degré variable de syndromes parkinsoniens et cérébelleux. Il n'existe actuellement aucun traitement pour ralentir l'évolution de la maladie. Ce travail de thèse a porté, d'une part, sur des approches précliniques visant à réduire l'accumulation de l'a-synuclein dans un modèle de souris transgénique de l'AMS, et d'autre part, sur une analyse anatomo-pathologique chez des patients présentant une forme lentement progressive de la maladie. Tout au long de ces trois années de travail, nous avons évalué différents candidats thérapeutiques chez la souris transgénique de l'AMS. La rapamycine, un médicament connu pour stimuler l'autophagie et la clairance des protéines, n'a montré qu'un effet neuroprotecteur partiel contre la perte neurale dans notre modèle. Le nilotinib, un médicament qui avait démontré des propriétés neuroprotectrices dans un modèle rongeur de la maladie de Parkinson, n'a pas eu d'effet sur l'accumulation de l'a-synuclein et la neurodégénérescence. Enfin, nous avons évalué la combinaison de deux médicaments (anle138b et belnacasan) qui ont déjà démontré leur capacité à réduire l'agrégation de l'a-synucléine et à protéger les neurones de la dégénérescence, pour déterminer si elles ont des effets synergiques.

Multiple system atrophy (MSA) is a rare, rapidly progressive neurodegenerative disease that affects numerous regions of the central nervous system, including the olivopontocerebellar and striatonigral systems as well as various autonomous nuclei of the brainstem. The pathological hallmark of MSA is the presence of oligodendroglial aggregates called glial cytoplasmic inclusions (GCI) whose main component is the protein ¦Á-synuclein. The neurodegenerative process leads to severe impairment of autonomic dysfunction, together with a varying degree of parkinsonian and cerebellar syndromes. There is currently no disease modifying therapy available. This PhD work focused, on the one hand, on preclinical approaches aiming to reduce the accumulation of ¦Á-synuclein in an animal model of MSA, and on the other hand, on a neuropathological analysis in patients with a slowly progressive subtype of the disease. Throughout the three years of work, we have assessed different therapeutic candidates in an animal model of MSA. Rapamycin, a drug known to enhance autophagy and protein clearance, showed only a partial neuroprotective effect against neural loss in our model. Nilotinib, a drug that had shown neuroprotective properties in a Parkinson¡¯s disease animal model, failed to modify the disease course in our study. Finally, we evaluated the combinations of two drugs that have already proven to reduce a-synuclein aggregation and protect neurons from degeneration, to assess whether they have synergistic properties.Keywords: Synuclein, Multiple system atrophy, glial cytoplasmic inclusions, post-mortem human brain study, rodent, translational approach, c-terminal truncation, phosphorylation, autophagy, protein aggregation; L'atrophie multisystematisée (AMS) est une maladie neurodégénérative rare et à évolution rapide qui affecte de nombreuses régions du système nerveux central, y compris les systèmes olivopontocérébelleux et striatonigral ainsi que divers noyaux autonomes du tronc cérébral. La caractéristique pathologique de l'AMS est la présence d'agrégats oligodendrogliaux appelés inclusions cytoplasmiques gliales dont le composant principal est la protéine a-synuclein. Le processus neurodégénératif conduit à une dysautonomie, ainsi qu'à un degré variable de syndromes parkinsoniens et cérébelleux. Il n'existe actuellement aucun traitement pour ralentir l'évolution de la maladie. Ce travail de thèse a porté, d'une part, sur des approches précliniques visant à réduire l'accumulation de l'a-synuclein dans un modèle de souris transgénique de l'AMS, et d'autre part, sur une analyse anatomo-pathologique chez des patients présentant une forme lentement progressive de la maladie. Tout au long de ces trois années de travail, nous avons évalué différents candidats thérapeutiques chez la souris transgénique de l'AMS. La rapamycine, un médicament connu pour stimuler l'autophagie et la clairance des protéines, n'a montré qu'un effet neuroprotecteur partiel contre la perte neurale dans notre modèle. Le nilotinib, un médicament qui avait démontré des propriétés neuroprotectrices dans un modèle rongeur de la maladie de Parkinson, n'a pas eu d'effet sur l'accumulation de l'a-synuclein et la neurodégénérescence. Enfin, nous avons évalué la combinaison de deux médicaments (anle138b et belnacasan) qui ont déjà démontré leur capacité à réduire l'agrégation de l'a-synucléine et à protéger les neurones de la dégénérescence, pour déterminer si elles ont des effets synergiques.

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est l’une des principales causes de la perte de vision chez les personnes âgées. Dans la DMLA de forme sèche, le stress oxydatif, l’inflammation et la dysfonction lipidique causent la perte des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) qui sont essentielles au maintien des photorécepteurs. Nous avons précédemment démontré qu’un ligand sélectif du CD36 permet de préserver la fonction rétinienne dans un modèle murin de la DMLA. Cependant, l’effet des ligands synthétiques du CD36 dans la protection du RPE n’a jamais été vérifié. L’objectif de cette étude était de caractériser l’effet cytoprotecteur du ligand du CD36 MPE-001 sur le RPE contre le stress oxydatif. Le stress oxydatif a été induit chez la lignée humaine hTERT RPE-1 par le NaIO3. Il a été observé que le MPE-001 diminue la production de superoxydes mitochondriaux et l’apoptose des cellules du RPE sans toutefois affecter le système antioxydant au niveau transcriptionnel. Des essais par immunobuvardage et par immunocytochimie ont montré que le NaIO3 perturbe le flux autophagique, alors que le MPE-001 le rétablit. L’effet protecteur du MPE-001 était complètement aboli par les inhibiteurs de l’autophagie wortmannin et bafilomycine A1. En conclusion, nous avons démontré pour la première fois qu’un ligand du CD36 protège les cellules du RPE contre le stress oxydatif de façon autophagie-dépendante. Nous proposons la modulation du stress oxydatif chez le RPE par l’activation du CD36 comme stratégie potentielle pour traiter la DMLA de forme sèche., Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of irreversible blindness in the elderly population. The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of epithelial cells that are critical in maintaining retinal neurons. Oxidative stress, inflammation and defects in lipid clearance are thought to cause damages to the RPE and the eventual loss of photoreceptors in the dry form of AMD. CD36 is a scavenger receptor that plays an important role in inflammation and lipid homeostasis. We have previously shown that stimulation of CD36 by a selective ligand preserves photoreceptor function in high fat high cholesterol diet-fed Apoe-/- mice, a mouse model of AMD. The effect of CD36 ligands on RPE cells protection from oxidative insults, however, had yet to be investigated. In this study, we aimed to study the cytoprotective effect of the CD36 ligand MPE-001 in RPE cells exposed to oxidative stress. Oxidative stress was induced in the human RPE cell line hTERT RPE-1 using NaIO3. MPE-001 was observed to decrease NaIO3-induced mitochondrial superoxide production and apoptosis, with no transcriptional effect on antioxidant enzymes. Immunoblotting and immunostaining showed that NaIO3 disrupts autophagic flux while MPE-001 co-treatment restores it. The protective effect of MPE-001 was completely abolished by the autophagy inhibitors wortmannin and bafilomycin A1. In conclusion, we report for the first time that a CD36 ligand confers protection to RPE cells under oxidative stress through the improvement of autophagic process. We therefore propose modulation of oxidative stress by CD36 ligands as a potential strategy to treat dry AMD.

Autophagy is an essential catabolic process that degrades cytoplasmic components within the autolysosome therefore ensuring cell survival and homeostasis. A growing number of viruses including members of the Herpesviridae have been shown to manipulate autophagy to facilitate their persistency or to optimize their replication. Previous works have shown that Epstein-Barr virus (EBV), a human γ-herpesvirus, hijacked autophagy during the lytic cycle possibly to favor the formation of viral particles. However, the viral proteins that are responsible for EBV-mediated subversion of the autophagy are still to be characterized. Here we provide first evidences that EBV BALF0/1 open reading frame encodes for two proteins, namely BALF0 and BALF1, that are expressed during the early phase of the lytic cycle. BALF1 stimulates the autophagic flux which, in turn, was limited in the presence of BALF0. A putative LC3-interacting region (LIR) was identified that is required both for BALF1 to colocalize with autophagosomes as well as to stimulate autophagy. BHRF1, one of the well-characterized Bcl-2 homologs of EBV, has been described as an anti-apoptotic modulator in different experimental cell systems. In this thesis, it also shown that BHRF1 stimulates mitophagy, a process that prevents the initiation of the innate immune response mediated by mitochondrial pathways. Co-expression of both BHRF1 and BALF1 resulted in a slight blockage in the degradative step of autophagy. Finally, we demonstrated that the accumulation of BHRF1, BALF0 and BALF1 resulted from a complex interplay.; L'autophagie est un processus catabolique essentiel qui dégrade les composants cytoplasmiques assurant ainsi la survie des cellules et l'homéostasie. Un nombre croissant de virus comprenant des membres de la famille des Herpesviridae se sont avérés capable de manipuler l'autophagie pour faciliter leur persistance ou optimiser leur réplication. Des travaux antérieurs ont montré que le virus d'Epstein-Barr (EBV), un γ-herpesvirus oncogène humain, détournait l'autophagie au cours de la phase lytique de son cycle pour favoriser la formation de particules virales. Cependant, les protéines virales responsables de la manipulation des voies autophagiques restent à caractériser. Nous montrons ici que le cadre ouvert de lecture BALF0/1 code deux protéines, à savoir BALF0 et BALF1, qui sont exprimées au cours de la phase précoce du cycle lytique. BALF1 stimule le flux autophagique, une activité partiellement limitée par BALF0. Une région supposée d'interaction avec LC3 (LIR) a été identifiée, qui est nécessaire à la fois pour que BALF1 puisse se localiser avec les autophagosomes et pour stimuler l'autophagie. Nous avons aussi contribué à démontrer que BHRF1, un orthologue viral de Bcl-2 bien connu pour ses fonctions anti-apoptotiques, stimule la mitophagie, un processus qui empêche l'initiation de la réponse immunitaire innée médiée par les voies mitochondriales. Enfin, nous montrons que les protéines BALF0, BALF1 et BHRF1 sont au cœur d’un réseau de régulation complexe.

National audience; À travers la simulation d’atmosphères réalistes complexes, l’objectif principal du projet PolluHealth est d’évaluer les effets respiratoires, sur la descendance, d’une exposition maternelle à la pollution atmosphérique pendant la gestation. Notre étude originale vise à : 1.Générer et caractériser trois types d’atmosphères polluées complexes (Paris, Pékin et une ville méditerranéenne du futur) / 2.Évaluer les conséquences respiratoires de l’exposition de souris gestantes à ces trois types d’atmosphères sur leur descendance.

Leptospira interrogans are pathogenic spirochetes responsible for leptospirosis. Chronically infected rodents excrete bacteria in their urine contributing to the spread of the disease. Currently, there is no cross-protective vaccine for more than 400 leptospiral serovars. Innate immune cells such as macrophages quickly respond to microbes through pattern-recognition receptors (PRRs). PRRs recognize conserved microbial-associated molecular patterns (MAMPs) and trigger innate immune responses. For instance, NOD1 and NOD2 receptors sense peptidoglycan (PG) and activate anti-microbial responses, among them autophagy. Furthermore, PRR engagement can trigger the so-called innate immune memory or trained immunity (TI). It has been shown that leptospires escape some innate immune sensing and the role of macrophages during leptospirosis has not yet been clearly established. Previous results from our laboratory established that the LipL21 lipoprotein binds to the leptospiral PG, impairing NOD sensing. My contribution was to confirm the specific role of LipL21 on NOD escape using the heterologous host E. coli that also harbors Gram-negative meso-Dap type PG (Ratet, et al PLoS Pathog. 2017). Next we studied the consequences of NOD escape in macrophages. First, in vitro infections suggested that leptospires were internalized independently of actin polymerization and survive in murine and human macrophages for 48h. Also, leptospires did not trigger nor block autophagy in murine macrophages. In addition, infection selectively induced the accumulation of the autophagy adaptor p62. Moreover, the pharmacological triggering of autophagy on infected cells had a marked effect decreasing the viability of leptospires. Co-infection of leptospires with NOD agonists induced autophagy and p62 degradation. In addition, preliminary data suggest that leptospires do not induce autophagy in the mouse model and that it can be restored with NOD agonists. Finally, using CL429, a NOD2/TLR2 agonist, we demonstrated that TI protects from leptospiral infection (Santecchia et al., PLoS Pathog. 2019). This phenotype was independent of B- and T-cells and characterized by the enhanced pro-inflammatory response of peritoneal macrophages (PMs) and splenic NK-cells towards different pathogenic serovars of L. interrogans. In addition, CL429 influences bone marrow cells, enhancing the antibacterial response of bone marrow-derived macrophages (BMMs). Both PMs and BMMs showed enhanced bactericidal activity alongside more nitric oxide production that has not been previously associated with TI. Finally, ex vivo training with CL429 renders human monocytes more responsive to pathogenic leptospires. In conclusion, we showed that leptospires escape autophagy and that it can be partially restored using NOD agonists. Moreover, training of macrophages with NOD agonists enhance their response toward different pathogenic serovars. Both NOD-based strategies could be exploited for prophylaxis or vaccination.; Les bactéries Leptospira interrogans sont des spirochètes pathogènes responsables de la leptospirose. Les rongeurs chroniquement infectés excrètent les bactéries dans leur urine, contribuant ainsi à la propagation de la maladie. Il n'existe actuellement aucun vaccin qui puissent conférer une protection croisée pour les 400 sérovars identifiés de leptospires. Les cellules immunitaires innées telles que les macrophages répondent rapidement aux microbes par le biais de récepteurs (PRR). Les PRR reconnaissent les motifs moléculaires conservés associés aux microbes (MAMP) et déclenchent des réponses immunitaires innées. Par exemple, les récepteurs NOD1 et NOD2 détectent le peptidoglycane (PG) et activent les réponses antimicrobiennes, parmi lesquelles l'autophagie. De plus, l'engagement des PRR peut déclencher une réponse mémoire immunitaire innée ou immunité entraînée (IE). Il a été démontré que les leptospires échappent à certaines réponses immunitaires innées. Le rôle des macrophages au cours de la leptospirose n'a pas encore été clairement établi. Les résultats antérieurs de notre laboratoire ont établi que la lipoprotéine LipL21 se lie au PG des leptospires, altérant la détection par les protéines NOD. Ma contribution a consisté à confirmer le rôle spécifique de la LipL21 sur l'évasion des NOD, en utilisant un système hétérologue d'expression chez E. coli, une bactérie à Gram négatif qui possède également un PG de type méso-Dap (Ratet, Santecchia et al. PLoS Pathog. 2017). Nous avons ensuite étudié les conséquences de l'échappement aux NOD dans les macrophages. Premièrement, des infections in vitro ont suggéré que les leptospires étaient internalisés indépendamment de la polymérisation de l'actine et survivaient dans les macrophages murins et humains pendant 48h. De plus, les leptospires ne déclenchent ni ne bloquent l'autophagie chez les macrophages murins. En outre, l'infection a induit sélectivement l'accumulation de l'adaptateur d'autophagie p62. De plus, le déclenchement pharmacologique de l'autophagie dans les cellules infectées a montré un effet marqué diminuant la viabilité des leptospires. La co-infection de leptospires avec des agonistes des NOD a induit l'autophagie et une dégradation de p62. De plus, des données préliminaires suggèrent que les leptospires ne provoquent pas d'autophagie dans le modèle murin et que l'autophagie au cours de l'infection par les leptospires peut être restaurée avec des agonistes des NOD. Enfin, en utilisant CL429, un agoniste de NOD2 / TLR2, nous avons démontré que l'IE protège de l'infection par les leptospires. Ce phénotype est indépendant des cellules B et T et est caractérisé par une réponse pro-inflammatoire accrue des macrophages péritonéaux et des cellules NK spléniques vis-à-vis de différents sérovars pathogènes de L. interrogans. En outre, le CL429 influence les cellules de la moelle osseuse, renforçant la réponse antibactérienne des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMM). Les PM et les BMM ont montré une activité bactéricide accrue parallèlement à une production accrue d'oxyde nitrique qui n'a jamais été associée auparavant à l'IE. Enfin, un entraînement ex vivo avec CL429 a également rendu les monocytes humains plus sensibles aux leptospires pathogènes (Santecchia et al., PLoS Pathog. 2019, in press). En conclusion, nous avons montré que les leptospires échappent à l'autophagie, qui peut être partiellement restaurée à l'aide d'agonistes des NOD. De plus, la stimulation de macrophages avec des agonistes des NOD améliore leur réponse à différents sérovars pathogènes. Ces deux stratégies basées sur l'utilisation des agonistes des NOD pourraient être exploitées pour la prophylaxie ou la vaccination contre L. interrogans.

International audience; Methionine (Met) is an essential amino acid (AA) in pigs and the third limiting AA in cereal based diets. Met supplementation improves animal’s performance and protein gain. Besides, Met is considered as an important factor in the control of oxidative status with potential benefits on health and meat quality. This study aimed at investigating the effects of dietary Met provided in excess relative to growth requirements on muscle metabolism in finishing pigs. During the last 14 days before slaughter, crossbred pigs were individually fed diets (13.6% protein, 5.8% fat, 10.8 MJ/kg Net energy, 0.73% Lys) supplemented (Met++) or not (CONT) with OH-Met (n=15 pigs/diet). Dietary Met content was 0.22% and 1.1% in CONT and Met++ diets, respectively. Growth rate, carcass lean meat content and Longissimus muscle (LM) weight at slaughter did not differ between the two groups. In LM, the free AA profile was modified (P