Search

152 p.-39 fig.-7 tab.-Material suplementario-películas., El trabajo descrito en esta Tesis Doctoral ha dado lugar a las siguientes aportaciones: A) Sobre el prionoide RepA-WH1(A31V) en E. coli • La proteína RepA-WH1(A31V), que había sido previamente caracterizada in vitro, tiene naturaleza de prionoide en E. coli: - La proteína WH1(A31V) agrega formando inclusiones amiloides. - Los agregados son heredados de célula madre a hija verticalmente, a modo de pequeñas partículas transmisibles. Los propagones heredados reclutan precursores solubles y se multiplican por fragmentación. - Las proteínas amiloides no son capaces de transferirse de célula a célula (horizontalmente) por lo que no son infectivas. • Los agregados de RepA-WH1 generan una proteinopatía en E. coli, ya que provocan que el tiempo de generación en la división bacteriana se multiplique hasta por cinco veces. Hasta la fecha no se conoce una tasa tan alta de toxicidad para un agregado intracelular bacteriano. • Si se observa la dinámica del agregado RepA-WH1(A31V) durante generaciones mediante microfluídica, se aprecia la generación de dos estirpes del prionoide (globular y elongada), que se mantienen de manera estable y generan un fenotipo característico en la proliferación celular. Además tales variantes pueden interconvertirse. - La forma diferente de los agregados (elongados frente a globulares), su alta proteotoxicidad y baja colocalización con IbpA, diferencian claramente al prionoide RepA-WH1(A31V) de los cuerpos de inclusión convencionales. - Tal y como se había descrito in vitro, la secuencia efectora de ADN (opsp) es capaz de promover la agregación amiloide de WH1(A31V) en E. coli, permitiendo desarrollar un dispositivo amiloidogénico modulable. - La chaperona molecular Hsp70 (DnaK) desempeña un papel esencial en la generación de las partículas amiloides pues tanto su inhibición como su sobreexpresión alteran la dinámica del prionoide RepA-WH1(A31V). - Hsp104 (ClpB) no parece participar en la propagación de RepA-WH1(A31V). B) Sobre el prion sintético [REP-PSI+] en S. cerevisiae • Las quimeras Sup35_WH1 en S. cerevisiae se comportan como módulos ortogonales: • Siempre que incluyan al menos dos repeticiones del péptido amiloidogénico, generan en S. cerevisiae priones [REP-PSI+] que son plenamente funcionales en ensayos estándar de amiloidosis. • Tal y como se observa para el prionoide en E. coli con respecto a ClpB, la propagación de los priones [REP-PSI+] es independiente de la chaperona Hsp104, cuyo papel podría estar desempeñado por la familia Hsp70. • El prionoide mínimo sintético RepA-WH1(A31V) ilustra cuestiones clave de la biología de los amiloides, siendo por lo tanto un sistema óptimo para abordar un programa de Biología Sintética bottom-up con claras implicaciones biotecnológicas: diseñar y construir dispositivos que ensamblados en módulos autónomos sirvan como herramientas útiles para dotar a los microorganismos con funciones nuevas o mejoradas.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa de demencia más frecuente en la población anciana, representando entre un 50 % y 80 % del total de las demencias. Se caracteriza por déficit cognitivo asociado a la muerte neuronal. A nivel molecular se encuentran agregados del Péptido β-amiloide (PBA), tanto en sinapsis como intracelularmente. Se ha reportado que PBA puede ser capturado por los astrocitos e interactuar con la enzima glutamina sintetasa, aunque el detalle de dicha interacción no se conoce. Este trabajo busco identificar la interacción de la glutamina sintetasa y el PBA. Para ello, se purifico la enzima proveniente de cerebro de rata y posteriormente se incubó con diferentes fragmentos del PBA, evaluándose la capacidad de formación de agregados con la enzima. Adicionalmente se evaluó dicha interacción en cultivo primario de astrocitos de rata. Los resultados en conjunto muestran que PBA interactúa con la enzima, posiblemente utilizando como secuencia blanco la correspondiente a PBA 25-35. En las células se identificaron cambios morfológicos correlacionables con astrogliosis temprana producto del tratamiento con los PBA / Abstract. Alzheimer's disease (AD) is the most common cause of dementia in the elderly population, accounting for between 50% and 80% of all dementias. It is characterized by cognitive deficits associated with neuronal death. At the molecular level are aggregates of β-amyloid peptide (PBA), both synapses and intracellularly. PBA has been reported that can be captured by astrocytes and interact with the enzyme glutamine synthetase, although the details of this interaction is not known. This paper sought to identify the interaction of glutamine synthetase and the PBA. To this end, the enzyme was purified from rat brain and then incubated with different fragments of the PBA, evaluating the ability to form aggregates with the enzyme. This interaction was also evaluated in primary cultures of rat astrocytes. The overall results show that PBA interacts with the enzyme, possibly used as a target sequence corresponding to PBA 25-35. Cells were identified in the morphological changes correlated with early astrogliosis proceeds of treatment with PBA. Doctorado

Introduction: Many publications consider that the Alzheimer's disease (AD) is exclusive to the human species, and that no other animal species suffers from the disease. However, various studies have shown that some species can present with some of the defining characteristics of the disease in humans, both in the neuropathological changes and cognitive–behavioural symptoms. Development: In this work, the results, published (PubMed) on the senile brain changes in non-human primates of different degrees of evolution, are reviewed. The neuropathological changes associated with the accumulation of amyloid or highly phosphorylated tau protein are rare outside the primate order, but in all the sub-orders, families, genera and species of non-human primates that have been studied, some senile individuals have shown amyloid accumulation in the brain. Even in some species the presence of these deposits in senility is constant. Changes related to the accumulation of tau protein, are always of very little significance, and have been detected only in some non-human primate species, both little evolved and highly evolved. In different species of non-human primates, some types of cognitive–behavioural changes are present in some senile individuals with greater intensity when compared with both normal adult individuals and other senile individuals of the species. The importance of the determination of the longevity of the species in different habitats (natural habitats, new habitats, semi-liberty, captivity) is stressed in these studies. Conclusions: Morphological and histochemical and cognitive–behavioural features similar to those observed in normal aged man are present in senile non-human primates. Moreover, other characteristics of the non-human primates could be indicative of a pathological “Alzheimer type” ageing. Resumen: Introducción: En muchas publicaciones se considera que la Enfermedad de Alzheimer (EA) es privativa de la especie humana, y que ninguna otra especie animal padece dicha enfermedad. Sin embargo, diversos estudios han mostrado que existen en algunas especies algunas de las características definitorias de la enfermedad en el hombre, tanto en el aspecto neuropatológico como en el cognoscitivo-comportamental. Desarrollo: En este trabajo se recogen los resultados mostrados en la bibliografía (PubMed) sobre alteraciones cerebrales en la senilidad en primates no humanos de diferente grado de evolución. Las alteraciones neuropatológicas relacionadas con la acumulación de amiloide o de proteína tau altamente fosforilada son muy raras fuera del orden primate, pero en todos los subórdenes, las familias, géneros y especies de primates que se han estudiado han mostrado que algunos individuos seniles presentan acumulaciones amiloideas en el cerebro. Incluso en algunas especies la presencia de acumulaciones amiloideas en la senilidad es constante. Las alteraciones neuropatológicas relacionadas con la acumulación de proteína tau, siempre de muy escasa relevancia, se han detectado solo en algunas especies de primates no humanos, tanto poco evolucionados como muy evolucionados. En diferentes especies de primates no humanos, algunos tipos de alteraciones cognoscitivo-comportamentales están presentes en algunos individuos seniles con una mayor intensidad tanto frente a los individuos adultos normales como a otros individuos seniles de la especie. Se analiza además la importancia de la determinación de la longevidad de las especies en los diferentes habitats (habitats naturales, nuevos habitats, semilibertad, cautiverio) para acreditar la condición de “senil” de los individuos en estudio. Conclusiones: Existen características morfohistoquímicas y cognoscitivo-comportamentales involutivas generales en los primates no humanos seniles similares a las observadas en el hombre anciano, y otras características que pudieran ser indicio de un envejecimiento patológico “tipo Alzheimer”. Keywords: Alzheimer's disease, Non-human primates, Ageing, Senility, Amyloid, Tau protein, Cognitive functions behaviour, Palabras clave: Enfermedad de Alzheimer, Primates no humanos, Envejecimiento, Senilidad, Amiloide, Proteína tau, Alteraciones cognoscitivo-comportamentales

CONTEXT: Primary amyloidosis, also known as AL amyloidosis, is commonly caused by clonal expansion of plasma cells in the bone marrow, thereby segregating light chains of clonal immunoglobulin that settle in tissues in the form of insoluble amyloid fibrils. The aim of this study was to report a case of primary amyloidosis with renal failure, diagnosed in Hospital São João, Porto, Portugal, focusing on the diagnostic difficulties and presenting a literature review. CASE REPORT: A 68-year-old Caucasian man was admitted to the Internal Medicine Department of the hospital with a condition of anasarca and nephrotic syndrome. After performing a renal biopsy that tested positive using Congo red and immunohistochemistry, lambda light chain amyloidosis was diagnosed. This evolved into terminal renal disease, which led to hemodialysis and several episodes of urinary and catheter infections. He was started on chemotherapy, consisting of bortezomib 0.7 mg/m² and dexamethasone 40 mg in six cycles. This led to clinical improvement, stabilization of the illness and good tolerance of the treatment. CONCLUSION: Amyloidosis is a rare entity that is difficult to diagnose. This is because of the unspecific early clinical manifestations of the disease. The hypothesis of amyloidosis is only considered when specific organ failure occurs. This case consisted of primary amyloidosis with involvement of the kidneys as an initial presentation of the disease and its difficulties were shown, going from the clinical approach to the final diagnosis. CONTEXTO: A amiloidose primária, também conhecida como amiloidose AL, é geralmente causada pela expansão clonal de plasmócitos na medula óssea que segregam cadeias leves de imunoglobulina clonal, as quais se depositam nos tecidos na forma de fibrilas amiloides insolúveis. O objetivo deste estudo é relatar um caso de amiloidose primária com acometimento renal diagnosticado no Hospital São João, Porto, Portugal, enfatizando as dificuldades do diagnóstico e apresentando uma revisão da literatura. RELATO DO CASO: Homem de 68 anos, branco, foi admitido no Serviço de Medicina Interna do hospital com quadro de anasarca e síndrome nefrótica. Após realizar biópsia renal, que foi positiva para o vermelho congo e imunoistoquímica, foi diagnosticada amiloidose de cadeia leve lambda. Evoluiu para doença renal terminal, o que levou a hemodiálise e tendo vários episódios de infecções urinárias e do cateter. Iniciou a quimioterapia com bortezimib, 0,7 mg/m², e dexametasona, 40 mg em seis ciclos, levando a uma melhoria clínica, a estabilização da doença e boa tolerância ao tratamento. CONCLUSÃO: Amiloidose consiste em uma entidade rara e de difícil diagnóstico. Isso ocorre devido a manifestações clínicas da doença pouco específicas, e esta hipótese só é considerada quando do acometimento de um órgão em particular. O caso em questão refere-se a uma apresentação da amiloidose primária com envolvimento renal, como apresentação clínica inicial da doença, e as dificuldades desde a abordagem clínica até o diagnóstico final.

[ES] Esta tesis tiene como objetivo evaluar los efectos del péptido Beta Amiloide 25-35 sobre la actividad sináptica septohipocampal fimbria/CA3 y las propiedades biofísicas de las neuronas piramidales de la región CA3 del hipocampo. Además también pretende caracterizar las propiedades electrofisiológicas de las neuronas piramidales de la región CA3, caracterizar la respuesta sináptica en el complejo fimbria -CA3 del hipocampo, evaluar los efectos del péptido Beta Amiloide (25-35) sobre la excitabilidad, resistencia interna y potencial de acción en las células piramidales de CA3, evaluar los efectos del péptido Beta Amiloide (25 -35) sobre la actividad sináptica del complejo fimbria -CA3 del hipocampo y determinar alguno de los posibles mecanismos de acción implicados en el proceso de disfunción sináptica generada por la aplicación del Beta Amiloide (25-35) sobre la actividad del hipocampo., [EN] This thesis aims to evaluate the effects of beta amyloid peptide 25-35 on the synaptic activity septohippocampal fimbria/CA3 and biophysical properties of pyramidal neurons in the hippocampus CA3 region. In addition also aims to characterize the electrophysiological properties of pyramidal neurons of the CA3 region, characterize the synaptic response in the complex fimbria-CA3 of the hippocampus, to evaluate the effects of amyloid beta peptide (25-35) on the excitability, internal resistance and potential action on CA3 pyramidal cells, evaluate the effects of amyloid beta peptide (25 -35) on the complex synaptic activity fimbria-CA3 of the hippocampus and determine any of the possible mechanisms involved in the process of synaptic dysfunction caused by the application of Beta Amyloid (25-35) on the activity of the hippocampus.

El interés en el estudio del proceso de envejecimiento cerebral y los cambios comportamentales relacionados con la edad en caninos y felinos geriátricos ha aumentado en la última década (Mentzel, 2005a; Ingram & Williams, 2010). Las alteraciones del comportamiento canino que responden a cambios fisiopatológicos relacionados con la edad y que involucran distintas esferas conductuales y cognitivas, se engloban bajo la denominación de Síndrome de Disfunción Cognoscitiva (SDC) (Mentzel, 2005b). El cual fue descrito en 1997 y se observó en perros de más de 9 años (Ingram & Williams). El Síndrome de Disfunción Cognoscitivo (SDC) es también llamado Alzheimer canino por las similitudes histopatológicas cerebrales y conductuales relacionadas. En el presente estudio, los caninos geriátricos presentaron los mismos depósitos proteicos anormales presentes en la enfermedad de Alzheimer, como las placas seniles, los cuerpos ubiquitinados y la angiopatía amiloide, pero no presentaron los ovillos neurofibrilares, los cuales son los responsables de la demencia que se padece en la enfermedad. Las únicas herramientas de evaluación prácticas en clínica para esta patología son las encuestas y formularios relacionados con aspectos comportamentales. Además existen exámenes diagnósticos postmortem que permiten identificar de una manera eficaz la presencia de elementos anormales involucrados en la neuropatología, uno de ellos es la inmunohistoquímica. En este estudio se utilizaron los anticuerpos monoclonales de uso humano anti-b-amiloide, anti-proteína tau y anti-ubiquitina en muestras de cerebros de perros mayores de 10 años. El modelo canino hoy en día está constituyendo un significado indispensable para el estudio de los procesos de neurodegeneración porque ha permitido un acercamiento a la teoría del problema desde nuevas perspectivas (Dimakopoulos & Mayer, 2002). The interest in the study of the process of cerebral aging and the changes in the behaviour related to age in geriatric canine and feline has increased in the last decade (Mentzel, 2005a; Ingram & Williams, 2010). The alterations of the canine behaviour that respond to physiopathological changes related to the age and which involve different conducts and cognitive spheres are included under the denomination of Canine Cognitive Dysfunction Syndrome (CDS) called canine Alzheimer, considering the cerebral and histopathologic behavioural similarities. In the present study the geriatric patients displayed the same abnormal protein deposits present in Alzheimer disease, such as senile plaques ubiquitinate bodies and the amyloid angiopathy. However they did not display the balls of neurofibrillary tangles which are characteristic of the disease. The only practical tools of evaluation in clinic for this pathology are the surveys and forms related to behavioural aspects. In addition there are post mortem exams such as those in inmunohistochemistry, that allow an effective identification of abnormal elements present in the neuropathology. In this study the monoclonal antibodies were used anti-b-amyloid, anti-protein tau and anti-ubiquitin in samples of brains in dogs over 10 years of age. The canine model constitutes an indispensable meaning for the study of the neurodegeneration processes because it has allowed an approach to the theory of the problem from a new perspective (Dimakopoulos & Mayer, 2002).

S'ha desenvolupat una nova estratègia per la síntesi ràpida i eficient de L-[metil-11C]metionina basada en el captive solvent method. La reacció de L-homocisteína (dissolució bàsica en aigua/etanol 1:1) amb [11C]CH3I en un loop de HPLC va permetre la formació del radiotraçador desitjat amb elevat rendiment radioquímic (38.4 ± 4.1%) en un temps curt (< 12 min). Tots el paràmetres analítics compleixen les especificacions requerides per la versió actual de la Farmacopea Espanyola, tot i que els valors d'activitat específica obtinguts van ser relativament baixos. Degut a això, es van estudiar i quantificar les principals fonts que contribueixen a la contaminació de carboni-12 durant les síntesis de [11C]CH3I efectuades segons el "wet" method. Es va observar que la principal font de contaminació de CO2 no radioactiu (contribució>90%) és el propi procés de bombardeig, probablement degut a la combustió (causada per les altes temperatures i pressions assolides durant la irradiació) dels compostos que contenen carboni i que es troben al gas irradiat (o a l'interior del blanc). Es van establir procediments generals per realitzar abans, durant i després de la radiosíntesi per prevenir la contaminació exterior i, d'aquesta manera, augmentar l'activitat específica dels radiotraçadors sintetitzats.En quant al marcatge amb nitrogen-13, s'ha desenvolupat un procés totalment automàtic per a la producció de [13N]NO2- a partir de [13N]NO3- generat en el ciclotró. El precursor radioactiu [13N]NO2- s'ha utilitzat per la radiosíntesi de compostos amb interès biològic com ara S-nitrosotiols (donadors de NO.), N-nitrosamines (molècules amb potencials efectes carcinogènics) i azo compostos (amb possible aplicació com a radiotraçadors per a la detecció in vivo de plaques de β-amiloide). En tots els casos es van obtenir excel·lents conversions radioquímiques (48.7% - 74.5% per S-[13N]nitrosotiols, 45.6% - 53.4% per N-[13N]nitrosamines i 40.0% - 58.3% per 13N-azo compostos) i bons rendiments radioquímics (33.8% - 60.6% per S-[13N]nitrosotiols, 34.0% - 37.8% per N-[13N]nitrosamines i 20.4% - 47.2% per 13N-azo compostos). A més a més, s'ha dissenyat i implementat un mòdul automàtic amb control remot pel marcatge de molècules amb 13N., Se ha desarrollado una nueva estrategia para la síntesis rápida y eficiente de L-[metil-11C]metionina basada en el captive solvent method. La reacción de L-homocisteína (disolución básica en agua/etanol 1:1) con [11C]CH3I en un loop de HPLC permitió la formación del radiotrazador deseado con elevado rendimiento radioquímico (38.4 ± 4.1%) en un tiempo corto (< 12 min). Todos los parámetros analíticos cumplían las especificaciones requeridas por la versión actual de la Farmacopea Española, aunque los valores de actividad específica obtenidos fueron relativamente bajos. Por ello, se estudiaron y cuantificaron las principales fuentes que contribuyen a la contaminación de carbono-12 durante las síntesis de [11C]CH3I efectuadas según el "wet" method. Se observó que la principal fuente de contaminación de CO2 no radiactivo (contribución>90%) es el propio proceso de bombardeo, probablemente debido a la combustión (causada por las altas temperaturas y presiones alcanzadas durante la irradiación) de los compuestos que contienen carbono y que se encuentran presentes en el gas irradiado (o en el mismo cuerpo del blanco). Se establecieron procedimientos generales para realizar antes, durante y con posterioridad a la radiosíntesis para prevenir la contaminación exterior y, de esta manera, aumentar la actividad específica de los radiotrazadores sintetizados.Respecto al marcaje con nitrógeno-13, se ha desarrollado un proceso totalmente automático para la producción de [13N]NO2- a partir del [13N]NO3- generado en el ciclotrón. El precursor radiactivo [13N]NO2- se ha utilizado para la radiosíntesis de compuestos con interés biológico tales como S-nitrosotioles (donadores de NO.), N-nitrosaminas (moléculas con potenciales efectos carcinogénicos) y azo compuestos (con posible aplicación como radiotrazadores para la detección in vivo de placas de β-amiloide). En todos los casos se obtuvieron excelentes conversiones radioquímicas (48.7% - 74.5% para S-[13N]nitrosotioles, 45.6% - 53.4% para N-[13N]nitrosaminas y 40.0% - 58.3% para 13N-azo compuestos) y buenos rendimientos radioquímicos (33.8% - 60.6% para S-[13N]nitrosotioles, 34.0% - 37.8% para N-[13N]nitrosaminas y 20.4% - 47.2% para 13N-azo compuestos). Además, se ha diseñado e implementado un módulo automático con control remoto para el marcaje de moléculas con 13N., A new strategy for the fast and efficient synthesis of L-[methyl-11C]methionine based on the captive solvent method has been developed. The in loop reaction of a basic water/ethanol 1:1 solution of L-homocysteine with [11C]CH3I led to the formation of the desired radiotracer with high radiochemical yield (38.4 ± 4.1%) in short production time (< 12 min). All analytical parameters were within the specifications of the current version of the Spanish Pharmacopoeia, although specific radioactivity values were relatively low. Thus, the main sources of carbon-12 during the synthesis of [11C]CH3I by the "wet" method were studied and the contribution attributable to each individual source was quantified. The most relevant contamination of non-radioactive CO2 (contribution>90%) was shown to be generated during the bombardment process, probably due to the combustion (caused by high temperature and pressure during irradiation) of carbon carrier compounds present in the irradiated gas (or target body). General procedures to be performed before, during and after the radiosynthesis were established to prevent external contamination and to improve the specific radioactivity of 11C-labeled radiotracers synthesized from [11C]CH3I produced via the "wet" method. Concerning 13N-labeling, a fully automatic process for the production of [13N]NO2- from cyclotron generated [13N]NO3- has been developed. The radioactive precursor [13N]NO2- has been used for the synthesis of biologically interesting 13N-labeled compounds such as S-nitrosothiols (well-known NO. donors), N-nitrosamines (molecules with potent carcinogenic effects) and azo compounds (with putative application as imaging probes for in vivo detection of β-amyloid plaques). In all cases, excellent radiochemical conversion (48.7% - 74.5% for S-[13N]nitrosothiols, 45.6% - 53.4% for N-[13N]nitrosamines and 40.0% - 58.3% for 13N-labeled azo compounds) and good radiochemical yields (33.8% - 60.6% for S-[13N]nitrosothiols, 34.0% - 37.8% for N-[13N]nitrosamines and 20.4% - 47.2% for 13N-labeled azo compounds) were achieved. An automatic remote controlled synthesis module for the preparation of 13N-labeled structures has been designed and implemented.

Presenilins (PS) are the catalytic components of γ-secretase, an aspartyl protease that regulates through proteolytic processing the function of multiple signaling proteins. Specially relevant is the γ-secretase-dependent cleavage of the β-amyloid precursor protein (APP) since generates the β-amyloid (Aβ) peptides that aggregate and accumulate in the brain of Alzheimer´s disease (AD) patients. Abnormal processing and/or accumulation of Aβ disrupt synaptic and metabolic processes leading to neuron dysfunction and neurodegeneration. Studies in presenilin conditional knockout mice have revealed that presenilin-1 is essential for age-dependent Aβ accumulation and inflammation. By contrast, mutations in the presenilin genes reponsible for early onset familial AD cause rapid disease progression and accentuate clinical and pathological features including inflammation. In addition, a number of loss of function mutations in presenilin-1 have been recently associated to non-Alzheimer's dementias including frontotemporal dementia and dementia with Lewy bodies. In agreement, total loss of presenilin function in the brain results in striking neurodegeneration and inflammation, which includes activation of glial cells and induction of proinflammatory genes, besides altered inflammatory responses in the periphery. Interestingly, some non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) that slow cognitive decline and reduce the risk of AD, decrease amyloidogenic Aβ42 levels by modulating allosterically PS/γ-secretase. In this review, I present current evidence supporting a role of presenilin/γ-secretase signaling on gliogenesis and gliosis in normal and pathological conditions. Understanding the cellular mechanisms regulated by presenilin/γ-secretase during chronic inflammatory processes may provide new approaches for the development of effective therapeutic strategies for AD.

El pèptid amiloide Aβ(1-40) és un dels principals components de les plaques dels cervells afectats per la malaltia d’Alzheimer, on normalment es troba associat als lípids de la membrana cel·lular. Les membranes poden tenir un rol important en la toxicitat del pèptid, tant com a possible diana com influenciant la formació d’agregats peptídics. Un punt particularment interessant de la influència de les membranes en el procés d’agregació, del que existeixen evidències experimentals, és la peroxidació lipídica com a factor important en la neurodegeneració. L’objectiu general d’aquest treball ha estat la caracterització molecular de la interacció del pèptid amiloide amb les membranes biològiques, parant especial esment en el rol de la peroxidació lipídica. Els resultats han mostrat que en presència de membranes de lípid d’extracte de cervell s’observa una clara acceleració de formació de fibres pel pèptid Aβ(1-40) i una major formació d’aquestes. Per altra banda, l’agregació del pèptid en presència de membranes no oxidades mostra un alentiment i una menor formació de fibres. S’ha observat que aquesta diferència en l’agregació del pèptid segons el grau d’oxidació de les membranes, és deguda a l’aparició de càrregues negatives a la superfície de les membranes durant el procés d’agregació. L’aparició de càrregues negatives a la superfície de la membrana implica un augment de la concentració de protons i per tant una davallada del pH a la superfície de la membrana. Aquesta baixada de pH afecta al plegament del pèptid Aβ(1-40). A pH neutre, aquest pèptid tendeix a formar fibres, passant per una sèrie d’agregats oligomèrics. A pH inferior a 6, quan les histidines del pèptid es troben protonades, aquest pèptid forma agregats amorfs d’alt pes molecular. En aquesta tesi, s’ha vist com aquests agregats tenen una capacitat més gran de desestabilitzar la membrana que no els agregats que es formen a pH neutre. La comparació amb els sistemes vius s’ha dut a terme utilitzant dues línies cel·lulars amb característiques diferents. S’ha vist com el pèptid és més tòxic en cèl·lules PC12 que en cèl·lules SH-5YSY. Les cèl·lules PC12 són crònicament apoptòtiques, la qual cosa implica un augment de fosfatidilserina a la superfície, lípid amb cap polar negatiu, que aporta càrregues negatives a la superfície, i que, per tant, implica una davallada del pH a la superfície cel·lular d’aquestes cèl·lules. El treball conclou que aquests agregats amorfs que es formen a pH baix podrien ser els responsables de la toxicitat del pèptid. Els resultats són rellevants ja que donen un possible mecanisme molecular a la relació que els processos oxidatius i les malalties vasculars en la malaltia d’Alzheimer. Tant els processos oxidatius, que implicarien una acidificació a la superfície cel·lular degut a la peroxidació lipídica, com les malalties vasculars, que poden implicar una acidificació local del teixit, podrien afavorir la formació d’aquests agregats amorfs d’alt pes molecular augmentant la toxicitat del pèptid., Aβ peptides are the main components of the characteristic fibrilar amyloid plaques found in central nervous systems affected by Alzheimer’s disease. Amyloid plaques are usually found associated to lipids from the plasma cell membrane. Membranes may play a role in amyloid toxicity, either as a peptide’s target or by influencing the peptide aggregation state. A particularly interesting aspect of the possible influence of lipid bilayers is the existence of an important amount of experimental evidence pointing to lipid peroxidation as an important factor in neurodegeneration. The general objective of this thesis was the molecular characterization of the peptide interaction with biological membranes. Granular non-fibrillar aggregates (GNAs) are identified as possible toxic species in Alzheimer’s disease. GNAs form on the surface of negatively charged biological membranes and as a consequence of an acidic environment, off the polymerization pathway at neutral pH. Aβ(1-40) GNAs disturb the bilayer structure of model membranes and seem to be more toxic to cells with negatively charged membranes (consequence of chronic pre-apoptosis). GNAs may be relevant in physiological situations associated to Alzheimer’s disease: a local acidic pH at the cell surface (consequence of lipid oxidation or other cell insults) and acidification as a consequence of vascular events causing hypoxia. Together with previous descriptions of granular aggregates with poly-glutamine peptides related to Huntington’s disease and the SH3 domain of PI3, GNAs related to Alzheimer’s disease are a further example of a possible common aggregation and toxicity mechanism in conformational diseases. GNAs may represent a new pharmacological target in Alzheimer’s disease.

Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Humana e Ambiente), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências Nível de preservação: critical, Criado em: 2010-01-19 18:44:37, Criado por: creator:LSARAM, Alterado em: 2010-01-19 19:16:24, Modificado por: viewer:internal Made available in DSpace on 2010-07-27T08:58:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 20900_ulfc080575_tm.pdf: 2178848 bytes, checksum: c2f1334dd43a7c68c44ebad0b1f223a9 (MD5) 20900.xml: 5763 bytes, checksum: 3fa38a93b255844c824b580b42f8c812 (MD5) Previous issue date: 2009

La formació de fibres amiloides és un tret característic dels sistemes nerviosos afectats per malalties com la d'Alzheimer o les priòniques. En els teixits, les fibres es troben associades a les membranes cel·lulars i a elements de la matriu extracel·lular com els glicosaminoglicans. En les diferents malalties amiloidogèniques, pèptids i proteïnes amb una homologia seqüencial molt baixa, donen lloc a la formació d'agregats amiloides, de característiques físico-químiques molt semblants. Aquest fet implica la possibilitat que existeixi un mecanisme comú de formació d'agregats amiloides i, per tant, una possible via d'intervenció comuna a les diferents malalties. En aquest sentit, ha estat descrit recentment un hipotètic motiu estructural d'unió a esfingolípid que seria comú al fragment 1-28 del pèptid β amiloide, relacionat amb la malaltia d'Alzheimer, i el fragment 185-208 de la proteïna priònica humana. A més, les dues seqüències contenen residus d'His, involucrats en possibles motius d'unió a heparina. El fragment 1-28 del pèptid β amiloide ha estat molt estudiat pel que fa a la seva capacitat per formar fibres amiloides, a la influència de l'heparina en el procés d'agregació i, fins i tot, en la seva capacitat d'interacció amb membranes biològiques. Les propietats amiloidogèniques del fragment 185-208 de la proteïna priònica, en canvi, eren fins ara desconegudes. Combinant l'espectroscòpia d'IR i de fluorescència amb la microscòpia electrònica, hem procedit a la determinació de les característiques amiloidogèniques del fragment priònic. Els resultats mostren que aquest fragment és capaç de formar fibres amiloides, seguint el característic procés de polimerització nucleada, només en presència d'heparina i de membranes biològiques amb càrrega superficial negativa. Les fibres formades mostren la típica morfologia amiloide. A diferència del fragment 1-28 del pèptid de l'Alzheimer, el fragment priònic és citotòxic, reduint en un 25% la viabilitat cel·lular en una línia de neuroblastoma. Un cop caracteritzat el fragment priònic, s'han estudiat les capacitats anti-amiloidogèniques dels dendrímers, uns polímers ramificats amb càrrega superficial positiva capaços d'interferir en el procés d'agregació amiloide, modulant la formació de fibres., La formación de fibras amiloides es una característica fundamental de los sistemas nerviosos afectados por la Enfermedad de Alzheimer o las enfermedades priónicas. En estos tejidos, las fibras están asociadas a las membranas celulares y a glicosaminoglicanos. En las diferentes enfermedades amiloidogénicas, péptidos y proteínas con homología secuencial muy baja dan lugar a la formación de agregados amiloides, los cuales tienen características fisicoquímicas muy similares. Este hecho implica la posibilidad de que exista un mecanismo común de formación de este tipo de agregados y, por tanto, una posible via de intervención común a las diferentes patologías. En este sentido, se ha descrito recientemente un hipotético motivo estructural de unión a esfingolípidos que seria común al fragmento 1-28 del péptido β amiloide, relacionado con la enfermedad de Alzheimer, y el fragmento 185-208 de la proteína priónica humana. Además, las dos secuencias contienen residuos de His, involucrados en posibles motivos de unión a heparina. El fragmento 1-28 del péptido β amiloide ha sido ampliamente estudiado en lo que se refiere a su capacidad de formar fibras amiloides, la influencia de la heparina en su proceso de agregación e, incluso, en su capacidad de interacción con las membranas biológicas. Las propiedades amiloidogénicas del fragmento 185-208 de la proteína priónica humana, en cambio, actualmente eran desconocidas. La combinación de la espectroscopia de IR y de fluorescencia con la microscopia electrónica, nos ha permitido determinar las características amiloidogénicas del fragmento priónico. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que este fragmento es capaz de formar fibras amiloides, siguiendo el característico proceso de polimerización nucleada, sólo en presencia de heparina y de membranas biológicas con carga superficial negativa. Las fibras formadas muestran la típica morfología amiloide. A diferencia del fragmento 1-28 del péptido del Alzheimer, el fragmento priónico resulta citotóxico, reduciendo en un 25% la viabilidad celular en una línea celular de neuroblastoma. Una vez caracterizado el fragmento priónico, se han estudiado las propiedades anti-amiloidogénicas de los dendrímeros, unos polímeros ramificados y con carga superficial positiva capaces de interferir en el proceso de agregación amiloide, modulando la formación de fibras., Amyloid fibril formation is a hallmark of nervous systems affected by Alzheimer's and prion diseases. In both pathologies, fibrils are found associated to cellular membranes and glycosaminoglycans. In this kind of pathologies, amyloid peptides and proteins with very poor sequence homology originate very similar aggregates. This fact implies the possible existence of a common amyloid formation mechanism, and therefore, common pathogenic mechanisms. In this sense, a homologous structural sphingolipid-binding motif has been described for the Alzheimer's peptide Aβ(1-28) and the human prion protein fragment PrP(185-208). Both sequences contain His residues in a cluster of basic residues proposed as a heparin binding motif.The Aβ(1-28) fragment has been widely described as an amyloid peptide and the influence of heparin in its aggregation process and its interaction with cellular membranes have been studied. The amyloidogenic properties of prion fragment were still unknown. In the present work, we have used a combination of spectroscopic techniques (Fourier-Transform Infrared Spectroscoy and Fluorescence Spectroscopy) complemented with electron microscopy in order to characterize PrP(185-208) as an amyloid peptide.The results show that PrP(185-208) is able to form amyloid aggregates following a nucleation-dependent polymerization only in the presence of heparin or negatively charged model membranes. The formed fibers show the typical amyloid morphology. Whereas Aβ(1-28) fragment is not toxic, as already known, 25% of the viability cell population in a neuronal cell line is reduced in the presence of PrP(185-208). Once the prion peptide was characterized as an amyloid, we checked the possible anti-amyloid properties of dendrimers, branched and globular polymers with a densely positive surface. Dendrimers ability to interfere with the aggregation process, modulating fibril formation is shown.

RESUMEN: Introducción: Un componente molecular predominante en el estudio de las enfermedades neurodegenerativas es lapresencia del complejo Tau-GSK3β y su asociación con agregados proteicos al interior de la célula. Evidencias considerablesmuestran que GSK3β es el principal causante de la hiperfosforilación de Tau. Sin embargo, son poco claros los eventosmoleculares que gobiernan este complejo.Objetivo: Determinar el efecto del 17 β-estradiol en la expresión y asociación de las quinasas responsables de lahiperfosforilación de Tau.Métodos: Se realizaron tratamientos con 17 β-estradiol en hipocampo de rata Wistar adulta ovariectomizada y en cultivosprimarios de hipocampo de rata tratados con β-amiloide. Se evaluó la asociación de complejos proteicos por co-inmunoprecipitación, ensayo de toxicidad por liberación LDH y cambios morfológicos celulares por microscopía confocal.Resultados: Este estudio mostró evidencias de que el estradiol disocia complejos macromoleculares como Tau/GSK3ß,Tau/GluR2/3, Tau/FAK, Tau/Fyn en hipocampo de rata adulta. Además, disminuyó la expresión de GSK3β-ptyr por eltratamiento hormonal y éste reguló la defosforilación de Tau en un modelo de excitoxicidad por β-amiloide.Conclusiones: Lo anterior sugiere, nuevos blancos que contribuyen al estudio de la neuroprotección y plasticidadneuronal mediada por el estrógeno ABSTRACT: Introduction: A predominant molecular component analyzed in the study of neurodegenerative diseases is the presenceof the Tau-GSK3β complex and its association with protein aggregation into the cell. Several evidences show that GSK3β hasan important role in abnormal pattern of the phosphorylation of Tau. However, the molecular events that are governing thiscomplex are unknown.Aim: Todetermine the effect of 17 β-estradiol treatment on the expression and association of Tau hyperphosphorylationresponsible kinases.Methods: 17 β-estradiol treatments were realized in the hippocampus of ovariectomized adult wistar rats and in hippocampalprimary cultures treated with β-amiloid. Protein complex association was assessed by co-immunoprecipitation, toxicity assayby LDH release and cell morphologic changes by confocal microscopy.Results: Our results show that 17β-estradiol produced dissociation of macromolecular complexes like Tau /GSK3ß, Tau/GluR2/3, Tau/FAK, and Tau /Fyn in hippocampus of adult rat. In addition the expression of GSK3β-ptyr was decreased by the hormonal treatment and this one regulated thedefosforilation of Tau in an excitotoxicity model by β-amiloid.Conclusions: It suggests new targets that will contributeto neuroprotection and neuronal plasticity studies mediatedby the estrogen COL0010744

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia

Tese de doutoramento em Ciências Biomédicas (Neurociências Básicas), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Medicina, 2007 Submitted by amelia Janeiro (ajaneiro@reitoria.ul.pt) on 2012-05-31T15:25:24Z No. of bitstreams: 1 ulsd053802_td_Claudia_Gomes.pdf: 15156394 bytes, checksum: a15052a2d59ac8f638800661bc57cee7 (MD5) Made available in DSpace on 2012-05-31T15:38:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulsd053802_td_Claudia_Gomes.pdf: 15156394 bytes, checksum: a15052a2d59ac8f638800661bc57cee7 (MD5) Previous issue date: 2007 Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/6270/2001) e Fundo Social Europeu

Fiorella Malchiodi Ileana Ferrero Stefano Alema

Objetivo: diagnosticar amiloidosis mediante biopsia de glándula salival menor. Material y Método: se utilizó el método de observación, retrospectivo y descriptivo. El estudio consistió en obtener resultados de 60 pacientes que se realizaron biopsias de glándula salival menor para descartar amiloidosis. Los pacientes estaban hospitalizados por otras patologías y tenían sospecha clínica de amiloidosis; por esa razón todos los pacientes traían una hoja de interconsulta. Resultados: de las 60 biopsias, 38 resultaron negativas y 22 resultaron positivas para amiloidosis. De los 60 pacientes, 13 tuvieron antecedentes de TBC, de los cuales 7 hicieron la enfermedad de amiloidosis. Conclusiones: la biopsia de glándula salival es útil para diagnosticar amiloidosis; además, es más accesible en comparación con las biopsias de riñón, mucosa rectal y grasa abdominal, que también se realizan para diagnosticar amiloidosis. De 16 pacientes con biopsia que tenían síndrome nefrótico, todos resultaron negativos para amiloidosis.

Reportamos el caso de un paciente masculino de 59 años de edad con adenoma pituitario productor de prolactina con depósitos de amiloide en el seno esfenoidal y el clivus, que presentó cefalea por 25 años, con hiperprolactinemia y por estudios de neuroimagen que incluye tomografía cráneo, tomografía e imagen de resonancia magnética, claramente con la presencia de un tumor en el seno esfenoidal y el clivus. Este tumor fue resecado parcialmente vía abordaje sublabial transeptal transesfenoidal ampliado al clivus. Presentamos su posible origen ectópico y relación embriológica.

The current article provides a comprehensive overview of the current strategies and the future directions of the pharmacological treatment of Alzheimer's disease. The benefits and shortcomings of cholinergic replacement therapy is discussed in the light of its neurobiological, pharmacological and clinical data, illustrated by the most relevant randomised controlled trials and recent meta-analytical studies. The role of memantine in moderate to severe dementia, and the perspectives of combination therapy are further discussed both at clinical and neuro-pharmacological levels. In addition, the role of oestrogen replacement, antioxidants, statins, and non-steroidal anti-inflammatory drugs, in the management and prevention of dementia is discussed, considering the negative results of recent controlled trials. The last segment of this review explores the treatment approaches into the molecular pathogenesis of dementia, focusing on disease-modifying candidate therapies such as anti-amyloid strategies and the immunotherapy of Alzheimer's disease. O presente artigo de revisão aborda as perspectivas atuais e futuras no tratamento farmacológico da doença de Alzheimer. Os benefícios e limitações da terapia de reposição colinérgica, representada fundamentalmente pelos inibidores das colinesterases, são apresentados com base em dados de pesquisas neurobiológicas, farmacológicas e clínicas, ilustrados pelos principais estudos controlados por placebo e por estudos recentes de metanálise. O papel da memantina nos casos de demência moderada a grave, bem como as perspectivas de seu emprego em associação com os inibidores das colinesterases, são discutidos adicionalmente com base em achados clínicos e neurobiológicos. Discute-se o papel da reposição estrogênica, dos antioxidantes, das estatinas e dos antiinflamatórios no tratamento e na prevenção da demência, levando em consideração os resultados negativos oriundos de estudos clínico-epidemiológicos recentes. Finalmente, são apresentadas algumas perspectivas futuras do tratamento da doença de Alzheimer: entre as estratégias farmacológicas, que têm como objetivo modificar mecanismos patogênicos, são abordadas as diferentes modalidades da terapêutica antiamilóide, com destaque na imunoterapia da doença de Alzheimer.