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Previous work in the laboratory had resulted in biolabile cationic lipids derived from a naturally cell membrane component, DOPC, by temporarily masking its negative charge by the introduction of a cleavable substituent, under acidic or enzymatic stimuli. This concept was particularly efficient for the delivery, in vitro and in vivo, of nucleic acids such as DNA plasmid or siRNA, with a minimized toxicological impact for cells. The present study is the transposition of this system to a therapeutic approach to cancer, using constructions derived from alkylphospholipids (APLs), a recent class of antitumor lipids. Biolabile prodrugs (pro-APLs) have been developed from three promising APLs: miltefosine, perifosine and erufosine. The biological evaluation of pro-APLs activity and the optimization of various parameters led to efficient formulations for the in vitro delivery of a therapeutic DNA plasmid, related to TRAIL, and the in situ APLs production for a potential antitumor combotherapy., Les précédents travaux menés au laboratoire avaient permis d’obtenir des lipides cationiques biolabiles dérivés d’un constituant naturel des membranes cellulaires, la DOPC, en masquant temporairement sa charge négative par l’introduction d’un substituant, clivable sous stimuli acide ou enzymatique. Ce concept s’était révélé efficace pour la délivrance, in vitro et in vivo, d’acides nucléiques, avec un impact toxicologique minimisé. Ce doctorat est la transposition de ce système à une approche thérapeutique du cancer, à l’aide de constructions dérivées d’alkylphospholipides (APLs), des lipides antitumoraux. De nombreuses prodrogues biolabiles (pro-APLs) ont été développées à partir de trois APLs prometteurs : miltéfosine, périfosine et érufosine. L’évaluation et l’optimisation de l’activité biologique des pro-APLs ont conduit à des formulations performantes pour la délivrance in vitro d’un ADN thérapeutique TRAIL et la production in situ d’APLs, pour une combothérapie antitumorale.

In the nanomedecine field, a new approach consists in developing synthetic vectors able to co-deliver into a cancer cell, an antitumoral drug and siRNAs that target protein(s) involved in MDR. The work described in this manuscript was dedicated to the development of micellar nanovectors for the intracellular co-delivery of these two therapeutic agents. The first part details the synthesis and the formulation of nanometric photopolymerized diacetylenic micelles adapted for the delivery and intracellular release of the siRNA. Then, the encapsulation and delivery properties of these micelles, bearing histidine polar heads have been investigated in vitro and in vivo for the application of combination therapy. Finally, the last part presents the functionalization by electrostatic interaction of these cationic vectors with antibodies, priorly modified by anionic oligonucleotides. This original and versatile system allowed achieving an active targeting of tumoral cells.; En nanomédecine, une nouvelle approche consiste à développer des vecteurs synthétiques pour co-délivrer au sein d’une cellule tumorale, un anticancéreux ainsi qu’un siARN, capable de supprimer l’expression d’une protéine impliquée dans les mécanismes de résistance. Les travaux décrits dans ce manuscrit ont été consacrés à la synthèse de nano-vecteurs micellaires pour la délivrance simultanée de ces deux agents thérapeutiques. Une première partie décrit la synthèse et la formulation de micelles nanométriques diacétyléniques photopolymérisables conçues pour délivrer efficacement un siARN. Les propriétés d’encapsulation et de délivrance de ces micelles ont ensuite été étudiées in vitro et in vivo pour une application en thérapie combinatoire. Enfin, une dernière partie présente la fonctionnalisation par interaction électrostatique de ces vecteurs cationiques avec des anticorps préalablement modifiés par des oligonucléotides anioniques pour réaliser un ciblage actif des cellules tumorales.

Oligonucleotides are finding an extremely large number of applications in molecular diagnostics and might become a very selective class of drugs for the treatment of a vast palette of diseases. Oligonucleotides are polyanions that exert their specifie activity following hybridization to a complementary sequence borne by another polyanionic nucleic acid. Simple electrostatic considerations imply that hybridization energy and cell binding couId benefit from addition of cationic groups to the oligonucleotide structure. Towards the aim of improving hybridization by decreasing electrostatic repulsions between the negatively charged strands, oligonucleotide-oligocation conjugates whose global charge is modulated by the number of cationic spermine moieties grafted on the oligonucleotides have been developed. Oligonucleotide-oligospermine conjugates are produced using an automated solid-phase synthesis of conjugates that are entirely based on the phosphoramidite coupling chemistry. Zip Nucleic Acids {ZNAs} are oligonucleotides with a short polycationic tail, composed of relatively few spermine units, leading to molecules overall negative in charge. The modification improves hybridisation by accelerating the target recognition and increases the melting temperature linearly with the number of grafted spermines on the oligonucleotide without altering the specificity. ZNAs have been shown to be potent primers and probes for PCR and are new interesting tools for molecular biology and diagnostics applications. Small interfering RNA (siRNA}-mediated gene silencing has become a drug development paradigm. As drug candidates, they must aIso be able to cross the anionic cell membrane. However, still one major limitation of the use of siRNA remains their inability to penetrate efficiently into cells of a particular tissue or tumour. That gives to oligonucleotide-oligospermine conjugates a real interest in this domain and more generally in vivo therapies. Cationic SIRNAPLUS are duplexes of small RNAs targeting a specifie mRNA. They are produced as an oligospermine-RNA sense strand, with positive global charge, associated to an antisense RNA strand. Results have shown that cationic siRNAs are able to enter cells efficiently without vector and to display silencing activity at nanomolar concentration. To have positive global charge, the number of spermine moieties has been increased. Purification and characterization methods have been developed to have cationic siRNAs compatible with in vivo experiments. My thesis will describe the synthesis of oligonucleotide-oligospermine conjugates as well as their applications.; Les oligonucleotides sont utilisés pour de nombreuses applications dans le domaine du diagnostic et ils peuvent également être utilisés comme traitement pour de nombreuses maladies. Les oligonucléotides sont des polyanions qui viennent s'hybrider sur leurs séquences complémentaires elles aussi anioniques. Les répulsions électrostatiques impliquent que l'addition de charges positives sur les oligonucléotides serait bénéfique pour diminuer les répulsions et améliorer l'hybridation. Dans le but de diminuer ces répulsions électrostatiques, des conjugués oligonucléotide-oligocation sur lesquels sont greffées des unités spermines ont été développés. Les conjugués oligonucléotideoligocation sont synthétisés sur un synthétiseur automatique d'oligonucléotide en utilisant la chimie des phosphoramidites. Les« Zip Nucleic Acid »ou ZNAs sont des oligonucléotides portant une queue cationique de quelques unités de spermine et sont de charge globale négative. Les modifications apportées permettent d'améliorer l'hybridation en accélérant la reconnaissance de la séquence cible et en augmentant la température de fusion linéairement avec le nombre de spermines greffées sans altérer la spécificité. Les ZNAs se révèlent être efficaces utilisés comme amorces ou sondes en PCR et ils apparaissent comme de nouveaux outils intéressants pour la biologie moléculaire. Les petits ARNintérferents (si RNA) induisant l'extinction d'un gène par la voie d' ARN interférence ont suscités un grand engouement ces dernières années, cependant leur très faible pénétration cellulaire est un frein majeur à leur utilisation. C'est pour cela que les conjugués oligonucléotide- oligospermine ont un réel intérêt pour le domaine de la thérapie in vivo. Les duplexes SIRNAPLUS cationiques sont des siRNAs ciblantspécifiquement un ARN messager. Ils sont constitués d'un brin sens ARN-oligospermine de charge globale positive hybridé à un brin antisens. Les résultats ont montré que lesSIRNAPLUS pouvaient entrer seuls dans les cellules sans agent de transfert pour induire l'extinction d'un gène cible et les premières expériences montrent qu'ils sont actifs in vivo. Mes travaux de thèse ont porté sur le développement des conjugués oligonucléotide oligospermine et démontrent des applications potentielles dans le domaine du diagnostic et de la thérapie.

Oligonucleotides are finding an extremely large number of applications in molecular diagnostics and might become a very selective class of drugs for the treatment of a vast palette of diseases. Oligonucleotides are polyanions that exert their specifie activity following hybridization to a complementary sequence borne by another polyanionic nucleic acid. Simple electrostatic considerations imply that hybridization energy and cell binding couId benefit from addition of cationic groups to the oligonucleotide structure. Towards the aim of improving hybridization by decreasing electrostatic repulsions between the negatively charged strands, oligonucleotide-oligocation conjugates whose global charge is modulated by the number of cationic spermine moieties grafted on the oligonucleotides have been developed. Oligonucleotide-oligospermine conjugates are produced using an automated solid-phase synthesis of conjugates that are entirely based on the phosphoramidite coupling chemistry. Zip Nucleic Acids {ZNAs} are oligonucleotides with a short polycationic tail, composed of relatively few spermine units, leading to molecules overall negative in charge. The modification improves hybridisation by accelerating the target recognition and increases the melting temperature linearly with the number of grafted spermines on the oligonucleotide without altering the specificity. ZNAs have been shown to be potent primers and probes for PCR and are new interesting tools for molecular biology and diagnostics applications. Small interfering RNA (siRNA}-mediated gene silencing has become a drug development paradigm. As drug candidates, they must aIso be able to cross the anionic cell membrane. However, still one major limitation of the use of siRNA remains their inability to penetrate efficiently into cells of a particular tissue or tumour. That gives to oligonucleotide-oligospermine conjugates a real interest in this domain and more generally in vivo therapies. Cationic SIRNAPLUS are duplexes of small RNAs targeting a specifie mRNA. They are produced as an oligospermine-RNA sense strand, with positive global charge, associated to an antisense RNA strand. Results have shown that cationic siRNAs are able to enter cells efficiently without vector and to display silencing activity at nanomolar concentration. To have positive global charge, the number of spermine moieties has been increased. Purification and characterization methods have been developed to have cationic siRNAs compatible with in vivo experiments. My thesis will describe the synthesis of oligonucleotide-oligospermine conjugates as well as their applications., Les oligonucleotides sont utilisés pour de nombreuses applications dans le domaine du diagnostic et ils peuvent également être utilisés comme traitement pour de nombreuses maladies. Les oligonucléotides sont des polyanions qui viennent s'hybrider sur leurs séquences complémentaires elles aussi anioniques. Les répulsions électrostatiques impliquent que l'addition de charges positives sur les oligonucléotides serait bénéfique pour diminuer les répulsions et améliorer l'hybridation. Dans le but de diminuer ces répulsions électrostatiques, des conjugués oligonucléotide-oligocation sur lesquels sont greffées des unités spermines ont été développés. Les conjugués oligonucléotideoligocation sont synthétisés sur un synthétiseur automatique d'oligonucléotide en utilisant la chimie des phosphoramidites. Les« Zip Nucleic Acid »ou ZNAs sont des oligonucléotides portant une queue cationique de quelques unités de spermine et sont de charge globale négative. Les modifications apportées permettent d'améliorer l'hybridation en accélérant la reconnaissance de la séquence cible et en augmentant la température de fusion linéairement avec le nombre de spermines greffées sans altérer la spécificité. Les ZNAs se révèlent être efficaces utilisés comme amorces ou sondes en PCR et ils apparaissent comme de nouveaux outils intéressants pour la biologie moléculaire. Les petits ARNintérferents (si RNA) induisant l'extinction d'un gène par la voie d' ARN interférence ont suscités un grand engouement ces dernières années, cependant leur très faible pénétration cellulaire est un frein majeur à leur utilisation. C'est pour cela que les conjugués oligonucléotide- oligospermine ont un réel intérêt pour le domaine de la thérapie in vivo. Les duplexes SIRNAPLUS cationiques sont des siRNAs ciblantspécifiquement un ARN messager. Ils sont constitués d'un brin sens ARN-oligospermine de charge globale positive hybridé à un brin antisens. Les résultats ont montré que lesSIRNAPLUS pouvaient entrer seuls dans les cellules sans agent de transfert pour induire l'extinction d'un gène cible et les premières expériences montrent qu'ils sont actifs in vivo. Mes travaux de thèse ont porté sur le développement des conjugués oligonucléotide oligospermine et démontrent des applications potentielles dans le domaine du diagnostic et de la thérapie.