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Orientador: Marcelo Lima Ribeiro Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A obesidade e considerada um problema de saúde publica, principalmente pelo fato desta estar associada com diversas patologias como a resistência a insulina (RI). Atualmente, diversas estratégias são utilizadas visando a redução de peso corporal, dentre estas se destaca o uso de produtos de origem vegetal, incluindo a Ilex paraguariensis, cujo nome comum e erva-mate. Muitos trabalhos mostram que os compostos detectados na erva-mate possuem diferentes funções biológicas, tais como: ação antioxidante, antiinflamatória, imunomodulatoria, anticancerígena, modificação do metabolismo de colesterol, entre outros. Muito embora diversos estudos destaquem as funções biológicas da erva-mate, pouco se sabe sobre sua capacidade de modulação na expressão de genes relacionados a obesidade, e seu efeito na via de sinalização da insulina. Deste modo o presente estudo teve como objetivo avaliar a ação do extrato aquoso de erva-mate tostado no processo de adipogênese e sua ação nos mecanismos de sinalização da insulina. Os dados do presente trabalho mostram que a erva-mate na concentração de 1,0g/kg em animais submetidos a dieta hiperlipídica aumentou a expressão de diferentes genes responsáveis pela ativação da AKT, reduziu a translocação nuclear de NF-kB e FOXO1, reduziu a expressão PEPCK e G6Pase ligados ao processo de gliconeogênese no tecido hepático. Os efeitos da erva-mate na sinalização da insulina foram ratificados, por analise protéica de IRS-1, IRS-2 e AKT, redução na resistência a insulina observada pelo teste do KITT e redução da glicemia basal. O presente trabalho demonstra ainda em cultura celular de 3T3-L1 que a erva-mate e alguns de seus principais compostos bioativos (ácido clorogênico, rutina e quercetina), possuem ação mais expressiva na etapa de diferenciação do adipócito e atuam modulando distintos genes relacionados ao processo de diferenciação do adipócitos. O trabalho ainda sugere que a erva-mate possa atuar in vitro e ex vivo de maneira mais expressiva na redução da adipogênese através da via WNT, visto pelo aumento da expressão de diferentes genes relacionados com essa via. O resultado final da ativação desta via e a repressão significativa de PPARy2 e C/EBP'alfa', principais fatores de transcrição necessários para que ocorra a etapa final do processo de diferenciação dos adipócitos, contribuindo assim para elucidar a redução do peso corpóreo e da gordura epididimal observada nos animais submetidos a dieta hiperlipídica tratados com erva-mate durante 60 dias, que por sua vez reduz a produção de citocinas, em especial o TNF-'alfa', contribuindo parcialmente para a melhora do quadro de sinalização a insulina observado apos intervenção Abstract: Obesity is a problem of public health, mainly because it is associated with many conditions such especially insulin resistance (IR). Currently, several strategies have been used in order to reduce the total body weight, among these there is a growing evidence supporting the use of products of plant origin, including the Ilex paraguariensis, whose common name is yerba mate. Various studies have shown that the compounds found in yerba mate has several biological functions, such as antioxidant, anti-inflammatory, immunomodulatory, anticancer, modification of cholesterol metabolism and others. Although several studies highlight the biological functions of yerba mate, there are lack of evidence providing their ability to modulate expression of genes related to obesity and its effect on the insulin signaling pathway. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects of yerba mate in gene expression that regulate adipogenesis and insulin signaling pathway. Our data showed yerba mate (1,0 g/kg) in animals subjected to high fat diet, increased different gene expression responsible for the activation of the AKT, reduction of FOXO1 and NF-kB nuclear translocation, reduction gene expression of PEPCK and G6Pase involved in gluconeogenesis process in liver. The effects of yerba mate in insulin signaling was confirmed by IRS-1, IRS-2 and AKT protein analysis, reduction in insulin test tolerance by KITT and reduction in glucose. Our data also showed in 3T3-L1 cell culture that yerba mate and some of its major bioactive compounds (chlorogenic acid, rutin and quercetin), act in an early stage of adipocyte differentiation and modulate different gene expression that regulate adipogenesis. Additionally, yerba mate can act in vitro and ex vivo in WNT pathway, seen by the increased expression of different genes in this pathway resulting in a significant repression of C/EBP'alfa' and PPARy2, the most important transcription factors essencial for the occurrence of adipocyte differentiation. This findings collaborate to elucidate the reduction of body weight and epididymal fat observed in animals subjected to high fat diet treated with yerba mate for 60 days, which reduces the production of cytokines, particularly TNF-'alfa', contributing partially to the improvement in insulin signaling observed after intervention Doutorado Genética Animal e Evolução Doutor em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Marcelo Lima Ribeiro Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A infecção por Helicobacter pylori e usualmente adquirida durante a infância e persiste durante toda a vida caso não seja tratada. A bactéria induz uma resposta inflamatória crônica, que esta associada com alterações hipergenéticas em oncogenes, genes supressores tumorais, e genes de reparo ao DNA. O Objetivo deste estudo foi avaliar a influencia da infecção por H. pylori no padrão de metilação de genes envolvidos na carcinogenese gástrica. O perfil de metilação de 106 genes foi caracterizado em biopsias provenientes de 5 pacientes adultos (1 Helicobacter pylori negativo, 3 com gastrite crônica infectados com linhagens de diferentes toxicidades e 1 com câncer gástrico) e em DNA proveniente de células epiteliais gástricas infectadas por H. pylori. Para estas analises foram utilizados o Promoter methylation array system, e o Gastric Cancer Methyl--Profiler DNA PCR Array. Os resultados destas análises mostraram que 20 % dos genes se encontravam metilados na amostra de câncer gástrico e 16 % dos genes na amostra de gastrite crônica, entretanto a analise comparativa entre estas amostras mostrou que compartilhavam 8,5 % dos genes metilados. A analise de metilação apos cocultura mostrou 12% dos genes metilados. Entre estes genes foram selecionados os seguintes: THBS1, HIC1, GATA--4, GATA--5 e MLH1 e MGMT, os quais foram avaliados em 239 amostras de biopsias gástricas, provenientes de 50 crianças e 97 adultos infetados ou não pela bactéria e de 92 adultos com câncer gástrico. O padrão de metilação foi avaliado por metilação PCR especifica (MSP--PCR). Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que não houve metilação da região promotora de MLH1, MGMT e HIC1, nas amostras provenientes de crianças, independente do estado de infecção. Os maiores níveis de metilação entre as amostras oriundas de adultos com gastrite crônica infectados foram observados em GATA--4 e THBS1 (p

Orientador: Juliana Alves Macedo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: No Brasil, especialmente na Amazônia, a variedade de óleos vegetais pouco explorados, com excelentes propriedades nutricionais, vem atraindo o interesse de pesquisadores para o potencial biológico destes óleos. Somado a isto, há o crescente interesse da indústria alimentícia na obtenção de lipídios estruturados, com melhores propriedades fisíco-químicas e nutricionais. A interesterificação enzimática é usada na reestruturação dos triacilgliceróis, induzindo a troca dos ácidos graxos na estrutura do glicerol. O uso de lipases, em reações de interesterificação tem apresentado resultados positivos na síntese de gorduras zero-trans e também de produtos de alto valor agregado, como substitutos de gordura de leite materno e manteiga de cacau. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial biológico, através da determinação dos compostos minoritários e da capacidade antioxidante, dos óleos amazônicos de buriti e murumuru, da mistura destes e dos novos lipídios estruturados, gerados pelo processo de interesterificação em três sistemas enzimáticos diferentes: com lipase não comercial, produzida por fermentação em estado sólifo do microorganismo Rhizopus sp.; com lipase comercial Lipozyme TL-IM (NOVOZYME®); com a adição das duas lipases concomitantemente. Os resultados mostraram o óleo de buriti como fonte de carotenos e tocoferóis, sem efeitos citotóxicos e de boa capacidade antioxidante, sendo superior à gordura de murumuru em todos estes quesitos. A reação de interesterificação enzimática originou lipídios estruturados ricos em carotenos e tocoferóis, mantendo as caracteristicas do óleo original. A capacidade antioxidante dos lipídios estruturados, em relação à simples mistura foi preservada ou melhorada de acordo com a lipase utilizada. As análises in vitro mostram os lipídios estruturados como substâncias capazes de modular a atividade das enzimas antioxidantes, podendo atuar no combate ao estresse oxidativo Abstract: In Brazil, especially in the Amazon, the variety of underexploited vegetable oils with excellent nutritional properties, have attracted interest in the study of the biological potential of these oils. Added to this, there is growing interest in the food industry in obtaining structured lipids, with better physical chemical and nutritional properties. Enzymatic interesterification is used in restructuring triglycerides, inducing exchange of fatty acid in the glycerol structure. The use of lipases in interesterification reactions, has shown positive results in the synthesis of zero-trans fats as well as high value-added products, as a substitute for breast milk fat and cocoa butter. The objective of this study was to assess the biological potential, by determining the minor compounds and antioxidant capacity of the Amazonian oils buriti and murumuru, and new structured lipids, generated from the interesterified blends in three different enzyme systems: for non-commercial lipase produced through fermentation by Rhizopus sp in solid form, with commercial lipase (NOVOZYME®), with the concomitant addition of the two lipases. And, to the simple mixture of oil and fat. The mixtures were composed by Buriti oil combined with murumuru fat. The results show the Buriti oil as a source of carotenes and tocopherols without cytotoxic effects and good antioxidant capacity, is better than the fat murumuru on all these points. The reaction of enzymatic interesterification originated structured lipids rich in carotenes and tocopherols, keeping the characteristics of the original oil. The antioxidant activity of structured lipids has been preserved or enhanced according to the lipase used. The in vitro assays show the structured lipids as substances capable of modulating the activity of antioxidant enzymes and may act to combat oxidative stress Mestrado Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos Mestra em Alimentos e Nutrição

Orientador: Edi Lúcia Sartorato Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A dislexia é definida como um distúrbio, ou transtorno de aprendizagem na área da leitura, escrita e soletração, que ocorre apesar de uma adequada inteligência e oportunidade sociocultural. A etiologia desse distúrbio se deve, em parte, a um importante componente genético. Ao todo, nove loci no genoma foram identificados por meio de estudos de ligação, e sete genes proeminentes foram propostos como candidatos à dislexia: DYX1C1, KIAA0319, DCDC2, ROBO1, MRPL19, C2ORF3 e KIAA0319L, mas nenhuma mutação funcional nesses genes foi efetivamente relacionada com a causa do distúrbio até o momento. O objetivo deste estudo foi verificar a relação de dados moleculares com a manifestação do distúrbio em 49 famílias de escolares brasileiros com diagnóstico de dislexia. Para isso, foi investigada a presença de grandes deleções e duplicações em algumas regiões dos genes candidatos DCDC2, KIAA0319 e ROBO1 pela técnica de Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA), utilizando o kit SALSA MLPA P150 (MRC-Holland, Amsterdam, The Netherlands). E além disso, foi realizado um estudo de associação utilizando 4 SNPs (Single Nucleotyde polymorphisms) presentes no gene DYX1C1, que já haviam sido relacionados com o fenótipo na literatura. A técnica de MLPA foi aplicada pela primeira vez na pesquisa de mutações em genes candidatos para a dislexia, este método foi reprodutível e o padrão de variação total por sonda foi baixo, porém a análise não revelou nenhuma deleção ou duplicação nas regiões de ligação das sondas nos genes estudados. Algumas modificações no kit de dislexia P150 foram sugeridas ao fabricante visando o aprimoramento para estudos futuros. Na etapa seguinte, a genotipagem dos SNPs foi realizada por PCR em tempo real, e a estratégia utilizada no estudo de associação foi o Teste de Transmissão de Desequilíbrio de Ligação (TDT). Nenhuma associação foi obtida para os marcadores estudados. As aparentes discrepâncias de nossos resultados com estudos anteriores podem ser explicados pelas diferenças na definição do fenótipo, a ancestralidade da amostra, o desenho do estudo, e as interações com efeitos ambientais que diferem entre populações. Esse resultado não descarta a participação do gene DYX1C1 na etiologia da dislexia, o aumento do número da amostra e de marcadores para estudos posteriores é fundamental para que se possa fazer uma análise mais completa do envolvimento desse gene no fenótipo, o que poderá fornecer importantes informações para o entendimento da dislexia e para futuros protocolos de diagnósticos e de conduta para os indivíduos afetados Abstract: Dyslexia or reading disability is a learning disorder associated with difficulty in learning to read, writing and spelling, despite adequate intelligence and educational opportunities, with a significant heritable trait. At least nine loci in the genome were related through linkage studies, and seven prominent genes were associated with dyslexia: DYX1C1, KIAA0319, DCDC2, ROBO1, MRPL19, C2ORF3 and KIAA0319L but no functional mutation in these genes was indeed related with the disorder cause so far. The intent of this study was access the contribution of these genes in the learning disorder molecular etiology, in a sample 49 families of dyslexic Brazilian individuals. Large deletions and duplications in the candidate genes DCDC2, KIAA0319 and ROBO1 were investigated by Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) technique, using the SALSA MLPA P150 kit (MRC-Holland, Amsterdam, The Netherlands). In addition, an association study was performed using 4 SNPs (Single Nucleotyde polymorphisms) in DYX1C1 gene, which had already related to the phenotype in the literature. The MLPA technique was applied for the first time in the search for candidate genes mutations in dyslexia, this method was reproducible and the overall standard variation per probe was low, but the analysis revealed no deletion or duplication in probes binding regions in the studied genes. Some modifications in the SALSA MLPA P150 kit have been suggested to the manufacturer attempting to improve it for future studies. In the next stage, SNPs genotyping was performed by real time PCR, and the strategy used in the association study was the Transmission Disequilibrium Test (TDT). No association was obtained for the markers. The apparent discrepancies of our results with previous studies can be explained by phenotype definition differences, the sample ancestry, study design, and interactions with environmental effects that differ between populations. This result does not rule out the involvement of DYX1C1 gene in the dyslexia etiology, the increase of the sample and markers numbers for future studies is essential to make a more complete analysis of this gene involvement in phenotype, which may provide important information to the dyslexia understanding and future diagnostic protocols and conduct for affected individuals Mestrado Genética Animal e Evolução Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Marcelo Lima Ribeiro Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A obesidade é um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento de doenças crônicas e morte prematura. Das estratégias utilizadas atualmente para a redução e controle do peso corporal, o uso de compostos naturais tem demonstrado potenciais efeitos tanto na redução do peso quanto no perfil metabólico. Nesse sentido, resultados anteriores publicados por nossa equipe demonstraram que a EM, apresentou resultados promissores concernentes à modulação da adipogênese e obesidade in vitro e in vivo, respectivamente, bem como efeito termogênico. Entretanto, os mecanismos regulatórios exercidos por esta no controle da obesidade permanecem pouco esclarecidos. Assim, o presente estudo investigou os possíveis efeitos da EM sobre função mitocondrial. Para tanto, foram realizadas análises in vitro utilizando linhagem celular C2C12 previamente tratadas com EM, na qual foi mensurada a OCR, indicativa de metabolismo celular. Adicionalmente, genes envolvidos nas vias de biogênese mitocondrial e termogênese foram investigados. Análises in vivo também foram conduzidas em modelo de obesidade induzida por DH, submetidos a 8 semanas de intervenção diária com EM. Acompanhamento semanal de ingestão de ração e respirometria foram realizados. Ao final do tratamento, análises de expressão de genes envolvidos na biogênese mitocondrial e termogênese, foram feitas em TAM e músculo esquelético. Os resultados mostraram que a EM estimulou efetivamente o metabolismo energético mitocondrial em células C2C12, através da ativação de genes envolvidos na biogênese mitocondrial (Ampk, Mttfa, Nrf1) e termogênese (Ucp-1 e Ucp-3), bem como aumentou a OCR, sugerindo melhora na função mitocondrial nessa linhagem. In vivo, dados encontrados no modelo de obesidade induzida por dieta hiperlipídica mostraram que a ingestão regular de EM reduziu o peso corpóreo do grupo DH+EM, quando comparado ao grupo DH. A perda de peso observada nesse grupo não foi relacionada à redução da ingestão alimentar. Adicionalmente, os dados antropométricos indicaram redução significativa nos pesos de gordura epididimal, perirrenal, subcutânea e mesentérica e fígado, em relação ao grupo DH. Além disso, os dados respirométricos indicaram aumento significativo nos parâmetros de VO2, VCO2, RER e GEB no grupo DH+EM, sugerindo que a EM foi capaz de estimular o gasto energético. Dados de expressão gênica em TAM e músculo esquelético mostraram aumento da expressão de Ucp-1 e Ucp-3 nos animais tratados com erva mate sugerindo efeito termogênico. Além disso, houve indicativos de estímulo de biogênese mitocondrial bem como melhora da atividade de fosforilação oxidativa, conforme evidenciados pelo aumento da expressão de gênica de Nrf-1, Mttfa, Pgc-1alfa e Sirt-1 e proteica de SIRT-1, p-AMPK, UCP-1, UCP-3 e OXPHOS em ambos os tecidos dos animais pertencentes ao grupo DH+EM. Resumidamente, os resultados do presente estudo, reafirmam a EM como uma excelente candidata na estratégia de combate à obesidade. Complementarmente ao seu potencial anti adipogênico, previamente comprovado, o presente trabalho constatou sua eficácia sobre desequilíbrios mitocondriais observados na obesidade, mediante a restauração da função mitocondrial e consequente melhora do metabolismo energético, benefícios que evidentemente culminaram no aumento do gasto energético, perda de peso e gordura corporal no modelo utilizado Abstract: Obesity is a major risk factor for the development of chronic diseases and premature death. From the strategies currently used for the reduction and control of body weight, the use of natural compounds has demonstrated potential effects in both weight reduction and metabolic profile. In this sense, previous results published by our team demonstrated that YM presented promising effects concerning the modulation of adipogenesis and obesity in vitro and in vivo, respectively, as well as thermogenic activity. However, the regulatory mechanisms exercises by YM in the control of obesity remain unclear. Thus, the present study investigated the possible effects of YM on mitochondrial function. For this, in vitro analyzes were performed using a C2C12 cell line previously treated with YM, in which was measured the OCR, indicative of cellular metabolism. Additionally, genes involved in the pathways of mitochondrial biogenesis and thermogenesis were investigated. In vivo analyzes were conducted in high fat diet- induced obese mice, submitted to 8 weeks of daily YM intervention. The food intake was monitored weekly and respirometric tests were performed. At the end of the treatment, analyzes of the expression of genes involved in mitochondrial biogenesis and thermogenesis were developed in BAT and skeletal muscle. The results showed that YM effectively stimulated mitochondrial energy metabolism in C2C12 cells, through the activation of genes involved in mitochondrial biogenesis (Ampk, Mttfa, Nrf1) and thermogenesis (Ucp-1 and Ucp-3), as well as increased OCR, suggesting an improvement in mitochondrial function in this lineage. In vivo, data showed that regular intake of YM reduced the body weight of the HFD + YM group when compared to the HFD group. The weight loss observed in this group was not related to the reduction in food intake. Additionally, the anthropometric data indicated a significant reduction in epididymal, perirenal, subcutaneous and mesenteric fat and liver weights, in relation to the HFD group. In addition, respirometric tests indicated a significant increase in VO2, VCO2, RER and EE parameters in the HFD + YM group, suggesting that YM was able to stimulate energy expenditure. Gene expression data in BAT and skeletal muscle showed increased expression of Ucp-1 and Ucp-3 in animals treated with YM suggesting thermogenic effect. In addition, there were indications of mitochondrial biogenesis stimulation as well as enhancement of oxidative phosphorylation activity as evidenced by increased of Nrf-1, Mttfa, Pgc-1alpha and Sirt-1 and SIRT-1, p- AMPK, UCP-1, UCP-3 and OXPHOS in both tissues of animals of the HFD + YM group. Briefly, the results of this study reaffirm YM as an excellent candidate in the strategy to obesity management. In addition to its anti-adipogenic potential, previously proven, the present study confirmed its efficacy on mitochondrial imbalances observed in obesity, through the restoration of mitochondrial function and consequent improvement in energy metabolism, benefits that evidently culminated in increased energy expenditure, weight loss and body fat in this model Doutorado Genética Animal e Evolução Doutora em Genética e Biologia Molecular CAPES

Orientador: Mônica Barbosa de Melo Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O glaucoma é a principal causa de cegueira irreversível no mundo, acometendo cerca de 70 milhões de indivíduos, com pelo menos 6,8 milhões de pessoas apresentando cegueira bilateral. As formas mais comuns são o glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA), seguido pelo glaucoma primário de ângulo fechado (GPAF). O GPAF é caracterizado por uma alteração anatômica na íris periférica, a qual leva ao bloqueio do fluxo do humor aquoso com consequente elevação da pressão intraocular (PIO). Suas formas clínicas incluem a crise aguda, processo tipicamente unilateral, mais agressivo e sintomático, levando a fortes dores oculares, dores de cabeça, visão borrada, náuseas e vômitos, e fechamento angular crônico, processo geralmente indolor e assintomático. Existe uma série de fatores predisponentes que foram extensivamente estudados na tentativa de explicar as variações populacionais e raciais na prevalência do GPAF. Além de fatores como sexo, idade e etnia, fatores anatômicos como 1) posição basal da íris, 2) medida da pressão diferencial e 3) resistência do canal íris-lente podem também contribuir para o desenvolvimento da doença. As predisposições étnicas e gênero-específicas e também o histórico familiar sugerem uma base genética para o desenvolvimento do GPAF. Dois Genome Wide Association Studies (GWAS) confirmaram a associação entre os loci rs11024102, rs3753841 e rs1015213 e o desenvolvimento do GPAF. O presente estudo propôs o estudo de características genéticas do GPAF em uma amostra de nossa população por meio da replicação dos loci previamente associados ao desenvolvimento da doença e o sequenciamento de exomas em duas famílias informativas para o GPAF. O estudo dos SNPs rs11024102, rs3753841 e rs1015213 não evidenciou associação entre os SNPs e o desenvolvimento do GPAF ou suas formas clínicas em nossa população. O estudo de exomas não evidenciou qual gene poderia estar causando a doença em ambas as famílias Abstract: Glaucoma is the leading cause of irreversible blindness worldwide, affecting approximately 70 million individuals, with at least 6.8 million people presenting bilateral blindness. The most common forms are primary open-angle glaucoma (POAG), followed by primary angle-closure glaucoma (PACG). Primary angle-closure glaucoma is characterized by an anatomical alteration in the peripheral iris, which leads to blockage of the aqueous humor outflow and consequent elevation of intraocular pressure (IOP). Its clinical forms include acute attacks, typically unilateral, more aggressive and symptomatic process, leading to severe eye pain, headaches, blurred vision, nausea and vomiting, and chronic angle closure, a process that is painless and asymptomatic. A number of predisposing factors are extensively studied in an attempt to explain geographic and racial variations in the prevalence of PACG. In addition to factors such as sex, age and ethnicity, anatomical factors such as 1) basal iris position, 2) differential pressure measurement, and 3) iris-lens resistance may also contribute to the development of the disease. Ethnical and gender-specific predispositions as well as family history suggest a genetic basis for the development of PACG. In an attempt to better comprehend the genetic aspects of PACG in a sample of the Brazilian population, two strategies have been used. A replication study was conducted in order to verify the frequency of rs11024102, rs3753841 and rs1015213 in PACG cases and controls as well as to determine their association with the disease and its clinical characteristics. These loci have been associated with the disease in two previous studies. Simultaneously, the evaluation of two informative families harboring PACG has been performed through exome sequencing. Our results showed no association between rs11024102, rs3753841 and rs1015213 with PACG development, as well as with its clinical forms. The exome study could not detect which gene might be responsible for the development of the disease in both studied families Doutorado Genética Animal e Evolução Doutor em Genética e Biologia Molecular CNPQ 157539/2013-0

Orientador: Edi Lúcia Sartorato Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A perda auditiva é dos distúrbios sensoriais humanos mais comum, afetando o desenvolvimento infantil, a integração social e a qualidade de vida dos pacientes. A neuropatia auditiva é um tipo de perda auditiva neurossensorial que consiste na alteração na condução do estímulo auditivo por acometimento das células ciliadas internas, do nervo auditivo ou das sinapses entre eles. É caracterizada pela ausência ou alteração das ondas no exame de potenciais evocados auditivos de tronco encefálico, com presença de emissões otoacústicas e/ou microfonismo coclear. Foram mapeados 4 loci relacionados à neuropatia auditiva não-sindrômica: DFNB9 (gene OTOF) e DFNB59 (gene PJVK), associados ao padrão de herança autossômico recessivo; AUNA1 (DIAPH3), autossômico dominante; e AUNX1, ligado ao cromossomo X. Além disso, mutações no gene da conexina 26 (GJB2) também já foram relacionadas à doença. Mutações no gene OTOF desempenham papel significativo, sendo que até o momento já foram identificadas mais de 100 mutações patogênicas em indivíduos com surdez não-sindrômica, em populações de origens variadas, com destaque para a mutação p.Q829X que foi encontrada em cerca de 3% dos casos de surdez na população espanhola. A identificação de alterações genéticas responsáveis pela neuropatia auditiva é um dos desafios que contribui para a compreensão das bases moleculares dos diferentes fenótipos da perda auditiva. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi pesquisar alterações moleculares em pacientes com diagnóstico clínico de neuropatia auditiva em uma amostra de pacientes brasileiros. Foram pesquisadas alterações genéticas em 15 pacientes, entretanto, a mutação p.Q829X no gene da otoferlina não foi identificada em nenhum dos casos. A mutação c.35delG no gene GJB2 foi encontrada em homozigose em três casos e em dois casos em heterozigose e a alteração IVS1+1g>a foi encontrada em heterozigose. Não se pode afirmar, se essas alterações no gene da conexina 26 estariam realmente associadas com a neuropatia auditiva nesses casos, ou se as emissões otoacústicas observadas nesses pacientes representam apenas atividade residual de células ciliadas externas que permaneceram vivas. No entanto, acredita-se que algumas mutações no gene GJB2 podem causar alterações nas células ciliadas internas e terminações nervosas das células ciliadas. Adicionalmente, foram rastreadas mutações no gene OTOF através do sequenciamento completo dos 48 éxons e da região 3¿ UTR. Foram encontradas alterações patogênicas através da técnica OTO-CGH array, sendo elas p.I1573T, p.W718X e p.D1709Efs*54. Apesar de existirem estudos moleculares relacionados à neuropatia auditiva em diferentes populações, é necessária uma maior investigação para estabelecer o envolvimento de alterações genéticas com a etiologia da neuropatia auditiva em indivíduos brasileiros. No gene PJVK foram encontradas alterações silenciosas e nenhuma alteração patogênica foi encontrada nesse gene, esse resultado está de acordo com os achados da literatura Abstract: Hearing loss is one of the most common human sensory disorders, affecting child development, social integration and quality of life of patients. Auditory neuropathy is a type of sensorineural hearing loss that consists of alteration in the conduction of the auditory stimulus due to involvement of the inner hair cells, the auditory nerve or the synapses between them. It is characterized by the absence or alteration of the waves in the auditory brainstem auditory evoked potentials, with presence of otoacoustic emissions and / or cochlear microphonism. Four loci related to non-syndromic auditory neuropathy were mapped: DFNB9 (OTOF gene) and DFNB59 (PJVK gene), associated with the autosomal recessive inheritance pattern; AUNA1 (DIAPH3), autosomal dominant; And AUNX1, bound to the X chromosome. In addition, mutations in the connexin 26 (GJB2) gene have also been related to the disease. Mutations in the OTOF gene play a significant role, and up to now more than 100 pathogenic mutations have been identified in individuals with non-syndromic deafness in populations of different origins, especially the mutation p.Q829X that was found in about 3 % Of deafness cases in the Spanish population. The identification of genetic alterations responsible for auditory neuropathy is one of the challenges that contributes to the understanding of the molecular basis of the different phenotypes of hearing loss. Thus, the objective of the present study was to investigate molecular alterations in patients with clinical diagnosis of auditory neuropathy in a sample of Brazilian patients. Genetic alterations were investigated in 15 patients; however, the mutation p.Q829X in the otoferlin gene was not identified in any of the cases. The c.35delG mutation in the GJB2 gene was found in homozygous in three cases and in two cases in heterozygosis and the IVS1 + 1g> a alteration was found in heterozygosity. It cannot be stated whether these changes in the connexin 26 gene would actually be associated with auditory neuropathy in these cases, or whether the otoacoustic emissions observed in these patients represent only residual activity of outer hair cells that remained alive. However, it is believed that some mutations in the GJB2 gene can cause changes in the inner hair cells and nerve endings of the hair cells. In addition, mutations in the OTOF gene were screened by complete sequencing of the 48 exons and the 3 'UTR region. Pathogenic alterations were found through the OTO-CGH array technique, being p.I1573T, p.W718X and p.D1709Efs * 54. Although there are molecular studies related to auditory neuropathy in different populations, more research is needed to establish the involvement of genetic alterations with the etiology of auditory neuropathy in Brazilian individuals. In the PJVK gene, silent alterations were found and no pathogenic alteration was found in this gene, this result is in agreement with the literature findings Mestrado Genética Médica Mestra em Ciências Médicas CAPES 01-P-3368/2017 CNPQ FAPESP

Orientador: Marcelo Lima Ribeiro Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Diariamente milhares de eventos moleculares danificam o DNA de nossas células. Para contrapor tais modificações existem eficientes vias de reparo ao DNA. A maquinaria de reparo do DNA desempenha um papel fundamental na manutenção da estabilidade genômica evitando que mutações ocorram. As enzimas de reparo ao DNA monitoram continuamente o DNA para corrigir qualquer dano que possa ser causado por agentes mutagênicos exógenos e endógenos. Além de mutações, que podem ser herdadas ou adquiridas somaticamente, alterações epigenéticas em genes de reparo do DNA têm sido associadas à carcinogênese. O câncer gástrico (GC) representa a segunda maior causa de mortalidade por câncer em todo o mundo. A doença se desenvolve a partir do acúmulo de várias alterações genéticas e epigenéticas. Entre os fatores de risco a infecção por "Helicobacter pylori" ("H. pylori") é considerado o principal fator associado ao desenvolvimento da doença. Sabe-se que esta bactéria induz a perda de características importantes na diferenciação epitelial, favorecendo a transição para um fenótipo mesenquimal, induz a formação de células tronco tumorais (CSCs) gástricas e, por conseguinte, a formação de tumores. As CSCs são resistentes ao tratamento de GC e, subsequentemente, responsável pela recorrência de tumores e metástases. Portanto, a determinação dos mecanismos de regulação e manutenção das CSCs são essenciais para compreender a fisiopatologia do GC. Assim, o presente estudo analisou o papel da infecção por "H. pylori" na regulação epigenética dos sistemas de reparo DSB e BER em células epiteliais e CSCs gástricas. Neste trabalho nós identificamos que a infecção por "H. pylori" estimula as principais características associadas à carcinogênese, tais como a proliferação celular, a translocação nuclear de 'beta'-catenina, indução de danos ao DNA e consequente indução de genes de reparo de forma dependente dos fatores de virulência bacteriano. Além disso, determinou-se que a indução do reparo ao DNA é mediada pela hiperacetilação das histonas H3 e H4 e hipometilação da região promotora. Determinou-se também que SOX9 é essencial para a manutenção das CSCs e estimula processos associados à carcinogênese gástrica, tais como proliferação celular, translocação nuclear de 'beta'-catenina, quimiorresistência, diminuição da apoptose e senescência. Além disso, encontramos uma interação em loop entre SOX9 e 'beta'-catenina. Interessantemente, demonstrou-se que SOX9 é induzido em resposta à "H. pylori" tanto em células epiteliais como em CSCs gástricas. Finalmente, observou-se que ATM está ativado em CSCs gástricas e infectadas por "H. pylori" e que SOX9 regula os genes de reparo ao DNA. A partir destes resultados, concluiu-se que a indução de reparo ao DNA ocorre em resposta à "H. pylori" para prevenir ou reduzir instabilidade genômica. Nossos resultados fornecem um novo mecanismo epigenético associado aos danos ao DNA causados pela infecção por "H. pylori" Abstract: Although thousands of DNA damaging events occur in each cell every day, efficient DNA repair pathways have evolved to counteract them. The DNA repair machinery plays a key role in maintaining genomic stability by avoiding the maintenance of mutations. The DNA repair enzymes continuously monitor the DNA to correct any damage that is caused by exogenous and endogenous mutagens. In addition to mutations, which can be either inherited or somatically acquired, epigenetic changes in DNA repair genes has been associated with carcinogenesis. Gastric cancer (GC) represents the second highest cause of cancer mortality worldwide. The disease develops from the accumulation of several genetic and epigenetic changes during the lifetime. Among the risk factors, "Helicobacter pylori" ("H. pylori") infection is considered the main driving factor to gastric cancer development. This bacteria induces the loss of key features of epithelial differentiation, the transition to a mesenchymal phenotype, endorses the transformation of gastric stem cells and therefore tumor formation. These cells with self-renewal properties (called cancer stem cells, CSCs) are also resistant to GC therapy and subsequently responsible for tumor recurrence and metastasis. Therefore, the determination of the mechanisms of CSCs regulation and maintenance are essential for understanding the pathobiology of GC. Thus, the current study analyzed the role of "H. pylori" infection on the epigenetic regulation of DSB and BER DNA repair systems in epithelial and CSCs. In this work we have identified that H. pylori infection stimulates key features of the development of cancer, such as cell proliferation, nuclear translocation of 'beta'-catenin, DNA damage and consequent induction of DNA repair genes response in a virulence factors dependent manner. In addition, it was determined that the induction of DNA repair is mediated by H3 and H4 hyperacetylation and hypomethylation of promoter region of certain genes. it was determined that SOX9 is essential for maintenance of CSCs and stimulate gastric key processes such as tumor cell proliferation, nuclear translocation 'beta'-catenin, chemoresistance, decreased apoptosis and senescence. In addition, we found a regulatory interaction loop between SOX9 and 'beta'-catenin. Interestingly, it was demonstrated that SOX9 is induced in response to "H. pylori" both in gastric epithelial cells as CSCs. Finally, it was observed that CSCs are regulated by ATM and there is an ATM increase in CSCs in response to H. pylori. From these results, we concluded that the DNA repair induction occurs in response to "H. pylori" to prevent or reduce chromosome aberrations. Our findings provide novel epigenetic mechanism associated to DNA damage caused by "H. pylori" infection Doutorado Genética Animal e Evolução Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2011/21710-0

Orientador: José Barreto Campello Carvalheira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A inflamação impacta diferentes fases da tumorigênese, exercendo efeitos desde a promoção tumoral, até as etapas de sobrevivência, angiogênese e metástase. O processo inflamatório crônico como ocorre nas doenças inflamatórias intestinais, retocolite ulcerativa e doença de Crohn, aumenta significativamente o risco de desenvolvimento de câncer colorretal (CCR). Dada a relevância epidemiológica do CCR em todo o mundo, o efeito do uso de agentes anti-inflamatórios na quimioprevenção do câncer associado a colite (CAC) ainda é pouco elucidado. O presente trabalho avaliou o papel da diacereína (DAR), um anti-inflamatório não esteroidal que atua inibindo a síntese da citocina pró-inflamatória IL-1?, no câncer associado a colite em animais. A DAR mostrou-se efetiva em reduzir o processo inflamatório no tecido colônico, reduzir o número e tamanho dos tumores de cólon, bem como reduzir a frequência de sangramento e diarreia nos animais com câncer de cólon induzido por azoximentano (AOM) e dextran-sulfato de sódio (DSS). O tratamento com DAR também reduziu os níveis de IL-1? e a ativação de mediadores inflamatórios intracelulares, como IKK e JNK, no cólon e em tecido tumoral, e aumentou a sobrevida dos animais. Como esperado, o tratamento com DAR não influenciou o crescimento tumoral em modelos nos quais o desenvolvimento do tumor é primariamente independente do processo inflamatório, como evidenciado nos xenoenxertos com células B16 e HT-29. A DAR não exerceu efeitos sobre os processos de proliferação e apoptose celular. Em consonância, o tratamento com DAR reduziu a atividade de proteínas envolvidas na proliferação celular, como AKT e P70 no cólon, mas não no tumor. Dessa forma, os resultados sugerem que a DAR foi capaz de atenuar o processo inflamatório mediante redução da expressão de IL-1? no cólon dos animais e consequentemente reduziu o desenvolvimento do CAC. Ademais, a DAR revela-se como um potencial agente quimiopreventivo para o câncer de cólon Abstract: Inflammation affects different stages of tumorigenesis and it exerts effects in tumor promotion, survival, angiogenesis and metastasis. Chronic inflammation, which occurs in inflammatory bowel disease, as ulcerative colitis and Crohn¿s disease, significantly increases the risk of developing colorectal cancer (CRC). Considering the epidemiological importance of CCR throughout the world, the effect of anti-inflammatory agents in colitis associated cancer (CAC) chemoprevention is still poorly elucidated. This study aimed to evaluate the role of diacerein (DAR), a non-steroidal anti-inflammatory that acts inhibiting the synthesis of IL-1?, a proinflammatory cytokine, in CAC in animals. DAR showed to be effective in inhibit inflammation in colonic tissue, reduce the number and size of colon tumors as well as decrease the frequency of rectal bleeding and diarrhea in animals with colon cancer induced by azoxymethane (AOM) and dextran sulfate de sodium (DSS). In parallel, DAR treatment reduced IL-1? levels and the canonical intracellular inflammatory signaling, such as IKK and JNK, in colon and tumor tissue, as well as increased animals survival. DAR treatment did not affect cancer xenograft growth, which the tumor development is primarily independent of the inflammatory process, as evidenced by B16 and HT-29 cells xenograft. DAR did not exert effect on proliferation and apoptosis cellular. Consistently, the DAR treatment reduced the activity of proteins involved in cellular proliferation, such as p70 and AKT in colon tissue, but not in tumor. Thus, our results indicate that DAR attenuates the inflammatory process by reducing the IL-1? expression in the colon of animals, and consequently reduced the CAC development. Moreover, our data revealed DAR as a potential chemopreventive agent for colon cancer Mestrado Clínica Médica Mestra em Ciências

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-06T20:54:03Z No. of bitstreams: 1 Natalia da Silva Lima Tese completa.pdf: 1644415 bytes, checksum: 9265d001dbaf82644d21ef8cf3faae0e (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-06T20:54:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Natalia da Silva Lima Tese completa.pdf: 1644415 bytes, checksum: 9265d001dbaf82644d21ef8cf3faae0e (MD5) Previous issue date: 2014-02-20 Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Yerba mate (Ilex paraguariensis) contributes to weight loss and insulin resistance improvement, even in combination with high-fat diet, arousing the interest of its use as a possible strategy to obesity control. Previously, we demonstrated that early weaned rats develop obesity, hyperleptinemia, insulin and leptin resistance in adulthood. Here we evaluate the benefits of aqueous extract of Ilex paraguariensis on body composition, hormonal and lipid profiles, leptin signaling, neuropeptides involved in the control of food intake, inflammatory markers and oxidative stress. To induce the early weaning, the nipples of lactating rats were blocked with a bandage for interrupt the offspring's access to breast milk in the last 3 days of lactation (EW group). Pups of C group had free access to milk during 21 days. At 150 days, EW offspring were subdivided into: EW and EW + Mate, according to the treatment (water or aqueous extract of yerba mate 1g/kg body weight, respectively), by gavage daily for 30 days. C offspring received water by gavage for 30 days. At 180 days, all groups were killed by decapitation. Data were significant when p

Orientadores: Mônica Barbosa de Melo, José Paulo Cabral de Vasconcellos Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O glaucoma é uma das principais causas de cegueira irreversível no mundo, acometendo cerca de 70 milhões de indivíduos, com pelo menos 6,8 milhões de pessoas apresentando cegueira bilateral. Fisiopatologicamente, o glaucoma é uma doença degenerativa do nervo óptico, frequentemente associada a uma elevada pressão intra-ocular (PIO) e caracterizada pela escavação do disco óptico e alterações no campo visual. Diferentes genes associados ao glaucoma têm sido identificados por meio de estudos de ligação, mas alterações nesses genes representam uma pequena proporção dos genes envolvidos no desenvolvimento da doença. Os genes identificados até o momento são TIGR/MYOC, OPTN, WDR36, NTF4 e ASB10, sendo que o último, identificado no ano de 2012, foi inicialmente mapeado em 1999 (lócus GLC1F) a partir do estudo de famílias com glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA). O gene ASB10 está localizado na região 7q36.1 (lócus GLC1F) e possui 6 éxons, sendo que sua região de leitura compreende os éxons 1 a 5. Pertencente à família de proteínas ASB, a proteína ASB10 possui uma região central com sete repetições de anquirinas codificada pelos éxons 2 e 3 e uma região C-terminal SOCS Box codificada pelo éxon 5. Pasutto et al. 2012 observaram que a variante Thr255Thr segregava com o glaucoma em uma família, tornando-o candidato a gene causador do GPAA no lócus GLC1F. O objetivo deste estudo do tipo caso-controle, foi avaliar a presença de mutações no gene ASB10 em 100 pacientes afetados por GPAA, e 100 indivíduos controle, por meio das técnicas de PCR e sequenciamento. A análise dos sequenciamentos permitiu a identificação de 13 mutações, sendo 8 do tipo "missense" e 5 sinônimas. Dentre as 13 variantes, quatro não haviam sido previamente reportadas ou encontram-se descritas em bases de dados. A análise estatística pelo teste qui-quadrado não mostrou associação entre alterações no gene ASB10 e o desenvolvimento de GPAA (p = 0.3377). Alterações foram encontradas na mesma proporção entre indivíduos do grupo com GPAA e do grupo controle. As variantes do tipo "missense" foram submetidas a duas análises in silico, que sugerem que tais alterações não causam danos relacionados à estrutura ou à função protéica ou possuem relação com o desenvolvimento da doença. Não foi possível observar relação entre alterações no gene ASB10 e níveis elevados de PIO. Em conclusão, sugere-se que alterações no gene ASB10 possam não estar associadas à etiologia do GPAA na amostra da população estudada Abstract: Glaucoma is an optic nerve degenerative disease, often associated with high intraocular pressure (IOP) and characterized by excavation of the optic disc and visual field loss. Some genes associated with glaucoma have been identified, but there is a small contribution of variants in these genes in disease development. The ASB10 gene, identified in 2012, was first mapped in 1999 through the study of families with primary open angle glaucoma (POAG). ASB10 is located at chromosome 7q36.1 (GLC1F locus) and has 6 exons, with an open reading frame region that comprises exons 1-5. Belonging to the family of ASB proteins, the ASB10 protein has a central region with seven ankyrin repeats encoded by exons 2 and 3 and a C-terminal SOCS Box region encoded by exon 5. The aim of this case-control study was to evaluate the presence of variations in the ASB10 gene in 100 patients with POAG and 100 controls. Coding sequence and intron-exon boundaries were evaluated through PCR and direct sequencing. Sequencing analysis allowed the identification of 13 variants, 8 missense and 5 synonymous. Among the 13 variants, four had not been previously reported or are not described in databases. Variants were observed in the same proportion among individuals from the POAG group and the control group. The missense variants that were described for the first time were subjected to in silico analysis, which suggest that such changes might not cause damages related to protein structure or function. It is important to note that four missense variants were present only in the POAG group including, A75E, R222G, P387T, and R438C. No association was observed between alterations in the ASB10 gene and high levels of IOP. Changes in the ASB10 gene may not be associated with the etiology of POAG in this sample of the Brazilian population. Functional analysis and an extended cohort may help in the evaluation of the role of ASB10 in relation to the etiology of POAG Mestrado Clínica Médica Mestre em Clínica Médica

Orientador: José Butori Lopes de Faria Textos em português e inglês Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: No diabetes mellitus (DM), o estresse oxidativo e a redução do óxido nítrico (NO) contribuem para a patogênese da nefropatia diabética. O desacoplamento da NO sintase endotelial (eNOS) faz com que essa sintase produza superóxido ao invés de NO. O objetivo do presente estudo foi investigar o potencial do chá verde (CV) na melhora do desacoplamento da eNOS no DM. Em ratos com DM induzido por estreptozotocina, a biodisponibilidade NO estava reduzida pelo desacoplamento da eNOS, caracterizada pela redução nos níveis de BH4 e pela redução da estrutura conformacional ativa da eNOS, avaliada pela expressão da razão dímero/monômero. O tratamento com chá verde foi capaz de reverter estas abnormalidades. Além disso, células mesangiais humanas imortalizadas (ihMCs) cultivadas sob condições de alta glicose (30mM) exibiram um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e uma redução na biodisponibilidade de NO, que foram revertidos pelo CV. A produção de BH4 e a atividade da guanosina trifosfato ciclohidrolase I (GTPCH I), enzima importante na formação do BH4, diminuíram em ihMCs expostas a alta glicose e foram normalizados pelo CV. Administração exógena de BH4 nas ihMCs reverteu o aumento das ERO e declínio da produção de NO induzido pela alta glicose. Contudo, a co-administração de CV e BH4 não resultou em uma redução adicional na produção de ERO, sugerindo que a redução na produção de ERO pelo CV é um efeito secundário ao desacoplamento da eNOS. Em resumo, CV reverte a redução dos níveis de BH4, induzida pelo DM, melhorando o desacoplamento da eNOS, levando ao aumento da biodisponibilidade de NO e redução do estresse oxidativo, duas anormalidades que são envolvidas na patogêneses da nefropatia diabética Abstract: The aim of the present study was to investigate the potential of green tea (GT) to improve uncoupling endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in diabetic conditions. In rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus (DM), nitric oxide (NO) bioavailability was reduced by uncoupling eNOS, characterized by a reduction in BH4 levels and an increase in the eNOS dimer/monomer ratio. GT treatment ameliorated these abnormalities. Moreover, immortalized human mesangial cells (ihMCs) exposed to high glucose (HG) levels exhibited a rise in reactive oxygen species (ROS) and a decline in NO levels, which were reversed with GT. BH4 and the activity of guanosine triphosphate cyclohydrolase I decreased in ihMCs exposed to HG and were normalized by GT. Exogenous administration of BH4 in ihMCs reversed the HG-induced rise in ROS and decline in NO production. However, co-administration of GT with BH4 did not result in a further reduction in ROS production, suggesting that reduced ROS with GT was indeed secondary to uncoupled eNOS. In summary, GT reversed the diabetes-induced reduction of BH4 levels, ameliorating uncoupling eNOS, thus increasing NO bioavailability and reducing oxidative stress, two abnormalities that are involved in the pathogenesis of diabetic nephropathy Doutorado Ciências Básicas Doutor em Clínica Médica

Orientador: Gabriela Alves Macedo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: A tanino acil hidrolase (EC 3.1.1.20), conhecida como tanase, é uma enzima com habilidade de atuar em ligações éster e depsídicas de taninos hidrolisáveis e também foi descrita como capaz de hidrolisar polifenóis como ácido clorogênico, epicatequina galato e epigalocatequina galato. Os polifenóis, ou compostos fenólicos, estão distribuídos em uma ampla variedade de fontes vegetais e estão relacionados à prevenção de câncer e doenças cardiovasculares. No entanto, os polifenóis ocorrem frequentemente como glicosídeos ou outros conjugados, o que pode comprometer a biodisponibilidade e os efeitos benéficos destes compostos à saúde, sendo necessária a biotransformação destes conjugados no trato gastrointestinal. Como alternativa tecnológica, a biotransformação enzimática dos polifenóis ou de suas fontes vegetais também pode liberar estes compostos de seus conjugados e consequentemente, melhorar a atividade funcional de tais antioxidantes. O objetivo do presente trabalho foi estudar a especificidade do extrato semipurificado de tanase de Paecilomyces variotii frente a diferentes padrões comerciais de polifenóis e avaliar sua atuação na matriz alimentar suco de laranja quanto a modificações em características físico-químicas, perfil fenólico e atividade antioxidante. O estudo da especificidade do extrato semipurificado de tanase foi realizado por CLAE-DAD e ESI-MS e o suco de laranja foi avaliado quanto aos parâmetros acidez total titulável, sólidos totais, pH, teor de vitamina C e fenólicos totais. As alterações no perfil fenólico do suco de laranja foram avaliadas por CLAE-DAD e a atividade antioxidante pelos métodos in vitro ORAC e de sequestro de radicais DPPH. Os resultados obtidos por CLAE-DAD e ESI-MS mostraram que não houve hidrólise dos padrões ácido clorogênico, ácido ferúlico, ácido elágico, resveratrol, quercetina e hesperetina pelo extrato semipurificado de tanase nas condições empregadas para o teste. No entanto, foi observado a hidrólise da ligação entre a aglicona e o dissacarídeo dos flavonoides rutina, naringina e hesperidina, gerando respectivamente os produtos quercetina, naringenina e hesperetina, e indicando uma atividade diglicosídica do extrato semipurificado de tanase. Para o suco de laranja, os resultados de acidez titulável, pH, sólidos solúveis e vitamina C não apresentaram diferença significativa após o tratamento enzimático do suco com extrato semipurificado de tanase, no entanto, houve um aumento de 16,8% no teor de fenólicos totais. Além disso, foi verificada uma modificação no perfil polifenólico do suco de laranja obtido por CLAE-DAD, resultando em um aumento na atividade antioxidante do suco biotransformado em aproximadamente 50% pelo método ORAC e 70% pelo método DPPH. Os padrões comerciais hesperidina e naringina biotransformados pelo extrato semipurificado de tanase também apresentaram maior atividade antioxidante do que o controle sem reação. Pelo que se tem conhecimento, a hidrólise de flavonoides glicosilados por tanase é um relato inédito na literatura e, portanto este trabalho fornece novos substratos para o extrato semipurificado de tanase de P. variotii e confirma que a biotransformação é uma boa estratégia para melhorar a atividade antioxidante in vitro de polifenóis e de suco de laranja Abstract: Tannin acyl hydrolases (EC 3.1.1.20), commonly named as tannases, are enzymes able to act on ester and depside bonds of hydrolysable tannins and have also been described to hydrolyse polyphenols such as chlorogenic acid, epicatechin gallate and epigallocatechin gallate. Polyphenols, or phenolic compounds, are widely distributed in the plant kingdom and are related to the prevention of cancer and cardiovascular diseases. However, polyphenols are often found as glycosides or other conjugates, which may affect their bioavailability and health benefits, being necessary the biotransformation of these compounds in the gastrointestinal tract. As a technological alternative, the enzymatic biotransformation of the polyphenols or their plant sources can also release these compounds from their conjugates and therefore improve the functional activity of these antioxidants. The objectives of the present study were to investigate the specificity of the crude extract of tannase from Paecilomyces variotii in reaction with differents comercial standards of phenolic compounds and to evaluate the effects on the physico-chemical properties, phenolic profile and antioxidant activity of the orange juice reacted with the crude extract of tannase. The specificity study of the crude extract of tannase was performed by HPLC-DAD and ESI-MS. The orange juice was subject to analysis of titratable acidity, pH, and total solids, vitamin C and total phenolics contents. Furthermore, changes in the phenolic profile of orange juice were analyzed by HPLC-DAD and the antioxidant capacity of the samples was tested by in vitro DPPH and ORAC assays. The results obtained by HPLC-DAD and ESI-MS did not show hydrolysis of the standards chlorogenic acid, ferulic acid, ellagic acid, resveratrol, quercetin and hesperetin at test conditions. However, the crude extract of tannase was able to hydrolyse the glucosidic bond between disaccharide and aglycone of the flavonoids rutin, hesperidin and naringin, yielding as products quercetin, hesperetin and naringenin, respectively, and indicating a diglycosidase activity of the crude extract of tannase. For orange juice, the results of acidity, pH, soluble solids and vitamin C showed no significant difference after enzymatic treatment with the crude extract of tannase, but there was an increase of 16.8% in total phenolic content. In addition, there was an extensive modification in the polyphenolic profile from the biotransformed orange juice obtained by HPLC-DAD, which resulted about 50% and 70% increase in orange juice antioxidant activity by ORAC and DPPH methods, respectively. The standards hesperidin and naringin biotransformed by crude extract of tannase also showed higher antioxidant activities than the control. To the best of our known, this is the first report about tannase which could hydrolyze flavonoid glycosides and, therefore this work provides new substrates for crude extract of tannase from P. variotii and confirms that biotransformation is a good strategy to improve in vitro antioxidant activity of polyphenols and orange juice Mestrado Ciência de Alimentos Mestra em Ciência de Alimentos

Ilex paraguariensis A. St.-Hil., conhecida como erva-mate, é uma árvore nativa da América do Sul onde as folhas e pequenos ramos secos são usados para preparar o chimarrão. Possui uma composição química complexa, da qual pode-se vislumbrar muitas aplicações potenciais, que poderiam vir a ampliar o emprego da erva-mate e, conseqüentemente, do mercado para esta matériaprima. As folhas de I. paraguariensis contem xantinas, flavonóides, derivados do ácido cafeoilquínico e uma quantidade significativa de saponinas triterpenóides (cerca de 10%). Neste estudo foram investigados quimicamente extratos hidroetanólicos de I. paraguariensis, de suas frações, e de algumas substâncias de referência, como também os efeitos desses na atividade antioxidante, no acúmulo de gordura (TG) e na atividade lipolítica em cultura de células 3T3-L1. Neste sentido obtivemos extratos brutos hidroetanólicos de folhas verdes (EBV) e secas (EBS) maceradas, os quais foram fracionados originando 8 frações. Ácido ursólico, ácido clorogênico e rutina foram quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Também foi realizada a determinação de fenóis por catequinas e pela precipitação por proteínas. A fração fenólicos da folha verde apresentou atividade antioxidante superior às substâncias de referência rutina e ácido clorogênico, enquanto que o ácido ascórbico apresentou a melhor atividade. O ensaio com brometo de 3- (4,5-dimetil)difenil tetrazólio (MTT) demonstrou que os extratos e padrões testados entre 50 μg/mL e 1000 μg/mL não foram citotóxicos para as células 3T3-L1. Dentre as frações testadas para a atividade na adipogênese, a fração resíduo aquoso da folha verde (RAV) apresentou maior inibição (24%) no teor de TG na concentração de 100 μg/mL. Dentre as substâncias de referência testadas, os melhores resultados foram obtidos com o ácido caféico nas concentrações de 300 μg/mL e da rutina na concentração de 100 μg/mL. Em relação à ativividade na lipólise, a fração RAV apresentou o melhor resultado nas concentrações de 50 e 75 μg/mL. Entre as substâncias de referência, o ácido gálico apresentou resultado significativo em relação à atividade antilipolítica nas concentrações de 500 e 1000 μg/mL. Para elucidar em qual estágio da adipogênese e da lipólise os extratos, frações e padrões atuam, são necessários a investigação da avaliação da ação desses extratos e frações através de análise de expressão de genes ligados a adipogênese e a atividade lipolítica. Ilex paraguariensis A. St.-Hil., known as maté, is a native tree from South América which leaves and twigs are used to prepare the traditional beverage “chimarrão”. It has a complex chemical composition that might have many potential applications in order to increase the use of maté and then, in consequence, increase the market demand of this raw material. Leaves from I. paraguariensis have xanthines, flavonoids, cafeoylquinic acid derivatives and triterpenoid saponins (ca. 10%). Herein, it was investigated, both chemically and biologically, the hydroethanolic extracts of leaves from I. paraguariensis, its fractions, and some reference substances, as the antioxidant activity, the adipogenesis (TG) and lipolytic activities in 3T3-L1 cell culture. So, it was prepared hydroethanolic extracts of fresh (EBV) and dried leaves (EBS) by maceration, which submitted to further fractionation furnished 8 fractions. Ursolic acid, chlorogenic acid and rutin were determined in these samples by liquid chromatography (HPLC) Also, phenolic constituents were determined using catequines and protein precipitation methods. The phenolic fraction from fresh leaves presented better antioxidant activity than the tested reference substances (rutin and chlorogenic acid), while ascorbic acid presented the best activity. The MTT assay showed that the tested extracts and fractions among 50 μg/mL and 1000 μg/mL did not present citotoxicity to 3T3-L1 cells. Among the tested fractions to adipogenesis, the aqueous residue fraction from fresh leaves (RAV) presented best inibition (24%) of TG at 100 μg/mL. Among tested reference substances, cafeic acid at 300 μg/mL, and rutin at 100 μg/mL presented the best results. In relation to the lipolytic activity, the RAV fraction presented best results at 50 e 75 μg/mL and, among the tested reference substances, galic acid presented best results at 500 e 1000 μg/mL. In order to understand the mechanim of action of these fractions and reference substances at the adipogenesis and lipolysis further studies will be performed specially those about the influence on the gene expression.