Search

Giriş: Son derece agresif bir malign tümör olan oral skuamöz hücreli karsinom, baş ve boyun kanserlerinin bir alt türüdür ve dünya çapında 6.sırada yer almaktadır. Oral kanserlerin tedavisinde kullanılan temel tedavi yöntemleri cerrahi, radyoterapi ve/veya kemoterapidir. İlaçların yeniden konumlandırması FDA-onaylı mevcut ilaçların, başta kanser olmak üzere farklı hastalıkların tedavisindeki potansiyel etkilerini belirlemek amacıyla kullanılan bir ilaç tasarım yöntemidir. Bu kapsamda Tip 2 diyabet tedavisinde kullanılan Metformin ve laktik asidoz tedavisinde kullanılan Dikloroasetat, FDA onaylı metabolik ajanlardır ve tümör metabolizması üzerindeki etkileri nedeniyle kanser tedavisinde kullanılabilecek potansiyele sahiplerdir.Amaç: Bu çalışmanın amacı; oral skuamöz hücreli karsinom hücre hattında (UPCI-SCC-131) Metformin ve Dikloroasetat'ın hücre canlılığı, HIF-1α and PDK-1 ekspresyonları ve mitokondiyal metabolizma üzerindeki etkilerinin incelenmesidir.Yöntem: İlk olarak, UPCI-SCC-131 hücreleri normoksik (%20 O2, 37ﹾ) ve hipoksik koşullar (%1 O2, 37ﹾ) altında 72 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda Metformin ve Dikloroasetat ile muamele edildi ve IC50 değerleri belirlendi. Metformin ve DCA kombinasyonlarının sinerji gösterip göstermediği CompuSyn software ile incelendi. Belirlenen ilaç dozları 48 saat boyunca hücrelere uygulandıktan sonra HIF-1α ve PDK-1 mRNA ekspresyon düzeyleri Real-Time PCR; protein ekspresyon düzeyleri ise Western Blot yöntemi ile incelendi. Bunun yanı sıra ilaçların metabolizma üzerindeki etkileri Seahorse XF Analyzer ile değerlendirildi.Bulgular: Metformin ve Dikloroasetatın normoksik koşullardaki IC50 değerleri sırasıyla 4mM ve 30mM iken; hipoksik koşullarda 14mM ve 40mM bulundu. Tüm kombinasyon gruplarındaki CI değerlerinin (0,46-0,80) 1'in altında olması, UPCI-SCC-131 hücrelerinde Metformin ve DCA'nın hücre canlılığı üzerinde sinerjistik bir etkiye sahip olduğunu gösterdi. Metformin uygulaması sonucunda UPCI-SCC-131 hücrelerinde HIF-1α ve PDK-1 mRNA ekspresyon düzeylerinin değişmediği, protein ekspresyon düzeylerinin ise anlamlı olarak azaldığı belirlendi. Dikloroasetat uygulanan hücrelerde ise PDK-1 mRNA ve protein ekspresyonlarının anlamlı olarak azaldığı, HIF-1α protein ekspresyon düzeylerinin ise doza bağlı olarak azaldığı belirlendi. Ek olarak, metabolik akış deneyleri uygulandığında ise UPCI-SCC-131 hücrelerinin hücresel fenotipinin Metformin kullanımı ile glikolitik yöne kaydığı, Dikloroasetat kullanımı ile enerjitik yöne kaydığı gösterildi.Sonuç: Sonuç olarak elde ettiğimiz verilerin gelecekte oral skuamöz hücreli karsinom metabolizmasını hedef alan ve anti-tümörijenik özelliklere sahip yeni terapötik kombinasyonların geliştirilmesine katkıda bulunacağını öngörmekteyiz. Introduction: Oral squamous cell carcinoma, highly aggressive malignant tumor, is sixth cancer worldwide and a subtype of head and neck cancers. The basic treatment methods of oral cavity cancer are surgery, radiotherapy and/or chemotherapy. Drug repositioning is a drug designing method in which available FDA-approved drugs are determined for their potent effects in different diseases especially cancer. In this context, Metformin, used in type 2 diabetes, and Dichloroacetate (DCA), used in lactic acidosis, are FDA approved drugs and have potential in cancer therapy for the effects on tumor metabolism.Objective: The aim of this study is to investigate the effects of Metformin and Dichloroacetate on cell viability, HIF-1α and PDK-1 expressions, and mitochondrial metabolism in the oral squamous cell carcinoma cell line (UPCI-SCC-131).Method: At first, UPCI-SCC-131 cells were treated with Metformin and Dichloroacetate at different concentrations for 72 hours under normoxic (20% O2, 37ﹾC) and hypoxic conditions (1% O2, 37ﹾC) and IC50 values were determined. The synergism of Metformin and DCA were analyzed with CompuSyn software. Gene and protein expression levels of HIF-1α and PDK-1 were examined by Real-Time PCR and Western Blot, respectively. In addition, the effects of drugs on metabolism were evaluated by Seahorse XF Analyzer.Results: The IC50 values of Metformin and Dichloroacetate under normoxic conditions were 4mM and 30mM; under hypoxic conditions were 14mM and 40mM, respectively. Combination index values in all combination groups (0.46-0.80) below 1 showed that Metformin and DCA in UPCI-SCC-131 cells had a synergistic effect on cell viability. After Metformin treatment, HIF-1α and PDK-1 mRNA expression levels did not change and protein expression levels decreased significantly in UPCI-SCC-131 cells. PDK-1 mRNA and protein expressions were significantly decreased in Dichloroacetate-treated cells. In addition, metabolic flow experiments showed that Metformin shifted cellular phenotype into glycolytic pathway and Dichloroacetate into the energetic pathway.Conclusion: We conclude that the data we have obtained will contribute to the development of new therapeutic combinations with anti-tumorigenic properties which targeted the oral squamous cell carcinoma metabolism in the future. 94

Giriş: Kolorektal kanser kaynaklı ölümlerin çoğu, primer tümörden çok metastatik hastalık sonucu gerçekleşmektedir; bu nedenle akciğer, prostat ve meme kanserinden sonra en sık ölümle sonuçlanan kanser türüdür. Ekstrasellüler alanda yer alan ve primer olarak ekstrasellüler matriksin yıkımından sorumlu olan matriks metalloproteinazların (MMP'ler) kolorektal karsinogenezi ve metastazını desteklediği bilinmektedir. Bununla birlikte küçük GTPaz'lar ailesinden olan RhoC, hücre içi sitoiskelet elemanlarının regülasyonunu sağlayarak hücre migrasyonunda rol almakta ve kanser metastazı ile yüksek korelasyon göstermektedir. Amaç: Bu çalışmanın amacı; primer ve metastatik kolon kanser hücrelerinde sitoiskelet elemanların regülasyonunda rol alan RhoC'nin ekstrasellüler proteolizden sorumlu olan MMP'ler arasındaki olası ilişkinin invazyon ve metastaz açısından araştırılmasıdır.Materyal ve Yöntem: İlk olarak, primer (HT-29, HCT116, SW480) ve metastatik (SW620 ve LoVo) kolon kanser hücrelerinde RhoC gen ekspresyonu siRNA tekniği ile susturuldu. Bu susturum sonucunda ROCK-I, mDia, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-14, TIMP-1 ve TIMP-2 mRNA ekspresyon düzeyleri Real Time PCR; MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-14 ve TIMP-2 protein ekspresyon düzeyleri Western Blot tekniği ile incelendi. Bunun yanı sıra MMP-2 ve MMP-9 salınım ve aktivite düzeyleri Jelatin Zimografi tekniği ile belirlendi. RhoC susturumu sonrası kolon kanser hücrelerinin migrasyon ve invazyon yetenekleri Hücre Migrasyonu ve Matrijel İnvazyon teknikleri ile değerlendirildi.Bulgular: RhoC'nin baskılanması sonucunda HT-29 hücrelerinde MMP-9 mRNA ekspresyon düzeylerinin azaldığı, TIMP-2 mRNA ve protein ekspresyon düzeylerinin ise anlamlı olarak arttırdığı belirlendi. HCT116 hücrelerinde ise MMP-9 mRNA ekspresyonunun anlamlı olarak azaldığı, TIMP-1 mRNA ekspresyon düzeylerinin ise arttığı belirlendi. Ayrıca RhoC inhibisyonu ile HT-29 hücrelerinde proMMP-2, proMMP-9 ve aktif MMP-9, SW480 hücrelerinde ise proMMP-2 aktivitelerinin azaldığı görüldü. Ek olarak, RhoC susturulan HT-29, SW480, SW620 ve LoVo hücre hatlarında hücre migrasyonunun ve HT-29, HCT116, SW480 SW620 ve LoVo hücre hatlarında hücre invazyonunun baskılandığı belirlendi.Tartışma: Sonuç olarak elde ettiğimiz verilerin ileride kolorektal kanser metastazının önlenmesi amacıyla; hem MMP aktivitesinin hem de RhoC sinyal yolaklarının baskılanmasını hedef alan, antimetastatik özellikte yeni terapötik ajanların geliştirilmesine katkı sağlayacağını öngörmekteyiz. Introduction: Most of deaths derived from colorectal cancer are due to metastasis rather than primary tumor; therefore colorectal cancer is the fourth leading cause of cancer death after lung, prostate and breast cancers. It is known that matrix metalloproteinases (MMPs) which are primarily responsible for degradation of extracellular matrix and locate in the extracellular area contribute carcinogenesis and metastasis of colorectal cancer. In addition RhoC, a member of small GTPases family, is involved in cell migration by regulating cytoskeletal components and highly correlated with metastasis.Aim: The aim of this research is to investigate the possible relation between RhoC that regulates the cytoskeletal components and MMP that is responsible for extracellular proteolysis in terms of invasion and metastasis in primary and metastatic colon cancer cells.Material and Methods: At first, RhoC gene expression was silenced with siRNA transfection in primary (HT-29, HCT-116 and SW480) and metastatic (SW620 and LoVo) colon cancer cells. After this transfection ROCK-I, mDia, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-14, TIMP-1 and TIMP-2 mRNA expression levels were investigated with Real Time PCR; the protein expression levels of MMP-2, MMP-9, MMP-7, MMP-14 and TIMP-2 were determined with Western Blot. In addition, secretion and activity levels of MMP-2 and MMP-9 were detected with Gelatin Zymography. After RhoC silencing, migration and invasion capability of colon cancer cells were evaluated with Cell Migration and Matrigel Invasion techniques. Results: The knockdown of RhoC resulted in decreased MMP-9 mRNA expression levels and significantly increased TIMP-2 mRNA and protein expression levels in HT-29 cells. In HCT116 cells, MMP-9 mRNA expression levels were significantly decreased and TIMP-1 mRNA expression levels were increased. Furthermore, RhoC inhibition declined proMMP-2, proMMP-9 and active MMP-9 activities in HT-29 cells and also proMMP-2 activity in SW480 cells. In addition, cell migration was inhibited in RhoC silenced HT-29, SW480, SW620 ve LoVo cell lines and cell invasion was decreased in RhoC silenced HT-29, HCT116, SW480 SW620 and LoVo cells.Conclusion: In conclusion, we predict that our results may contribute for developing new anti-metastatic therapeutic agents that target both RhoC signalling and MMP activity to prevent colorectal cancer metastasis. 155

Giriş: Anaplastik tiroid kanseri en agresif neoplazilerden biridir. Sodyum-iyod simporter ve TSH-reseptöründeki ekspresyon kayıpları, tiroidektomi ya da radyoaktif iyodür tedavisi gibi konvensiyonel tedavilerin sonuçsuz kalmasına neden olmaktadır. Ameliyat, radyoterapi ve agresif kemoterapi ajanlarının birlikte kullanıldığı multimodel tedavilere rağmen, sağ kalım oldukça düşüktür. Bu nedenle anaplastik tiroid kanserinin tedavisinde tümör büyümesini inhibe edici ve diferansiyasyonu tetikleyici, kemoterapötikler ile kullanımında düşük sitotoksisite gösteren ajanların geliştirilmesi önemlidir. Amaç: Bu çalışmanın amacı Nthy-ori-3-1 hücreleri ile 8505C hücrelerinde N-Myc Dowstream Regulated Gene-2 (NDRG2) ve Sodyum-İyot Simporter (NIS) gen ekspresyonlarındaki olası farkın karşılaştırılması ve 1,25-dihidroksivitamin D3'ün (kalsitriol) farklı sürelerde inübasyonunun 8505C hücrelerinde hücre canlılığı ile NDRG2 ve NIS gen ekspresyonları üzerindeki meydana getirebileceği olası değişimlerin incelenmesidir. Materyal ve Yöntemler: Çalışma, Nthy-ori-3-1 normal insan tiroid folliküler epitelyal hücreleri ile 8505C indiferansiye insan anaplastik tiroid kanseri hücreleri üzerinde gerçekleştirildi. Her iki hücre hattındaki başlangıç NDRG2 ve NIS gen ekspresyon düzeyleri Real-Time Polimerase Chain Reaction (RT-PCR) ile incelendi. Kalsitriolün 8505C hücre hattında, hücre canlılığı üzerindeki etkisi WST-1 testi ile değerlendirildi. Kalsitriolün 8505C hücrelerinde NDRG2 ve NIS gen ekspresyonları üzerinde meydana getirdiği olası değişimler de RT-PCR ile değerlendirildi. Bulgular: Nthy-ori-3-1 hücrelerinde NDRG2 ve NIS gen ekspresyonları, 8505C hücrelerine göre anlamlı ölçüde yüksek bulundu. WST-1 bulgularına göre 8505C hücrelerinin 60 nM kalsitriol ile 24,48 ve 72 saat inkübasyonları sonucu, kalsitriolün hücre canlılığı üzerinde sırasıyla %62, %63 ve %56 düzeyinde azalma meydana getirdiği gözlendi. 60 nM kalsitriol ile 24 ve 48 saat inkübe edilen 8505C hücreleri ile kalsitriol uygulanmayan kontrol grubu arasında NDRG2 ve NIS gen ekspresyonları bakımından anlamlı bir fark bulunmadı.Sonuç: Nthy-ori-3-1 hücrelerinde NDRG2 ve NIS gen ekspresyonları 8505C hücrelerine göre anlamlı ölçüde yüksek bulundu. Ancak kalsitriolün 8505C hücrelerinde NDRG2 ve NIS gen ekspresyonları üzerinde anlamlı bir fark yaratmadığı saptandı.Anahtar Kelimeler: Anaplastik tiroid kanseri, 1,25-dihidroksivitamin D3, N-myc Donwstream Regulated Gene-2, Sodyum-İyot Simporter Background: Anaplastic thyroid cancer is one of the most agressive neoplasm. The loss of expressions in sodium-iodide symporter and TSH-receptor leads to failed conventional therapies such as thyroidectomy and radioactive iodide treatment. Despite surgery, radiotherapy and chemotherapy agents used in combination with aggressive multimodal therapies, the survival rate is extremely low. Thus, it is important to develop tumor growth inhibiting and differantiation inducing agents which can be used with chemotherapeutics that have low cytotoxicity.Aim: The aim of this study is to compare the possible difference of N-myc Downstream Regulated Gene-2 (NDRG2) and Sodium-Iodide Symporter (NIS) gene expressions in Nthy-ori-3-1 and 8505C cells and to investigate the possible effects of 1,25- dihydroxyvitamin D3 (calcitriol) on cell viability as well as NDRG2 and NIS gen expressions in 8505C cells with different incubatoin time.Material and Methods: This study was carried out on Nthy-ori-3-1, normal human thyroid follicular epithelial cells and 8505C, undifferentiated human anaplastic thyroid carcinoma cell line. The basal expression levels of NDRG2 and NIS on both cell lines were investigated with RT-PCR. The effect of calcitriol on cell viability was evaluated with WST-1 test. The changes in NDRG2 and NIS gene expressions in calcitriol treated 8505C cells were also investigated with Real-Time Polimerase Chain Reaction. Results: NDRG2 and NIS gene expressions were found significantly higher in Nthy-ori-3-1 cells compared with 8505C cells. According to WST-1 test results, the incubation of 8505C cells with 60 µM calcitriol by 24 - 48 and 72 hours resulted in 62% - 63% and 56% decrease in cell viability, respectively. No significant differences were found in NDRG2 and NIS gene expressions between control group without calcitriol and 8505C cells which were incubated with 60 µM calcitriol by 24 and 48 hours.Conclusions: NDRG2 and NIS gene expressions were found significantly higher in Nthy-ori-3-1 cells compared to 8505C cells. However, it was shown that calcitriol didn?t lead to any differences on NDRG2 and NIS gene expressions in 8505C cells.Keywords: Anaplastic thyroid cancer, 1-25dihyroxivitamin D3, N-myc Dowstream Regulated Gene-2, Sodium-Iodide Symporter 120

Giriş: Canlı organizmalarda bulunan matriks metalloproteinazlar (MMP'ler), aktif bölgelerinde Zn2+ atomu içeren endopeptidazlardır. MMP'ler başlıca kollajen, laminin gibi ekstrasellüler matriks (ESM) bileşenlerinin yanı sıra, büyüme faktörleri, reseptörler gibi ESM dışı moleküllerin degradasyonundan da sorumludurlar. Kollajenazlar olarak bilinen MMP-1,-8 ve-13; tip I-II-III-V ve IX doğal fibriler kollajeni yıkma yeteneğine sahip proteazlardır. MMP'lerin aynı jel üzerinde pro ve aktif formlarının düzeylerini belirlemede kullanılan Zimografi tekniği, SDS-PAGE tekniğine dayalı elektroforetik bir yöntemdir. Kullanılan substrata göre jelatin, kazein veya kollajen zimografi şeklinde adlandırılmaktadır.Amaç: Bu çalışmada; kollajen zimografi tekniğinin standardizasyonu sağlanarak kollajenazların (MMP-1, -8 ve -13) aktivitelerinin kantitasyonu ve kollajen zimografi tekniğinin laboratuvarımıza kazandırılması amaçlanmıştır.Yöntem: Kollajen zimografi yönteminde substrat olarak kullanılan tip I kollajen sıçan kuyruk tendonlarından ekstrakte edilerek saflaştırıldı. Bununla birlikte substratların spesifikliklerini karşılaştırmak amacıyla tip I ve II kollajen ticari olarak satın alındı. İnsan rekombinant kollajenazları kullanılarak kollajen zimografi tekniği standardize edildi. Her çalışma en az 6 defa tekrar edildi. Yapılan zimografi işleminin ardından jeller ?UVP Gel Logic System? ile görüntülendi, litik bantların yoğunlukları hesaplandı ve standart grafikleri çizildi.Bulgular: Veriler değerlendirildiğinde tüm kollajenazlar için en uygun substratın tip I kollajen olduğu belirlendi ve çalışmaya aynı zamanda düşük maliyeti nedeniyle saflaştırılmış tip I kollajen üzerinden devam edildi. En belirgin litik bantlar 48 saatlik inkübasyon sonucunda görüldü. Yapılan standardizasyon çalışmaları sonucunda kollajen zimografi tekniği ile en az 1 ng kollajenaz aktivitesinin saptanabildiği bulundu. Bu nedenle 1-100 ng aralığında rekombinant kollajenazlar kullanılarak standart grafikleri çizildi.Sonuç: Sonuç olarak; MMP-1, -8, -13'ün aktif ve pro formlarını ayrı ayrı deteksiyonunu sağlayan kollajen zimografi tekniği laboratuvarımıza kazandırılmıştır ve gelecekte yapılacak olan projelerimizde kullanmak üzere standart grafikleri oluşturulmuştur. Introduction: In living organisms matrix metalloproteinases (MMPs) are endopeptidases which contain Zn2+ atoms at their active site. MMPs are responsible for degradation of extracellular matrix (ECM) components like collagen and laminin as well as non-ECM molecules such as growth factors and reseptors. MMP-1, -8 and -13 which are also known as collagenases are proteases that capable of degradation of natural fibriller collagen type I-II-III-V and IX. Zymography is an electrophoretic technique based on SDS-PAGE prensible in which pro and latent forms of MMPs can be detected in the same gel. According to used substrate, zymograpy is reffered as gelatin, casein and collagen zymography..Objective: In this research we aimed to standardize collagen zymography, detect quantification of activity of collagenases (MMP-1, -8 ve -13) and gain collagen zymography technique to our laboratory.Method: Type I collagen was extracted from rat tail tedons to use as substrate in collagen zymography. In addition type I and type II collagen were bought commercially to compare the spesifities of substrates. Then collagen zymography technique was standardized by using human recombinant collagenases. Each experiment was repeated six times. After collagen zymography, the gels were monitorized by using UVP Gel Logic System, densities of lytic bands were analysed and standart graphs were drawn.Results: When the results were evaulated, type I collagen was determined as the best suitable substrate and extracted type I collagen was used because of its low price. The best clear lytic bands were obtained after 48 hours incubation. In the result of standardization of collagen zymography, it is found that at least 1 ng collagenase activity can be detected. Therefore, the range of 1-100 ng recombinant collagenases are used to draw standart graphs.Conclusion: In conclusion, in our laboratory we standardized collagen zymography which can detect active and pro forms of MMP-1, -8, -13 separately and made standard graphs that can be used in our following projects. 77

Kolorektal kanser (KRK) dünyada en sık görülen kanserlerden biridir. 50 yaşından sonra görülme sıklığı giderek artar. Genelde asemptomatik seyretmesi nedeni ile erken tanı oldukça güçtür. Ekstrasellüler matriksin yıkımı invazyon ve metastazdaki en önemli adımdır. Matriks metalloproteinazlar (MMP) ve onların doku inhibitörleri (TIMP) arasındaki dengenin bozulması invazyonun oluşumunda önemlidir. Matrilizin (MMP-7) kolorektal poliplerin kansere dönüşümünde indükleyici rol oynar. Erken evre kolorektal kanserde artışı gösterilmiştir. TIMP-1'in MMP inhibisyonu dışında antiapopitotik etkisi gibi tümör oluşumunu arttırıcı etklileri olduğu gösterilmiştir. TIMP-1'i kolorektal kanserde arttığını, CEA `ya göre duyarlılığının daha yüksek olduğunu gösteren çalışmalar mevcuttur. Fekal TIMP-1 ve CEA'nın KRK'de duyarlılıkları saptanmıştır. Siklooksijenaz-2 (COX-2) artışının kolorektal karsinogenez basamağında etkili olduğu gösterilmiştir. Birçok çalışmada kolorektal kanserde COX-2 artışı gösterilmiştir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda feçesde COX-2 ve MMP-7 mRNA ekspresyonları gösterilmiştir. CEA şu an için KRK'de kullanılan tek biyokimyasal belirteçtir. Duyarllığının ve özgüllüğünün düşük olması nedeni ile tanıda değil takipte kullanılır. Gaita gizli kan testi KRK için duyarlılığı düşük noninvaziv bir testtir. Tanı amaçlı kullanılan kolonoskopi hastalar için rahatsızlık verici, pahalı ve invaziv bir yöntemdir.Bu çalışmanın amacı fekal ve plazma MMP-7, COX-2, TIMP-1 ve CEA düzeylerinin kantite edilmesi, kontrol, polip ve kanser grubu arasındaki farkların ve bu belirteçlerin tanı değerinin ortaya konmasıdır. Polip ve kanser grubu için klinikopatolojik değişkenlerle MMP-7, COX-2, TIMP-1 ve CEA düzeyleri arasındaki ilişkiyi değerlendirmektir.Çalışma grubuna 33 kontrol, 23 polip, 15 kanser hastasının plazma örnekleri ile aynı hastaladan elde edilebilen 16 kontrol, 8 polip, 8 kanser feçes örneği alındı. Fekal ekstraksiyon sonrası elde edilen süpernatanlar ve plazma örnekleri ELISA ile çalışıldı.Plazma TIMP-1,MMP-7,COX-2 düzeyleri açısından kontrol, polip ve kanser grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark görülmedi. Plazma CEA düzeyleri kanser grubunda kontrol grubuna göre anlamlı (p=0,008) ve polip grubuna göre anlamlı (p=0,012) yüksek bulundu. Plazma TIMP-1, MMP-7, COX-2, CEA düzeyleri ile klinikopatolojik değişkenler arasında anlamlı fark görülmedi. Fekal ve plazma TIMP-1, MMP-7, COX-2, CEA düzeyleri arasında korelasyon saptanmadı. Plazma CEA, COX-2, TIMP-1 ve MMP-7 için kanser ve kontrol grubu arasında ROC eğrisinde eğri altında kalan alan farkları sırasıyla, 0.728, 0.571, 0.480 ve 0.359 dur. Polip ve kanser grubu arasında plazma CEA, TIMP-1, MMP-7 ve COX-2ROC eğrisinde eğri altında kalan alan farkları sırasıyla 0.735, 0.614, 0.516 ve 0.396'dır. Fekal CEA düzeyleri kanser grubunda kontrol grubuna göre anlamlı (p=0,027) yüksek bulundu. Fekal TIMP-1,MMP-7,COX-2 düzeyleri açısından kontrol, polip ve kanser grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark görülmedi. Fekal CEA, MMP-7, TIMP-1 ve COX-2 için kanser ve kontrol grubu arasında ROC eğrisinde eğri altında kalan alan farkları sırasıyla, 0.769, 0.466, 0.463 ve 0.425dir. Fekal polip ve kanser grubu arasında CEA, COX-2, MMP-7 ve TIMP-1 ROC eğrisinde eğri altında kalan alan farkları sırasıyla 0.750, 0.625, 0.438 ve 0.196 dır.Sonuç olarak plazma CEA düzeyleri kolorektal kanserde kullanılan tek belirteç olduğunu kanıtlar niteliktedir. Plazma CEA, TIMP-1 ve MMP-7 polip ve kanser ayırımında tanı değerine sahiptir. Fekal CEA'nın yüksek olması kolorektal kanser için yeni bir belirteç olabilir. Fekal TIMP-1 ve COX-2 de polip ve kanseri ayırmada tanı değerine sahiptir. Plazma ve fekal belirteçlerin tanı değerini arttırmak amacıyla geniş çaplı klinik araştırmalara ihtiyaç vardır.Anahtar Kelimeler: Kolorektal kanser, fekal ve plazma TIMP-1, MMP-7, COX-2, CEA, ELISA Colorectal cancer (CRC) is one of the most common cancers in the world. The incidence increases progressively after the age of 50. Its early diagnosis is difficult because of its usually remain asymptomatic. The degradation of extracellular matrix is the most important step in invasion and metastasis. The imbalance between matrix metalloproteinases (MMPs) and their tissue inhibitors (TIMP) is important in the formation of invasion. Matrilizin (MMP-7) plays an inducing role in the transformation of colorectal polyps to cancer. It has been shown that MMP-7 increases in early-stage of colorectal cancer. TIMP-1 has also antiapoptotic effect which inhibits tumor growth. There are studies showing that TIMP-1 increases in colorectal cancer and has a higher sensitivity according to CEA. The sensitivities of fecal TIMP-1 and CEA in CRC was determined. It was shown that the increase of cyclooxygenase-2 (COX-2) is effective in the steps of colorectal carcinogenesis. The increase of COX-2 in colorectal cancer are shown in many studies. COX-2 and MMP-7 mRNA expression in the feces are shown in recent studies. CEA is the unique biochemical marker currently used in CRC. Due to the low specificity and sensitivity , it is used in follow-up but not in diagnosis. Fekal occult blood test is a noninvasive test to detect low sensitivity for CRC. Colonoscopy is used for diagnosis and it is uncomfortable, expensive and invasive procedure for patients.The purpose of this study is to quantify fecal and plasma MMP-7, COX-2, TIMP-1 and CEA levels in colorectal cancer, polyps and control patients and also to analyze the differences between these groups and the diagnostic value of these markers. In addition, we aimed to asses the relationship between clinicopathologic variables for cancer and polyps and MMP-7, COX-2, TIMP-1, CEA levels .For working group, plasma samples were taken from 33 controls, 23 polyps, 15 cancer patients and fecal samples were taken from 16 controls, 8 polyps, 8 cancer. Fecal supernatants obtained from extraction and plasma samples were determined by ELISA.Plasma TIMP-1, MMP-7, COX-2 levels were not observed statistically significant difference between control, polyps and cancer patients. Plasma CEA levels were significantly higher in the cancer group than control group (p = 0.008) and than polyp group (p = 0.012). There was no difference between plasma TIMP-1, MMP-7, COX-2, CEA levels and clinicopathological variables. There was no statistical correlation between fecal and plasma TIMP-1, MMP-7, COX-2, CEA levels. In the control and cancer group, the differences the area under the curve in ROC curve for plasma CEA, COX-2, TIMP-1 and MMP-7 are 0.728, 0.571, 0.480 and 0.359, respectively. Between polyps and cancer groups, the differences the area under the curve in ROC curve for plasma CEA, TIMP-1, MMP-7 and COX-2 are 0.735, 0.614, 0.516 and 0.396, respectively. Fecal CEA levels were higher in the cancer group than the control group (p = 0.027). Fecal TIMP-1, MMP-7, COX-2 levels were not observed statistically significant difference between control, polyps and cancer patients. For fecal CEA, MMP-7,TIMP-1 and COX-2 in cancer and the control group, the differences between the ROC curve area under the curve are 0.769, 0.466, 0.463 and 0.425. Between polyps and cancer group, the differences the area under the curve in ROC curve for fecal CEA, COX-2, MMP-7 and TIMP-1 are 0.750, 0.625, 0.438 and 0.196, respectively.As a result, plasma CEA levels are the unique marker in colorectal cancer. Plasma CEA, TIMP-1 and MMP-7 have value of diagnostic differentiation of colorectal cancer and polyps. Fecal CEA may be a new marker for colorectal cancer. Fecal TIMP-1 and COX-2 have diagnostic value of the distinguish from cancer to polyps. In order to increase the diagnostic value of plasma and fecal markers, a large-scale clinical studies are needed.Key words: colorectal cancer, fecal and plasma TIMP-1, MMP-7, COX-2, CEA, ELISA 95

Giriş: %80'i kolonda, %20'si rektumda meydana gelen kolorektal kanser (KRK); başta endüstriyel batı dünyası olmak üzere dünya genelinde akciğer, prostat ve meme kanserinden sonra ölüme neden en büyük kanserdir. Yapılan pek çok çalışmada Matriks metalloproteinaz-7'nin (MMP-7) diğer MMP'lere göre tümör progresyonunda daha önemli bir rol oynadığı ileri sürülmektedir.Amaç: Bu çalışmanın amacı; KRK hastalarından alınan tümörlü ve eşlenik normal doku örneklerinde MMP-7 ekspresyon (protein ve mRNA) düzeylerini ve MMP-7'nin aktif-latent formlarını incelemek ve MMP-7'nin lokal endojen aktivasyonunu In Situ Kazein Zimografi yöntemiyle gösterebilmektir.Materyal ve Yöntemler: Çalışma, 31 KRK hastasından alınan kolorektal tümör ve eşlenik normal dokularında gerçekleştirildi. MMP-7 mRNA ve protein ekspresyon düzeyleri Real Time PCR ve ELISA teknikleriyle, MMP-7 lokalizasyonu ise immünohistokimyasal boyama ve görüntüleme analizi ile belirlendi. MMP-7'nin proteolitik aktivitesini belirlemek amacıyla Kazein zimografi, lokal kazeinolitik aktiviteyi değerlendirmek amacıyla in situ kazein zimografi tekniği kullanılmıştır. Ayrıca elde edilen sonuçlar, tümörün klinikopatolojik değişkenleri ile (cinsiyet, yaş, tümör yerleşimi, tümör boyutu, tümör diferansiyasyonu, histolojik tip, uzak metastaz, T-evre, N-evre, patolojik evre, perinöral invazyon, lenfatik invazyon, vasküler invazyon) ayrı ayrı karşılaştırıldı.Bulgular: MMP-7 mRNA ekspresyonu tümöral dokuda normal dokulara oranla istatistiksel olarak anlamlı yüksek bulundu (p = 0,001). Ayrıca mRNA ekspresyon düzeyleri, T evre ve P evre ile pozitif korelasyon (r = 0,687 p = 0,005 ve r = 0,536 p = 0,04), yaş ile negatif korelasyon (r = -0,588 p = 0,021) gösterdi. Buna karşılık tümör ve normal dokularda MMP-7 protein ekspresyon düzeyleri arasında anlamlı bir fark belirlenmemiştir (p = 0,636). MMP-7 protein düzeyleri ve klinikopatolojik değişkenler arasındaki ilişki incelendiğinde perinöral invazyon ile arasında pozitif korelasyon belirlenmiştir (r = 0,462 p = 0,010). İmmünohistokimyasal boyama sonucu, tümör dokularında hücre sitoplazması ve membranında boyama görülürken, normal dokularda herhangi bir MMP-7 boyaması görülmedi. Ek olarak, tümör dokularında normal dokulara göre daha yüksek kazeinolitik aktivite görüldü ve bu aktivitenin epitel bölgede daha yoğun olduğu belirlendi.Sonuç: Elde edilen sonuçlar MMP-7'nin kolorektal kanser gelişimde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bundan dolayı, kolorektal kanserde yeni kemopreventif terapi geliştirilmesinde MMP-7'nin hedef molekül olarak seçilebileceğini göstermektedir.Anahtar Kelimeler: Kolorektal Kanser, Matriks Metalloproteinaz-7, Kazein Zimografi, In Situ Kazein Zimografi. Background: Colorectal cancer (CRC) that occurs at the percent in 80% of colon and 20% in rectum is now the most common cause of cancer related deaths after lung, prostate and breast cancer in Western world. There is increasing evidence to indicate that matrix metalloproteinase (MMP)-7 plays a more important role in tumor progression than other MMPs.Aim: The aim of this study is to analyze MMP-7 expression (protein and mRNA) levels and active-latent forms of MMP-7 in tumor and paired normal tissue samples that are taken from colorectal cancer patients and to develop In Situ Casein Zymography technique for detection of local endogen activation of MMP-7.Material and Methods: Thirty-one colorectal tumor and paired normal tissue samples were taken from patients with CRC. MMP-7 mRNA and protein expression levels were detected by Real Time PCR and ELISA whereas MMP-7 localization was examined by immunohistochemical staining and image analysis. Casein Zymography and In Situ Casein Zymography methods were used to detect proteolytic activity of MMP-7 and to estimate local caseinolytic activity, respectively. The results were compared with clinicopathological variables (such as gender, age, tumor localization, tumor size, tumor differentiation, histological type, distant metastasis, T-stage, N-stage, pathological stage, perineural invasion and vascular invasion).Results: MMP-7 mRNA expressions in tumor tissues were statistically higher than paired normal tissues (p = 0.001). Furthermore mRNA expression levels were positively correlated with T stage and P stage (r = 0.687 p = 0.005 and r = 0.536 p = 0.04) and negatively correlated with age (r = -0.588 p = 0.021). In the results of immunohistochemical staining, it was observed that there were cytoplasm and cell membrane staining in tumor tissues whereas there was no MMP-7 staining in paired normal tissues. Unlike there were no significant differences between tumor and paired normal tissues in MMP-7 protein expression levels (p = 0,636). When it was analyzed the correlations between MMP-7 protein expression levels of tumor tissues and clinicopathological variables, it was determined that protein expression levels positively correlated with perineural invasion (r = 0.462, p = 0.010). In addition, it was found that caseinolytic activity, localize epithelium region, was higher in tumor tissues than the paired normal tissues.Conclusions: Our results suggest that MMP-7 plays an important role in the progression of human colorectal cancer. Therefore MMP-7 may be selected as a target molecule in the use of new chemopreventive therapy in colorectal cancer.Key Words: Colorectal Cancer, Matrix Metalloproteinase-7, Casein Zymography, In Situ Casein Zymography. 128

Giriş: Kolorektal kanser, görülme sıklığı en yüksek olan kanserler arasındadır. Anjiogeneze bağımlı olan tümör metastazı ve progresyonu; bazal membran (BM) ve ekstrasellüler matriksin (ESM) degradasyonu, hücre adezyonunun değişmesi ve tümör hücresinin fiziksel hareketliliğini kapsar. Tüm bu aşamalar içinde; aşırı ESM yıkımı tümör metastaz ve progresyonunda önemli rollere sahiptir. ECM'in degradasyonunda birçok proteinaz sistemleri rol oynamakla birlikte matriks metalloproteinazlar (MMP) bunların başında yer alır. Yapılan deneysel kanser modellerinde ve hasta çalışmalarında MMP-2 ve MMP-9'un kolorektal kanser progresyonu, invazyonu ve metastazında rolleri olduğu bildirilmektedir. Bu enzimlerin aktiviteleri ekstrasellüler olarak regüle edilir ve regülasyonları pro-enzim aktivasyonu ile doku inhibitör proteinleri olan TIMP'ler arasındaki dengeye bağlıdır. Bundan başka MMP-2 ve MMP-9'un VEGF gibi proanjiogenik ve endostatin gibi antianjiogenik moleküllerin oluşumunda da rol aldığı bildirilmektedir. Bu nedenle bu enzim sisteminin aktivasyonu tümör progresyonunda farklı aşamalarda büyük önem taşımaktadır.Amaç: Kolon ve rektum kanserlerinin gelişim mekanizmalarına ilişkin literatür incelediğinde bu mekanizmaların birbirinden farklı olduğunu bildiren çalışmalar ve bunların total kolorektal olarak değil homojen ayrı iki tip tümör grubu olarak çalışılmasını savunan görüşler vardır. Biz de bu görüşü savunarak, gerçekleştirdiğimiz bu çalışmada kolorektal kanserleri kolon ve rektum tümörü olarak homojen ayrı iki grup olarak değerlendirdik. Bu araştırmanın temel amacı jelatinaz aktivasyon düzeylerini, MMP-2'nin endojen inhibitör proteini TIMP-2, aktivatör proteini MT-1 MMP ve anjiogenez regülasyonunda rol oynayan anjiogenik potansiyeli yüksek olan VEGF ve anjiogenez inhibitörü endostatinin protein düzeylerini her iki tip tümör ve eşlenik normal dokularda ayrı ayrı araştırmak ve bu parametrelerin klinikopatolojik değişkenler ile ilişkisini tanımlamaktır. Ayrıca in vitro koşullarda HT-29 kolon adenokarsinoma hücre dizinde rekombinant endostatinin hücre canlılığı, invazyonu, MMP sekresyonu ve aktivitesi üzerine etkilerini araştırmaktır.Materyal ve Yöntem: Çalışma 50 kolon ve 34 rektum tümörlü hastadan alınan tümör ve eşlenik normal dokularda gerçekleştirildi. MMP-2, MMP-9 aktivasyon düzeyleri jelatin zimografi ile incelenmiştir. MT-1 MMP aktivite düzeyleri enzim aktivite ölçüm yöntemi ile analizlenmiştir. TIMP-2, VEGF ve endostatin protein düzeyleri ise ELISA ile belirlenmiştir. Ayrıca tümör ve eşlenik normal dokulardaki endostatin ekspresyonu Western Blot yöntemi ile araştırılmıştır. İn vitro deneylerde HT-29 hücrelerinin canlılığı MTT testi ile değerlendirildi. Hücrelerin invazyon yetenekleri, matrijel ile kaplanmış 8 mm büyüklüğünde por içeren hücre plaklarında değerlendirilmiştir.Bulgular: Kolon tümör dokusunda MMP-2'nin pro ve aktif, MMP-9'un ise aktif formları eşlenik normal dokuya göre anlamlı olarak yüksek bulundu (p0.05). Parametreler ile klinikopatolojik değişkenler incelendiğinde tümör dokusu aktif MMP-9 ile tümör invazyon derinliği pT1 vs pT3-4 (p=0.011) ve uzak metastaz varlığı arasında anlamlı ilişki saptandı. Rektum tümör dokusunda ise MMP-2 ve MMP-9'un hem pro hem de aktif formlarının aktivite düzeyleri, eşlenik normal doku aktivite düzeylerine göre istatistiksel olarak anlamlı yüksek bulundu (p0.05). Parametreler ile klinikopatolojik değişkenler arasındaki ilişki incelendiğinde ise rektum tümör aktif MMP-9 ve aktif MMP-2/ProMMP-2 (rMMP-2) ile tanı anı metastaz arasında (sırasıyla; p=0.002 ve p=0.006); ve tümör aktif MMP-9 ile perinöral invazyon varlığı arasında (p=0.042); tümör proMMP-9 ve proMMP-2 ile lenf nodu metastazı (sırasıyla; p= 0.012, p=0.021); tümör TIMP-2 düzeyleri ile nüks arasında (p=0.011) ve tümör VEGF düzeyleri ile perinöral invazyon arasında anlamlı ilişki saptandı (p=0.044). Ayrıca rektum tümör çapı ile VEGF düzeyleri arasında anlamlı orta derecede pozitif korelasyon belirlendi (p=0.009 r=0.454). İn vitro deneyler ile rekombinant endostatinin HT-29 hücre dizinde hücre canlılığını ve proMMP-2 aktivite düzeylerini anlamlı olarak azalttığı saptandı (p

ÖZET İNSAN keloid, hipertrofik skar VE ATROFİK skarlarinda MATRİKS METALLOPROTEİNAZ-2 VE -9 ENZİMLERİNİN GELATİN ZİMOGRAFİ YÖNTEMİ İLE DEĞERLENDİRİLMESİ Skar oluşum sürecinin bozulmasına, yara iyileşme süreçlerinden sadece birinin değil, birbirini takip eden olaylardaki değişimler etki eder. Yaralanma sonrası ekstrasellüler matriksin yapımında ve yıkımında değişiklikler meydana gelir. Yapım ve yıkım arasındaki hassas dengenin bozulmasında veya her ikisinin de arttığı durumlarda anormal skar gelişimi görülmektedir. Ekstrasellüler matriksin proteolitik yıkımı kutanoz yara iyileşmesi sırasında tamir ve `remodeling` süreçlerinin temel niteliklerindendir. Anormal skarlarda matriks metalloproteinaz ailesinden Gelatinaz A (MMP-2) ve Gelatinaz B (MMP-9) aktiviteleri hakkında çok az şey bilinmektedir. Gelatinazlar kollajenaz-1 ve stromelizin-1 ile birlikte matriks `remodeling` sürecinde rol alan önemli metalloproteinazlardır. Bu araştırmanın temel amacı; hipertrofik skar, keloid ve atrofik skar dokularındaki ekstrasellüler matriks yapım ve yıkım süreçlerinin değerlendirmesi için MMP-2 ve MMP-9 aktiviteleri ile bu skar dokularındaki kollajen düzeylerinin incelenmesidir. Hasta grubu olarak, Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi Polikliniğine 14.5 ay süre içinde başvuran, vücutlarının çeşitli yerlerinde hipertrofik skarı olan 29, vücutlarının çeşitli yerlerinde keloidi olan 4 ve vücutlarının çeşitli yerlerinde atrofik skarı olan 3 birey seçildi. Olguların seçim kriterleri, olgularda yara iyileşmesini etkileyecek herhangi bir ek sistemik hastalığın olmaması ve skarların matürasyonunu tamamlamış olmalarıydı. Hipertrofik ve atrofik skarlar, skar revizyonu yapılan hastalardan; keloidler, yapılan biopsi veya tedavi amaçlı çıkarılan örneklerden alınmıştır. Normal deri 14 bireyden herhangi bir sebeple alınan greft örneklerinden elde edildi. Doku örneklerinde kollajen ölçümü Reddy ve Enwemeka'nm alkali hidrolizi kullanarak biyolojik dokularda hidroksiprolin miktarını saptadıkları yöntemin modifiye şekli kullanılarak yapddı. MMP-2 ve MMP-9 düzeyleri `enzyme linked immunosorbent assay` (ELISA) ile aktiviteleri ise gelatin zimografi metoduyla ölçüldü.İstatistiksel değerlendirmelerde; grup ortalamalarını karşılaştırmak için `Mann Whitney U testi`, regresyon analizi için `Spearman's Rho korelasyon testi` kullanıldı. Tüm analizlerde anlamlılık seviyesi p