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A ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2) é uma doença hereditária autossómica dominante que, em conjunto com outras oito doenças neurodegenerativas, forma um grupo de doenças, denominado por doenças de poliglutaminas. Estas são causadas por uma expansão anormal do trinucleótido CAG (citosina-adenina-guanina), que leva à formação de uma proteína anormal, o que afeta a homeostase celular. A SCA2 foi descrita pela primeira vez em 1971 e é causada por um aumento de mais de 31 repetições CAG no gene ATXN2. Este codifica uma proteína ataxina-2 anormal que não é eficientemente degradada, acumulando-se e levando à formação de agregados tóxicos, presentes principalmente no citoplasma. Esses agregados levam a diferentes mecanismos de patogénese, como a disfunção da autofagia, que é responsável pela degradação e reciclagem de proteínas. Ainda não existe cura para a SCA2, porém atualmente existem várias estratégias terapêuticas em estudo, como a redução do número de agregados através da ativação da autofagia pela cordicepina. Assim, o presente estudo teve como objetivo estudar a autofagia na SCA2 e perceber se a indução desta pode vir a ser uma futura estratégia terapêutica. Os resultados demostraram uma disfunção da via autofágica em células Neuro-2A transfectadas com formas mutantes de ataxina-2, pela verificação de um aumento dos níveis de SQSTM1 e de uma diminuição dos níveis de LC3B-II, e no tecido cerebral post-mortem de pacientes com SCA2, pela observação de um aumento dos agregados de ataxina-2 e de uma acumulação anormal de marcadores autofágicos. Além disso, demonstraram ainda que a administração de cordicepina leva à diminuição da perda neuronal e à redução da agregação da proteína ataxina-2. Assim e apesar de serem necessários mais estudos complementares este estudo demonstrou que a regulação positiva da autofagia pode ser uma futura estratégia terapêutica para o tratamento da doença SCA2. Spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2) is an autosomal dominant inherited disease, which together with eight other neurodegenerative diseases, forms a group of diseases, called polyglutamine diseases. These are caused by an abnormal expansion of the CAG (cytosine-adenine-guanine trinucleotide), which leads to the formation of an abnormal protein, that affects cellular homeostasis. SCA2 was first described in 1971 and is caused by an increase of more than 31 CAG repeats in the ATXN2 gene. This encodes for an abnormal ataxin-2 protein that is not efficiently degraded, accumulating and leading to the formation of toxic aggregates, present mainly in the cytoplasm. These aggregates lead to different pathogenesis mechanisms, such as autophagy dysfunction, responsible for degradation and recycling of proteins. There is still no cure for SCA2, but there are currently several therapeutic strategies under study, such as reducing the number of aggregates through the activation of autophagy by cordycepin. Therefore, the present study aimed to study autophagy in SCA2 and to understand whether its induction can become a future therapeutic strategy. The results demonstrated a dysfunction of the autophagic pathway in Neuro-2A cells transfected with mutant forms of ataxin-2, by verifying an increase in the levels of SQSTM1 and a decrease in the levels of LC3B-II, and in the post-mortem brain tissue of patients with SCA2, by observing an increase in ataxin-2 aggregates and an abnormal accumulation of autophagic markers. Furthermore, administration of cordycepin has been shown to lead to decreased neuronal loss and reduced aggregation of ataxin-2 protein. Thus, and despite the need for further complementary studies, this study demonstrated that the upregulation of autophagy may be a future therapeutic strategy for the treatment of SCA2 disease.

O progresso científico e médico tem vindo a permitir ao ser humano viver para além da esperança média de vida. Com os novos conhecimentos, vão sendo desenvolvidos novos tratamentos e medicamentos que permitem à humanidade viver por mais anos – o aumento de estudos de doenças permitem curar ou retardar os efeitos destas mesmas doenças. No entanto, daí advêm consequências, mais precisamente doenças relacionadas com a idade. Ainda que os seres humanos vivam mais anos, esta longevidade está associada, na maior parte dos casos, a uma má qualidade de vida e de saúde. As diferenças no processo do envelhecimento e as suas implicações no corpo humano podem ser o resultado de fatores genéticos, epigenéticos e ambientais, que terão impacto a nível celular, tais como senescência celular, alterações epigenéticas, perda da proteostase, desregulamentação na deteção de nutrientes, disfunção mitocondrial, instabilidade genómica, instabilidade nos telómeros, exaustão das células estaminais e alteração na comunicação intercelular. Para futuramente estudar os mecanismos relacionados com a idade e para entender melhor os benefícios dos fatores anti-envelhecimento, foram estabelecidas, no ambiente do trabalho de Mestrado, Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells, que são células com propriedades de células estaminais embrionárias. Assim as células iPS têm a capacidade de diferenciação em qualquer tecido/célula adulta e servir como modelo celular in vitro para estudar o envelhecimento celular. Neste projeto, propôs-se a reprogramação de células somáticas recolhidas de dadores com a Síndrome da Progeria Hutchison-Gilford (HGPS) para obter células iPS. O processo de reprogramação conduz as células somáticas a desdiferenciar até um estado de pluripotência, tal como as Células Estaminais Embrionárias humanas. Assim, podemos ter um modelo de Células iPS que tiveram origem em células de doentes com Progeria, para serem depois utilizadas para outras experiências, tal como a diferenciação em cardiomiócitos ou neurónios, por exemplo. Nesse processo poderá ser visível como esta patologia afeta estas células específicas com o tempo, podendo também ser uma forma de observar como um tratamento poderia atrasar o processo de senescência, característico desta patologia. Scientific and medical progress has allowed human beings to live beyond average life expectancy. With new knowledge, new treatments and medicine are being developed that allow mankind to live for more years – the increase in illnesses related studies allow to heal or delay the effects of those same illnesses. However, that causes consequences, in particular diseases related to aging. Despite human beings living longer, this longevity is, in most cases, associated with a bad quality of life and health. Differences in the process of aging and its implications in the human body can be the result of genetic, epigenetic and environmental factors, that will have an impact at the cellular level, such as cellular senescence, epigenetic changes, loss of proteostasis, deregulation of nutrient sensing, mitochondrial dysfunction, genomic instability, telomere attrition, stem cell exhaustion and altered intercellular communication. To further study age-related mechanisms and to better understand the benefits of anti-aging factors, Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells were established, in the context of the Master degree work, which are cells with embryonic stem properties. Thus, the iPS cells have the capacity for differentiation in any tissue/adult cell and serve as in vitro cellular model to study aging. In this project, it was proposed the reprogramming of somatic cells collected from donors with The Hutchison-Gilford Progeria Syndrome (HGPS) to obtain iPS cells. The reprogramming process takes somatic cells to dedifferentiate until a state of pluripotency, such as human Embryonic Stem (ES) Cells. Thus, we can have a model of iPS cells that was originated in cells from patients with Progeria, to be used for other experiments, such as differentiation in cardiomyocytes or neurons, for example. In this process it can be visible how this pathology affects these specific cells over time and may also be a way of observing how a treatment could delay the senescence process, characteristic of this pathology.

Polyglutamine diseases are neurodegenerative disorders where the associated genes and translated protein products have an abnormal number of CAG triplets and glutamines, respectively. Mutated proteins with increased number of glutamines are usually correlated with neuronal dysfunction. Depending on the length of the pathogenic mutation, the effects on the normal cell mechanisms may be less or more severe, in other words, the severity of the disease is usually directly proportional with the number of glutamine repeats. There are 9 polyglutamine diseases: Huntington’s disease (HD), dentatorubral-pallidoluysian atrophy (DRPLA), spinal and bulbar muscular atrophy (SBMA) and the spinocerebellar ataxias (SCAs) 1, 2, 3, 6, 7 and 17. All these diseases are caused by the same mutation in their respective, and otherwise unrelated, genes – CAG triplet expansion. This abnormal triplet expansion is found in coding gene regions and later gives rise to the expanded glutamine sequence in the translated proteins. Mutated proteins with an increased number of glutamines often interfere with the normal cellular function by not performing their normal tasks and by compromising crucial cell mechanisms. PolyQ Database is a project that aims to be an online resource where everyone can learn about the most important features of every polyglutamine disease. Since information on each specific disease is usually scattered throughout various online sources, one of the main goals is to have all the most important information in one single online resource. The data available in PolyQ Database consists of simple and straightforward introductory information followed by more complex explanations about the genes and proteins affected in each disease, along with the pathophysiological mechanisms and cellular and biological deficits that may arise from these. This platform was done with hypertext markup language, cascading style sheets and JavaScript for the front-end (what the user interacts with). The back-end structure was entirely made with python Django framework. All the data stored for each disease was initially stored in an object oriented SQlite3 database created with Django but was later imported to a Microsoft SQL server. To obtain a scientific database structure with consistent and constant slices of information, the same data was presented for each polyglutamine disease. For each condition, the topics presented are: introduction, first description, epidemiology, causative gene, codified protein (structure, domains, functions and intracellular localization), pathophysiology and clinical manifestations (neuropathology, other signs and symptoms). The PolyQ Database can be found at https://polyq.pt/, where all the information gathered from various sources is presented, along with added supplementary pages, including a contact and authors pages, and a home page to search the diseases using either a search engine or disease tags. As doenças de poliglutaminas são um conjunto de doenças neurodegenerativas associadas à presença de sequências anormalmente longas de glutaminas em proteínas particulares. Este número elevado de glutaminas é consequência da repetição anormal de tripletos CAG existentes na parte codificante de genes respetivos, que são posteriormente traduzidos para proteína. Sequências de repetições de CAG com maior tamanho estão diretamente relacionados com uma maior probabilidade de desenvolver doença e com uma severidade das manifestações clínicas. O mecanismo principal que parece estar na origem destas doenças é a expansão de repetições do trinucleotídeo CAG, em que expansões anormais surgem de mutações indel, ou simplesmente, mutações de inserção ou deleção. O principal mecanismo por detrás destas mutações indel é o slipped strand mispairing (SSM). SSM é um tipo de mutação que pode ocorrer durante a replicação de DNA e que envolve vários processos que causam mutações ligeiramente diferentes. No caso das doenças de poliglutaminas, a repetição anormal de CAG dever-se-á ao facto de a DNA polimerase, ao sintetizar a nova cadeia, dar “um salto” para trás e copiar novamente o que já foi copiado. As proteínas traduzidas a partir destes genes mutados podem comprometer vários processos celulares, que estão relacionados com o desenvolvimento das respetivas doenças. Proteínas com um número elevado de glutaminas são geralmente menos eficientes a executar as suas funções normais comprometendo assim vários processos celulares em que participam. Com o aumento anormal de glutaminas, existe também a possibilidade de as proteínas se envolverem em novos processos celulares, com os quais, em situações normais, não se envolveriam. Outra característica de diversas doenças de poliglutaminas é a existência de agregados citoplasmáticos e nucleares (inclusões nucleares) que contêm a proteína mutada. Estas agregados podem sequestrar outras proteínas importantes e criar agregados macromoleculares que a célula não tem capacidade de degradar. A formação de agregados/inclusões no interior do núcleo pode interferir com o normal funcionamento de vários processos nucleares, nomeadamente a transcrição. Existem nove doenças de poliglutaminas extensamente relatadas e identificadas: doença de Huntington, atrofia dentatorubro-palidoluisiana, atrofia muscular espinhal-bulbar e as ataxias espinocerebelosas 1, 2, 3, 6, 7 e 17. Cada uma destas doenças é causada pela expansão de um gene e de uma proteína particulares, e está associada a degeneração de zonas específicas do sistema nervoso e a mecanismos patofisiológicos distintos, apresentando por isso diferentes sinais pelos quais é possível diferenciar e classificar cada uma das doenças de poliglutaminas. No entanto, considera-se que certos mecanismos patogénicos e sinais neuropatológicos são comuns às nove doenças. As manifestações clínicas das doenças de poliglutaminas são diversas, e variam de acordo com as estruturas afetadas. Por exemplo, a coreia, no caso da doença de Huntington, e a ataxia, no caso das ataxias espinocerebelosas, surgem respetivamente da decadência funcional dos gânglios basais e do cerebelo, respetivamente. No entanto, estas doenças acabam também por exibir sintomas em comum, que normalmente surgem no decorrer da doença ou em fases mais tardias, como a demência, a fraqueza muscular, epilepsia e convulsões e deficiências cognitivas. O projeto PolyQ Database teve como objetivo o estabelecimento de uma plataforma que permitisse um acesso fácil a todas as informações importantes acerca de cada uma das doenças de poliglutaminas, num mesmo local. Essa plataforma foi feita com hypertext markup language, cascading style sheets e JavaScript para o front-end (com o que o usuário interage). A estrutura de back-end foi inteiramente feita com o framework Django do Python. Todos os dados armazenados para cada doença foram inicialmente armazenados num banco de dados SQlite3 orientado a objetos criado com Django, mas posteriormente foram importados para um servidor Microsoft SQL. De acordo com a estrutura estabelecida, foi desenhado um website que apresenta, para cada uma das 9 doenças, uma parte introdutória seguida pela informação acerca das suas primeiras descrições históricas e por dados epidemiológicos. De seguida, são apresentadas diversas informações acerca do gene afetado e da proteína traduzida (estrutura, funções e localização intracelular). Por fim, são apresentados os mecanismos celulares afetados que levam ao desenvolvimento da doença e os sinais/sintomas observados em pessoas afetadas. A PolyQ Database está disponível em https://polyq.pt/ ,onde se apresenta toda a informação recolhida de várias fontes, de acordo com a estrutura descrita. O website apresenta ainda outras páginas suplementares, como a página de contato e página dos autores. A página home permite ao utilizador aceder à informação acerca das diversas doenças através de um motor de busca ou por escolha direta de qualquer doença disponível por marcadores opcionais.

O envelhecimento é um processo biológico universal caracterizado por uma acumulação de danos e outros efeitos nocivos que levam a uma perda progressiva da integridade fisiológica e funcional que culminam na morte do organismo. As alterações que acompanham o envelhecimento ocorrem nos diversos níveis da organização do ser vivo, ou seja, a nível molecular, dos organelos, celular, dos tecidos, órgãos e sistemas. O envelhecimento constitui um dos fatores principais das patologias humanas, como o cancro, a diabetes, doenças cardiovasculares e doenças neurodegenerativas, nomeadamente, as doenças de Alzheimer e Parkinson. Por esta razão e o aumento progressivo da população idosa, nas últimas décadas têm ocorrido um aumento e progresso na investigação focada no envelhecimento. Notavelmente, ao longo das últimas décadas, tem ocorrido uma mudança gradual no foco da investigação sobre o envelhecimento, ao invés de focar-se nos efeitos e sintomas do envelhecimento, tem-se concentrado nos mecanismos moleculares subjacentes ao processo de envelhecimento. Esta nova abordagem levou à descoberta de que a taxa de envelhecimento é controlada, pelo menos até certo ponto, por vias genéticas e processos bioquímicos conservados na evolução, o que permitiu identificar e categorizar as características celulares e moleculares do envelhecimento, sendo estes definidos como os biomarcadores do envelhecimento. Foram propostos nove biomarcadores do envelhecimento: instabilidade genómica, encurtamento dos telómeros, alterações epigenéticas, perda de homeostasia proteica, desregulação da sensibilidade de nutrientes, disfunção mitocondrial, senescência celular, exaustão das células estaminais, alteração da comunicação intercelular. De entre os diversos mecanismos moleculares que impactam o envelhecimento, as alterações que afetam o proteoma celular têm um papel fulcral. Quase todos os processos fisiológicos são dependentes de proteínas e, portanto, a preservação da integridade do proteoma é imperativa para a vida do organismo. Vários fatores especializados são dedicados a preservar a integridade do proteoma celular, desde o processo de pré-tradução até o final do ciclo de vida funcional da proteína. A manutenção da homeostase celular correlaciona-se diretamente com a manutenção de um equilíbrio preciso da síntese, degradação e função de cada proteína. Quando esse equilíbrio é perturbado, as proteínas danificadas se acumulam progressivamente, levando a um estado prejudicial e até mesmo à morte celular. O distúrbio deste equilíbrio ocorre naturalmente com o envelhecimento, à medida que a integridade e a eficácia da maquinaria da síntese proteica e dos sistemas de controlo de qualidade das proteínas diminuem gradualmente devido ao inevitável acúmulo de danos com a idade. Em particular diversos estudos demonstram que a síntese proteica reduz com a idade em diversos organismos, tendo-se observado uma redução de diferentes componentes da maquinaria de tradução, nomeadamente, abundância dos ribossomas e atenuação da atividade e dos níveis dos principais fatores de iniciação e alongamento. Apesar destas descobertas e do crescente número de estudos, vários aspetos da síntese proteica no contexto do envelhecimento permanecem elusivos, especialmente a nível mecanístico. Neste sentido, o presente estudo tem como objetivo elucidar o papel da síntese proteica e do controle da tradução no envelhecimento e na expectativa de vida, assim como compreender a sua conexão funcional com os vários biomarcadores do envelhecimento. Para isso, analisou-se o perfil da taxa global de tradução em modelos celulares. De modo a estabelecer uma ligação entre o envelhecimento e a síntese proteica focamos na proteína de ligação a poliadenilato 1 (PABP1), uma proteína central no controle da tradução e estabilidade de mRNA. Esta proteína promove a circularização do mRNA, levando à estabilização e estimulação da iniciação da tradução. Por isso, PABP1 poderá desempenhar um papel fulcral na mediação de mudanças na síntese proteica com o envelhecimento. Para o estabelecimento da relação entre síntese proteica e o envelhecimento, primeiramente analisou-se a variação do PABP1 com o envelhecimento em modelo celular e em morganhos. Seguidamente, o PABP1 foi sobre-expresso no hipotálamo de morganhos envelhecidos e analisou-se diferentes proteínas ligadas ao envelhecimento, nomeadamente: mTOR, relacionado à desregulação da sensibilidade de nutrientes; Ataxina-2, referente à tradução de mRNA; LC3B e P62, alusivo à perda de homeostasia proteica; IL-6 e NF-κB, concernente à alteração da comunicação intercelular, particularmente, inflamação; e por fim PGC-1α, respeitante à disfunção mitocondrial. O hipotálamo foi o foco da sobre-expressão do PABP1 devido o seu envolvimento com diversas funções fisiológicas que diminuem com o envelhecimento, tais como: desenvolvimento, metabolismo, reprodução, ritmo circadiano e homeostase. Por conectar sistema neuroendócrino aos processos fisiológicos, supõe-se que o hipotálamo seja um regulador chave no envelhecimento sistemático. Foi possível observar que de uma forma geral a taxa de síntese proteica sofre realmente alterações com o envelhecimento. Os resultados obtidos apontam para um papel fundamental da PABP1 no envelhecimento ao induzir a expressão de P62. A expressão de P62 induzida por PABP1 poderá ter, potencialmente, um papel na inflamação, pois podem afetar os níveis de citocinas cruciais, levando à sua redução. Observou-se que danos celulares que geram instabilidade genómica ou condições de estresse podem afetar a taxa geral de síntese proteica, provavelmente, afetando a longevidade. Em conclusão, há uma corelação complexa entre o envelhecimento e síntese proteica. A síntese proteica pode ser alterada por danos celulares que afetam os componentes da maquinaria de tradução, como mutações que causam instabilidade genómica ou estresse oxidativo, impactando subsequentemente a longevidade. PABP1, um componente central na maquinaria de tradução, poderá ter um papel no contexto do envelhecimento por induzir a expressão de P62, que está envolvida em vários processos celulares que implicam o envelhecimento. A PABP1 também, potencialmente, poderá diminuir a inflamação no hipotálamo, indiretamente induzindo a diminuição do IL-6 através do P62, o que permite mitigar várias patologias associadas à inflamação com o envelhecimento. No entanto, devido à complexidade da relação da síntese proteica com o envelhecimento, mais estudos futuros são necessários para elucidar o papel da síntese proteica no envelhecimento. Aging is a universal biological process characterized by an accumulation of damage and other deleterious changes that lead to a progressive loss of physiological integrity, functionality, and fitness, ultimately resulting in death. It constitutes the primary risk factor for major human pathologies such as cancer, diabetes, cardiovascular disorders, and neurodegenerative diseases. It was proposed nine hallmarks of aging (genomic instability, telomere attrition, epigenetic alterations, loss of proteostasis, deregulated nutrient sensing, mitochondrial dysfunction, cellular senescence, stem cell exhaustion, and altered intercellular communication) that are considered to contribute to the aging process and cooperatively determine the aging phenotypes. Among these multiple molecular mechanisms underlying aging, alterations that affect protein synthesis seem to play a central role. Accumulating evidence suggests that protein synthesis and translation control could significantly influence lifespan. Therefore, this study aims to elucidate the role of protein synthesis and translation control in aging and lifespan and understand their functional connection with several hallmarks of aging. To this end, the translation rate profile was analyzed in different cellular models. Furthermore, to establish a link between aging and protein synthesis, we focused on polyadenylate binding protein 1 (PABP1), a central protein in the control of mRNA translation and stability. PABP1 was overexpressed in old mice's hypothalamus, and key proteins tightly linked with the hallmarks of aging were analyzed. We found that the overall rate of protein synthesis is altered with aging. Moreover, we observed that cellular damage generating genomic instability or stress conditions could impact the overall rate of protein synthesis, possibly affecting lifespan. In addition, our data point to a key role of PABP1 in aging by inducing the expression of p62. PABP1-induced expression of p62 could potentially have a role in inflammaging, as it could reduce the levels of crucial cytokines such as IL-6. Altogether, the results revealed a complex relationship between protein synthesis and aging; therefore, more studies are necessary to elucidate the role of protein synthesis in aging.

Polyglutamine (PolyQ) diseases are a group of hereditary and incurable neurodegenerative pathologies, caused by abnormal expansion of CAG trinucleotide repeats in the disease-causing genes. In these disorders, the formation of toxic aggregated species from the expanded protein leads to dysfunction of several biological systems, ultimately resulting in neuronal degeneration and death widespread across different brain regions. Dysfunction of cellular pathways also correlates with stress responses, such as the formation of stress granules (SGs). Recently, multiple evidence suggested that SGs and its components play a role in the pathogenesis of PolyQ diseases. Therefore, the general goal of this project was to clarify the SGs role in the context of PolyQ diseases pathogenesis, trying to identify new pathways and targets for a therapeutic intervention, using spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3) and type 2 (SCA2) as PolyQ disease models. We found that several SGs components have their gene expression levels altered in these two diseases, including regulated heat stable protein 1 (CARHSP1) and Pumilio homolog 1 (PUM1), which have their levels upregulated in SCA3 and SCA2 diseases. We found that the downregulation of CARHSP1 resulted in reduced mutant protein aggregation in SCA3 cellular and mouse models, as well as amelioration of motor and neuropathological abnormalities. On the other hand, knockdown of PUM1 levels led to increased aggregation of polyQ-expanded protein, as well as worsening of motor deficits in mouse models of SCA3 disease. We further assessed the downregulation of CARHP1 in a novel striatal lentiviral mouse of SCA2, although no alterations in neuropathological features were observed. Overall, our study contributes to the putative involvement of SGs in PolyQ disease and showed that the modulation of CARHSP1 SGs component could be potential therapeutic approach for SCA3 disease. Future studies are needed to fully understand SGs and its components importance in the context of PolyQ and other neurodegenerative diseases. As doenças de poliglutaminas são um grupo de nove doenças neurodegenerativas causadas pelo mesmo tipo de mutação genética. Estas patologias resultam de uma repetição aberrante do códão CAG na região codificante dos genes responsáveis por cada uma destas doenças. Esta mutação genética traduz-se numa expansão tóxica de glutaminas nas respetivas proteínas traduzidas, que sofrem alterações conformacionais levando à formação de agregados proteicos em diversas populações de neurónios. Apesar de serem causadas por genes e proteínas diferentes, as doenças de poliglutaminas partilham vários mecanismos de patogénese, que incluem a desregulação de diversos sistemas celulares essenciais à sobrevivência celular. Para além disto, a expressão de proteínas com expansões de poliglutaminas conduz a aumento dos níveis de stress celular, induzindo a formação de grânulos de stress. Diversos estudos sugeriram que os grânulos de stress podem desempenhar um papel relevante na patogénese das doenças de poliglutaminas e de outras doenças neurodegenerativas. Assim, o objetivo global deste trabalho foi estudar o papel dos grânulos de stress e dos seus componentes nestas doenças, de forma a tentar identificar novas vias celulares envolvidas nestas patologias e novos alvos com um potencial terapêutico, utilizando a ataxia espinocerebelosa do tipo 3 (SCA3, do inglês spinocerebellar ataxia type 3) e do tipo 2 (SCA2, do inglês spinocerebellar ataxia type 2), como modelos das doenças de poliglutaminas. Estas duas doenças resultam da expansão anormal de poliglutaminas nas proteínas ataxina-3 e ataxina-2, respetivamente. Neste trabalho, começámos por analisar quais os componentes dos grânulos de stress que estavam diferencialmente expressos, utilizando a análise de dados de transcriptómica, de modelos de murganho de cada uma das doenças modelo. Estes resultados demonstraram que as proteínas, CARHSP1 (do inglês calcium regulated heat stable protein 1) e PUM1 (do inglês Pumilio homolog 1) tinham os seus níveis aumentados, comparados com animais saudáveis. De seguida, decidimos avaliar se a diminuição dos níveis destas proteínas através da ferramenta de edição génica CRISPR-Cas (do inglês clustered regularly short palindromic repeats-CRISPR associated nucleases) poderia ter um impacto em diversas caraterísticas da SCA3. Os resultados obtidos demonstraram que a diminuição de CARHSP1 levou a uma redução da agregação da proteína ataxina-3 expandida em modelos celulares e animais desta doença. Para além disto, observou-se a melhoria do fenótipo motor e das características neuropatológicas em murganhos de SCA3. Por outro lado, a diminuição dos níveis de PUM1 resultou no aumento dos níveis de agregação da proteína mutante e no agravamento da função motora na doença de SCA3. Assim, estes resultados demonstraram que a diminuição dos níveis de CARHSP1 teve um efeito benéfico nos modelos de doença de SCA3. De forma a podermos testar o efeito do componente dos SGs, CARHSP1, na doença SCA2, procedemos ao desenvolvimento de um novo modelo de murganho desta doença com patologia no estriado. Para isto, recorremos ao uso de vetores lentivirais para expressar a construção com o gene mutante de SCA2. A caraterização deste modelo revelou a expressão da proteína mutante resulta na formação de agregados dentro dos neurónios do estriado, levando à depleção de marcadores neuronais, à morte neuronal e à indução de inflamação no estriado. O modelo lentiviral de murganho de SCA2 criado revelou-se como uma ferramenta útil para estudar novos mecanismos de doenças e testar novos potencias alvos terapêuticos. De seguida, fomos então avaliar se a diminuição dos níveis de CARHSP1 poderia ter o mesmo papel benéfico na doença SCA2. Após a modulação dos níveis de CARHSP1, não observámos alterações significativas na neuropatologia dos animais com SCA2. Em conclusão, este trabalho identificou a proteína CARHSP1, componente dos SGs, como um potencial alvo terapêutico para o tratamento da doença de PolyQ SCA3. Por outro lado, este alvo não resultou em melhorias no modelo de doença de SCA2. Assim, estudos futuros em outras doenças de PolyQ devem ser feitos para validar o CARHSP1 como alvo terapêutico para estas doenças.

The aging process is a set of changes that occur in the entire organism as a consequence of degenerative damage that affects biological, molecular, and physiological processes. The hypothalamus plays an important role in several physiological functions associated with the aging process. There are several mediators involved in the process of regulating these functions, one of which is Ataxin-2. Ataxin-2 is a cytoplasmic protein with an important role in the RNA metabolic process, regulation of translation, stress granule assembly, calcium homeostasis and insulin signalization, among others. This study aims to evaluate the impact of Ataxin-2 expression in the hypothalamus, assessing molecular and physiological characteristics of the aging process. For that, C5BL/J6 mice were randomly divided into three groups and subsequently submitted to stereotaxic injections of lentiviral vectors encoding for human ATX2 and for GFP (as control). There were three experimental groups: one with non-injected mice, one with mice injected with Ataxin-2, and one with mice injected with GFP. Results show that Ataxin-2 caused the mice to gain weight and the tissues of the mice injected with Ataxin-2 revealed to be like young mice histology, with Ataxin-2 reducing the levels of inflammation on a molecular level. These data could suggest that Ataxin-2 delays the aging process, proving to have a very important role in regulating molecular and physiological functions in the hypothalamus during that process. However, further investigation is needed to establish Ataxin-2 as a regulatory aging mediator. O envelhecimento é um processo biológico natural que ocorre em todos os organismos. É um processo caracterizado pela perda gradual e global de funções fisiológicas, biológicas e por processos moleculares que conduzem a alterações que comprometem a função de células, tecidos e órgãos e culminam com a morte do organismo. O hipotálamo é uma pequena parte do cérebro que controla a maioria das funções fisiológicas alteradas pelo processo de envelhecimento. De entre muitas funções, o hipotálamo tem também a capacidade de detetar inflamação, por meio de sinais sistémicos no sangue. O hipotálamo desempenha funções essenciais como o controlo do ritmo circadiano, a resposta ao stress, a regulação do balanço energético e a regulação da homeostasia corporal. Todas estas funções fazem com que o hipotálamo desempenhe um papel fundamental no processo de envelhecimento. A ataxina-2 é uma proteína citoplasmática que se encontra quer em tecidos embrionários, quer em tecidos adultos. No cérebro é nas células de Purkinje do cerebelo onde apresenta maiores níveis de expressão. Esta proteína desempenha funções no papel do metabolismo de RNA, na regulação da tradução, na formação de grânulos de stress, na reorganização do citoesqueleto, na sinalização de cálcio, na sinalização de insulina, entre outros. Um estudo anterior demonstrou que a ataxina-2 hipotalâmica mitigou alguns danos provocados pela obesidade a nível da sensibilidade à insulina, na inflamação e na degradação dos órgãos periféricos. Como tal, sendo os danos provocados pela obesidade uma consequência que acelera o processo de envelhecimento, fomos estudar a ataxina-2 hipotalâmica no processo de envelhecimento. Assim, este estudo teve como principal objetivo avaliar o impacto local da ataxina-2 no hipotálamo em características moleculares e fisiológicas do envelhecimento. Neste estudo, murganhos C57BL/6J foram divididos aleatoriamente em três grupos, sendo submetidos a injeções exterotáxicas de vetores lentivirais que codificam para ATXN2 humana e para o GFP. No estudo três grupos experimentais foram constituídos, o grupo dos animais não injetados, o grupo dos animais injetados com ataxina-2 e o grupo dos animais injetados com GFP. Os resultados obtidos demonstraram que a ataxina-2 reverte alguns dos danos causados pelo envelhecimento. Nomeadamente, nos animais injetados com a ataxina-2, foi possível observar que o peso dos animais aumentou comparativamente aos dos grupos controlo, a nível de danos em órgãos e tecidos foi-nos possível concluir, através da análise histológica, que os órgãos e tecidos destes animais se assemelhavam aos de animais jovens. A nível molecular observou-se que a ataxina-2 reduziu os níveis de inflamação, comparativamente aos grupos controlo. Por fim observou-se também que os animais injetados com GFP, apresentaram características semelhantes aos animais não injetados, o que sugere que a cirurgia esterotáxica não levou a alterações no funcionamento do hipotálamo. Este trabalho permitiu concluir que a ataxina-2 parece desempenhar um papel fundamental na regulação de funções moleculares e fisiológicas pelo hipotálamo no processo de envelhecimento. No entanto, mais estudos serão necessários para estabelecer a ataxina-2 como um mediador regulatório do envelhecimento e para melhor compreender a nível molecular as vias de regulação envolvidas.

Spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2) is a neurodegenerative polyglutamine disease caused by an aberrant expansion of the trinucleotide CAG in the coding region of the ATXN2 gene. As a result, ataxin-2, the protein product resulting from this gene, harbors an abnormally expanded polyglutamine tract, which renders it more prone to aggregation and consequent formation of inclusion bodies within the brain of SCA2 patients. Moreover, a toxic gain-of-function of ataxin-2, accompanied by the reported toxicity of an ATXN2 antisense RNA, are thought to induce cellular alterations with subsequent neuronal death. Although only some neuroanatomical regions are primarily affected in SCA2, the neurodegeneration process seems to progress towards other brain regions, in latter stages of the disease. Nevertheless, the mechanisms responsible for this apparent disease spreading phenomenon have never been addressed. In the last decade, recurrent evidence has shown that extracellular vesicles (EVs) can mediate neuron-neuron transfer of aggregate-prone proteins associated with many neurodegenerative diseases. In some cases, it was also reported that this mechanism can induce toxicity in healthy recipient cells, suggesting an explanation for disease spreading. This study aimed to investigate the possibility of ataxin-2, in its protein and/or mRNA forms, being intercellularly transferred, similarly to what has been reported for proteins involved in neurodegenerative diseases. We show that eGFP-tagged ataxin-2 can be detected in non-transfected neuroblastoma cells when these are cultured in conditioned medium derived from eGFP-ataxin-2-transfected cells. Moreover, we show that ataxin-2 mRNA was found within two different types of extracellular vesicles, which were able to induce the formation of ataxin-2 aggregate-like structures within recipient cells, both in vitro and in vivo. Overall, this study suggests for the first time that EV-mediated transport of ataxin-2 mRNA can induce the formation of ataxin-2 aggregates in healthy recipient cells, possibly representing a novel mechanism involved in SCA2 pathogenesis. A ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2, do inglês spinoceberellar ataxia type 2) é uma doença neurodegenerativa que pertence ao grupo das doenças de poliglutaminas. A SCA2 é causada por uma expansão aberrante de uma região repetida de codões CAG presente na região codificante do gene ATXN2. Esta mutação resulta na síntese de uma proteína denominada ataxina-2, que contém uma sequência repetitiva de glutaminas anormalmente expandida, na sua região N-terminal. Os monómeros de ataxina-2 mutante tendem a agregar, levando à formação de oligómeros e, eventualmente, de agregados proteicos de natureza amilóide. De facto, uma das características da SCA2, à semelhança de outras doenças de poliglutaminas, é a presença de agregados proteicos constituídos por diversas proteínas no tecido nervoso dos doentes, denominados de corpos de inclusão. Contudo, existe uma grande incerteza no que concerne à possibilidade de estes agregados serem a causa direta da toxicidade observada na SCA2, uma vez que alguns estudos sugerem a ausência de correlação entre a presença de agregados e neurodegeneração. De facto, à semelhança do que acontece no contexto de outras doenças neurodegenerativas, alguns autores sugerem a possibilidade de pequenas espécies proteicas, como os oligómeros de ataxina-2, constituírem a verdadeira causa de toxicidade, enquanto a agregação macromolecular destas espécies poderá constituir um mecanismo celular de proteção, que pode contrariar a morte neuronal. Por outro lado, a ataxina-2 mutante poderá interagir de forma aberrante com certas proteínas ou perder a sua capacidade intrínseca de se associar com outras, resultando num quadro geral de disfunção da ataxina-2. Consequentemente, a falta de ataxina-2 funcional poderá levar a mecanismos de patogénese que incluem disfunção da autofagia, efeitos deletérios resultantes do processamento aberrante de pré-mRNA, toxicidade mediada por RNA, aumento de stress oxidativo, alterações na sinalização celular e perturbações na homeostasia de cálcio. Tanto a presença de agregados de ataxina-2 como o processo de neurodegeneração são especialmente marcados em regiões particulares do encéfalo, nomeadamente no cerebelo e ponte dos doentes de SCA2. Contudo, a neurodegeneração aparenta estender-se a outras regiões neuroanatómicas, concomitantemente à progressão da doença. Apesar da aparente seletividade regional onde a morte neuronal ocorre, os mecanismos responsáveis pela sua propagação até diferentes áreas anatómicas interconectadas permanecem pouco compreendidos na SCA2, bem como no contexto de outras doenças neurodegenerativas. Durante a última década, diversos estudos têm vindo a demonstrar a participação de vesículas extracelulares na propagação de proteínas com conformações aberrantes, associadas a diversos processos neurodegenerativos. Em alguns casos, verificou-se que este tipo de mecanismo de transporte intercelular constituía uma verdadeira causa de propagação de toxicidade para células saudáveis, sustentando a hipótese da existência de um mecanismo de disseminação de doença. As vesículas extracelulares são estruturas delimitadas por uma bicamada lipídica, que são secretadas, virtualmente, por todos os tipos celulares. Existem diversos tipos de vesículas extracelulares que diferem fisicamente, molecularmente e funcionalmente entre si. Contudo, existe um conjunto de sobreposições de caraterísticas entre os diferentes grupos de vesículas extracelulares que dificultam a sua correta caracterização e classificação. Apesar das diferenças, na sua generalidade, as vesículas extracelulares são capazes de transportar um conjunto de cargas variadas entre células, nomeadamente proteínas, lípidos e diversos tipos de RNAs, que podem, potencialmente, influenciar o comportamento da célula que as internaliza, seja num contexto fisiológico ou patológico. O facto de as vesículas extracelulares serem recorrentemente implicadas na propagação de proteínas com conformação aberrante em diversas doenças neurodegenerativas levou-nos a questionar se este potencial mecanismo de disseminação de doença poderia existir na SCA2 e, assim, explicar, pelo menos em parte, a progressiva neurodegeneração que é observável nos doentes. Deste modo, o objetivo principal deste trabalho consistiu em determinar se a ataxin-2 ou o seu transcrito de mRNA são transportados intercelularmente e se este processo contribui para a propagação de um fenótipo de doença. Na primeira parte deste estudo, observámos que a incubação de células de neuroblastoma de murganho (N2a) com meio condicionado obtido a partir de células que expressam ataxina-2 humana conduz à deteção da proteína humana naquelas células. Adicionalmente, verificámos que o mRNA da forma humana da ataxina-2 mutante se encontra presente em dois tipos diferentes de vesículas extracelulares (exossomas e microvesículas) obtidas a partir de células N2a que expressam a proteína humana. Observámos, ainda, que ambos os tipos de vesículas extracelulares isolados foram capazes de induzir, em células N2a, a formação de estruturas intracelulares semelhantes a agregados de ataxina-2, que aumentaram em número e volume de forma progressiva. Na segunda parte deste trabalho, averiguámos a possibilidade de as vesículas extracelulares serem capazes de propagar a forma humana da ataxina-2 mutante por diferentes regiões do encéfalo de murganhos. Para isso, isolámos exossomas e microvesículas de células N2a que expressavam a ataxina-2 mutante e injetámos, separadamente, as vesículas extracelulares no ventrículo lateral direito dos animais, através de cirurgia estereotáxica. Vinte e quatro horas depois, verificámos a presença de foci contendo ataxina-2 em diversas regiões anatómicas do encéfalo, em diferentes graus de abundância. Por exemplo, as células de Purkinje do cerebelo, que se sabem estarem especialmente afetadas na SCA2, apresentavam uma maior quantidade de foci, comparativamente ao caudoputamen. Por outro lado, as células das camadas granular e molecular do cerebelo não mostravam qualquer presença destas estruturas. Estas discrepâncias observadas poderão ser explicadas pela especificidade de internalização das vesículas extracelulares, que poderá variar de acordo com o tipo celular que as internaliza. Em conclusão, este estudo sugere pela primeira vez que a ataxina-2 mutante é transportada intercelularmente, pelo menos na forma de mRNA, através de vesículas extracelulares que promovem a formação de agregados de ataxina-2 em células saudáveis. Este processo poderá contribuir para a patofisiologia da SCA2 e para a seletividade regional da neurodegeneração que se verifica na doença.

The brain possesses 20% of whole-body cholesterol, becoming the richest cholesterol organ in our body. Due to the Blood Brain Barrier, the cholesterol has its own way to synthesize and degrade cholesterol, in order to maintain its homeostasis. Cholesterol is synthesized through de novo synthesis in the brain and transported out of the brain in the form of oxysterols, more specifically 24-hydroxycholesterol (24-OHC). This process is acomplished through CYP46A1, a protein of the CYP450 family. Alterations in cholesterol homeostasis can lead to metabolic abnormalities, such as obesity, inflammation and insulin resistance. Previous studies in our laboratory showed that alterations in the expression of Cyp46A1 gene (more specifically silencing) with different diets, rich and poor in fat, had impacts in whole-body homeostasis. Taking these results into account, the main objective of this study was to evaluate the impact of modulation of Cyp46A1 gene in the main metabolic organs (liver, pancreas, and adipose tissue), through silencing and overexpressing CYP46A1 in the arcuate nucleus of the hypothalamus. This modulation was made in C57BL/6J mice fed with two distinct diets, one rich in fat (HF diet) and one poor in fat (CHOW diet). The data obtained from microscopy and tissue quantification made it possible to see the physiological changes resultant from the modulation of CYP46A1. It was possible the phenomenon BAT “whithening”, an increase in the size of Langerhans islets and lipidic hypertrophy. RT-qPCR was also realized to evaluate the mRNA levels of the different targets in the hypothalamus. The results obtained from RT-qPCR, showed that modulation of Cyp46A1 affected the mRNA levels of the different targets tested (POMC, NPY and TNF-alpha). All this data confirmed our hypothesis, that the modulation of CYP46A1 do alter the whole-body metabolism. Further studies must be conducted to continue this project, in order to investigate if this gene could be a target for genetic therapies. Um dos grandes problemas de saúde atuais da nossa sociedade é a obesidade. Esta condição é um dos principais sintomas da síndrome metabólica sendo consequência, para além da ausência de exercício físico, de uma dieta desequilibrada e rica em gorduras. A obesidade gera várias consequências no corpo, sendo uma delas a inflamação, podendo esta ocorrer no tecido adiposo, fígado e até no cérebro. O cérebro é o órgão do corpo humano que possui maior teor de colesterol, cerca de 20% do colesterol total corporal. Este é necessário para a formação das bainhas de mielina e membranas celulares. O cérebro possui uma barreira protetora, altamente seletiva que protege o órgão de substâncias tóxicas que possam ser encontradas no sangue, a barreira hematoencefálica. Esta barreira, impede também o colesterol de entrar ou sair do cérebro, pelo que o cérebro possui um metabolismo do colesterol altamente controlado. Este equilíbrio é mantido através da síntese de novo, conversão e efluxo. Para que o colesterol possa ser transportado para fora do cérebro, é necessário que seja previamente convertido em oxisterol, um derivado hidrolisado do colesterol, que por sua vez é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica. Esta conversão é possível através da enzima Cyp46a1, que converte o colesterol em colesterol-24-hidroxilase, para que possa ser eliminado no fígado. Diversos estudos mostraram que alterações na homeostasia do metabolismo do colesterol poderiam levar à obesidade e problemas relacionados (resistência à insulina e diabetes tipo 2). Tendo isto em conta, o principal objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da modulação do Cyp46A1 no cérebro no metabolismo corporal. Para tal, utilizouse uma amostragem de 69 ratinhos C57BL/6J, onde 45 ratinhos foram expostos a um silenciamento da expressão do gene Cyp46A1 e 24 ratinhos a uma sobre expressão deste gene. Para tal, foi realizada uma injeção estereotáxica bilateral no núcleo arqueado do hipotálamo, com os respetivos grupos virais: a sobre expressão, AAV-Cyp46A1 e o silenciamento, AAV-shCyp46A1. Para verificar também a influência da dieta, os ratinhos foram divididos em seis grupos contendo duas dietas diferentes: AAVCyp46A1, AAVshCyp46A1 e grupo controlo (não injetados) com uma dieta rica contendo 60% de gordura (denominada High Fat Diet, HF) e AAVCyp46A1, AAV-shCyp46A1 e grupo controlo com uma dieta que continha 10% de gordura (denominada Low Fat control diet, CHOW). Os resultados obtidos neste estudo, revelaram que a modulação do gene Cyp46a1 no núcleo arqueado do hipotálamo afetou a morfologia de vários órgãos metabólicos, levando a um aumento no tamanho das ilhotas de Langerhans no pâncreas, a uma acumulação de gotículas lipídicas no fígado e também a alterações na estrutura do tecido adiposo, nomeadamente hipertrofia. Estes resultados foram também comprovados através da quantificação dos respetivos tecidos. Foram também realizados vários RT-qPCR, de forma a verificar se a modulação do gene Cyp46a1 alterou os níveis de mRNA do próprio Cyp46A1 e de outros importantes mediadores metabólicos do núcleo arqueado do hipotálamo, entre eles o POMC e o NPY. Foi possível verificar uma diminuição dos níveis de mRNA do Cyp46A1 no grupo silenciado quando comparado com o grupo controlo, embora esta não seja significativa. Por outro lado, verificou-se que os níveis de NPY, tanto o grupo AAV-shCyp46A1 como o AAV-Cyp46A1 com a dieta HF possuem aumentos significativos nos níveis de mRNA, quando comparados com o grupo de animais não injetados. Foram estudados também os níveis de mediadores de inflamação, nomeadamente do TNF-alfa. Neste alvo, observou-se claramente um aumento nos níveis de mRNA nos grupos AAV-Cyp46A1 e AAV-shCyp46A1 que possuíam a dieta HF, em relação aos grupos controlo. Os resultados obtidos sugerem então um papel fundamental do gene Cyp46a1 no metabolismo corporal, para além do papel desempenhado a nível cerebral. No entanto, será necessário realizar mais estudos de forma a tentar compreender de forma mais completa o papel desta proteína no metabolismo corporal.

Diet-induced obesity causes a central inflammatory process in the brain, more specifically in the arcuate nucleus of the hypothalamus; in addition to substantially altering cholesterol homeostasis in the brain. The brain is one of the richest organs in cholesterol and cholesterol homeostasis has proved to be very important not only to maintain healthy brain physiology, but also directly influencing the whole-body homeostasis. In addition, several metabolic disorders are correlated with different neurodegenerative diseases. Cholesterol in the brain is converted primarily to 24-hydroxycholesterol (24-OHC) by CYP46A1. Changes in oxysterol metabolism have been correlated with obesity. Previous studies from our laboratory have identified CYP46A1 as a relevant therapeutic target, not only for Machado de Joseph disease, but also for other neurodegenerative diseases. One of these studies revealed that the silencing of the expression of the Cyp46a1 gene (using AAV5-shCyp46A1), in the hypothalamus of C57BL/6J mice fed a low fat diet (Chow) (control diet) and a high fat diet (HFD), had a profound impact on the dysregulation of the entire physiological process of body homeostasis. In this sense, additional studies became necessary to demonstrate that the effect of silencing the Cyp46a1 gene in the arcuate nucleus was specific, discarding the effect of the surgical procedure or viral vectors administration. Thus, in this study, our main objective was to control the effect of Cyp46a1 silencing on the hypothalamus (arcuate nucleus). For this, through stereotaxic surgery, a control gene (GFP) was delivered by AAV vectors in the arcuate nucleus; both in animals fed with Chow ration and those fed with HFD ration. The project's main hypothesis is that the GFP protein does not interfere in the physiology of the hypothalamus and consequently in the metabolism of the whole-body, regardless of diet. Our data confirm that stereotaxic surgery and GFP expression did not alter the homeostasis of the hypothalamus and, consequently, there was no change in the whole-body metabolism of the mice. A epidemia do excesso de peso e obesidade representa um dos mais importantes problemas de saúde pública do século XXI. A obesidade induzida por dieta causa um processo inflamatório central no cérebro, mais especificamente no núcleo arqueado do hipotálamo. O núcleo arqueado é uma região especial do cérebro responsável pela regulação da homeostasia energética corporal, possuindo uma importância crucial na manutenção do equilíbrio entre consumo e gasto energético. Na obesidade há disfunção hipotalâmica e esta disfunção pode alterar substancialmente a homeostasia do colesterol no cérebro. O cérebro é um dos órgãos mais ricos em colesterol e a sua homeostasia do colesterol é muito importante para manter a fisiologia cerebral saudável e também influencia diretamente a homeostasia do resto do organismo. Além disso, o facto de os distúrbios metabólicos estarem correlacionados com diferentes doenças neurodegenerativas, como: doença de alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington. O colesterol no cérebro é convertido principalmente em 24S-hidroxicolesterol pela enzima Cyp46a1. Alterações no metabolismo do oxisterol foram correlacionadas com a obesidade. Estudos do nosso laboratório identificaram o CYP46A1 como um alvo terapêutico relevante, não apenas para a doença Machado de Joseph, mas também para outras doenças neurodegenerativas. Um desses estudos, revelou que o silenciamento da expressão do gene Cyp46a1 (utilizando-se AAV5-shCyp46A1), no hipotálamo (núcleo arqueado), de morganhos C57BL/6J alimentados com dieta com baixo teor de gordura (Chow – low fat control diet) (dieta controlo) e com uma dieta com alto teor de gordura (HFD – high fat diet), tem impacto profundo na desregulação de todo o processo fisiológico da homeostasia corporal destes ratinhos. Tem ainda grande impacto no perfil fisiológico dos órgãos metabólicos e alterações na morfologia estrutural de cada um deles, como: WAT, BAT, fígado, pâncreas, entre outros. Desta forma, os resultados deste estudo sugerem que o silenciamento do Cyp46a1 nos animais Chow AAV5-shCyp46a1 e HFD AAV-shCyp46a1 resulta em um fenótipo de obesidade, alterações nos níveis de oxisteróis cerebrais e diabetes mellitus tipo 2; além de modificações significativas no comportamento. Os resultados sugerem o papel importante do gene Cyp46a1 na manutenção do metabolismo do colesterol no cérebro e no controlo da homeostasia energética corporal. Diante destas observações, estudos adicionais tornaram-se necessários para comprovar o efeito do silenciamento do gene Cyp46a1 no núcleo arqueado, descartando o efeito do procedimento cirúrgico. Desta forma, neste estudo, o nosso principal objetivo foi controlar o efeito do silenciamento de Cyp46a1 no hipotálamo (núcleo arqueado). Para tal, por meio de cirurgia estereotáxica foi realizada a injeção de um gene controlo (GFP) mediado por vetores AAV no núcleo arqueado; tanto em morganhos alimentados com dieta Chow, como em morganhos alimentados com dieta HFD. A hipótese do projeto é que a proteína GFP não interfere na fisiologia do hipotálamo e consequentemente no metabolismo de todo o corpo, independentemente da dieta. Este estudo foi conduzido durante um período de 12 semanas; no início do estudo os morganhos (C57BL/6J) foram divididos aleatoriamente em dois grupos: Chow (controlo) e HFD. A partir deste momento, cada grupo foi alimentado com a dieta específica por 12 semanas. Na quarta semana do estudo, os dois grupos foram submetidos a injeção estereotáxica bilateral no núcleo arqueado. Os resultados demonstraram que a proteína GFP não interferiu na fisiologia do hipotálamo (núcleo arqueado) e que as injeções estereotáxicas (AAVGFP) não causaram inflamação comprometedora que tenha alterado a fisiologia e o fenótipo alcançado através exclusivamente da dieta administrada (Chow e HFD) aos grupos dos morganhos utilizados. O fenótipo obeso foi previsivelmente alcançado pela indução de dieta gordurosa apenas nos morganhos HFD, assim como, a alteração da morfologia de vários tecidos metabólicos (WAT, BAT, pâncreas e fígado) e houve uma grande acumulação de lípidos nos órgãos. Os morganhos controlo (dieta Chow) não desenvolveram obesidade, não apresentaram alterações na morfologia dos tecidos metabólicos (WAT, BAT, pâncreas e fígado) e também não apresentaram modificações no acúmulo lipídico dos órgãos. Como este estudo é um controlo importante para o projeto de silenciamento do gene Cyp46a1 realizado anteriormente, os resultados aqui apresentados confirmam que a cirurgia estereotáxica e a expressão de GFP não alteram a homeostasia do hipotálamo e consequentemente não há alteração no metabolismo corporal dos morganhos.

Os vírus adeno-associados (AAV) têm 25 nm de diâmetro e transportam uma molécula de DNA de cadeia simples. O seu genoma está flanqueado por duas repetições terminais invertidas e codifica para proteínas de replicação, proteínas da cápside e para a proteína AAP. É um vírus cuja replicação depende da co-infeção com outro vírus, como por exemplo o adenovírus ou o herpes simplex vírus, pois não possui a capacidade de se replicar por si só. Até hoje foram descritos 13 serótipos de AAV e não existe na literatura doenças associadas à sua infeção. Os vetores AAV demonstraram ser sistemas de entrega seguros e fiáveis para entrega de transgenes terapêuticos no sistema nervoso central, mas também noutros órgãos e tecidos. O sistema nervoso central possui um caráter imuno privilegiado, uma vez que, está protegido pelas meninges, pela barreira hemato-encefálica e pelo líquido cefalorraquidiano, que em conjunto previnem a passagem de agentes nocivos exógenos, mas também de agentes terapêuticos. É, portanto, urgente encontrar novos métodos para que o transgene terapêutico atinja as células alvo no tratamento ou na cura de doenças neurológicas. O presente estudo pretende investigar as propriedades do novo vetor mosaico AAV1/AAV2 injetado no estriado e nos núcleos profundos do cerebelo (DCN), comparando-o com os serótipos parentais AAV1 e AAV2. Os critérios avaliados foram a biodistribuição do vetor pelo cérebro, as regiões do cérebro que é capaz de transduzir, o tipo de células que infeta e a toxicidade inerente à sua administração. O novo vetor mosaico AAV1/AAV2 é um AAV recombinante que transporta uma cadeia de DNA simples constituído por as repetições terminais repetidas do serótipo AAV2, o gene que codifica para a proteína green flourescent protein (GFP) e pelo promotor do citomegalovírus. A particularidade que diferencia este vetor dos já existentes, é a constituição da sua cápside, uma vez que a mesma é constituída por proteínas da cápside do serótipo AAV1 e do serótipo AAV2, originando-se por isso uma cápside tipo mosaico, daí o nome, vetor mosaico AAV1/AAV2. Ao possuir estes dois serótipos como constituintes da sua cápside, é possível que o vetor mosaico contenha características das cápside dos vetores parentais tais como, a capacidade de transduzir as células neuronais, característica dos AAV1 e ao mesmo tempo seja capaz de reconhecer o recetor de heparina que é comumente conhecido por ser o recetor primário do AAV2. Este recetor é por isso utilizado para o processo de purificação dos vetores recombinantes do AAV2, através de cromatografia por afinidade à heparina. Desta forma, há a possibilidade do vetor mosaico AAV1/AAV2 poder ser purificado pelo mesmo método. O método da tripla transfecção foi utilizado para a produção dos vetores virais. Este consiste na transfecção de uma linha celular de packaging (HEK293) com três plasmídeos: um plasmídeo helper, um plasmídeo com o transgene de interesse e um plasmídeo que codifica para as proteínas da cápside; que, neste caso específico, são dois plasmídeos, um codificante para as proteínas da cápside do serótipo do AAV1 e outro codificante para as proteínas da cápside do serótipo AAV2. Do mesmo, resulta a produção de um novo vetor com aproximadamente 50% de proteínas da cápside do serótipo AAV1 e os restantes 50% do serótipo AAV2. Numa primeira experiência, murganhos C57BL/6 foram injetados no estriado com 3×109 genomas virais (vg) do vetor mosaico AAV1/AAV2 ou com um dos vetores dos serótipos parentais, AAV1 ou AAV2. Numa segunda experiência, os murganhos foram injetados nos núcleos profundos do cerebelo com 5×109 vg do vetor mosaico AAV1/AAV2 ou com os vetores dos serótipos parentais. Um mês após a injeção, os animais foram sacrificados e o cérebro foi separado, um hemisfério para análise molecular e outro dos hemisférios para análise histológica. Os resultados sugerem que o vetor mosaico AAV1/AAV2 tem uma melhor biodistribuição e transdução comparativamente aos vetores dos serótipos parentais, aquando da sua injeção no estriado. No estriado, os vetores parentais e o vetor mosaico AAV1/AAV2 foram capazes de se espalhar desde a região da injeção para a região mais dorsal do cérebro. No cerebelo os vetores distribuíram-se desde os núcleos profundos do cerebelo para todo o cerebelo, assim como para as regiões que o cerebelo recebe e envia projeções. No estriado, o vetor mosaico AAV1/AAV2 foi o que obteve melhores resultados de transdução e biodistribuição, sendo capaz de transduzir o córtex, o estriado, tálamo, os núcleos endopiriformes, núcleos sub-talâmicos e o globus pallidus; enquanto que, aquando a injecção nos núcleos profundos do cerebelo, o vetor do serótipo AAV1 teve melhor transdução e biodistribuição, sendo capaz de transduzir o cerebelo, o tálamo, o mesencéfalo, o núcleo central da amígdala, a medula e a ponte. Tanto no estriado, como nos núcleos produndos do cerebelo não foi possível inferir o tropismo celular dos vetores parentais e o vetor mosaico AAV1/AAV2, pois nenhum co-localizou com os marcadores utilizados, NeuN, GFAP e Iba-1 que marcam respetivamente, os neurónios, astrócitos e microglia. No entanto, é possível verificar a transdução das células de Purkinje por microscopia, uma vez que, a região onde estas se localizam se encontra a expressar GFP. Os testes toxicológicos revelaram que após a administração dos vetores parentais e o vetor mosaico AAV1/AAV2 no estriado, não houve perda de marcador neuronal. Em conclusão, o vetor mosaico AAV1/AAV2 demonstrou ser um vetor seguro, com resultados que indiciam ser um bom candidato para transdução de células do sistema nervoso central. Este foi capaz de manter o tropismo celular do serótipo parental AAV1 e, simultaneamente, ser purificado pelo método de purificação utilizado para o AAV2, i.e. a cromatografia de afinidade à heparina. Aquando da injeção do vetor mosaico AAV1/AAV2 no cerebelo, a biodistribuição parece estar diminuída em relação ao serótipo AAV1, o que levanta a questão quanto ao contributo do serótipo AAV2 para o modo de dispersão do vetor nesta região. No futuro são necessários testes complementares para determinar se a utilização do vetor mosaico AAV1/AAV2 é superior relativamente aos serótipos parentais e ainda determinar a população neuronal especifica traduzida pelo vetor de interesse. Seria muito interessante que o vetor AAV1/AAV2 fosse empacotado com um gene terapêutico para ser testado, por exemplo, num modelo animal de uma doença neurodegenerativa. Caso os resultados demonstrassem que a utilização do vetor mosaico AAV1/AAV2 fossem vantajosos em relação aos vetores conhecidos, poderia vir a ser utilizado em ensaios clínicos para o tratamento ou cura de doenças neurodegenerativas. Adeno-associated viral (AAV) vectors have demonstrated to be safe and reliable gene delivery systems to the central nervous system (CNS). Due its immune privileged status, it is difficult to deliver the therapeutical treatment to the target cell and treat neurological disorders of the CNS. This study investigates the spreading, transduction, cell tropism, and toxicity of a novel mosaic AAV, the AAV1/AAV2 delivery system, upon intraparenchymal injection in the striatum and in the deep cerebellar nuclei (DCN) of normal mice. The mosaic AAV1/AAV2 vector was produced using the “triple” transfection method, however, the packing cell was transduced by 2 plasmids encoding for the AAV1 and AAV2 serotype capsid proteins instead of one. The first cohort of C57BL/6 mice was bilaterally injected with 3×109 vg in the striatum with mosaic AAV1/AAV2 or parental serotypes, AAV1 and AAV2. The second cohort was bilaterally injected in the DCN region of the cerebellum with 5×109 vg of mosaic AAV1/AAV2 or parental serotype. The results indicate that in the striatal injection, the mosaic AAV1/AAV2 vector had better spreading and transduce more brain regions than the parental serotypes. The mosaic AAV1/AAV2 and parental vector tropism was unable to be detected with the used antibodies, NeuN, GFAP and Iba-1, which detect neurons, astrocytes, and microglia, respectively, in both striatum and DCN. None of the viral vectors exhibited toxicity in the striatal injection. In the DCN injection, the AAV1 serotype had better spreading and higher transduction levels than the other vectors. In conclusion, the mosaic AAV1/AAV2 is a safe delivery vehicle for CNS with wide transduction results upon intraparenchymal injection. It is capable of sustaining the AAV1 neuronal tropism, as well as to be purified by the AAV2 standard technique, i.e. heparin affinity chromatography. However, further investigation is necessary to increase the sample size and determine the vector cell tropism.

Spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2) is a hereditary neurodegenerative disorder caused by expansion of CAG trinucleotide repeats present in the codifying region of the ATXN2 gene. The mutant ATXN2 product - a ataxin-2 protein with an expanded polyglutamine tract - displays a cytotoxic gain-of-function, leading to progressive neurodegeneration. No definitive therapy for this disease has yet been developed, but ATXN2 knock-down represents a promising approach. The versatility of the CRISPR-Cas system enables gene silencing at a genomic level, through an array of unprecedently diverse mechanisms. Cas nucleases guided by a single guide RNA (sgRNA) molecule produce modifications in precise regions of the DNA, and the system can be modified to direct transcriptional inhibitors such as the Krüppel-associated box domain (KRAB) to particular genetic loci. The aim of this study was to develop two ATXN2 silencing strategies, utilizing catalytically active Cas9 to knock-down the ATXN2 gene or, alternatively, a dCas9-KRAB fusion protein to pre-transcriptionally repress ATXN2 expression. One sgRNA targeting the codifying region of ATXN2 was cloned into a plasmid encoding Cas9, and another sgRNA targeting the ATXN2 promoter was cloned into a plasmid encoding dCas9-KRAB. Plasmids were transfected into human embryonic kidney (HEK) 293T cells and endogenous ATXN2 mRNA and protein levels were analyzed by qPCR and Western blot. Cas9/sgRNA did not alter ATXN2 mRNA levels in comparison to controls, contrasting with ataxin-2 protein levels that revealed a decrease tendency. dCas9-KRAB/sgRNA did not alter ATXN2 mRNA levels, but displayed a tendency for decreasing ataxin-2 protein levels, relative to non-transfected cells. Our study suggests that the CRISPR-Cas9 system may be adapted for ATXN2 gene silencing applications, but further improvements to our strategies will be necessary to produce significant alterations. De entre as diferentes formas hereditárias de ataxia, a ataxia espinocerebelosa tipo 2 representa a segunda mais comum a nível mundial. Os sintomas progressivos desta doença neurodegenerativa incluem perda de coordenação motora, movimentos sacádicos oculares e vários sinais resultantes de degeneração cerebelosa, como disartria e disfagia. A ataxia espinocerebelosa tipo 2 surge como consequência de uma expansão anormal de repetições de trinucleótidos CAG presentes no exão 1 do gene ATXN2, em número igual ou superior a 33. O gene ATXN2 codifica a proteína ataxina-2 e, na sua forma mutada, origina uma forma alterada desta proteína, com uma sequência de glutaminas anormalmente expandida. Esta expansão confere à proteína propriedades citotóxicas, responsáveis pela disfunção e morte de populações particulares de neurónios, nomeadamente as células de Purkinje. Com efeito, a ataxia espinocerebelosa tipo 2 insere-se no grupo das doenças de poliglutaminas, um conjunto de nove doenças neurodegenerativas monogénicas que têm em comum o facto de serem causadas por expansões de repetições de glutaminas nas proteínas a que estão associadas. Recentemente, estudos têm sugerido que tratos de CAG expandidos presentes em transcritos de mRNA podem também apresentar toxicidade e contribuir para os mecanismos fisiopatológicos. Até aos dias de hoje, não foi ainda desenvolvida nenhuma terapia eficaz para a ataxia espincerebelosa tipo 2, que seja capaz de tratar a doença ou de atrasar o seu curso. Como tal, o tratamento da ataxia espinocerebelosa tipo 2 tem sido limitado ao controlo dos sintomas. Algumas estratégias terapêuticas estão atualmente a ser desenvolvidas e diversos alvos terapêuticos continuam por explorar. Algumas das estratégias mais promissoras baseiam-se no silenciamento do gene ATXN2, mas até hoje ainda não foram testados métodos de silenciamento que atuem a nível genómico, em contraste com os métodos clássicos que atuam sobre as moléculas de ARNm. O sistema de edição génica CRISPR/Cas9 tem expandido as possibilidades de manipulação que pode ser exercida sobre o genoma, e sobre a expressão genética. Este sistema tem como base uma endonuclease, Cas9, e uma molécula de ARN guia (single guide RNA; sgRNA) que, quando combinadas, formam um complexo ribonucleoproteíco. O ARN guia direciona o complexo para uma região alvo do ADN, ligando-se a essa sequência por complementaridade de bases. A proteína Cas9 tem a capacidade de clivar ambas as cadeias da hélice dupla de ADN, introduzindo assim um corte na cadeia dupla. Este sistema pode ser explorado para produzir mutações em regiões particulares do genoma, decorrentes da reparação da região clivada. Alternativamente, a proteína Cas9 pode ser modificada e usada para direcionar inibidores da transcrição, como o domínio Krüppel-associated box (KRAB), para loci genéticos específicos. Este projeto teve como objetivo desenhar e desenvolver uma estratégia com potencial terapêutico para a ataxia espinocerebelosa tipo 2, sustentada no silenciamento do gene ATXN2 e recorrendo a ferramentas moleculares baseadas no sistema CRISPR/Cas9. Para alcançar este objetivo, foram testadas duas abordagens distintas. Primeiramente, procurou-se utilizar o sistema CRISPR/Cas9 convencional de modo a introduzir um codão de terminação prematuro no gene ATXN2 e assim incapacitar permanentemente a tradução de ataxina-2, num fase inicial da síntese proteica. Numa estratégia alternativa, recorreu-se a uma variante do sistema CRISPR/Cas, designado de CRISPR interference (CRISPRi), para reprimir a expressão do gene ATXN2 a um nível pré-transcricional. Esta última abordagem tomaria partido de um complexo proteico constituído por uma proteína Cas9 sem atividade catalítica (dCas9), fundida com um domínio KRAB. O bloqueio da expressão genética mediada por CRISPR/Cas9, na sequência de um corte da cadeia dupla de DNA, depende de um sistema endógeno de reparação do ADN - a união terminal não homóloga (non-homologous end-joining; NHEJ). Este processo introduz pequenas inserções ou deleções (indels) na cadeia de ADN, que levam consequentemente à formação de um codão de terminação prematuro a jusante do local reparado. De modo a introduzir um corte na cadeia dupla de DNA a montante do trato de CAGs do gene ATXN2, desenhou-se um sgRNA complementar a uma sequência presente entre o codão de iniciação da tradução e o início das repetições de CAG. A sequência de sgRNA foi clonada num plasmídeo de expressão que codificava Cas9 cataliticamente ativa, e este plasmídeo (Cas9/Indel) foi então transfetado em células HEK 293T, com o objectivo de se determinar o seu efeito na expressão do gene ATXN2, a nível de ARNm e da proteína ataxina-2, através de qPCR e Western blot, respetivamente. Os resultados de qPCR indicaram que os níveis de expressão de ARNm do gene ATXN2 em células HEK 293T transfetadas com Cas9/Indel não apresentavam uma diferença estatisticamente significativa comparativamente às condições controlo. Quanto aos resultados de Western blot, as células transfetadas com a ferramenta molecular em teste apresentaram uma tendência para uma redução dos níveis proteicos de ataxina-2. Contudo, tal como nos resultados de qPCR, esta diferença não se demonstrou estatisticamente significativa. Com o objetivo de silenciar a expressão de ATXN2 através de CRISPRi, desenharam-se várias sgRNAs capazes de direcionar a proteína de fusão dCas9-KRAB para o promotor do gene ATXN2. Esperava-se que a ligação da proteína dCas9-KRAB ao promotor do gene ATXN2 silenciaria a expressão do gene através do recrutamento, mediado pelo KRAB, de maquinaria modificadora de cromatina. Umas das sequências de sgRNAs foi clonada num plasmídeo codificando a fusão dCas9-KRAB, e células HEK 293T foram transfetadas com o plasmídeo assim gerado (dCas-KRAB/Prom2). O efeito desta estratégia na expressão do gene ATXN2 foi avaliado novamente a nível do mARN e da proteína ataxina-2, através de qPCR e Western blot. Os resultados de qPCR relativos aos níveis de ARNm do gene ATXN2 expressos por células transfetadas com dCas-KRAB/Prom2 não revelaram diferenças estatisticamente significativas, em comparação com os restantes grupos experimentais. A análise dos resultados de Western blot revelou uma tendência para a redução dos níveis proteicos de ataxin-2, comparando com as células não transfetadas, embora, uma vez mais, sem significância estatística. Este estudo demonstra a variedade de estratégias de silenciamento genético que se podem elaborar com base no sistema CRISPR/Cas9. Contudo, serão necessários estudos adicionais e a optimização de alguns dos procedimentos utlizados antes que se possa validar e estabelecer o potencial das duas estratégias desenvolvidas neste trabalho como estratégias putativas para o silenciamento do gene ATXN2 e o tratamento da ataxia espinocerebelosa tipo 2.

Cilia are specialized organelles present in most mammalian cells to detect multiple environmental cues, important to regulate cell proliferation, differentiation, and function. Defects in these structures can cause innumerous severe disorders known as ciliopathies. During ciliogenesis, the ciliary base attaches to the plasma membrane and forms a Transition Zone (TZ) that acts as a specialized ciliary gate. The microtubule-based ciliary axoneme then extends forming the Middle and the Distal Segments, surrounded by a receptor-rich ciliary membrane. Building of all types of cilia depends on the efficient bidirectional transport of different components from the ciliary base and tip, known as Intraflagellar Transport (IFT). Kinesin-II motors transport cargo to the tip, while dynein-2 retrieves signaling molecules and other IFT components to the base. The dynein-2 motor is a large multi-subunit complex composed of several dimers of Heavy Chains (HC), Light Intermediate Chains (LIC), Intermediate Chains (IC) and Light Chains (LC). However, most aspects of dynein-2 subunit recruitment and function are still poorly understood. To determine the mechanisms that control dynein-2 recruitment and activity inside cilia, and increase our understanding on how mutations in dynein-2 subunits cause developmental ciliopathies, I used live fluorescence microscopy to directly monitor the dynamics of dynein-2 subunits in Caenorhabditis elegans. In this study, I showed the importance of dynein-2 IC (WDR-60) and LIC (XBX-1) for the ciliary recruitment of the dynein-2 HC (CHE-3). I also found that loss of WDR-60 results in severe defects in IFT kinetics and CHE-3 accumulations near the TZ. Strikingly, by disrupting TZ components, I was able to rescue the accumulation of these particles, revealing that, in addition to contributing to dynein-2 activity, WDR-60 is critical for the passage of IFT particles through the TZ to exit cilia. Thus, the results from this study have important implications for the better understanding of WDR60-associated ciliopathies. Os cílios são organelos especializados presentes na maioria das células de mamíferos. Os cílios podem ser divididos em dois grupos: móveis e imóveis, de acordo com a sua estrutura e função. Cílios móveis incluem, por exemplo, os flagelos em espermatozoides, importantes para a fertilidade, e os multi-cílios nas células das vias aéreas que promovem o fluxo de muco. Cílios imóveis incluem os cílios dos neurónios olfativos que são responsáveis por captar moléculas odorantes, e os cílios de conexão especializada em fotorreceptores que permite a formação de um segmento externo, critico para a visão. Para além destas funções mais especializadas, os cílios primários presentes na maioria das células contribuem para a regulação da proliferação, diferenciação e função celular. Sendo assim, não é de estranhar que defeitos nestas estruturas podem causar inúmeras doenças severas conhecidas como ciliopatias. Estas ciliopatias incluem o Síndrome de Bardet-Biedl (SBB), o Síndrome de Joubert (JBTS), a Nefronoftise (NPHP), o Síndrome de Meckel (MKS), a Displasia torácica de costela curta (SRTD), e muitas outras. Apesar da clara importância dos cílios no desenvolvimento humano, ainda não está claro como mutações em diferentes proteínas ciliares podem resultar em múltiplos tipos de patologias com anomalias distintas. Durante a ciliogénese, o centríolo mais velho do centrossoma (a base ciliar) liga-se à membrana plasmática e forma uma zona de transição que atua como uma porta ciliar especializada - mais precisamente a zona de transição controla as proteínas que podem entrar ou sair do cílio, individualizando-o do citoplasma da célula. O axonema do cílio, formado por microtúbulos, estende-se depois da zona de transição dando origem ao segmento médio e ao segmento distal do cílio, que são envolvidos por uma membrana ciliar rica em recetores. A construção de todos os tipos de cílios depende do transporte bidirecional especializado de diferentes complexos proteicos da base para a ponta do cílio, conhecido como Transporte Intraflagelar (IFT). O IFT depende de proteínas motoras acopladas a complexos de IFT para efetuar o transporte de cargas do cílio. Os motores de cinesina-2 transportam a carga da base até à ponta do cílio, ou seja, no sentido anterógrado, enquanto que a dineína-2 é responsável pelo transporte retrógrado de moléculas de sinalização e outros componentes de IFT para a base do cílio. Os complexos de IFT são compostos de diversas proteínas interligadas entre si que desempenham diferentes funções no IFT, e são divididos em complexo IFT-A e complexo IFT-B. O complexo IFT-A encontrasse mais associado ao transporte retrógrado enquanto que o complexo IFT-B participa no transporte anterógrado sendo essencial para a entrada de componentes para o interior do cílio. O motor retrógrado da dineína-2 é um grande complexo de múltiplas subunidades composto por vários dímeros de cadeias pesadas (HC), cadeias intermediárias leves (LIC), cadeias intermediárias (IC) e cadeias leves (LC). Sabe-se que algumas subunidades da dineína-2 são recrutadas para a base ciliar onde são incorporadas nos comboios IFT para depois participarem no transporte retrógrado na ponta do cílio. Alguns estudos sugerem que o recrutamento das subunidades HC e LIC da dineína-2 para dentro do cílio é interdependente. Também foi reportado que a perda de componentes do complexo IFT-B leva ao bloqueio da entrada de algumas subunidades da dineína-2 para o cílio enquanto que a deleção de subunidades do complexo IFT-A tende a reter a subunidades da dineína-2 dentro do cílio. Contudo, a maioria dos aspetos do recrutamento e a função das subunidades da dineína-2 ainda são pouco compreendidos. Para determinar os mecanismos que controlam o recrutamento e a atividade da dineína-2 dentro dos cílios, e para aumentar a nossa compreensão sobre como mutações nas subunidades da dineína-2 causam ciliopatias de desenvolvimento, neste projeto usei microscopia de fluorescência in vivo para monitorizar diretamente a dinâmica das subunidades da dineína-2 em Caenorhabditis elegans, na presença e ausência da IC (WDR-60) e LIC (XBX-1). Os meus resultados revelam a importância da IC (WDR-60) e LIC (XBX-1) no recrutamento e distribuição da dineína-2 HC (CHE-3) dentro dos cílios de neurónios sensoriais. Mais precisamente, confirmei que a subunidade XBX-1 é necessária para CHE-3 ser recrutada para a base ciliar e mostrei pela primeira vez que WDR-60 é dispensável para o recrutamento ciliar de CHE-3 e XBX-1. Contudo, descobri que a perda de WDR-60 resulta em defeitos graves na velocidade e frequência do movimento retrógrado de CHE-3, e em acumulações desta subunidade perto da base do cílio. Em concordância com estes resultados, também observei que a perda de WDR-60 resulta igualmente em acumulações de várias subunidades dos complexos IFT (A e B) ao longo do cílio, com uma redução significativa nas cinéticas dos seus movimentos retrógrados. Utilizando marcadores da zona de transição do cílio, as acumulações de CHE-3 que observei na ausência de WDR-60 ocorrem na parte mais distal da zona de transição. Com este resultado em consideração, hipotetizámos que a WDR-60 poderia ser importante para a capacidade da dineína-2 de atravessar a zona de transição. Assim, decidimos testar se a remoção dos Y-links da zona de transição seria suficiente para aliviar a acumulação de CHE-3 perto da zona de transição. Efetivamente, quando deletei os componentes da zona de transição que formam os Y-links, consegui reverter as acumulações de CHE-3 mesmo na ausência de WDR-60, revelando que, para além de contribuir para a atividade da dineína-2 durante IFT, a WDR-60 é fundamental para a passagem das partículas de IFT pela zona de transição e assim permitir a sua saída dos cílios. Com base nos resultados deste estudo, eu proponho 3 possíveis modelos de como a IC WDR-60 poderá estar a influenciar a atividade e funções da dineína-2 e do IFT: i) a IC WDR-60 é necessária para que o motor da dineína-2 atinja a velocidade/força que necessita para atravessar a densa região da zona de transição; ii) a IC WDR-60 interage com alguma proteína da zona de transição para permitir a passagem da dineína-2 e de componentes do IFT e saída destes do cílio; iii) a IC WDR-60 é necessária para a correta conformação do complexo da dineína-2, consequentemente, influenciando a sua atividade e eficiência em atravessar a zona de transição. Os resultados deste estudo têm implicações importantes para o melhor entendimento das causas das ciliopatias associadas a mutações em WDR60. This work was financed by FEDER - Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional funds through the COMPETE 2020 - Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal 2020, and by Portuguese funds through FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior in the framework of the project POCI-01-0145-FEDER-029471.

As doenças de poliglutaminas são um grupo de nove doenças neurodegenerativas raras causadas por uma expansão anormal do trinucleótido CAG no gene causador, que codifica um segmento de poliglutaminas expandido na respetiva proteína. Estas proteínas tendem a agregar, formando agregados de proteína insolúveis, que é uma característica neuropatológica das doenças de poliglutaminas. Os mecanismos moleculares da patogénese de doenças de poliglutaminas ainda não são completamente compreendidos. Além disso, atualmente não estão disponíveis opções terapêuticas para estas doenças raras, que parem ou atrasem a sua progressão e que infelizmente culmina com a morte dos doentes. A regulação da expressão genética é um processo crucial através do qual as células eucarióticas respondem e adaptam-se a diferentes estímulos. Quando os mRNAs sofrem transcrição, eles são sujeitos a alterações que controlam a tradução e estabilidade do mRNA, eventos que são regulados por proteínas ligantes de RNA (RBPs). Os eventos de processamento de RNA desempenham um papel fundamental na regulação do desenvolvimento cerebral e funcionamento normal, o que significa que defeitos no metabolismo do RNA podem levar a comprometimentos neuronais e sinápticos, que podem acabar por desencadear patologias. Refletindo esta importância, mais de 50% dos RBPs conhecidos são expressos no cérebro, onde estão envolvidos em diferentes processos como splicing alternativo, transporte, localização, estabilidade e tradução de RNAs. O nosso objetivo neste projeto foi estudar o impacto da sobreexpressão de G3BP1 num modelo transgénico de doenças de poliglutaminas. Foi possível verificar que o cruzamento de murganhos heterozigóticos SCA3/MDJ com animais wild-type gera murganhos transgénicos. Estudos in vivo revelaram que a sobrexpressão de G3BP1 conduz à melhoria do fenótipo motor e da neuropatologia de murganhos com SCA3/MJD. Em conclusão, estes resultados sugerem que a sobreexpressão de G3BP1 apresenta um efeito neuroprotetor. No entanto, são necessários mais estudos para compreender o mecanismo molecular responsável por este efeito. Polyglutamine (PolyQ) diseases are a group of nine rare neurodegenerative disorders caused by an abnormal expansion of the trinucleotide CAG in the causative gene, which encodes a PolyQ tract in their respective protein. These proteins carrying an abnormally expanded PolyQ tract tend to aggregate, forming insoluble protein aggregates, which are a key feature of PolyQ diseases. The molecular mechanisms underlying PolyQ diseases pathogenesis are not yet fully understood. Moreover, currently there are no therapeutic options available for these rare diseases stopping or delaying the disease progression, which culminates with patient death. The regulation of gene expression is a crucial process whereby eukaryotic cells respond and adapt to different stimuli. Once mRNAs undergo transcription, they are subjected to posttranscriptional changes controlling mRNA translation and stability, events that are regulated by the RNA-binding proteins (RBPs). The RNA processing events play a major role in the regulation of brain development and normal functioning, meaning that defects in RNA metabolism could lead to neuronal and synaptic impairments, which ultimately might lead to disease. Reflecting this importance, more than 50% of known RBPs are expressed in the brain, where they are involved in different processes such as alternative splicing, transport, localization, and stability and translation of RNAs. Our goal in this project was to study the impact of the overexpression of G3BP1 in a transgenic mouse model of PolyQ diseases. It was possible to verify that the crossing of heterozygotic SCA3/MJD mice with wild-type animals generates transgenic mice. In vivo studies revealed that the G3BP1 overexpression can ameliorate the motor phenotype and neuropathology in SCA3/MJD mice. In conclusion, these results suggest that G3BP1 overexpression displays a neuroprotective effect. Although, further studies are required to fully understand the molecular mechanism of action responsible for this effect.

Aging is an ongoing process that cannot be stopped, being characterized by a progressive loss of physiological integrity. Hallmarks of aging can be divided in 3 major categories: primary, antagonistic and integrative. Hypothalamus is known for is key role in the endocrine system, being responsible to regulate growth, development, reproduction, metabolism, systemic aging, and ultimately lifespan control. Ghrelin, known as the “hunger hormone”, plays not only a major role in food intake but also in whole-body metabolism. With this investigation, we aimed to evaluate the effect of subcutaneous injection of ghrelin in aged mice. For that, we performed 2 kinds of treatment: a short-term treatment, where animals were submitted to 1-month administration of ghrelin and a gong-term treatment, where animals were submitted to a 2-month treatment. We hypothesise that continuous administration of ghrelin in mice will improve several aging hallmarks. We observed that ghrelin treatment induces less stress and anxiety in mice. Plus, treated mice presented higher weight loss, but improved BAT, WAT and pancreatic functions. In BAT, treated mice have less signs of adipocytes death. In pancreas, treated mice have a tendency of having larger pancreatic area and less dead cells. In addition, ghrelin treatment significantly decreased hypothalamus inflammation. We conclude that ghrelin treatment can improve aging hallmarks such as mitochondrial dysfunction, proteostasis and nutrient sensing. This way, ghrelin can be studied in the future as a potential therapeutic approach to extend lifespan. O envelhecimento é um processo contínuo, caracterizado pela perda progressiva da integridade fisiológica, podendo assim aumentar o risco de desenvolver patologias relacionadas com a idade como o cancro, diabetes, doenças cardiovasculares e doenças neurodegenerativas. Os fatores que influenciam o envelhecimento podem ser divididos em 3 categorias principais: i) fatores primários, que têm um impacto diretamente negativo no organismo; ii) fatores antagónicos, em que o seu impacto no organismo depende diretamente da intensidade desse fator; e iii) fatores integrativos, que são os fatores que afetam a homeostasia corporal. O hipotálamo desempenha uma função de extrema importância no sistema endócrino, tornando-o responsável pela regulação do crescimento, desenvolvimento, reprodução, metabolismo, envelhecimento sistémico e longevidade. Embora seja apelidada de “hormona da fome”, papel da grelina é muito mais amplo do que a indução da ingestão de alimentos. Por exemplo, no que concerne à adiposidade, a grelina, por um lado, induz a acumulação de ácidos gordos e, por outro lado, inibe a sua oxidação. No cérebro, a grelina atua no hipocampo e melhora a capacidade de memória e aprendizagem, uma vez que tem um efeito neuro-protetor. A grelina tem também função regulatória a nível cardiovascular, ósseo, gastrointestinal, metabolismo da glucose, do timo e do ciclo circadiano. Com este trabalho, o nosso objetivo é avaliar o efeito da administração subcutânea de grelina em murganhos envelhecidos. Para isso, fizemos 2 tipos de tratamentos: tratamento de curto prazo, em que a grelina foi administrada diariamente durante um mês, e um tratamento de longo prazo, em que a grelina foi administrada diariamente durante 2 meses. A nossa hipótese é que a administração de grelina pode atrasar os principais fatores que levam ao envelhecimento. Após o tratamento, observámos que o grupo experimental tratado com grelina apresentou menos stress e menos ansiedade face ao grupo controlo. Contrariamente à literatura, observámos que ambos os tratamentos com grelina (curto prazo e longo prazo) induzem perda de massa corporal nos murganhos. Estas observações podem, no entanto, estar relacionadas com a sua avançada idade. Verificámos também que esta perda de massa corporal não está relacionada com a quantidade de comida ingerida, uma vez que esta foi semelhante em ambos os grupos. Estes dados sugerem que a grelina pode influenciar a regulação da massa corporal sem interferir no apetite. No tecido adiposo castanho, observamos que a grelina reduz o número de adipócitos mortos, sugerindo assim que a grelina poderá melhorar a função deste tecido. No tecido adiposo branco, observamos que a área dos adipócitos é significativamente superior nos ratinhos sujeitos ao tratamento. No pâncreas, os ratinhos tratados apresentaram não só uma maior área de ilhas pancreáticas, mas também um menor número de células mortas nas mesmas. Sabendo a importância do pâncreas na regulação da glucose, estes dados sugerem que a grelina poderá desempenhar um papel importante na prevenção de doenças relacionadas com a desregulação da homeostasia da glucose, nomeadamente na diabetes. A nível molecular, no hipotálamo, observámos que o tratamento é capaz de aumentar a expressão de mRNA de genes orexigénicos, nomeadamente os recetores NPY 1 e 2 e o AgRP. Observámos também uma diminuição da expressão do gene anorexigénico POMC. Em relação à inflamação, verificámos que os ratinhos sujeitos ao tratamento apresentaram uma diminuição significativa na expressão de TNF-α, sugerindo assim que que a grelina é capaz de reduzir a sua inflamação. A administração continua de grelina pode, de facto, melhorar os fatores que levam ao envelhecimento corporal. O facto de no tecido adiposo castanho e no pâncreas existir um número inferior de células mortas poderá ser explicado por uma melhoria na proteostasia mitocondrial através da administração de grelina. Para além disso, alguns estudos demonstraram que a inflamação no hipotálamo está relacionada com a perda da proteostasia. Estes dados sugerem que a grelina poderá abrandar o envelhecimento provocado pela acumulação de dano celular através do restauro da proteostasia. Verificámos também que os murganhos tratados mostraram uma melhoria da função pancreática, sugerindo assim uma melhoria na regulação da insulina e, por sua vez, na regulação da glucose. Em suma, um tratamento de grelina poderá melhorar o metabolismo e a homeostasia corporal, em especial nos principais fatores que induzem o envelhecimento. No entanto, estudos e análises adicionais são necessários para melhor compreender a sua ação. Desta forma, a grelina poderá uma possível abordagem terapêutica para aumentar a longevidade.

Cholesterol metabolism is tightly controlled in the brain, through an equilibrium of cholesterol de novo synthesis and cholesterol efflux. Most of the cholesterol in the brain is in myelin sheaths to insulate axons and to maintain their morphology and synaptic transmission. The importance of cholesterol in the brain is highlighted by the fact that dysfunctions in its metabolism homeostasis are correlated with different neurodegenerative disorders. The hypothalamus, specially the ARC, is the principal brain region in the control of whole-body energy homeostasis, having a crucial role in metabolic organ regulation. This project goal was to silence the expression of the Cyp46a1 mouse gene in the hypothalamus of C57BL/6J wild-type mice fed with Chow and HFD, and to investigate its impact in the whole-body metabolism homeostasis. As the ARC is implicated in the control of whole-body energy metabolism, and oxysterols levels are altered in obesity, we hypothesize that the silencing of Cyp46a1 gene could lead to an obesity and TIIDM phenotypes. In this study, C57BL/6J wild-type mice (n=45) were divided into two groups corresponding to two different diets. One group (n=24) had access to a Chow containing 10% of fat and the other group (n=21) had access to an HFD containing 60% of fat. This study was conducted during 12 weeks. In the 4th week, the two groups of mice (Chow and HFD) were divided into four subgroups, from which two were submitted to the stereotaxic injection delivering the AAV of the serotype 5, with the shRNA targeting the mouse Cyp46a1 gene in each side of the ARC and two remained non-injected, as control. The silencing of Cyp46a1 mouse gene in the ARC of mice fed with Chow and HFD leads to an increase of BW, changes in food and water intake, to a reduction of glucose tolerance, of insulin sensitivity and leads also to modifications in several metabolic organs, comparatively to the non-injected animals. In fact, in the Chow AAV5-shCyp46a1 animals, the impact of the silencing Cyp46a1 gene appears to mimic an HFD effect, whereas in HFD AAV5-shCyp46a1 mice this silencing exacerbates the phenotype of obesity. These results could suggest an important role of the cholesterol metabolism in the brain, specially of the Cyp46a1 enzyme in the control of whole-body homeostasis. Finally, additional studies are needed to continue this project and it would be interesting to perform the overexpression of Cyp46a1 in the ARC to investigate if this gene could be a potential target to further genetic therapies. No cérebro, o metabolismo do colesterol é extremamente controlado através do equilíbrio entre a síntese de novo, conversão e efluxo do colesterol. Quando a síntese do colesterol excede a sua necessidade no cérebro, ocorre o processo hidroxilação do colesterol em 24-hidroxicolesterol (24-OHC) através da ação da enzima CYP46A1, uma enzima codificada pelo gene CYP46A1. O oxisterol 24-OHC, ao contrário do colesterol, possui a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica contribuindo desta forma para a homeostasia do colesterol no cérebro. Este está maioritariamente localizado nas bainhas de mielina, de modo a isolar os axónios e manter a sua morfologia e transmissão sináptica. Diversas doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer e a doença de Huntington, foram correlacionados com disfunções na homeostasia do colesterol no cérebro, destacando desta forma a sua importância no organismo. O hipotálamo, especialmente o núcleo arqueado, é a região do cérebro responsável pela regulação da homeostasia energética corporal, apresentando um papel crucial no equilíbrio entre o consumo e o gasto energético. O objetivo deste projeto foi silenciar a expressão do gene Cyp46a1 no hipotálamo de ratinhos C57BL/6J wild-type alimentados com uma dieta de controlo com baixo teor em gordura (Chow – low fat control diet) e com uma dieta com alto teor em gordura (HFD - high fat diet) e investigar o seu impacto na homeostasia energética corporal. Uma vez que o núcleo arqueado está implicado regulação da homeostasia energética corporal e que os níveis de oxisteróis encontram-se alterados na obesidade, criou-se a hipótese de que o silenciamento do gene Cyp46a1 poderia resultar em um fenótipo de obesidade e de diabetes mellitus do tipo 2. Desta forma, os ratinhos C57BL/6J (n=45) foram divididos em dois grupos correspondentes a dietas distintas. Um dos grupos (n=24) teve acesso a uma dieta Chow, contendo 10% de gordura, e o outro grupo (n=21) teve acesso a uma dieta HFD, contendo 60% de gordura. Este estudo foi conduzido durante o período de 12 semanas, no qual, na quarta semana os dois grupos (Chow e HFD) foram divididos em quatro subgrupos. Dois grupos foram submetidos à injeção estereotáxica bilateral no ARC, constituindo os grupos tratados, (Chow AAV5-shCyp46a1 e HFD AAV5-shCyp46a1) e os restantes grupos não foram submetidos à injeção estereotáxica, constituindo os grupos de controlo. O silenciamento do gene Cyp46a1 no núcleo arqueado dos ratinhos C57BL/6J alimentados com uma dieta Chow resultou em um aumento no peso corporal, na ingestão de alimentos e de água, na redução da tolerância à glucose, na sensibilidade à insulina e ainda, em modificações em vários órgãos metabólicos. Da mesma forma, o silenciamento do gene Cyp46a1 dos ratinhos C57BL/6J alimentados com uma dieta HFD resultou em um aumento do peso corporal, em uma diminuição da ingestão de alimentos, da sensibilidade à insulina e em modificações nos órgãos metabólicos. O silenciamento do gene Cyp46a1 no núcleo arqueado dos ratinhos C57BL/6J parece modificar a morfologia do tecido adiposo branco, do tecido adiposo castanho e do fígado, nos animais submetidos à injeção estereotáxica. Os grupos tratados apresentaram importantes modificações na acumulação lipídica nestes órgãos, bem como modificações nos níveis de proteína. Além disso, o silenciamento do gene Cyp46a1 resulta em modificações no comportamento nos ratinhos C57BL/6J alimentados com dietas Chow e uma HFD. Nos animais Chow AAV5-shCyp46a1, o impacto do silenciamento parece mimetizar o efeito de uma HFD, enquanto nos ratinhos HFD AAV5-shCyp46a1 esse silenciamento parece exacerbar o fenótipo da obesidade, uma vez que estes animais já se encontravam metabolicamente desregulados. Os resultados podem desta forma sugerir um papel importante do metabolismo do colesterol no cérebro, especialmente da enzima CYP46A1 no controlo da homeostasia energética corporal. Finalmente, estudos adicionais ainda são necessários e seria interessante realizar a sobre expressão do gene Cyp46a1, no núcleo arqueado, para investigar se este gene poderá ser um potencial alvo terapêutico.