Search

[ES] El microbioma humano constituye el conjunto de microorganismos (bacterias, arqueas, virus, hongos y protistas) que están en nuestro cuerpo, y se ha demostrado en múltiples investigaciones el rol fundamental que tiene en la salud, así como su relación con muy diversas enfermedades o con la respuesta de los pacientes a distintos tratamientos. En concreto, se ha probado que el análisis de la microbiota es de gran ayuda para la predicción y caracterización de enfermedades tales como diabetes, hepáticas, o intestinales, entre otras. Por ello, esta es una línea de investigación prometedora, ya que trata de mejorar el diagnóstico de diferentes enfermedades, lo cual supondría un avance importante para la medicina. Sin embargo, el análisis bioinformático y estadístico de datos de microbioma medidos con técnicas de secuenciación de alto rendimiento no está exento de retos. Por una parte, está la dimensión de los datos, ya que se trabaja con alrededor de 1000 variables pero con no más de 100 pacientes en la mayoría de los casos. Además, son datos con una alta variabilidad y ruido debido a la técnica, y con un elevado número de valores nulos. Esto implica que se debe elegir cuidadosamente el pre-proceso o transformación de los datos, previo al análisis estadístico. Por otra parte, se requieren modelos de clasificación que minimicen el error de predicción pero que funcionen bien bajo supuestos de multicolinealidad y que permitan una adecuada interpretación de los resultados, de tal forma que los biólogos, médicos, etc. puedan identificar qué microorganismos son más relevantes para el diagnóstico o tratamiento de la enfermedad estudiada. Todas estas cuestiones son todavía objeto de discusión entre la comunidad científica y aún están por definir unos procedimientos estandarizados para el análisis de este tipo de datos. Así pues, el objetivo de este estudio es contribuir al establecimiento de un protocolo de análisis, tanto en la parte del pre-proceso de los datos como en la metodología estadística empleada para su análisis. Para ello, se utilizará una colección de al menos 6 bases de datos de microbioma de pacientes sanos y enfermos públicamente accesibles para el estudio de 5 patologías diferentes: cirrosis hepática, enfermedad inflamatoria intestinal (Inflammatory Bowel Desease, IBD), obesidad, diabetes tipo 2 y cáncer colorrectal. Los métodos de aprendizaje automático comúnmente empleados en este tipo de análisis son la regresión logística, el Random Forest o las máquinas de soporte vectorial (SVM). Sin embargo, las metodologías basadas en la proyección sobre estructuras latentes como es la Regresión en Mínimos Cuadrados Parciales (PLS), han sido poco o nada utilizadas en la literatura para abordar este problema. En este trabajo, aplicaremos en concreto el PLS para el Análisis Discriminante (PLS-DA) como método de clasificación y compararemos los resultados con los obtenidos mediante los métodos mencionados para identificar las ventajas o desventajas de cada uno, así como la influencia del pre-procesado de los datos en dichos resultados., [EN] The human microbiome is made up of the set of microorganisms (bacteria, archaea, viruses, fungi and protists) that are in our body, and the fundamental role it plays in health has been demonstrated in multiple investigations, as well as its relationship with very diverse diseases or with the response of patients to different treatments. Specifically, it has been proven that the analysis of the microbiota is of great help for the prediction and characterization of diseases such as diabetes, hepatic, or intestinal, among others. For this reason, this is a promising line of research, since it tries to improve the diagnosis and treatment of different diseases, which would mean an important advance for medicine. However, bioinformatics and statistical analysis of microbiome data measured with high-throughput sequencing techniques is not without its challenges. On the one hand, there is the dimension of the data, since we usually work with hundreds of variables but with no more than 100 patients in most cases. In addition, they are data with high variability and noise due to the technique, and with a high number of null values. This implies that the pre-processing or transformation of the data must be chosen carefully, prior to the statistical analysis. On the other hand, classification models are required that minimize the prediction error but that work well under assumptions of multicollinearity and that allow an adequate interpretation of the results, in such a way that biologists, doctors, etc. can identify which microorganisms are most relevant for the diagnosis or treatment of the disease studied. All these issues are still the subject of discussion among the scientific community and standardized procedures for the analysis of this type of data have yet to be defined.//[0.2cm] Thus, the objective of this study is to contribute to the establishment of an analysis protocol, both in the pre-processing of the data and in the statistical methodology used for its analysis. For this, a collection of 6 publicly accessible microbiome databases of healthy and sick patients will be used for the study of 5 different pathologies: liver cirrhosis, inflammatory bowel disease (Inflammatory Bowel Desease, IBD), obesity, type 2 diabetes and cancer. colorectal.//[0.2cm] The machine learning methods commonly used in this type of analysis are logistic regression, Random Forest or support vector machines (SVM). However, methodologies based on the projection on latent structures such as Regression in Partial Least Squares (PLS), have been little or not used in the literature to address this problem. In this paper, we will specifically apply the PLS Discriminant (PLS-DA) as a classification method and we will compare the results with those obtained by the aforementioned methods to identify the advantages or disadvantages of each one, as well as the influence of the pre-processing of the data in these results.

[ES] Las plantas de vid (Vitis vinifera L.) están expuestas a una gran variedad de patógenos. En la actualidad, las enfermedades fúngicas de la madera de la vid (GTDs) se encuentran entre los principales factores que limitan la productividad de este cultivo. Una vez las vides están infectadas, la productividad de la planta disminuye, provocando una muerte lenta o apoplética. La investigación de agentes de control biológico (BCAs) capaces de prevenir, o al menos minimizar, el impacto de las GTDs, se considera una prioridad de investigación. En esta Tesis Doctoral se caracterizó un agente de biocontrol potencial y, junto con un producto comercial biológico ya registrado, fueron probados contra varios patógenos agentes causales de GTDs, en invernadero bajo condiciones controladas, y también durante el proceso de propagación de la vid en vivero. Los resultados del análisis genómico completo de Bacillus subtilis PTA-271 muestran un sistema funcional de motilidad de enjambre, una fuerte capacidad de supervivencia y un conjunto de genes que codifican sustancias bioactivas conocidas por estimular el crecimiento o las defensas de las plantas, influir en la microbiota beneficiosa y contrarrestar la agresividad de los patógenos. Cuando Bs PTA-271 se probó contra Neofusicoccum parvum BT67 en plantas injertadas de invernadero, Bs PTA-271 y Ta SC1 demostraron que el cultivar contribuye a los efectos beneficiosos de Bs PTA-271 y Ta SC1 contra Np-Bt67. La aplicación simultánea de ambos BCAs demostró ser beneficiosa contra este patógeno en vides del cultivar Tempranillo. El análisis transcriptómico de las mismas muestras mostró ampliamente los cambios en la fisiología de la planta inducidos tanto por Bs PTA-271 como por Ta SC1 para proteger la vid ante la infección por Np-Bt67. En Chardonnay, las plantas infectadas con Np-Bt67 presentan genes sobreexpresados que están implicados en las vías de señalización del acido absicico (ABA). En Tempranillo, la infección con Np-Bt67 provoca cambios de expresión en más de 200 genes, relacionados sobre todo con la importación de aminoácidos, procesos relacionados con el cloroplasto y el fotosistema, respuestas de la planta a estímulos bióticos y biosíntesis de metabolitos secundarios. La protección de Ta SC1 en las plantas de Tempranilllo implica un mayor número de cambios, que abarcan tanto el metabolismo primario como el secundario, relacionados con cambios en las señales hormonales, como con el aicdo absicico (ABA). Durante el proceso de producción de la vid en vivero, los resultados demostraron una reducción significativa del porcentaje de plantas infectadas con los patógenos asociados a las enfermedades de decaimiento por Botryosphaeria y Pie negro en el material de vivero tratado con Ta SC1 y Bs PTA-271 respectivamente. Los tratamientos simultáneos con ambos BCAs presentaron una reducción en el porcentaje de plantas infectadas con ambos tipos de patógenos. Al probar el efecto de Bs PTA-271 y Ta SC1 en el microbioma de la rizosfera de la vid de dos suelos diferentes infectados con patógenos del pie negro, los resultados muestran que la inoculación de los BCAs parece mejorar las redes del microbioma de la rizosfera y el estado de saneamiento, sin embargo, el efecto beneficioso de los BCAs puede ser dependiente del suelo. En general, este estudio aportó nuevos conocimientos sobre el uso de uno o más BCAs contra varios patógenos asociados a las GTDs, tanto en el vivero como en vides adultas (viñedo). Además, se destacó el modo de acción de ambos BCAs en la protección de la vid. Por lo tanto, estos hallazgos proporcionan, no sólo una mejor comprensión de las interacciones entre los BCAs, la vid y los patógenos, sino que también son una fuerte contribución a una estrategia de gestión sostenible de las GTDs., [CA] Les plantes de vinya (Vitis vinifera L.) estan exposades a una gran varietat de patògens. En l'actualitat, les malalties fúngiques de la fusta de la vinya (GTDs) es troben entre els principals factors que limiten la productivitat d'aquest cultiu. Una vegada les vinyes estan infectades, la productivitat de la planta disminueix, provocant una mort lenta o apoplética. La investigació d'agents de control biològic (BCAs) capaços de previndre, o almenys minimitzar, l'impacte de les GTDs, es considera una prioritat d'investigació. En aquesta Tesi Doctoral es va caracteritzar en profunditat un agent de biocontrol potencial i, juntament amb un producte comercial biològic ja registrat, tots dos BCAs van ser provats contra diversos patògens agents causals de GTDs, en hivernacle sota condicions controlades, i també durant el procés de propagació de la vinya en viver. Els resultats de l'anàlisi genòmica completa de Bs PTA-271 mostren un sistema funcional de motilitat d'eixam, una forta capacitat de supervivència i un conjunt de gens que codifiquen substàncies bioactivas conegudes per estimular el creixement o les defenses de les plantes, influir en la microbiota beneficiosa i contrarestar l'agressivitat dels patògens. Quan Bs PTA-271 es va provar contra Np BT67 en plantes empeltades d'hivernacle, Bs PTA-271 i Ta SC1 van demostrar que la cultivar contribueix als efectes beneficiosos de Bs PTA-271 i Ta SC1 contra Np-Bt67. L'aplicació simultània de tots dos BCAs va demostrar ser beneficiosa contra aquest patogen en vinyes del cultivar Ull de llebre. L'anàlisi transcriptómico de les mateixes mostres va mostrar àmpliament els canvis en la fisiologia de la planta induïts tant per Bs PTA-271 com per Ta SC1 per a protegir la vinya davant la infecció per Np-Bt67. En Chardonnay, les plantes infectades amb Np-Bt67 presenten gens sobreexpresados que estan implicats en les vies de senyalització de l'acidifique absicico (ABA). En Ull de llebre, la infecció amb Np-Bt67 provoca canvis d'expressió en més de 200 gens, relacionats sobretot amb la importació d'aminoàcids, processos relacionats amb el cloroplast i el fotosistema, respostes de la planta a estímuls biòtics i biosíntesis de metabòlits secundaris. La protecció de Bs PTA-271 en Chardonnay implica gens relacionats amb la biosíntesi d'ABA, les vies dels fenilpropanoides, els metabòlits secundaris, i l'estructura i organització de la paret cellular. La protecció de Ta SC1 en les plantes de Tempranilllo implica un major nombre de canvis, que abasten tant el metabolisme primari com el secundari, relacionats amb canvis en els senyals hormonals, com amb l'acid abcísic (ABA). Durant el procés de producció de la vinya en viver, els resultats van demostrar una reducció significativa del percentatge de plantes infectades amb els patògens associats a les malalties de decaïment per Botryosphaeria i Peu negre en el material de viver tractat amb Ta SC1 i Bs PTA-271 respectivament. Els tractaments simultanis amb tots dos BCAs van presentar una reducció en el percentatge de plantes infectades amb tots dos tipus de patògens. En provar l'efecte de Bs PTA-271 i Ta SC1 en el microbioma de la rizosfera de la vinya de dos sòls diferents infectats amb patògens del Peu negre, els resultats mostren que la inoculació dels BCAs sembla millorar les xarxes del microbioma de la rizosfera i l'estat de sanejament, no obstant això, l'efecte beneficiós dels BCAs pot ser dependent del sòl. En general, aquest estudi va aportar nous coneixements sobre l'ús d'un o més BCAs contra diversos patògens associats a les GTDs, tant en el viver com en vinyes adultes. A més, es va destacar la manera d'acció de tots dos BCAs en la protecció de la vinya. Per tant, aquestes troballes proporcionen, no sols una millor comprensió de les interaccions entre els BCAs, la vinya i els patògens, sinó que també són una forta contribució a una estratègia de gestió sostenible de les GTDs., [EN] Grapevine (Vitis vinifera L.) plants are exposed to a wide variety of pathogens. Nowadays, grapevine fungal trunk diseases (GTDs) are amongst the main constraints for the productivity of this crop. Once infected, plant productivity is decreased, leading to a plant slow or apoplectic death. Investigation of biocontrol agents (BCAs) capable to forestall or at least to minimize the impact of GTDs, while being a sustainable treatment, is viewed as a research priority. One potential BCA was deeply characterized, and together with a biological commercial product, both BCAs were tested against several GTD pathogens, in greenhouse under controlled conditions, and during the grapevine propagation process. Results from the full genomic analysis of Bacillus subtilis PTA-271 (as BCA with a potential) show a functional swarming motility system, strong survival capacities and a set of genes encoding for bioactive substances known to stimulate plant growth or defenses, influence beneficial microbiota, and counteract pathogen aggressiveness. When tested against Neofusicoccum parvum Bt67 (thereafter Np-Bt67) in greenhouse cuttings, B. subtilis PTA-271 (Bs PTA-271) and T. atroviride SC1 (Ta SC1) proved that the cultivar contributes to their beneficial effects against Np-Bt67. The simultaneous application of both BCAs was further proved to be even more effective to protect Tempranillo cuttings. Moreover, the transcriptomic analysis from the same samples showed extensively the plant physiology changes induced by the pathogen but also by each BCA, Bs PTA-271 on Chardonnay and Ta SC1 on Tempranillo, to protect grapevine from Np-Bt67 infection. Thus, Chardonnay cuttings infected with Np-Bt67 showed overexpressed genes implicated on abscisic acid (ABA) biosynthesis and signaling pathways. In Tempranillo, the infection with Np-Bt67 leads to more substantial changes in gene expression, related mostly with amino acid import, chloroplast and photosystem related processes, plant responses to biotic stimulus, and biosynthesis of secondary metabolites. Protection induced by Bs PTA-271 in Chardonnay targets genes related to ABA biosynthesis, phenylpropanoid pathways and secondary metabolites, and cell wall structure/organization in relationship with carbohydrate metabolism that requires much more consideration. Protection with Ta SC1 in Tempranilllo requires a larger number of changes related to transporters, cell wall integrity and extension, cell division and pathogen induced cell death, multidirectional active proteins, and microbiome interactions. During the grapevine nursery process, the results demonstrated a significant reduction on the percentage of infected plants with Botryosphaeria dieback and Black-foot pathogens in the material treated with Ta SC1 and Bs PTA-271 respectively. The simultaneous treatments with both BCAs presented a reduction on infected plants with both Botryosphaeria dieback and Black foot pathogens. When testing the effect of Bs PTA- 271 and Ta SC1 in grapevine rhizosphere microbiome of two different soil infected with Black foot pathogens, results show that the inoculation of BCAs seems to improve the rhizosphere microbiome networks and sanitation status, however, the beneficial effect of BCAs can be soil-dependent. Moreover, as observed in the other experiments, the combination of both BCAs improves their beneficial effect in the rhizosphere microbiome. Overall, this study brought new insights on the use of one or more BCAs against several GTD pathogens, from nursery to adult grapevines. Moreover, highlighted both BCAs mode of action in grapevine protection. Thus, these findings provide, not only a better understanding of BCAs, grapevine, and pathogens interactions, but are also a strong contribution for the future development of sustainable GTDs management strategies.

A Europa, l'amenaça del ressorgiment i introducció de malalties transmeses per mosquits, com la malària i la febre de la vall del Rift, ha despertat un nou interès en l'estudi del microbioma associat amb mosquits autòctons per a una millor comprensió de les interaccions mosquit-patogen amb la finalitat de desenvolupar eines de vigilància vectorial i control ecològicament més adequades - En conseqüència, la tesi present es va enfocar en i) explorar la microbiota de l'Anopheles atroparvus, ii) avaluar la influencia de flavivirus insecto-específic en la competència vectorial del Culex pipiens i de l'Aedes vexans d' Europa per a la transmissió de RVFV, i iii) Aplicar metagenòmica a targetes FTA com a nou mètode per a la detecció de virus i vigilància d'arbovirus. Al primer capítol, es va establir una colònia de laboratori d' An. atroparvus del Delta de l' Ebre i es va actualitzar el seu protocol de cria. El seqüènciament del gen bacterià 1S rRNA va mostrar que l'ambient de cria, fisiologia i hàbits de farratge va influir en la microbiota tant de mosquits de camp com de laboratori. Addicionalment, els anàlisis de diversitat van mostrar variació entre els diferents estadis de desenvolupament silvestres i un declivi de la diversitat en el grup de femelles de la desena generació de laboratori F10, tot i això, van conservar una fracció significativa de la microbiota de les femelles silvestres. Finalment, proteobactèries Gram-negatives van predominar en la microbiota de l' An. atroparvus, entre les quals Pseudomonas, Asaia i Serratia van ser identificades com a candidates potencials per al control vectorial local. Per avaluar la influencia de ISFVs en la competència vectorial enfront de la transmissió de RVFV (Capítol 2), primer es va estudiar la infecció de Culex flavivirus (CxFV) a Cx. Pipiens a través d'exposició oral i inoculació intratoràcica. CxFV va infectar a Cx. Pipiens després d'inoculacions intratoràciques però no a través de l'exposició oral. Posteriorment, els assajos de competència vectorial enfront de RVFV es van realitzar en co-infecció amb CxFV i un flavivirus de mosquit de circulació natural, respectivament, en Cx. pipiens i Ae. vexans. Ambdues poblacions locals van mostrar ser competents per a RVFV després d'exposició oral. Per altra banda, ni CxFV ni RVFV van interferir en la seva respectiva infecció, mentre que el flavivirus de mosquit de circulació natural va modular la susceptibilitat d'infecció amb RVFV en Ae. vexans, suggerint el seu potencial ús com agent biològic per a la prevenció de la transmissió de RVFV. Finalment, per a avaluar noves alternatives per a la detecció de virus circulants i vigilància d'arbovirus (Capítol 3), targetes FTA amb esquer de mel van ser exposades a mosquits capturats en el camp durant jornades de vigilància entomològica per a la seva posterior anàlisi mitjançant seqüenciació de nova generació. Virus associats a artròpodes i plantes van ser identificats en les FTAs i es van obtenir genomes virals gairebé complets, el que suggereix una bona preservació d' ARN viral. Per a confirmar la presència de virus associats amb mosquits en els espècimens capturats, els pools de mosquits van ser analitzats utilitzant PCR de transcripció reversa i primers espècie-específics dissenyats a partir de les seqüències obtingudes de les FTAs. Virus relacionats amb Alphamesonivirus, Quaranjavirus i Bunyavirales no classificats van ser detectats en mosquits de Catalunya constituent el primer registre de distribució d'aquests virus en mosquits europeus. La detecció d' ISVs a la saliva de mosquits de forma silvestre demostra la viabilitat d'aquest mètode per a fer monitoreig de la fracció transmissible del viroma de mosquits i a seva utilitat en la vigilància d'arbovirus. En Europa, la amenaza del resurgimiento e introducción de enfermedades transmitidas por mosquitos, como la malaria y la fiebre del Valle de Rift, ha despertado un nuevo interés en el estudio del microbioma asociado con mosquitos autóctonos para un mejor entendimiento de las interacciones mosquito-patógeno con el fin de desarrollar herramientas de vigilancia vectorial y control ecológicamente más adecuadas. Consecuentemente, la presente tesis se enfocó en: i) explorar la microbiota de Anopheles atroparvus, ii) evaluar la influencia de flavivirus insecto-específico en la competencia vectorial de Culex pipiens y Aedes vexans de Europa para la transmisión de RVFV, y iii) Aplicar metagenómica en tarjetas FTA como un nuevo método para la detección de virus y vigilancia de arbovirus. En el primer capítulo, se estableció una colonia de laboratorio de An. atroparvus del Delta del Ebro y se actualizó su protocolo de cría. El secuenciamiento del gen bacteriano 16S rRNA mostró que el ambiente de cría, fisiología y hábitos de forrajeo influyeron en la microbiota de mosquitos tanto de campo como de laboratorio. Los análisis de diversidad mostraron variación entre los diferentes estadios de desarrollo silvestres y un declive de diversidad en hembras de la décima generación de laboratorio, sin embargo, una fracción significativa de la microbiota de hembras silvestres fue conservada. Finalmente, proteobacterias Gram-negativas predominaron en la microbiota de An. atroparvus, entre las cuales Pseudomonas, Asaia y Serratia fueron identificadas como candidatas potenciales para control vectorial local. Para evaluar la influencia de ISFVs en la competencia vectorial frente a la transmisión de RVFV (Capítulo 2), primero se estudió la infección de Culex flavivirus (CxFV) en Cx. pipiens a través de exposición oral e inoculación intratorácica. CxFV infectó a Cx. pipiens después de inoculaciones intratorácicas pero no a través de la exposición oral. Los ensayos de competencia vectorial frente a RVFV se realizaron en co-infección con CxFV y un flavivirus de mosquito de circulación natural, respectivamente, en Cx. pipiens y Ae. vexans. Ambas poblaciones mostraron ser competentes para RVFV después de exposición oral. Por otra parte, CxFV ni RVFV interfirieron con su respectiva infección, mientras que el flavivirus de mosquito moduló la susceptibilidad de infección con RVFV en Ae. vexans, sugiriendo su potencial uso como agente biológico para la prevención de la transmisión de RVFV. Finalmente, para evaluar nuevas alternativas para la detección de virus circulantes y vigilancia de arbovirus (Capítulo 3), tarjetas FTA con cebo de miel fueron expuestas a mosquitos capturados en el campo durante jornadas de vigilancia entomológica para su posterior análisis mediante NGS. Virus asociados a artrópodos y plantas fueron identificados en las FTAs y genomas virales casi completos fueron obtenidos, lo que sugiere una buena preservación de ARN viral. Para confirmar la presencia de virus asociados con mosquitos en los especímenes capturados, los pools de mosquitos fueron analizados usando RT-PCR y primers especie-específicos diseñados a partir de las secuencias obtenidas de las FTAs. Virus relacionados con Alphamesonivirus, Quaranjavirus y Bunyavirales no clasificados fueron detectados en mosquitos de Cataluña constituyendo el primer registro de distribución de estos virus en mosquitos europeos. La detección de ISVs en la saliva de mosquitos de forma silvestre demuestra la viabilidad de este método para monitorear la fracción transmisible del virroma de mosquitos y su utilidad en la vigilancia de arbovitus. El presente trabajo contribuye con información para un mejor entendimiento de los factores detrás de la estructura del microbioma de mosquitos locales y su potencial influencia en la competencia vectorial frente a arbovirus. Adicionalmente, provee un nuevo método para complementar la vigilancia de arbovirus en zonas susceptibles, así como, para la detección de nuevos virus circulantes y potencialmente patogénicos The threat of the resurgence or introduction of mosquito-borne diseases, such as malaria and Rift Valley fever, into the European continent has awakened new interests in studying the microbiome associated to autochthonous mosquitoes for better understanding mosquito-pathogen interaction and developing ecologically adequate vector surveillance and control tools. Consequently, this thesis aimed to i) explore the microbiota of Anopheles atroparvus, a vector involved in malaria transmission in Europe, ii) assess the influence of insect-specific flaviviruses on the vector competence of European Culex pipiens and Aedes vexans for the transmission of RVFV, and iii) apply metagenomics on FTA cards as a new approach for virus detection and arbovirus surveillance. In the first chapter, a laboratory colony of An. atroparvus from the Ebro Delta was established, and its rearing protocol updated. Sequencing of the bacterial 16S rRNA gene showed that the breeding environment, physiology and foraging habits influenced the microbiota of field-caught and laboratory-colonized mosquitoes. Diversity analyses showed inter-sample variation among sylvan developmental stages and a diversity decline in adult females after ten-laboratory generations. Nonetheless, a significant fraction of the microbiota was conserved from wild-caught specimens until the tenth laboratory-generation. Environmentally acquired Gram-negative proteobacteria dominated the microbiota of this anopheles population, among which, Pseudomonas, Asaia and Serratia were identified as potential candidates to be studied for local vector control. To assess the influence of ISFVs on the vector competence for the transmission of RVFV (Chapter 2), the infection of Culex flavivirus (CxFV) was first studied in Cx. pipiens by oral exposure and intrathoracic inoculations. CxFV infected Cx. pipiens after intrathoracic inoculations but not after oral exposure. Then, RVFV vector competence assays in co-infection with CxFV and a mosquito-flavivirus of natural circulation were conducted in Cx. pipiens and Ae. vexans respectively. Both Catalonian species showed to be competent vectors for RVFV after oral exposure. CxFV nor RVFV interfered with each other's infection, while, naturally infecting mosquito-flavivirus modulated RVFV infection susceptibility in Ae. vexans, suggesting its potential use as bio-agent for preventing RVFV transmission. Finally, to assess new alternatives for circulating viruses' detection and arboviral surveillance (Chapter 3), next generation sequencing was applied on honey-baited FTA cards that were exposed to field-captured mosquitoes during entomological surveys. Arthropod- and plant-infecting viruses were identified on FTAs and near-complete viral genomes were obtained suggesting good quality preservation of viral RNAs. To confirm the presence of mosquito-associated viruses in the captured specimens, mosquito pools were screened using reverse-transcription PCRs and species-specific primers designed from the sequences obtained from the FTAs. Viruses related to Alphamesonivirus, Quaranjavirus and unclassified Bunyavirales were detected in Catalonian mosquitoes. These findings constitute the first distribution record of these insect-specific viruses in European mosquitoes. Detecting ISVs in mosquitoes' saliva in field conditions demonstrate the feasibility of this approach to monitor the transmissible fraction of the mosquitoes' virome and its suitability for arbovirus surveillance. Overall, the present work contributes with valuable information for better understanding the factors behind the structure of the microbiome of local vector mosquitoes, its potential influence in vector competence, and provides a new approach to complement arbovirus surveillance in susceptible areas and to detect circulating and new potentially pathogenic viruses.

The gut microbiota plays a fundamental role in Hepatitis C Virus (HCV)-related liver disease. Indeed, HCV infection alters the gut microbiota, whereas intestinal dysbiosis induces an underlying inflammatory state. This status may lead to liver disease progression. The advent of direct acting antivirals (DAAs) was a turning point in the history of HCV infection, which enhances the chances of recovery. Beyond the elimination of the virus, DAA therapy can affect the gut microbiota of the HCV patient. The study of the gut microbiota in the patient with HCV-related liver disease could be the first step in understanding the etiopathogenesis of hepatopathy thereby opening the way to new therapeutic opportunities. Herein we evaluate current knowledge regarding the gut microbiota in patients with HCV infection and the impact of DAA therapy.

Las concentraciones elevadas de dióxido de carbono (CO2) en la atmósfera tienen varios efectos sobre los ecosistemas. Estos incluyen el aumento de la fotosíntesis y el crecimiento vegetal, cambios en la distribución de especies, alteraciones en los ciclos biogeoquímicos y posibles impactos en la biodiversidad y la interacción entre las especies, por otro lado, las plantas C3, plantas C4 y plantas CAM son diferentes tipos de fotosíntesis que utilizan las plantas. Las concentraciones elevadas de CO2 tienen efectos variables en cada uno de estos tipos de plantas. En general, las plantas C3 tienden a beneficiarse más de los niveles elevados de CO2, ya que experimentan un aumento en la fotosíntesis y un mayor crecimiento. Las plantas C4 y CAM también pueden beneficiarse, pero en menor medida. El CO2 elevado en la rizosfera (la región del suelo que rodea las raíces de las plantas) de plantas C4 puede tener efectos sobre los procesos de absorción de nutrientes y la fisiología de la planta. Puede promover un mayor crecimiento de las raíces y alterar la interacción de las plantas con los microorganismos del suelo. Las plantas CAM también puede influir en la absorción de nutrientes y en la fisiología de estas plantas. Puede tener un impacto en la capacidad de las plantas CAM para almacenar carbono y en su adaptación a condiciones ambientales cambiantes. High concentrations of carbon dioxide (CO2) in the atmosphere have several effects on ecosystems. These include increased photosynthesis and plant growth, changes in species distribution, alterations in biogeochemical cycles, and potential impacts on biodiversity and species interactions. On the other hand, C3 plants, C4 plants, and CAM plants are different types of photosynthesis utilized by plants. High CO2 concentrations have variable effects on each of these plant types. Generally, C3 plants tend to benefit the most from elevated CO2 levels as they experience increased photosynthesis and greater growth. C4 and CAM plants can also benefit but to a lesser extent. Elevated CO2 in the rhizosphere (the soil region surrounding plant roots) of C4 plants can have effects on nutrient uptake processes and plant physiology. It can promote increased root growth and alter the plant's interaction with soil microorganisms. CAM plants can also influence nutrient uptake and physiology. It can impact the ability of CAM plants to store carbon and adapt to changing environmental conditions.

O cultivo da oliveira (Olea europaea L.) reveste-se de importância cultural, ecológica e económica nos países do Mediterrâneo. Em Portugal, a contribuição da olivicultura para a economia e a tendência de crescimento da procura e do valor comercial da azeitona e do azeite, tem conduzido a alterações no tipo de cultivo. A este tipo de agricultura, está associada a irrigação artificial e a utilização de agroquímicos, práticas suscetíveis de afetar negativamente a qualidade dos solos e a sustentabilidade dos sistemas agrícolas. Adicionalmente, as variedades introduzidas em Portugal, mais produtivas e adaptadas ao cultivo intensivo, tornam crítica a prevenção de riscos fitossanitários e proteção das variedades autóctones. O microbioma das plantas tem vindo a ser reconhecido como um fator fundamental na produtividade e na sua condição fisiológica. Assim, a manipulação do microbioma, emerge como uma promissora ferramenta biológica, cuja aplicação generalizada carece ainda de conhecimento científico aprofundado. Este estudo visa contribuir para o conhecimento do microbioma de variedades autóctones de oliveira, como base para estratégias futuras de promoção da sustentabilidade, resiliência e produtividade do olival. Procedeu-se à caraterização da estrutura e composição das comunidades bacterianas associadas às variedades autóctones Galega Vulgar e Cobrançosa, com particular enfoque em dois compartimentos: um mais associado ao recrutamento da microbiota (rizosfera) e outro menos explorado, mas potencialmente associado à dispersão da microbiota pela planta (seiva xilémica). A amostragem realizou-se numa exploração olivícola em Oliveira do Hospital. Para a análise microbiológica recorreu-se a sequenciação avançada do gene ribossomal 16S RNA. Os resultados apontam para diferenças significativas entre as comunidades bacterianas encontradas na seiva xilémica e na rizosfera, sendo este último compartimento caraterizado por maior riqueza e diversidade. A análise da estrutura taxonómica ao nível da família, sugere que quer a rizosfera, quer a seiva xilémica, representam micro-habitats colonizados por bactérias com potencial para promoção do crescimento da planta. As famílias mais representadas foram Bradyrhizobiaceaa, Solirubrobacteraceae e Nocardioidaceae na rizosfera e Moraxellaceae, Sphingomonadaceae e Oxalobacteraceae na seiva xilémica. Foi também detetada maior diversidade bacteriana na variedade Galega Vulgar, comparativamente à estimada para a variedade Cobrançosa. Estas diferenças na microbiota, podem ter implicações em termos de suscetibilidade/resistência de diferentes variedades, a fatores de stresse biótico e abiótico, que merece ser explorada em estudos futuros. Olive cultivation (Olea europaea L.) is of cultural, ecological, and economic importance in Mediterranean countries. In Portugal, the contribution of olive growing to the economy and the growing trend in demand and commercial value of olive and olive oil has led to changes in the type of cultivation towards the intensive and super-intensive regime. This type of agriculture is associated with artificial irrigation and the use of agrochemicals practices that may negatively affect soil quality and the sustainability of agricultural systems. Additionally, the introduction of foreign varieties, more productive and adapted to intensive cultivation, may introduce new phytosanitary risks that are new challenges for the protection of native varieties. The microbiome of plants has been recognized as a fundamental factor in productivity and physiological conditions. Thus, the manipulation of the microbiome emerges as a promising biological tool, but its widespread application still needs scientific validation. This study aims to contribute to the knowledge of the microbiome and indigenous varieties of olive tree, as a basis for future strategies to promote sustainability, resilience, and productivity of the olive grove. We characterise the structure and composition of bacterial communities associated with the indigenous varieties Galega Vulgar and Cobrançosa, with a particular focus on two compartments: one more associated with the recruitment of the microbiota (rhizosphere) and the other less explored but potentially associated with the dispersion of the microbiota by the plant (xylemic sap). The sampling took place on an olive farm in Oliveira do Hospital. Advanced sequencing of the ribosomal gene 16S RNA was used for microbiological analysis. The results point to significant differences between bacterial communities found in xylem sap and rhizosphere, the latter compartment being characterized of greater richness and diversity. The analysis of the taxonomic structure at the family level suggests that both the rhizosphere and xylem sap represent micro-habitats colonized by bacteria with potential to promote plant growth. The most represented families were Bradyrhizobiaceaa, Solirubrobacteraceae and Nocardioidaceae in the rhizosphere and Moraxellaceae, Sphingomonadaceae and Oxalobacteraceae in xylem sap. These differences in the microbiota may have implications in terms of susceptibility/resistance of different varieties to biotic and abiotic stress factors, which deserve to be explored in future studies. Mestrado em Biotecnologia

[ES] España es el segundo productor mundial de almendra por detrás de EEUU. El almendro es un cultivo susceptible diversas enfermedades que necesitan diferentes estrategias de gestión. Desde 2012 se han observado parcelas de almendro en España afectadas por una enfermedad de etiología desconocida denominada el chancro espumoso. El agente causal de esta enfermedad es desconocido y existen muy pocas referencias bibliográficas al respecto. En este contexto, el objetivo del presente trabajo es mejorar el conocimiento sobre esta enfermedad estudiando el microbioma de plantas sintomáticas y asintomáticas mediante análisis genómicos utilizando PCR convencional y secuenciación masiva. Para ello se analizaron mediante PCR 19 almendros con y sin síntomas del chancro espumoso para determinar posibles bacterias asociadas con la enfermedad. Además, una de las muestras sintomáticas se seleccionó para el estudio del microbioma mediante análisis de secuenciación masiva. Los resultados mostraron que en todas las muestras sintomáticas y en ninguna de las asintomáticas se detectó la presencia de la bacteria Zymobacter palmae. Se analizó también la presencia de otras bacterias con potencial interés pero no se observó una correlación clara con los síntomas. Los resultados demuestran que la bacteria Z. palmae podría asociarse con la enfermedad del chancro espumoso del almendro. Además, se intentó ensamblar el genoma de la bacteria a partir de los resultados obtenidos mediante secuenciación masiva para obtener mayor información a nivel genético sobre Z. palmae., [EN] Spain is the second largest producer of almonds globally, after the United States of America. Almond trees are susceptible to a variety of diseases, each requiring a different management approach. Since 2012 the foamy canker disease of almonds, which is a disease with an unknown etiology, has started appearing in some Spanish orchards. Because its causal agent(s) is not known yet, and due to the very limited literature on this subject, the aim of this study is to provide more information about this disease, by studying the microbiomes of symptomatic and asymptomatic plants with genomic approaches, using molecular methods such as conventional PCR and the high-throughput sequencing. To this end, nineteen different foamy canker symptomatic and asymptomatic almond trees were analyzed by PCR looking for possible bacteria associated with this disease; and one of the symptomatic samples was selected for high throughput sequencing to reveal its microbiome. Results showed that the bacterium Zymobacter palmae was present in all symptomatic samples and absent in all asymptomatic ones. Other bacteria of potential interest were also screened, but the results could not be correlated with the symptoms. These findings suggest that Z. palmae could be associated with the foamy canker disease. In addition, from the HTS data, an attempt to assemble the genome of this bacterium was made, in order to provide genetic information on this new isolate of Z. palmae.

Rhizosphere microorganisms play an important role in the growth and health of plants. Around the world, diverse soil-borne pathogens attack Capsicum annuum causing significant damage and economic losses. This study determined whether the diversity and composition of microbial communities in the rhizosphere soil of C. annuum plants is significantly changed by wilt disease. We used the 16S rRNA gene for bacteria and the internal transcribed spacer region for fungi to characterize the rhizosphere microbiomes of healthy and wilted plants. The most abundant bacterial phyla were Proteobacteria and Gemmatimonadetes, while the most abundant fungal phyla were Ascomycota and Mucoromycota. The bacterial α-diversity did not show significant differences in richness and diversity, but did show a significant difference in evenness and dominance of species. Rare taxa were present in both healthy and wilted conditions with relative abundances < 1%. In the fungi, all evaluated estimators showed a significant reduction in the wilted condition. The β-diversity showed significant differences in the structure of bacterial and fungal communities, which were segregated according to plant health conditions. The same occurred when comparing the alpha and beta diversity of this study based on organic agriculture with that of other studies based on conventional agriculture. We observed a significant difference with estimators analyzed by segregating rhizosphere communities depending on the farming method used. Finally, the differential abundance analysis did not show significant results in the bacterial communities; however, in the fungal communities, Fusarium, Thanatephorus, Rhizopus, Curvularia, Cladosporium, and Alternaria were more abundant in the rhizosphere of wilted than healthy plants. Species from these genera have been previously reported as phytopathogens of several plants, including C. annuum. RESUMO: Microrganismos na rizosfera desempenham um papel importante no crescimento e saúde das plantas. Em todo o mundo, vários patógenos do solo atacam o Capsicum annuum causando danos significativos e perdas econômicas. Este estudo teve como objetivo determinar se a diversidade e composição das comunidades microbianas no solo da rizosfera de plantas de C. annuum é alterada significativamente pela murcha. Usamos o gene 16S rRNA para bactérias e a região espaçadora transcrita interna para fungos para caracterizar os microbiomas da rizosfera de plantas saudáveis e plantas com murcha. Os filos bacterianos mais abundantes foram Proteobacteria e Gemmatimonadetes, enquanto os filos fúngicos foram Ascomycota e Mucoromycota. A diversidade alfa bacteriana não mostrou diferenças significativas na riqueza e diversidade, mas mostrou uma diferença significativa na uniformidade e dominância das espécies. Táxons raros estavam presentes em condições saudáveis e murchas com abundância relativa < 1%. Em fungos, todos os estimadores avaliados apresentaram redução significativa na condição de murcha. A diversidade beta apresentou diferenças significativas na estrutura das comunidades bacterianas e fúngicas, que foram segregadas de acordo com as condições fitossanitárias. O mesmo aconteceu ao comparar a diversidade alfa e beta deste estudo baseado na agricultura orgânica com a de outros estudos baseados na agricultura convencional. Uma diferença significativa foi observada com os estimadores analisados segregando as comunidades da rizosfera dependendo do método de cultivo utilizado. Por fim, a análise de abundância diferencial não apresentou resultados significativos nas comunidades bacterianas; entretanto, nas comunidades fúngicas, os gêneros Fusarium, Thanatephorus, Rhizopus, Curvularia, Cladosporium e Alternaria foram mais abundantes na rizosfera de plantas murchas do que saudáveis. Várias espécies desses gêneros foram previamente relatadas como fitopatógenos de várias plantas, incluindo C. annuum.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, área científica de Sanidade Animal Vultures, as obligate scavengers, have developed the ability to feed on decaying carcasses. As their ecological context is quite particular, the captivity settings at rehabilitation centers may trigger stress-related polymicrobial reorganizations in vultures’ oral microbiome. As the biodiversity of host-associated microbiota is recognized as a relevant factor in wildlife management practices, it is important to characterize, under these specific settings, whether these oral cross-kingdom interactions are symbiotic or pathogenic for the host. This study considers the oral microbiome as valuable data for assessing (1) dysbiosis or environmental stress-related unbalances, (2) causes and effects of microbial community changes, (3) whether these changes have functional consequences for the hosts, and (4) the efficacy of habitat restorations. The oral samples considered for this study (n=22) were collected from two different vulture species – namely, Eurasian Griffon Vulture and Eurasian Black Vulture – recovering at two wildlife rehabilitation centers in Portugal. The study was divided in three main topics: 1) characterization of oral yeast-like species present in vulture’s host-associated microbiota by performing their morphological and biochemical identification (using API20CAUX) of oral yeast-like colonies isolated from vultures oral samples, and evaluating their biofilm forming capacity (using Red Congo Agar); 2) evaluation of the contrast between the bacterial microbiome (16S rRNA profiling by 4th NGS) of animals with and without gross signs of oral yeast-like infections; and 3) evaluation of the potential cross-kingdom interactions between yeasts and other microorganisms present in the oral cavity of the sampled animals. Candida was commonly found as the most abundant fungal species in the biofilm producing co-occurrence networks whenever an overrepresentation of Clostridium perfringens and/or Paeniclostridium sordelli occurred, strongly suggesting that synergistic relationships are being established, so vultures can assimilate the food provided in captivity circumstances due to bacterial degradation of carrion. Besides Candida, the most prevalent co-occurrence fungal patterns identified also comprised other emergent species – namely Trichosporon, Cryptococcus, and/or Rhodotorula. The detected fungal-bacterial interactions linked strictly anaerobic bacteria growth to polymicrobial complex biofilms, which may assure the establishment of anoxic oral microenvironments. We hint that these polymicrobial reorganizations can be part of a prompt responsiveness of vulture’s innate immune system RESUMO - HOMEOSTASIA DO MICROBIOMA ORAL DE ABUTRES E AS INTERAÇÕES SINERGÉTICAS ENTRE REINOS - Os abutres, como necrófagos obrigatórios, desenvolveram a capacidade de se alimentarem exclusivamente de carcaças em decomposição. Considerando o seu nicho ecológico, quando em cativeiro (e.g., centros de reabilitação), ficam suscetíveis a afeções associadas ao stress, podendo este estimular reestruturações adaptativas ao seu microbioma. Sendo a caracterização e diversidade do microbioma um fator considerado relevante no maneio e prognóstico da recuperação da fauna selvagem, este estudo considera que a identificação da diversidade da microbiota oral poderá representar uma ferramenta para (1) caracterizar a disbiose face a desequilíbrios por stress ambiental, (2) averiguar causas e efeitos das alterações da população polimicrobiana do hospedeiro, avaliar (3) se estas alterações têm consequências funcionais para os mesmos, e (4) a eficácia das recuperações da fauna selvagem. Este projeto visa descrever os constituintes fúngicos e a fração bacteriana do microbioma da cavidade oral de abutres em recuperação (n=22) — nomeadamente, de Grifos e Abutres Negros — em centros de reabilitação da vida selvagem em Portugal. O estudo foi dividido em três pontos principais: 1) caracterização de leveduras presentes na microbiota oral dos abutres, realizando a identificação morfológica e bioquímica (API20CAUX) de colónias isoladas a partir de amostras da cavidade oral de abutres e avaliação da capacidade da produção de biofilme (Congo Agar Red); 2) avaliação do contraste entre o microbioma (sequenciação do 16S rRNA por 4ª NGS) de animais com e sem sinais de micose oral; e 3) identificar interações entre microorganismos presentes na cavidade oral dos abutres. A Candida foi a espécie fúngica mais abundante nas redes co-ocorrentes de isolados produtores de biofilme e, simultaneamente, verificou-se uma sobrerrepresentação de Clostridium perfringens e/ou Paeniclostridium sordelli. Estes resultados sugerem que podem estar a ser criadas relações sinergéticas para que os abutres possam digerir alimentos fornecidos em circunstâncias de cativeiro, i.e. carcaças não putrefactas que serão digeridas graças à degradação bacteriana. Além de Candida, os padrões fúngicos identificados de coocorrência de isolados mais prevalentes incluíam também outras espécies emergentes - nomeadamente, Rhodotorula, Trichosporon e/ou Cryptococcus. As interacções fúngicobacterianas detectadas no presente estudo relacionam o crescimento de bactérias estritamente anaeróbias, a biofilmes complexos e polimicrobianos, que podem assegurar o estabelecimento de microambientes orais anóxicos. Sugerimos que estas reorganizações polimicrobianas possam fazer parte de uma resposta rápida do sistema imunitário inato dos abutres N/A

Ageing is essentially a biological process that leads to the malfunction of cells and organs, dysregulation of body systems, and generally, age-related illnesses that ultimately result in the individual's death. These age-related medical conditions can have several consequences for the organism affecting several systems in the body. One of the elements between disease and body response is the gut microbiota. Several factors can affect the microbiota composition, including age and health status. An important genus in the gut is Bacteroides and its abundance in the elderly have been targeted with different outcomes. Therefore, studying the alterations of the microbiome in the elderly population can constitute a valuable tool to help understand the non-healthy and healthy status of old individuals, and also establish interventions in the gut microbiota to promote health in the elderly people. In the current study, twelve faecal samples from 7 healthy and 5 non-healthy individuals aged between 60 and 90 years old, including individuals from both genders from the Algarve region were analysed regarding their bacteriome using the Oxford Nanopore system. The isolation of Bacteroides species was performed using the culture medium Bacteroides vulgatus Selective Agar (BVSA). Isolates from representative characteristic and uncharacteristic colonies were identified by sequencing the 16S rRNA gene and the Gram-negative isolates from uncharacteristic colonies were first identified using the RapID ONE system (Thermo Fisher Scientific). The individual bacteriome profile revealed that the phylum Firmicutes was prevalent in all samples except for one that showed the dominance of the phylum Bacteroidetes. The bacteriome pattern regarding the abundance of the different genera and species evidence a tendency for a unique pattern, but Oscillibacter valericigenes was abundant in the majority of the samples. Differences between gender were noticed, namely, the phylum Proteobacteria was more abundant in males, and several species were unique for each group. The results of the bacteriome profile according to the health status evidence that Bacteroides vulgatus (Phocaeicola vulgatus) was more abundant in the non-healthy group, whereas Prevotella copri was more abundant in the healthy group. It was possible to recover in culture the different Bacteroides species, even those reported at very low numbers in the bacteriome. Uma microbiota intestinal funcional é atualmente reconhecida como um elemento essencial na prevenção de doenças atribuídas ao processo de envelhecimento. O papel da microbiota intestinal em doenças relacionadas com a idade, tais como diabetes tipo 2, demência e Alzheimer, Parkinson, doenças cardiovasculares, obesidade, depressão, entre outras tem sido nos últimos anos reconhecido pela comunidade científica. É importante realçar que nos últimos anos, um número significativo de estudos evidenciou a forte associação entre a composição do microbiota intestinal e os vários parâmetros utilizados na avaliação do desempenho físico e no estado de fragilidade. Em particular, as alterações na abundância do género Bacteroides no envelhecimento têm sido reportadas em alguns países. O presente estudo preliminar tem como objetivo a avaliação do bacterioma intestinal de indivíduos idosos com um padrão de envelhecimento saudável e não saudável de diferentes locais da região do Algarve, conjuntamente com a quantificação e identificação de espécies cultiváveis de Bacteroides do trato gastrointestinal destes indivíduos. Neste estudo, foram recolhidas 12 amostras fecais incluindo 7 indivíduos saudáveis e 5 não saudáveis com idades compreendidas entre os 60 e os 90 anos, abrangendo indivíduos de ambos os géneros. O perfil bacteriano da microbiota intestinal de cada indivíduo foi analisado com recurso à plataforma de sequenciação de quarta geração Nanopore MinION (MinION Mk1C). Assim sendo, foi realizada a sequenciação do gene 16S rRNA (região V1-V9, com um comprimento ~1.5 kpb) a partir do DNA total de cada amostra fecal. Previamente à preparação da biblioteca a concentração do DNA foi determinada com recurso ao fluorómetro Qubit 2.0. Na preparação da biblioteca foram utilizados o kit 16S barcode (SQK-RAB204) e a célula de fluxo R9.4.1. Os resultados da sequenciação foram analisados com recurso à plataforma EPI2ME da Oxford Nanopore Technologies. A segunda abordagem (cultura-dependente) foi direcionada para a quantificação e identificação de espécies de Bacteroides. Com este objetivo, foi utilizado o meio seletivo Bacteroides vulgatus Selective Agar (BVSA) para inoculação das amostras, todas as colónias características foram contabilizadas e sujeitas a purificação em meio Brain Heart Infusion (BHI) suplementado com hemina (0,01% p/v). Colónias não características foram igualmente isoladas. Posteriormente a identificação dos isolados foi realizada através da sequenciação do gene 16S rRNA. Os resultados da análise do bacterioma intestinal evidenciaram que os filos mais abundantes nos indivíduos idosos mais saudáveis e menos saudáveis são similares diferindo no quarto e quinto filo mais abundante. Os três filos mais abundantes quer nos indivíduos saudáveis, quer nos indivíduos menos saudáveis foram Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, o quarto e quinto filo variaram entre os indivíduos havendo, nomeadamente o filo Fusobacteria, Lentisphaerae, Verrucomicrobia, Cyanobacteria, Actinobacteria e Tenericutes. O perfil dos idosos com envelhecimento menos saudável, a nível do género, foi caraterizado por níveis elevados de Bacteroides, Acidaminococcus e Oscillibacter, este grupo de amostras possui ainda dois géneros que não se observaram no grupo saudável, nomeadamente o género Kineothrix e Klebsiella. Nos idosos com perfil saudável, o género bacteriano mais abundante foi Prevotella, seguido de Oscillibacter. Os géneros Lactobacillus e Streptococcus foram apenas observados no grupo de idosos saudáveis. Nos idosos menos saudáveis as espécies mais abundantes foram Bacteroides vulgatus, Acidominococcus intestini, Oscillibacter valericigenes, Bacteroides faecis e Haemophilus parainfluenzae, enquanto nos mais saudáveis as espécies mais abundantes foram Prevotella copri, O. valericigenes, Dialister invisus, Lactobacillus mucosae e Agathobacter rectale. A recuperação em cultura das espécies de Bacteroides a partir das amostras de idosos saudáveis e menos saudáveis permitiu a identificação de trinta e quatro isolados, destes, dezoito pertencem à ordem Bacteroidales. Com esta técnica, foi ainda observada a recuperação de um número significativo de enterobactérias com menor suscetibilidade à colistina. Os resultados obtidos evidenciam um bacterioma intestinal diferenciado de acordo com o estado de saúde dos idosos, embora com uma tendência de perfil individual único. A análise entre géneros também demonstrou diferenças entre os perfis do bacterioma intestinal feminino e masculino, com valores mais elevados de Bacteroidetes e Proteobacteria nos indivíduos do género masculino em comparação com as amostras provenientes de indivíduos do género feminino que apresentaram no seu bacterioma as espécies H. parainfluenzae and D. invisus. Os resultados do corrente estudo apesar de preliminares evidenciam diferenças na composição do bacterioma entre idosos com um envelhecimento saudável e idosos com um envelhecimento menos saudável, bem como foram observadas diferenças no bacterioma intestinal entre idosos do género masculino e do género feminino, reforçando a ideia de que vários fatores podem ter influência na composição da microbiota intestinal. I acknowledge the support of the project “ALgarve Fit Aging Score (ALFA Score): a new integrated tool to improve quality of life and healthy ageing”.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Universitário Egas Moniz O Microbioma oral é um ecossistema complexo, e quando este ecossistema sofre alterações torna-se um problema para a saúde oral e sistémica. Ainda que, no imediato, a falta de saúde oral não represente risco de vida, tem um papel importante na qualidade da mesma numa população, em especial da população geriátrica, por isso é importante a manutenção de uma boca saudável. A levedura Candida albicans faz parte da microflora comensal da cavidade oral e não é indicativo de doença. No entanto quando o paciente desenvolve candidíase, mesmo assintomática, deve ser tratada, dado que atua como um reservatório para futuras infeções. Existem vários métodos de tratamento, tais como os antifúngicos tópicos e sistémicos, antissépticos e desinfetantes, radiação micro-ondas, entre outros. O uso de próteses dentárias resulta numa alteração da cavidade oral e, consequentemente na microflora oral. As próteses são frequentemente colonizadas por leveduras e o biofilme tem de ser removido. Estas podem ser limpas através de métodos mecânicos, químicos ou uma combinação de ambas. Existem vários produtos de limpeza químicos tais como, peróxidos alcalinos, hipocloritos alcalinos, clorexidina, outros desinfetantes, enzimas ou ácidos. Infelizmente, o uso de produtos para higienizar a prótese não consegue remover totalmente o biofilme de Candida. Esta complicação juntamente com os efeitos prejudiciais que estes produtos têm para a prótese, contribuem para o aumento do crescimento de microrganismos. Com isto, várias estratégias novas de prevenção e limpeza das próteses, são cada vez mais investigados. The oral microbiome is a complex ecosystem, and when this ecosystem undergoes changes, it becomes a problem for oral and systemic health. Although, immediately, the lack of oral health does not represent a risk to life, it plays an important role in the quality of the same population, especially the life of the geriatric population, so its preservation is important for the maintenance of a healthy mouth. The yeast Candida albicans is part of the commensal microflora of the oral cavity and is not indicative of disease. However, when the patient develops candidiasis, even asymptomatic, it must be treated, as it acts as a reservoir for future infections. There are several treatment methods, such as topical and systemic antifungals, antiseptics and disinfectants, microwave radiation, among others. The use of dental prostheses results in a change in the oral cavity and, consequently, in the oral microbiome. Dentures are often colonized by yeast and the biofilm must be removed. These can be cleaned using a mechanical, chemical or a combination of both. There are several chemical cleaning products such as alkaline peroxides, alkaline hypochlorites, chlorhexidine, other disinfectants, enzymes or acids. Unfortunately, the use of products to clean the denture cannot fully remove Candida biofilm. This complication, together with the harmful effects that these products have on the prosthesis, contribute to the increase of microorganisms. With this, several new strategies for prevention and cleaning of dentures are being further investigated.

O dispositivo intrauterino (DIU) é o método contraceptivo reversível mais usado no mundo. Quando inserido, o dispositivo pode acarretar mudanças no microbioma que podem alterar a resposta imune local. Estudar o funcionamento da resposta imunológica da microbiota vaginal frente ao uso do DIU para o entendimento do seu uso racional na saúde das mulheres em idade reprodutiva no mundo. Trata-se de uma revisão bibliográfica de 2000 a 2021, nas línguas Portuguesa e Inglesa, com base nos artigos encontrados via PubMed, Scielo e LILACS. Utilizou-se as estratégias de busca: “intrauterine device AND microbiome”, “intrauterine device AND immune response”. Ademais, foi utilizado o filtro de artigos dos últimos 21 anos. Os critérios de inclusão foram o ano de publicação, a leitura dos títulos e dos resumos mais pertinentes ao assunto. Foram encontrados 99 artigos e após o uso do filtro, restaram 38. Por fim, pela seleção manual, foram selecionados 14 artigos. De forma geral, o uso do DIU altera o microbioma e, por conseguinte, a resposta imune no ambiente vaginal, apresentando-se ainda como um desafio para a saúde da mulher em idade reprodutiva, ressaltando a necessidade de mais pesquisas e estudos convergentes nessa área.

Background Health surveillance of murine colonies employed for scientific purposes aim at detecting unwanted infection that can affect the well-being of animals and personnel, and potentially undermine scientific results. In this study, we investigated the use of a next-generation sequencing (NGS) metagenomic approach for monitoring the microbiota composition and uncovering the possible presence of pathogens in mice housed in specific pathogen-free (SPF) or conventional (non-SPF) facilities. Results Analysis of metagenomic NGS assay through public and free algorithms and databases allowed to precisely assess the composition of mouse gut microbiome and quantify the contribution of the different microorganisms at the species level. Sequence analysis allowed the uncovering of pathogens or the presence of imbalances in the microbiota composition. In several cases, fecal pellets taken from conventional facilities were found to carry gene sequences from bacterial pathogens (Helicobacter hepaticus, Helicobacter typhlonius, Chlamydia muridarum, Streptococcus pyogenes, Rodentibacter pneumotropicus, Citrobacter rodentium, Staphylococcus aureus), intestinal protozoa (Entamoeba muris, Tritrichomonas muris, Spironucleus muris) nematoda (Aspiculuris tetraptera, Syphacia obvelata), eukaryotic parasites (Myocoptes musculinus) and RNA virus (Norwalk virus). Thus, the use of NGS metagenomics can reduce the number of tests required for the detection of pathogens and avoid the use of sentinel mice. Conclusions In summary, in comparison with standard approaches, which require multiple types of test, NGS assay can detect bacteria, fungi, DNA and RNA viruses, and eukaryotic parasites from fecal pellets in a single test. Considering the need to protect animal well-being and to improve the success and reproducibility of preclinical studies, this work provides the proof-of-concept that the use of NGS metagenomics for health monitoring of laboratory mice is a feasible and dependable approach, that is able to broaden the current concept of health monitoring of laboratory mice from “pathogen surveillance” to a more inclusive “microbiota surveillance”.