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Li-Fraumeni syndrome (LFS), an inherited cancer predisposition syndrome, is associated with germline mutations in TP53. It is characterized by high risk of multiple, early cancers. In Brazil, a variant form of LFS is exceedingly frequent due to a widespread founder TP53 mutation, p.R337H, detected in about 0.3% of the general population in Southern Brazil. This mutation occurs in p53 oligomerization domain and its effect on p53 oligomerization is supposed to be dependent upon pH conditions. Recent studies indicate that p53 plays a critical role in regulating differentiation and asymmetric divisions of stem cells. The main objective of this study is to isolate and to characterize Cancer Stem Cells (CSC) in patients with germline mutations in TP53 gene with Li-Fraumeni syndrome and Li-Fraumeni-like Syndrome. We have isolated and characterized CSC from tumors of p.R337H mutation carriers. After informed consent, surgical resection fragments were dissociated and brought in culture. Adherent cells and spheroids were derived from different tumor types. Spheroids and stromal cells derived from a breast cancer (BC) were further analyzed by immunofluorescence and flow cytometry to demonstrate positive immunolabeling for CD44+, CD24−, Oct4, Ki67 and Sox2 antibodies. Time-lapse videomicroscopy showed rapid growth, frequent asymmetric division and absence of senescent phenotypes for least 17 passages. Moreover, we showed by Colony Forming Units assay (CFU) that stromal cells are very clonogenic, once 103 cells initially plated were able to form 442 new colonies after 15 days in culture. It was also verified the differentiation potential of stromal cells for the following lineages: adipogenic, osteogenic and muscle-like cells. The adherent stromal cells as well as oncoesferas are able to self-renew and to proliferate in vitro for long periods without losing its main features. These properties are similar to stem cell possessing the p53 inactive. However, we observed that treatment of adherent cells with doxorubicin (DNA damaging agent) causes accumulation of p53 and causing induction of cell cycle arrest with low doses of this drug, and cell death / apoptosis in higher doses. Our findings using CSC-p.R337H can provide a very useful model for better understanding the role of specific mutation, as well as the TP53 tumor biology. Citation Format: Lisley I. Mambelli, Irina Kerkis, Pierre Hainaut, Maria Isabel W. Achatz. Establishment of primary cultures of cancer stem cells from patients with Li-Fraumeni Syndrome, carrier of TP53 p.R337H Brazilian founder mutation. [abstract]. In: Proceedings of the 104th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2013 Apr 6-10; Washington, DC. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2013;73(8 Suppl):Abstract nr 3771. doi:10.1158/1538-7445.AM2013-3771

Made available in DSpace on 2013-08-28T14:12:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 WOS000305892100123.pdf: 1025211 bytes, checksum: f3114ad3d761d448ea4009979a8c8d68 (MD5) Made available in DSpace on 2013-09-30T18:31:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 WOS000305892100123.pdf: 1025211 bytes, checksum: f3114ad3d761d448ea4009979a8c8d68 (MD5) WOS000305892100123.pdf.txt: 56945 bytes, checksum: e71c3f4e9d87411582be429d4ea1669f (MD5) Previous issue date: 2012-06-29 Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T13:44:59Z No. of bitstreams: 2 WOS000305892100123.pdf: 1025211 bytes, checksum: f3114ad3d761d448ea4009979a8c8d68 (MD5) WOS000305892100123.pdf.txt: 56945 bytes, checksum: e71c3f4e9d87411582be429d4ea1669f (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-20T13:44:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 WOS000305892100123.pdf: 1025211 bytes, checksum: f3114ad3d761d448ea4009979a8c8d68 (MD5) WOS000305892100123.pdf.txt: 56945 bytes, checksum: e71c3f4e9d87411582be429d4ea1669f (MD5) Previous issue date: 2012-06-29 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Dental pulp (DP) can be extracted from child's primary teeth (deciduous), whose loss occurs spontaneously by about 5 to 12 years. Thus, DP presents an easy accessible source of stem cells without ethical concerns. Substantial quantities of stem cells of an excellent quality and at early (2-5) passages are necessary for clinical use, which currently is a problem for use of adult stem cells. Herein, DPs were cultured generating stem cells at least during six months through multiple mechanical transfers into a new culture dish every 3-4 days. We compared stem cells isolated from the same DP before (early population, EP) and six months after several mechanical transfers (late population, LP). No changes, in both EP and LP, were observed in morphology, expression of stem cells markers (nestin, vimentin, fibronectin, SH2, SH3 and Oct3/4), chondrogenic and myogenic differentiation potential, even after cryopreservation. Six hours after DP extraction and in vitro plating, rare 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) positive cells were observed in pulp central part. After 72 hours, BrdU positive cells increased in number and were found in DP periphery, thus originating a multicellular population of stem cells of high purity. Multiple stem cell niches were identified in different zones of DP, because abundant expression of nestin, vimentin and Oct3/4 proteins was observed, while STRO-1 protein localization was restricted to perivascular niche. Our finding is of importance for the future of stem cell therapies, providing scaling-up of stem cells at early passages with minimum risk of losing their stemness. Instituto Butantan, Genet Lab, São Paulo, Brazil Fed Univ São Paulo UNIFESP, Dept Morphol, São Paulo, Brazil State Univ São Paulo UNESP, Dept Orthodont & Pediat Dent, Araraquara, SP, Brazil Case Western Reserve Univ, Dept Biol, Skeletal Res Ctr, Cleveland, OH 44106 USA State Univ São Paulo UNESP, Dept Orthodont & Pediat Dent, Araraquara, SP, Brazil FAPESP: 10/51051-6

Li-Fraumeni syndrome (LFS), an inherited cancer predisposition syndrome, is associated with germ line mutations in TP53. It is characterized by high risk of multiple, early cancers. In Brazil, a variant form of LFS is exceedingly frequent due to a widespread founder TP53 mutation, p.R337H, detected in about 0.3% of the general population in Southern Brazil. This mutation occurs in p53 oligomerization domain and its effect on p53 oligomerization is supposed to be dependent upon pH conditions. We have isolated and characterized Cancer Stem Cells from tumors of p.R337H mutation carriers. After informed consent and surgical resection fragments were dissociated and brought in culture. Adherent cells and spheroids were derived from different tumor types. Spheroids derived from a breast cancer (BC) were further analyzed to demonstrate positive immunolabeling for CD44, CD24, Oct4 and Sox2 antibodies. Time-lapse videomicroscopy showed rapid growth, frequent asymmetric division and absence of senescent phenotypes for least 17 passages. At confluence, some cells spontaneously differentiated into adipogenic and muscle-like cells. Floating and adherent spheroids contained self-renewing cells capable of long-term proliferation without losing their primary characteristics. These properties are similar to those of stem cells with inactivated p53 protein. However, treatment of adherent cells with the DNA damaging agent doxorubicin elicited p53 accumulation, p21 induction, cell cycle arrest at low doses of Dox and cell death/apoptosis at higher doses. These results are consistent with the notion that p.R337H may retain a quasi-normal p53 function in response to stress while expressing properties similar to mutant p53 in long-term CSC culture. These p.R337H CSC may provide a very useful model for studying the defects underlying inherited cancer in p.R337H carriers. Citation Format: {Authors}. {Abstract title} [abstract]. In: Proceedings of the 103rd Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2012 Mar 31-Apr 4; Chicago, IL. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2012;72(8 Suppl):Abstract nr 5349. doi:1538-7445.AM2012-5349

Huntington's disease (HD) is a fatal genetic disorder, which causes the progressive breakdown of neurons in the human brain. HD deteriorates human physical and mental abilities over time and has no cure. Stem cell-based technologies are promising novel treatments, and in HD, they aim to replace lost neurons and/or to prevent neural cell death. Herein we discuss the use of human fetal tissue (hFT), neural stem cells (NSCs) of hFT origin or embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (IPSCs), in clinical and pre-clinical studies. TheA doença de Huntington (DH) é uma desordem genética que provoca a destruição progressiva dos neurônios no cérebro humano. A DH deteriora progressivamente as habilidades físicas e mentais humanas, e é incurável. Tecnologias terapêuticas baseadas em células representam novas alternativas para diversas doenças neurodegenerativas, pois visam substituir neurônios e/ou prevenir a morte neuronal. Nesta revisão discutirmos o uso de tecido fetal humano, células tronco neurais (CTN) de origem fetal ou de células tronco embrionárias ou células tronco pluripotentes induzidas, em estudos pré-clínicos e clínicos. Além disso, o uso terapêutico de células derivadas de tecidos não-neurais, como células tronco mesenquimais, também será discutido. Todos estes estudos provam o potencial do transplante celular na DH, demonstrando a sua habilidade em enxertar no encéfalo e diferenciar em neurônios

Biphasic calcium phosphate (BCP) bioceramics have been successfully applied in a broad variety of presentation forms and with different ratios of hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium phosphate (β-TCP). BCPs have been loaded with stem cells from different origins for bone tissue engineering purposes, but evidence of stem cell behavior on different compositions (various HA/β-TCP ratios) and physical features of BCPs is limited. We compared the adhesion, proliferation, viability and osteogenic potential of human mesenchymal stem cells (MSCs) on granular BCPs with equal HA/β-TCP ratio of diverse particle sizes and on porous blocks which had different chemical compositions. In addition, the osteogenic differentiation of MSCs was compared to adipose-derived (ADSC) and dental pulp (DPSC) stem cells, as well as to pre-osteoblasts on a particulate BCP. MSCs growing on granular BCPs demonstrated increased number as compared to MSCs growing on blocks. Cells proliferated to a greater extent on small granular BCPs, while large granular BCPs and blocks promoted cell differentiation. Surprisingly, the expression of genes involved in osteogenesis was upregulated in MSCs on bioceramics in basal medium which indicates that BCPs may have osteoinductive potential. This was confirmed with the upregulation of osteochondrogenic markers, at different time points, when stem cells from various tissues were grown on the BCP. This study demonstrates that BCPs, depending on their physical features and chemical composition, modulate stem cell behavior, and that stem cells from different origins are inherently distinct in their gene expression profile and can be triggered toward osteochondrogenic fate by BCPs.

Purpose: To evaluate the ability of human immature dental pulp stem cells, which are mesenchymal stem cells of neural crest origin, to differentiate into the corneal epithelium for purposes of corneal transplantation and tissue engineering when cultured on de-epithelized amniotic membranes. Methods: We compared the immunophenotypes (ABCG2, K3/12, and vimentin) of cells grown on amniotic membranes or plastic surfaces under serum-free conditions or in culture media containing serum or serum replacement components. Results: Immature dental pulp stem cells grown on amniotic membranes under basal conditions are able to maintain their undifferentiated state. Our data also suggest that the culture medium used in the present work can modulate the expression of immature dental pulp stem cell markers, thus inducing epithelial differentiation of these cells in vitro. Conclusions: Our results suggest that the amniotic membrane is a good choice for the growth and transplantation of mesenchymal stem cells, particularly immature dental pulp stem cells, in clinical ocular surface reconstruction.

Background The golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs represent the best available animal model for therapeutic trials aiming at the future treatment of human Duchenne muscular dystrophy (DMD). We have obtained a rare litter of six GRMD dogs (3 males and 3 females) born from an affected male and a carrier female which were submitted to a therapeutic trial with adult human stem cells to investigate their capacity to engraft into dogs muscles by local as compared to systemic injection without any immunosuppression. Methods Human Immature Dental Pulp Stem Cells (hIDPSC) were transplanted into 4 littermate dogs aged 28 to 40 days by either arterial or muscular injections. Two non-injected dogs were kept as controls. Clinical translation effects were analyzed since immune reactions by blood exams and physical scores capacity of each dog. Samples from biopsies were checked by immunohistochemistry (dystrophin markers) and FISH for human probes. Results and Discussion We analyzed the cells' ability in respect to migrate, engraftment, and myogenic potential, and the expression of human dystrophin in affected muscles. Additionally, the efficiency of single and consecutive early transplantation was compared. Chimeric muscle fibers were detected by immunofluorescence and fluorescent in situ hybridisation (FISH) using human antibodies and X and Y DNA probes. No signs of immune rejection were observed and these results suggested that hIDPSC cell transplantation may be done without immunosuppression. We showed that hIDPSC presented significant engraftment in GRMD dog muscles, although human dystrophin expression was modest and limited to several muscle fibers. Better clinical condition was also observed in the dog, which received monthly arterial injections and is still clinically stable at 25 months of age. Conclusion Our data suggested that systemic multiple deliveries seemed more effective than local injections. These findings open important avenues for further researches.

Diarreia continua sendo uma das principais causas de morte de crianças em todo mundo. Escherichia coli (E.coli) enteropatogênica (EPEC) é um dos principais patótipos de E.coli envolvidos em surtos de diarreia em crianças com idade inferior à 5 anos. A transcrição de fatores que participam da virulência dessas amostras, além de genes evolvidos na formação de biofilme e motilidade estão sob regulação mediada por sinalização química. Uma importante mólecula sinalizadora é o mensageiro secundário Bis-(3´-5´)-monofosfato de guanosina cíclico (c-di-GMP), que regula uma diversidade de processos celulares nas células. C-di-GMP é sintetizada a partir de duas moléculas de GTP pela diguanilato ciclase (DGCs) e degradada por fosfodiesterases (PDEs) sendo que para ser efetivo, c-di-GMP deve estar ligada a uma molécula efetora. YhjH (PdeH) é a principal PDE de E.coli e YcgR, um receptor de c-di-GMP, juntos estas duas proteínas fazem parte da regulação da motilidade e formação de biofilme de E.coli Diversos estudos demonstram a importância de C-di-GMP na regulação de fatores de virulência em diversas espécies todavia, poucos estudos para entender o papel desta molécula em E.coli patogênicas foram realizados até o presente momento. Deste modo, o objetivo deste trabalho é analisar a possível influência de C-di-GMP na regulação de mecanismos de virulência em amostras de EPEC. Para este trabalho foram construídos mutantes ycgR e yhjH das amostras de aEPEC O55:H7 e ONT:H25 através da técnica de recombinação homóloga mediada pelo sistema Lambda Red . Ensaios fenotípicos e de transcrição gênica mostram que estes dois genes estão envolvidos diretamente na regulação da motilidade, e nos componentes da matriz extracelular do biofilme. Todavia, embora ambas as amostras pertençam ao mesmo patótipo os resultados se apresentam de maneira bastante divergente, demonstrando a grande heterogenidade dentro deste grupo. Diarrhea is still one of the leading causes of death for children worldwide. Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is one of the main pathotypes of E. coli involved in outbreaks of diarrhea in children under the age of five. The transcription of factors that participate in the virulence of these samples, in addition to genes involved in biofilm formation and motility, is under regulation mediated by chemical signaling. An important signaling molecule is bis-(3\'-5\')-cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP), a secondary messenger that regulates a variety of cellular processes in cells. C-di-GMP is synthesized from two GTP molecules by diguanylate cyclases (DGCs) and degraded by phosphodiesterases (PDEs), and to be effective, c-di-GMP must be linked to an effector molecule. YhjH (PdeH) is the main PDE of E.coli and YcgR, a c-di-GMP receptor; together, these two proteins form a part of the regulation of motility and biofilm formation in E. coli. The importance of c-di-GMP in the regulation of virulence factors in several species has been demonstrated in several studies; however, few studies have been conducted to date in order to understand the role of this molecule in pathogenic E. coli. Thus, the objective of this work is to analyze the possible influence of c-di-GMP on the regulation of virulence mechanisms in EPEC samples. For this work, ycgR and yhjH mutants of aEPEC O55: H7 and ONT: H25 samples were constructed using a homologous recombination technique mediated by the Lambda Red system. Phenotypic and gene transcription assays show that these two genes are directly involved in the regulation of motility and in the components of the extracellular matrix of the biofilm. However, although both samples belong to the same pathotype, the results are quite divergent, demonstrating the great heterogeneity within this group.

AA é uma doença grave caracterizada por pancitopenia e hipocelularidade medular, que pode levar a morte. Em casos severos os tratamentos são restritos ao transplante alogênico de MO e/ou uso de imunossupressores. Para isso, deve ser tipado o HLA entre doador e beneficiário. Com isso, as CTM são fontes celulares candidatas para este propósito, pois são praticamente não imunogênicas devido à sua ação parácrina de imunomodulação. Além disso, as CTM possuem um importante papel na hematopoiese. Para induzir AA utilizamos inicialmente ciclofosfamida (n=10) e radiação ionizante a 6 Gy (n=40), que foi o modelo experimental adotado. Após a radiação ocorreram três transplantes de CTIPDh com intervalo de 15 dias via IP. A resposta clínica do transplante foi monitorada pela avaliação da massa corpórea, hemograma e histopatologia da MO. O enxerto das CTIPDh na MO e seu efeito na hematopoiese, também foi verificado. Os resultados demonstraram que os animais irradiados e tratados com CTIPDh apresentaram benefícios clínicos em relação aos animais não tratados. Observamos enxertia das CTIPDh na MO e baço dos camundongos e recuperação dos componentes medulares em comparação aos animais não tratados. Assim, o transplante das CTIPDh são uma fonte terapêutica em potencial. AA is a several disease characterized by peripheral pancytopenia and bone marrow hypoplasia, which can lead to death. In severe cases, treatments are limited to allogeneic BM transplant and/or immunosuppressants administration. For this purpose, the donor blood must be typed to identify their HLA. Thereby, MSC are appropriate candidates for therapeutic use, because they present low immunogenicity and provide immunomodulation effect in tissue repair. Furthermore, MSC have important role in supporting hematopoiesis. Thus, AA was induced using cyclophosphamide (n = 10) and 6 Gy ionizing radiation (n = 40), which caused BM ablation in mice. Thus ionizing radiation of AA model was selected. After radiation, the mice received three equal doses of hDPSC each 15-day via intraperitoneal injection. Clinical response was monitored by body mass, blood cells counting and histopathology of BM. The influence of hDPSC infusion on hematopoiesis and engraftment capacity of this cell was also investigated. Our data show the hDPSC transplantation in irradiated mice improves clinical conditions and the transplant intraperitoneal showed hDPSC grafting in BM and recovery of medullary components when compared to untreated group. The results indicate that hDPSC transplantation is a potential tool for cell-based therapeutics.

Os venenos de serpentes contém uma mistura complexa de toxinas (proteínas e enzimas) que destroem os processos bioquímicos ou fisiológicos da presa. A crotamina é um dos principais componentes do veneno da cascavel Sul Americana Crotalus durissus terrificus. Essa proteína pertence à família dos polipeptídeos miotóxicos de baixo peso molecular (SBMPs). Uma importante atividade da crotamina é a habilidade de penetrar rapidamente em células proliferamente ativas, podendo ser usada como nanocarreadora, levando DNA plasmidial e drogas para dentro de células tumorais. Outra atividade interessante desta toxina é a indução de morte celular dose dependente em células cancerígenas proliferamente ativas sem prejudicar células normais, demonstrando promissora atividade anticâncer. A crotamina apresenta forte atividade antifúngica e moderada atividade contra procariotos, age bloqueando canais de potássio dependente de voltagem, sendo seletiva para os canais Kv1.1, Kv1.2 e Kv1.3, e induz paralisia dos membros posteriores de camundongo. Dada a importância das atividades da crotamina, a toxina foi usada para produzir na forma recombinante. De forma geral, as toxinas animais são peptídeos secretados para o lúmen da glândula de veneno e são ricos em pontes dissulfeto, comumente expressas em sistemas procarióticos na forma de corpúsculos de inclusão ou em sistemas de expressão periplasmática. Foram construídos três genes sintéticos, um para a expressão em citoplasma e dois para a expressão em periplasma bacteriano utilizando o vetor pRSET-A (Invitrogen ®). Para a expressão de crotamina em citoplasma bacteriano, a região do DNA que codifica a região do peptídeo maduro foi clonada em fusão com uma cauda simples de 6 x His separada por uma seqüência codificante do sítio de clivagem de enterokinase em substituição à proteína de fusão do vetor comercial pRSETA. Para a expressão em periplasma a região codificante da crotamina madura foi clonada sob o controle da seqüência sinal da OmpA de E. coli. Todos os códons raros da crotamina madura foram otimizados de acordo com os códons preferenciais de E. coli. Em uma das construções para a expressão em periplasma, além da crotamina madura, o peptídeo sinal de OmpA também teve seus códons raros otimizados. Os plasmídeos desenhados para a expressão da crotamina madura em citoplasma e periplasma foram transformados em bactéria competente BL21(DE3) e BL21-AI e a indução da proteína foi feita por IPTG e arabinose, respectivamente. A expressão foi analisada por SDS-PAGE e Western Blotting, mostrando que foi possível expressar as três construções em BL21-AI. Snake venoms contain a complex cocktail of toxins (proteins and enzymes) which disrupt physiological or biochemical processes of the pray. Crotamine is one of the major components present in the venom of the South American rattlesnake Crotalus durissus terrificus. It belongs to the small basic myotoxins peptide SBMPs. An important activity of crotamine is the ability to rapidly penetrate proliferative cells, acting as a nanocarrier, carrying plasmid DNA and drugs into tumor cells. Another interesting activity of this toxin is the ability to promote cell death of actively proliferating cancer cells in a dose dependent manner. Crotamine shows strong antifungical activity and modest activities against prokaryotes, it acts by blocking voltage-dependent potassium channels being selective for channels Kv1.1, Kv1.2 e Kv1.3 and inducing paralysis of the hind limbs of mice. Given the importance of the activities of crotamine, the toxin was chosen for production in the recombinant form. Generally, animal toxins are peptides secreted into the lumen of the venom gland and are rich in disulfide bridges. When expressed in prokaryotic system, animal toxins are commonly found in the form of inclusion bodies. They can also be expressed in periplasmic sytem. Three synthetic genes were constructed, one for expression in the cytoplasm and two for expression in the bacterial periplasm using pRSET-A (Invitrogen ®) system. For cytoplasm expression, the DNA region encoding the mature peptide was cloned in fusion with a 6 x His tag separated by a site. For expression in the periplasm, the mature crotamine coding region was cloned in fusion with E. coli OmpA signal sequence. All crotamine and OmpA signal peptide rare codons were optimized according to E. coli preferred codon usage. The plasmids designed for crotamine expression in periplasm and cytoplasm have been transformed in strains BL21(DE3) and BL21-AI were used as hosts, and the induction of recombinant protein was done by IPTG and arabinose, respectively. The induced culture products were analyzed by SDSPAGE and Western Blot, showing that it was possible to express the three constructs in BL21-AI.

Os tecidos da polpa dentária e vibrissa são dois microambientes celulares que compartilham a mesma origem embrionária. Ambos possuem o seu nicho especifico pós-natal que abrigam células tronco adultas (CTA). O objetivo do trabalho foi investigar a expressão diferencial dos marcadores de células pluripotentes, mesenquimais e neuroepiteliais nas populações de células tronco isoladas das vibrissas (CTV) e polpa de dente (CTPD) de camundongos C57BL-6. Resultados obtidos no presente trabalho, utilizando o método de imunofluorescência, revelaram que as CTA de ambos tecidos expressam um amplo painel de marcadores de pluripotência (Oct4, Nanog e Sox2), mesenquimais (CD73, CD90 e CD105), hematopoiético (CD34), crista neural (CKit), neuronal (Nestina) e epitelial (Integrina α6, LGR5 e LGR6) e indica possível potencial destas células em diversas linhagens celulares. Desta forma, células isoladas destes tecidos podem ser interessantes para serem aplicadas em diversos tratamentos na medicina regenerativa. Portanto, o estudo comparativo da expressão de um amplo painel de marcadores de células tronco em CTV e CTPD pode vir a aumentar o leque de possibilidades de sua utilização na terapia celular. Com isso, as células isoladas de polpa dentária foram submetidas à análise de expressão de marcadores já citados e a outros conhecidamente positivos e específicos para os folículos piloso como Citoqueratina 15 (CK15), LRig1 e Blimp1. Foram realizados ensaios de imunofluorescência, imunohistoquímica, citometria de fluxo e RT-PCR. Os dados obtidos nos permitiram concluir, que as CTA isoladas das ambas as fontes são bastante semelhantes em relação ao seu imunofenótipo, porém as características da sua diferenciação precisam ainda ser analisadas. The tissues of the dental pulp and vibrissae are two cellular microenvironments that share the same embryonic origin. Both have their postnatal specific niche that keep adult stem cells (ASC). The objective of this study was to investigate the differential expression of pluripotent markers, mesenchymal and neuroepithelial in populations of stem cells isolated from whiskers (WSC) and dental pulp (DPSC) C57BL-6 mice. Results obtained in this study, using immunofluorescence, revealed that the ASC both tissues express a broad panel of pluripotency markers (Oct4, Nanog and Sox2), mesenchymal cells (CD73, CD90 and CD105), hematopoietic (CD34), crest neural (cKIT), neuronal (Nestin) and epithelial (Integrin α6, LGR5 and LGR6) and indicates possible potential of these cells in several cell lines. Thus, isolated cells of these tissues may be interesting for application in various treatments in regenerative medicine. Therefore, the comparative study of the expression of a broad panel of stem cell markers in WSC and DPSC could increase the range of possibilities for their use in cell therapy. Thus, the isolated cells were subjected to the dental pulp marker expression analysis cited above and others known to be positive and specific to hair follicles as Cytokeratin 15 (CK15), and LRig1 Blimp1. Immunofluorescence assays were performed, immunohistochemistry, flow cytometry and RT-PCR. The data allowed us to conclude that the ASC isolated from both sources are quite similar with respect to their immunophenotype, but the characteristics of differentiation remain to be analyzed.

Os vírus são eficazes na transferência de genes em células devido aos seus mecanismos especializados. No entanto, vírus como veículos de entrega de genes podem acarretar em problemas, particularmente quando proposto para reprogramar células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) visando utilização terapêutica. No presente estudo, procurou-se desenvolver um sistema alternativo para entregar diretamente proteínas nucleares (Oct4, Sox2, KLF4, e c-Myc) fusionadas com o domínio de transdução de proteína TAT, para promover a reprogramação de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF) ou células mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano (hASC) em células iPS. Primeiramente o PTD TAT ou TAT- foi fundido a proteína verde fluorescente (GFP) como modelo para prova de princípio e padronização detalhada. Inesperadamente, TAT-GFP produzido e secretado pelas células NIH-3T3 produtora não foi capaz de ser detectado no meio de cultura por verificação quantitativa fluorimétrica, nem foi capaz de ser detectada em células-alvo, por citometria de fluxo, depois de co-cultura em transwells. Essa observação pode ser explicada por: (1) ineficiência desse tipo de célula em secretar proteínas e (2) falta de resistência à clivagem por endoproteases furinas. Para contornar esses fatores limitantes usou-se citometria de fluxo para avaliar as melhores condições para a transfecção por seis diferentes tipos de células (CHO, NIH-3T3, HT1080, HEK-293A, HEK-293t e COS-7) com TAT (modificada para ser resistente à furinas) fundido a GFP. Células 293t-TAT-GFP exibiram a maior eficiência de transfecção e também de secreção. O mesmo pôde ser observado para as seis linhagens celulares expressando fatores de transcrição nucleares TAT, determinados por ELISA. Em seguida, diferentes estratégias de entrega foram testadas. A primeira foi baseada na co-cultura de uma mistura de células produtoras com MEF ou hASC. No entanto, não foi possível observar a reprogramação devido à morte celular. A segunda foi baseada na concentração de meio condicionado de cultura de células por centrifugação usando colunas Amicon, trocando o meio a cada 24h, em quatro ciclos. No entanto, apesar da presença de algumas colônias após 20-30 dias, nenhuma colônia verdadeira iPS foi obtida. Na sequência, as células foram tratadas com cada proteína de forma independente, e as demais foram substituídas pelo retrovírus correspondente, trocando meio a cada 72h, em quatro ciclos. Essa estratégia, apesar de permitir verificar a função de cada proteína, também não resultou em reprogramação. Este achado pode ser explicado pela diferenciação celular induzida por BCS, que também é concentrado no processo. Assim, passou-se a adaptação de \"células produtoras\" em condições de cultura livre de soro, para enriquecer a produção dos fatores nucleares individuais, necessários para a reprogramação. A otimização sistematizada deste processo está sendo realizada em parceria com o IPT e deve resultar em quantidades de proteína de fusão suficientes para o teste final da hipótese proposta. Em conjunto, são apresentados os dados da geração de linhagens celulares expressando estavelmente os vários fatores de transcrição e estratégias para melhorar a eficiência necessária para a produção iPS. Esta nova estratégia garante uma produção eficiente de TAT fundida a fatores nucleares de reprogramação e sua eficácia para promover a reprogramação de células somáticas de maneira livre de vírus merece ser investigado futuramente Viruses are effective at transferring genes into cells by its specialized mechanisms. However, viruses as gene delivery vehicles entail problems, particularly when proposed to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem cells (iPS) for therapeutic uses. In the present study, we aimed to develop an alternative system for directly delivering nuclear proteins (Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc) fused with TAT protein transduction domain to promote reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEF) or human adipose tissue derived mesenchymal cells (hASC) into iPS cells. First TAT- or TAT- PTD was fused to green fluorescent protein (GFP) as a proof of principle model and for detailed standardization. Unexpectedly, TAT-GFP produced and secreted by NIH-3T3 producer cells was not detected in the culture medium by quantitative fluorimetric verification, nor detected on target cells, by flow cytometry, after being co-cultured using transwells. This observation maybe explained by: (1) inefficiency of this cell type to be transfected and to secrete proteins and (2) lack of resistance to furin endoproteases cleavage on Golgi of TAT sequence. To circumvent these limiting factors we used flow cytometer to assess the best conditions for transfection in six different cell types (CHO, NIH-3T3, HT1080, HEK-293A, HEK-293t and COS-7) with TAT- (a modified PTD to be resistant to furin endoproteases) fused to GFP. 293t-TAT-GFP cells displayed the highest transfection efficiency and secretion levels. The same could be observed for the six cell lineages expressing TAT- nuclear transcription factors, determined by ELISA.Next, different delivery strategies were tested for TAT- nuclear transcription factor system. Co-culturing a mix of producer cells with MEF or hASC resulted in not reprogramming and this was associated with cell death. The second was based on the use of microconcentrated conditioned cell culture medium, changed every 24h, in four cycles. However, despite the presence of some emerging colonies after 20-30 days, no true iPS colonies were obtained. Then, cells were treated with each protein independently, and the others were replaced by the corresponding retrovirus, changing cell medium every 72h, in four cycles. We verified the reprogramming potential of each protein, but no true colonies were obtained.One possibility for this finding is that BCS is also concentrated by centrifugation and may induce cell differentiation. To circumvent these problems, we have started the adaptation of producer cells in a serum-free culture condition to enrich the production of the individual factors required for reprogramming. This optimization process is taking place in collaboration with the IPT and shall result in large amounts of the fusion protein to finally test the proposed hypothesis. Altogether, we presented the generation of several cell lines stably expressing the transcription factors and strategies to improve the efficiency required for iPS production. This novel strategy guarantees efficient production of TAT-fused reprogramming nuclear factors and its efficacy to promote somatic cells reprogramming in a virus-free manner deserves to be further investigated

A retina é composta por células neuronais especializadas, que quando danificadas são incapazes de se regenerar. CTIPD são uma promissória fonte para substituir o tecido lesado pois são capazes de se diferenciar em quase todos os tipos celulares. O objetivo do estudo é avaliar o potencial de diferenciação das CTIPD em neurônios retinais. As CTIPD foram submetidas a formação de neuroesfera, a qual foi avaliada pela expressão de nestin, b-III-tubulin e Pax-6. A partir da neuroesfera foi realizada a indução da diferenciação em neurônios retinais, a qual foi avaliada pela expressão dos marcadores específicos da diferenciação retinal. Observou-se a reação positiva com nestin, b-III-tubulin e Pax-6 na esfera, sugerindo um comprometimento com a linhagem neural/retinal. Nas células diferenciadas observamos uma maior expressão de Chx-10 e Crx e menor de Nrl, Calbindin, Recoverin e Rhodopsin. Este estudo sugere que CTIPD apresentam potencial de desenvolvimento em neurônios retinais. Entretanto, estudos adicionais são necessários para elucidar a formação da retina neural. Retina is composed of specialized neuronal cells, which in case of damage are unable to regenerate. CTIPD is a promissory source to replace the injured tissue because they can differentiate into almost all cell types. The aim of the study was to evaluate the differentiation potential of CTIPD in retinal neurons. CTIPD were submitted to neurosphere formation and evaluated by the expression of nestin, b-III-tubulin and Pax-6. From the neurosphere was performed the induction of differentiation into retinal neurons, which was assessed by the expression of specific markers of retinal differentiation. We observed a positive reaction with nestin, b-III-tubulin and Pax-6 in the sphere, suggesting a commitment to the neural/retinal lineage. In differentiated cells we found a higher expression of Chx-10 and Crx and a lower expression of Nrl, Calbindin, Recoverin and Rhodopsin. This study suggests that CTIPD show potential development into retinal neurons. However, additional studies are needed to elucidate the formation of the neural retina.

Pesquisas com células tronco têm demonstrado que essa alternativa terapêutica tem grande potencial em diversas patologias. Contudo, muito ainda precisa ser elucidado quanto aos mecanismos de ação, dose e melhores vias de aplicação, para que essa alternativa terapêutica seja efetivamente incorporada às outras. Neste contexto, a via de aplicação se torna crucial na efetividade do tratamento. O objetivo do presente estudo foi avaliar no modelo de necrose tubular aguda (NTA) induzido pelo glicerol o potencial de migração das células tronco mesenquimais derivadas de polpa dentária humana, utilizando as vias intraperitoneal e a via intravenosa. Os nossos resultados demonstraram que neste modelo, não há diferença na migração das células para o órgão alvo, o rim. Contudo, a via intravenosa proporcionou uma melhora da função renal mais significativa do que quando comparada a via intraperitoneal. Stem cell research have demonstrated that this alternative therapy has great potential in various diseases. However, much remains to be elucidated about the mechanisms of action, dosage and best means of implementation, so that alternative therapy may be incorporated other. In this context, the route of application becomes crucial in the effectiveness of treatment. The aim of this study was to evaluate the model of acute tubular necrosis (NTA) induced by glycerol the potential for migration of mesenchymal stem cells derived from human dental pulp, using the intraperitoneal and intravenous route. Our results demonstrate that this model, there is no difference in cell migration to the target organ, the kidney. However, the intravenous route provided an improvement in renal function more significantly than when compared to the intraperitoneal route.

Este estudo teve como objetivo geral a análise do gene FMR1 (Fragile X Mental Retardation gene 1) quanto a sua relação com a insuficiência ovariana primária (Fragile X-related Primary Ovarian Insufficiency, FXPOI). No Capítulo I, apresentamos revisão da literatura sobre FXPOI. A pré-mutação do gene FMR1 constitui a mais frequente causa genética de predisposição para menopausa precoce e entre os casos familiais, cerca de 10% estão associados à pré-mutação do gene FMR1. Entretanto, pouco se conhece sobre a expressão do gene no ovário de mamíferos e os mecanismos pelos quais a pré-mutação causa POI permanecem desconhecidos. O Capítulo II apresenta os resultados do estudo da expressão do gene FMR1 nos ovários adultos, humano e murino. As enormes dificuldades inerentes à obtenção e ao estudo de células germinativas femininas nos levaram a estudar células da granulosa humana (HGC), que são de fácil obtenção, como subprodutos de procedimentos de fertilização in vitro. Também estudamos a expressão do Fmr1 em células da granulosa de camundongos da linhagem CD1 (MGC), coletadas nos ovidutos, após estimulação da ovulação. As células da granulosa interagem intensamente com os ovócitos durante a foliculogênese, transmitindo sinais através do ovário e apoiando o crescimento e a maturação dos ovócitos durante as últimas fases do crescimento folicular. É, portanto, possível que alterações celulares induzidas pela pré-mutação do gene FMR1 nas HGC afetem o crescimento folicular, a taxa de ovulação e a fecundidade. Padronizamos os protocolos de isolamento e de cultivo das HGC do fluido folicular e confirmamos a origem das células isoladas pela expressão de marcadores de HGC, por RT-PCR, e pela natureza lipídica dos grânulos citoplasmáticos, pela coloração com o corante lipofílico DiI. Demonstramos, por RT-PCR que as HGC isoladas do líquido folicular expressam o mRNA do FMR1. Em camundongos, também por RT-PCR, evidenciamos a expressão do mRNA do Fmr1 em ovócitos e nas MGC, coletados do oviduto após hiper-estimulação da ovulação. Por hibridação in situ de RNA em HCG cultivadas, detectamos o mRNA do FMR1 disperso no citoplasma e no núcleo, concentrado em regiões cujas características indicaram ser nucléolos. Essa mesma distribuição foi observada em fibroblastos cultivados. Essa provável localização nucleolar sugere que o transcrito do FMR1, nessas células, constitua ribonucleoproteínas mensageiras, para seu direcionamento do nucléolo para sítios citoplasmáticos específicos, onde ocorre sua tradução. Verificamos, por Western blotting, que as HGC expressam, em níveis elevados, isoformas da FMRP, com massa molecular entre 60 e 95 kDa. Determinamos a localização subcelular da FMRP nas HGC e da Fmrp nas MGC, por imunocoloração. Os sinais de hibridação foram visualizados dispersos, em grânulos finos, no citoplasma das HGC e das MGC, de maneira semelhante ao padrão de distribuição da proteína em neurônios. Nos filopódios das MGC, observamos marcação concentrada em alguns pontos, de forma semelhante ao padrão, previamente descrito, de distribuição da Fmrp em espinhas dendríticas de neurônios de hipocampo de rato, constituindo grânulos de RNA, que promovem o transporte de mRNA e controlam a tradução. O padrão de distribuição semelhante entre neurônios e MGC pode refletir similaridade da função da Fmrp nos dois tecidos. A indução de estresse oxidativo nas HGC por tratamento com arsenito sódico, levou a proteína a deixar de ter distribuição citoplasmática difusa e passar a fazer parte de grânulos de estresse perinucleares, colocalizando-se com TIA-1, marcador dessas estruturas. Resultados semelhantes foram anteriormente obtidos em células HeLa e no hipocampo de rato. Esses resultados apoiam a hipótese de que a FMRP participa do mecanismo transitório de parada da tradução após estresse. No Capítulo III, descrevemos nossas tentativas para obtenção de linhagem de células tronco embrionárias (ESC) de camundongo knockin (KI) quanto a pré-mutação do gene Fmr1. Para a obtenção de embriões KI, fêmeas selvagens (WT; linhagem C57) foram cruzadas com machos KI (linhagem C57/BL6) e fêmeas KI foram cruzadas com machos WT. Pretendíamos comparar a expressão do gene Fmr1 na linhagem de ESC KI e linhagem de ESC WT, inclusive durante a diferenciação Não tivemos sucesso, o que pode ser atribuído às dificuldades inerentes à obtenção de ESC. No acompanhamento dos primeiros quatro dias do desenvolvimento in vitro dos embriões, alterações de clivagem e parada de desenvolvimento foram mais frequentemente observadas nos embriões obtidos de fêmeas KI. Entretanto as taxas médias de sobrevivência de ovócitos para blastocistos e de embriões com 8 a 16 células para blastocistos não diferiram estatisticamente entre as fêmeas KI e selvagens; a grande variabilidade entre o número de blastocistos obtidos por fêmea e o pequeno número delas nos grupos KI (seis) e selvagem (sete) indicam que esses resultados devem ser interpretados com cautela. A análise da proteína Fmrp nos blastocistos, por imunocoloração, mostrou distribuição provavelmente citoplasmática, com padrão granular de marcação, sendo as granulações mais frequentes nos blastocistos de fêmeas WT, porém mais grosseiras nos blastocistos de fêmeas KI. Esse conjunto de dados é sugestivo de efeito da pré-mutação do gene Fmr1 em fêmea murina sobre o início do desenvolvimento de seus embriões. Esse aspecto necessita investigação mais aprofundada This study aimed at investigating the FMR1 gene (Fragile X Mental Retardation gene 1), regarding its relationship with primary ovarian insufficiency (Fragile X-related Primary Ovarian Insufficiency, FXPOI). In Chapter I, we present a literature review on FXPOI. The FMR1 premutation is the most frequent genetic cause of predisposition to premature ovary insufficiency (POI) and, among the POI familial cases, about 10% are associated with the FMR1 gene premutation. However, little is known about the gene expression in the mammal ovary, and the mechanisms by which the premutation causes POI remain unknown. Chapter II presents the study of the FMR1 gene expression in the human and murine adult ovaries. The enormous difficulties inherent in obtaining and studying female germ cells led us to study human granulosa cells (HGC), which are easily obtained as byproducts of in vitro fertilization procedures. We also studied the FMR1 expression in granulosa cells of mice of the CD1 strain (MGC), collected from the oviducts after ovulation induction. Granulosa cells interact functionally with oocytes during folliculogenesis, transmitting signals through the ovary and supporting growth and maturation of oocytes during the later stages of follicular growth. It is, therefore, possible that cellular changes induced by the FMR1 premutation in HGCs affect follicular growth, ovulation rate and fecundity. We standardized protocols for isolation and culture of HGCs obtained from follicular fluid and confirmed the origin of the isolated cells by the expression of HGC markers, using RT-PCR, and by the lipid nature of the cytoplasmic granules, as demonstrated by the staining with the lipophilic dye DiI. We demonstrated, by RT-PCR, that HGCs isolated from follicular fluid express the FMR1 mRNA. In mice, also by RT-PCR, we detected the Fmr1 mRNA in oocytes and in the MGCs, collected from the oviduct after ovulation hyperstimulation. Using RNA in situ hybridization on cultured HCGs, we detected the FMR1 mRNA dispersed in the cytoplasm and, in the nucleus, concentrated in regions whose features indicated to be nucleoli. This same distribution was observed in cultured fibroblasts. This probable nucleolar localization of the FMR1 transcript in these cells suggests that it constitutes messenger ribonucleoproteins for further targeting to specific cytoplasmic sites where translation occurs. We verified, by Western blotting, that HGCs express high levels of the main FMRP isoforms, with molecular mass between 60 and 95 kDa. We determined the FMRP subcellular localization in HGCs and that of Fmrp in MGCs, by immunostaining. The hybridization signals were seen scattered in fine granules in the cytoplasm of both HGCs and MGCs, in a pattern of distribution similar to that observed in neurons. In the MGC filopodia, the protein labeling was concentrated at some sites, similar to the previously described pattern of Fmrp distribution in neuronal dendritic spines of rat hippocampus, where it is part of RNA granules, promoting mRNA transport and translation control. The similar distribution pattern between neurons and MGC may reflect the similarity of FMRP function in both tissues. The induction of oxidative stress in the HGC by treatment with sodium arsenite led the protein to leave its diffuse cytoplasmic distribution to become part of perinuclear stress granules, co-localized with TIA-1, a marker of these structures. Similar results were previously obtained in HeLa cells and in rat hippocampus. These results support the hypothesis that FMRP participates in the mechanism of the transient translation arrest after stress. In Chapter III, we describe our attempts to obtain an embryonic stem cell line (ESC) from knock-in mice (KI) for the FMR1 premutation. To obtain KI embryos, wild females (WT, strain C57) were crossed with males KI (strain C57/BL6), and KI females were crossed with WT males. We planned to compare the expression of the fmr1 gene in the ESCs from the KI and WT strains, including during differentiation. We did not succeed in obtaining an ESC KI line, which can be attributed to difficulties inherent to the procedure. At follow-up of the first four days of in vitro development of embryos, changes in cleavage and developmental arrest were more frequently observed in embryos obtained from KI females. Meanwhile, the average survival rates of oocytes to blastocysts, and 8-16 cell embryos to blastocysts were not statistically different between the KI and WT females. The great variability among the numbers of blastocysts obtained per female and the small size of the KI (six females) and WT (seven females) groups indicate that these results should be interpreted with caution. Immunostaining analysis of the Fmrp in blastocysts showed a probably cytoplasmic distribution, with a granular pattern of labeling, the grains being more common in blastocysts from WT females, but coarser in blastocysts from KI females. These data are suggestive that the Fmr1 premutation in murine females affects the early development of their embryos. This aspect needs further investigation

Doenças pulmonares intersticiais fibrosantes são doenças que afetam homens, mulheres e crianças, tem prognóstico ruim e os pacientes possuem sobrevida estimada entre 3 e 5 anos após a confirmação diagnóstica, sobretudo os portadores de Fibrose pulmonar idiopática. Estudos recentes demonstram a capacidade das células-tronco em se diferenciar em diferentes linhagens celulares e tecidos, como já comprovado em órgãos como coração, fígado, trato gastrointestinal, sistema nervoso e pulmão. Os objetivos deste trabalho foram os de estabelecer a espécie suína como modelo experimental e utilizar a terapia celular experimentalmente como possibilidade de estudo para tratamento das doenças pulmonares intersticiais fibrosantes. Para estabelecer o modelo experimental e induzir a doença nos dois grupos de animais estudados (grupos tratado e controle) foi utilizado sulfato de bleomicina pela via intratraqueal em procedimento único. Após a instalação da doença, os animais dos grupos tratado e controle foram submetidos a tomografia computadorizada de alta resolução (TCAR); um grupo tratado com terapia celular e após noventa dias os dois grupos reavaliados com TCAR antes da eutanásia, totalizando para os dois grupos, cento e oitenta dias de doença instalada. As análises tomográficas mostraram que o tempo para que a doença intersticial seja estabelecida ocorre até três meses após a infusão de bleomicina. As provas histológicas corroboram a viabilidade do modelo testado e as análises imunohistoquímicas sugerem a migração das células mononucleares de medula óssea para os pulmões, bem como a presença de populações celulares que indicam provável reestruturação do parênquima pulmonar. Fibrotic Interstitial pulmonary illnesses affect men, women and children, and presents bad prognostic, 3-5 years depending on the diagnostic confirmation, mainly in idiopathic pulmonary fibrosis. Recent studies demonstrate the capacity of the stem cells in differentiating into different cellular lineages and different tissues, as in heart, liver, gastrointestinal, nervous system and lung. The objectives of this study were to investigate the possibility to consider the swine as experimental model of fibrotic pulmonary disease and experimental stem cell therapy. Bleomycin sulphate was injected into the trachea to induce the pulmonary disease in control and treatment groups. High resolution computed scan (TCAR) was carried out in both groups after the confirmation of the disease. The tomographic analyses showed that the interstitial illness was established after three months of the bleomicine infusion. Histologic investigation revealed the viability of the tested model and the imunohistochemical analyses suggest the migration of the mononuclear cells to the lungs, as well as the presence of new cellular populations that would indicate probable reorganization of the pulmonary parenchyma.

O transplante intrauterino de células-tronco (TIUCT) é um método de tratamento de doenças genéticas, congênitas, hematológicas e imunológicas em um feto durante a gestação. Em pesquisa básica este modelo permite o estudo da dinâmica de migração, enxertia e estado funcional de diferentes tipos de células-tronco (CT). Estas células podem ser transplantadas em diferentes momentos do período gestacional, que pode ser dividido em três momentos do desenvolvimento fetal, sendo estes, diferentes funcionalmente. A escolha deste momento para o transplante influenciará tanto no comportamento celular quanto no resultado. Para o TIUCT são utilizadas as CT mesenquimais derivadas da medula óssea ou fetais ou hematopoiéticas. Para esta pesquisa utilizamos células-tronco derivadas da polpa dentária imatura humana (CTIPDh) as quais apresentam potencial pluripotente e propriedades imunomodulatórias. Nosso principal objetivo foi avaliar a capacidade migratória, bem como de proliferação e endereçamento (homing) das CTIPDh durante o terceiro período gestacional do desenvolvimento fetal no modelo canino. Todos os procedimentos experimentais foram elaborados sob protocolo anestésico apropriado e aprovados pelo comitê de ética da FMVZ da USP. Foram transplantadas via intraperitoneal (IP) 1x106 CTIPDh GFP+ em cada feto, durante procedimento cirúrgico de laparotomia exploratória com ultrassonografia guiada intraoperatóriamente em quatro fetos com idade gestacional aproximada de 45 dias, e outros dois fetos os quais não receberam o transplante, utilizados como controle. Avaliamos os fetos pré e pós-transplante através do ultrasson. Após sete dias, realizamos a ovário-salpingo-histerectomia (OSH) para a colheita dos fetos. Em seguida coletamos seus órgãos e tecidos os quais foram fixados em paraformoldeído a 4% e criopreservados a temperatura de -80oC. Analisamos a biodistribuição das CTIPDh dentro dos órgãos e tecidos em criocortes de 5µm sob microscopia Confocal. Constatamos o homing das CTIPDh nos órgãos derivados das linhas germinativas endodermais, ectodermais e mesodermais. No estômago e intestinos as CTIPD/GFP+ foram identificadas tanto no espaço intraglandular, como na camada muscular da mucosa; no fígado no parenquima hepático; no coração especialmente no tecido muscular do miocárdio; no cérebro nos vasos da substância branca, e cerebelo entre células de Purkinje. Na placenta estas células foram encontradas especialmente junto aos vasos. Quantificamos as CTIPD GFP+ utilizando a citometria de fluxo. Comparativamente dentre os órgãos analisados, obtivemos resultados expressivos do homing celular no miocárdio (~50%), no baço e fígado. Nossos resultados foram confirmados através das análises de imunohistoquímica e imunofluorescência utilizando os anticorpos Anti-núcleo (HuNu), Anti-CTIPD e Anti-GFP humanos. Concluímos que as CTIPDh apresentam grande potencial migratório e proliferativo após o TIUCT em fetos caninos. Estas células indiferenciadas demonstraram homing, especialmente nos tecidos: hematopoiéticos fetais (placenta, fígado e baço), tecido epitelial e glandular de órgãos, bem como de nichos perivasculares de CT. Estes dados sugerem que as CTIPD através do TIU, é uma alternativa viável, segura e promissora para o tratamento de doenças genéticas, congênitas, hematológicas e imunológicas. Intra-uterine stem cells transplantation (IUSCT) is a method for the treatment of genetic, congenital, hematological, and immunological diseases. In basic research it provides a model for studying the dynamics of migration, graft and functional status of different types of stem cells. The cells can be transplanted in different moments of gestational period, which can be divided into quarters that are not functionally equivalent. The choice of the cells and quarter where the stem cells will be applied can influence cells behavior and results of transplantation. Fetal and adult hematopoietic or bone marrow derived mesenchymal stem cells (MSCs) were mainly used for IUSCT. We previously obtained human immature dental pulp stem cell (IDPSCs), which showed pluripotent potential and immune-compatible properties. The goal of our study was to evaluate migration capacity, proliferation and homing of IDPSCs after IUSCT during the third fetal period in dogs. All experimental procedures were approved by the Ethical Committee of the School of Veterinary Medicine and Animal Science of São Paulo University and were performed under appropriate anesthesia. 1x106 of undifferentiated GFP-positive human IDPSCs were transplanted following laparotomy and intraperitoneal injection under intra-operative ultrasound control into 5 fetuses at the 45 days of gestation. Five fetuses, which did not receive IDPSCs, were used as a control. Ultrasound analyses were performed daily before collection of the fetuses. After 7 days ovarian hysterectomy was performed, fetuses were collected; organs and tissues were isolated and fixed in 4% paraformaldehyde or cryopreserved. Biodistribution of IDPSCs within the organs and tissues were analyzed on cryosections (5µm) under Confocal Microscopy. Homing of IDPSCs was observed in organs derived from three germ lines, endoderm, ectoderm and mesoderm. In stomach and in intestine GFP IDPSCs were found in intraglandular space as well as in muscularis mucosae. In liver they appeared in hepatic parenchyma; in heart in myocardium and in brain in bold vessels, in cerebellum within Purkinje cells. Using Flow cytometry assay GFP IDPSCs graft was quantified. Among the different organs an expressive homing was observed in myocardium of heart (~50%), in spleen and liver. The IDPSCs were also found in canine placenta, especially in blood vessels. These data were confirmed using anti-human nucleus (HuNu), anti-GFP and anti-IDPSCs anti-bodies. Human IDPSCs showed high migration and proliferation potential after IUSCT in dog fetuses. Undifferentiated IDPSCs demonstrated homing in fetal hematopoietic (placenta), epithelial (gastric glands) and perivascular stem cells niches. Our data suggest that IDPSCs is a new promising source for genetic, congenital, hematological, and immunological treatment for those diseases through IUSCT.

Crotamina é um peptídeo de baixo peso molecular composto de 42 resíduos de aminoácidos. A presença de nove resíduos de lisina e três pontes dissulfeto confere a crotamina compactibilidade elevada, estabilidade, carga positiva líquida, apresentando similaridade estrutural com defensina, um peptídeo antimicrobiano do epitélio humano. Crotamina até 10,0 mM é inócua para células normais (e.g., fibroblastos humanos e células-tronco embrionárias de murinos), mas letal para células tumorigênicas CHO-K1. Aqui, nós demonstramos que 1 mg crotamina (0,2 mM) foi citotóxica para céluas B16-F10, Mia Paca-2 e SK-Mel-28 células in vitro, como se provou pelos ensaios de MTT, coloração com Hoechst 33342 e Iodeto de Propídio. Adicionalmente, nós avaliamos o efeito citotóxico da crotamina sobre a invasão do melanoma cutâneo primário produzido pela implantação de células B16-F10 em camundongos C57BL/6J. O efeito da crotamina em melanoma cutâneo foi estudado em dois grupos de camundongos (tratados com crotamina e não tratados), sendo cada grupo composto por 35 camundongos. Cada animal do grupo, tratado com crotamina, recebeu diariamente 1,0 mg/100 mL de crotamina (2 mM) , enquanto aqueles não tratados receberam apenas placebo. O tratamento com crotamina durou 21 dias. O atraso da implantação do tumor e redução da mortalidade foi observado para o grupo tratado com crotamina quando comparados ao grupo controle não-tratados. O peso médio d o tumor no grupo não tratado foi 4,60 g, enquanto nos tratados com crotamina foi de apenas de 0,27 g, quando detectados. O cálculo de sobrevida estimado de Kaplan Meier indicou que o grupo tratado com crotamina apresentou diferenças significativas, número de sobreviventes (n = 28/35), em comparação ao grupo não tratado (n = 7/35). Os dados de nossa pesquisa demonstram que a crotamina possui in vitro e in vivo uma atividade citotóxica específica e seletiva contra tipos de tumores de crescimento rápido e agressivo. Crotamine is a low molecular weight peptide composed of 42 amino acid residues. The presence of nine lysine residues and three disulfide bonds confers to crotamine high compactness, stability, net positive charge, and overall structural similarity to b-defensin 2, an antimicrobial peptide from the human epithelia. Crotamine, up to 10.0 mM, is innocuous to normal cells (e.g., human fibroblasts and murine embryonic stem cells), but lethal for tumorigenic CHO-K1 cells. Herein, we demonstrated that 1 mg of crotamine (0,2 mM) was cytotoxic for B16-F10, Mic PaCa-2 and SK-Mel-28 cells in vitro, as proved by MTT assay, Hoechst 33342 and Propidium iodide staining. Additionally, we evaluate the cytotoxic effect of crotamine on primary invasion of cutaneous melanoma produced by injection of B16-F10 cells into C57Bl/6J mice. The effect of crotamine on cutaneous melanoma was studied on two groups of mice (crotamine-treated and non-treated), each composed by 35 mice. Each animal in crotamine-treated group received daily 1 mg/100 mL of crotamine (2 mM), while those non-treated received placebo. Crotamine treatment lasted for 21 days. The delay of tumor implantation and reduction of death was observed for crotamine-treated group when compared to control non-treated group. Average weight of tumor in non-treated group was 4.60 g, while in crotamine-treated, was only about 0.27 g, if detectable. The Kaplan Meier estimator indicated that crotamine-treated group present significant survival number (n=28/35) in comparison with non-treated group (n=7/35). Data from our research demonstrate that crotamine possesses in vitro and in vivo specific and selective cytotoxic activity against aggressive and fast growing types of tumor.

A aplicação terapêutica de Células Tronco (CT) em equinos é um campo emergente. Nestes animais, as CT são promissoras para o tratamento de lesões nos tendões e rupturas de ligamentos. Apesar das características e do potencial na restauração de tecidos lesionados, bem como dos efeitos parácrinos destas células, não existem dados a respeito do seu uso no tratamento de desordens sistêmicas que podem acometer os equinos, tais como a endometrose. A endometrose é uma doença progressiva e irreversível que leva a degeneração do endométrio e a formação de um tecido fibroso periglandular, sendo de grande relevância na medicina veterinária, por ser uma das maiores causas de infertilidade. Apesar dos constantes avanços na busca de um tratamento, nenhum obteve sucesso. Levando-se em consideração a importância da doença, o objetivo deste projeto foi utilizar CT, previamente isoladas e caracterizadas pelo nosso grupo, no tratamento da endometrose, visando diminuir o processo inflamatório e a formação do tecido fibroso periglandular. Seis éguas com endometrose foram sincronizadas. Em quatro foram infundidas CT previamente marcadas com Vybrant, e nas outras duas (controle) apenas solução fisiológica. Antes da infusão, foram coletadas biópsias uterinas e amostras para citologia. Após 7, 21 e 61 dias da infusão, foram coletadas novas biópsias e amostras citológicas. Por meio da fluorescência direta observamos a presença das CT marcadas enxertadas tanto no corpo quanto nos cornos uterinos das éguas. Através de análises histológicas observamos uma significativa melhora no aspecto morfológico e na organização do tecido uterino, bem como, das glândulas endometriais, após a infusão das CT, tal resultado foi observado progressivamente ao longo dos dias. Notamos também uma diminuição no processo de fibrose do tecido periglandular. As análises de citologia demonstraram a ausência de inflamação uterina antes e após a infusão das CT. Nossos dados sugerem que existem benefícios na utilização de CT de tecido adiposo de equinos no tratamento do tecido uterino acometido pela endometrose, que clinicamente só poderão ser validados após a prenhez desses animais. In horses, Stem Cell (SC) therapies are a promising tool to the treatment of many injuries, as tendon lesions and ligaments rupture. Besides the characteristics and the potential in tissue restoration, as well as, paracrine effects of SC, there is no information about the use of them for the treatment of systemic disorders which can commit horses, such as endometrosis. Endometrosis is a progressive and irreversible disease which is defined as active or inactive periglandular and stromal endometrial fibrosis, including glandular alterations within fibrotic foci. Modifications induced by this disease alter the surface of endometrium which, in consequence, led to infertility. Conventional treatments do not reduce the fibrotic process or even help to restore fertility. Considering the importance of this disease, the goal of this project is to use SC, previously isolated and characterized by our group, in the treatment of endometrosis, in order to reduce inflammatory process and periglandular fibrous tissue formation, typical of this disease. Six mares with confirmed endometrosis were synchronized for the use as animal model in this work. In four of animals we infused stem cells previously marked with Vybrant, and the other two (control group) were infused with saline solution. Before the infusion, uterine biopsies and also samples for cytology were collected. After 7, 21 and 61 days of cells infusion new biopsies and cytology samples for analysis were collected. We observed, by direct fluorescence, the presence of marked cells grafted in both body and uterine horns of treated animals. Through histological analysis we observed a significant improvement in morphology and organization of uterine tissue, as well as endometrial glands, after infusion of stem cells, this result was observed progressively throughout the days. Furthermore, we noted a decrease in the process of periglandular tissue fibrosis, after infusion of cells. Cytology analysis showed that the animals have no uterine inflammation before or after infusion of SC. Our data suggest that there are benefits of using stem cells from equine adipose tissue in the treatment of uterus tissue affected by endometriosis, which can only be clinically validated after pregnancy of these animals.

A espermatogênese é extremamente sensível a tratamentos quimioterápicos. A ciclofosfamida é um exemplo de droga amplamente utilizada em pacientes, que pode causar infertilidade nos homens. Baseando-nos no fato de que a ciclofosfamida diminui a contagem deespermatozóides, e de que a recuperação da produção espermática é dependente da regeneração das células-tronco, no presente estudo nós desenvolvemos um regime de tratamento com ciclofosfamida capaz de eliminar células germinativas em diferenciação nos testículos decamundongos, e avaliamos a abilidade das espermatogônias-tronco de regenerarem a espermatogênese in situ e após transplante de células germinativas. Nós utilizamos um tratamento com sete doses de ciclofosfamida, administradas com um intervalo de 4 dias entre doses, que resultou em uma drástica redução do número de células germinativas em diferenciação, porém aproximadamente 50% das espermatogônias do tipo A indiferenciadas ainda estavam presentes noepitélio seminífero, com morfologia normal. Nós monitoramos a cinética da recuperação espermática e encontramos que o número de espermatozóides testiculares foi restaurado para 64% do resultadoapresentado para animais controle, dentro do tempo necessário para que as células-tronco se tornem espermatozóides. Quando as espermatogônias que sobreviveram ao tratamento com ciclofosfamidaforam transplantadas para camundongos com espermatogênese endógena deprimida por radiação fracionada, a recuperação da espermatogênese foi reduzida para 12% do valor esperado, quandocomparados com animais criptorquídicos. Assim, nós concluímos que múltiplas doses de ciclofosfamida não eliminaram completamente as espermatogônias-tronco, mas resultaram em perdacelular e dano funcional das células-tronco.

Em vista das limitações éticas em torno da obtenção de células-tronco de fetos humanos, o cão é uma alternativa para estes estudos. Além disso, a terapia celular proporciona novas expectativas para o tratamento na espécie. Realizamos o estudo comparativo das células isoladas de saco vitelino, fígado e medula óssea de fetos caninos. As células foram analisadas microscopicamente e ultra estruturalmente. O imunofenótipo das células foi avaliado através de marcadores. Caracterizamos a plasticidade, o cariótipo e o potencial teratogênico destas células. Após expansão as células progenitoras formaram colônias com morfologia fibroblastóide. As células progenitoras do saco vitelino e medula óssea são compostas por: células com alta proporção núcleo-citoplasma e células com citoplasma rico em organelas, enquanto que as células progenitoras do fígado eram semelhantes à célula epitelial e células ricas em organelas. As células-progenitoras dos três tecidos fetais foram positivas para os anticorpos nestina e vimentina, mas negativas para CD45 e CD13. Células progenitoras de medula óssea foram positivas para o marcador CD44. Células progenitoras do fígado e medula óssea expressaram a proteína citoqueratina-18, enquanto as do saco vitelino expressaram ve-caderina. Células positivas para Oct3/4 foram detectadas em todas as células progenitoras. As células-progenitoras do saco vitelino e medula óssea diferenciaram-se em tecidos ósseo, cartilaginoso e muscular; já as do fígado para tecido ósseo e muscular. Nenhum tipo celular diferenciou-se em adipócitos. As células progenitoras da medula óssea diferenciaram em células semelhantes a neurônios. Sugere-se a presença de progenitores semelhantes a células mesenquimais e epiteliais. Todas as células mantiveram o cariótipo estável e não formaram tumores. Células progenitoras de medula óssea apresentaram maior capacidade de proliferação e diversidade de diferenciação. Sugere-se que estas células são possíveis candidatas para a terapia celular. The use the human fetuses for stem cells isolation have ethical limitations. In this context the dog is an excellent candidate to fetal stem cells. Furthermore, these cells can be used in cell therapy of canine diseases We aimed at isolation and comparative characterization of progenitor cells from yolk sac, liver and bone marrow of canine fetuses. Cells were characterized using stem cells antibodies. Differentiation assays as well as karyotype analysis were performed. Teratogenic properties this cells were evaluated. After establishment of primary culture, best proliferation potential was observed in bone marrow progenitor cells. Bone marrow and liver progenitor cells were more efficient in CFU-F assay, then yolk sac progenitor cells. Evidenced by TEM cells with a high nuclear-to-cytoplasmic ratio and cells with cytoplasm rich in organelles. Cells isolated from liver showed epithelial-like morphology and cytoplasm rich in organelles. The yolk sac, liver bone marrow cells reacted positively with nestin and vimentin, being negative to CD45 and CD13 antibodies. Additionally bone marrow progenitor cells were positive to CD44. Bone marrow and liver progenitor cells reacted positively with cytokeratin 18. Yolk sac progenitor cells were positive to ve-cadherin. A few Oct3/4 positive cells were found in yolk sac, liver and bone marrow. Yolk sac and bone marrow progenitor cells showed successful osteogenic, chondrogenic, myogenic differentiation. Differentiation liver progenitor cells were able to bone and muscle cells. The bone marrow progenitor cells were able to produce neuron-like cells. None of progenitor cells showed adipogenic differentiation. The study suggests the presence of mesenchymal-like and epithelial-like progenitor cells. All the karyotype remained and failed to induce the formation of tumors. Stem cells from bone marrow showed high diversity of differentiation than other cell types. It is suggested that these cells are possible candidates for cell therapy.

O cão é um excelente modelo pré-clínico para o estudo de doenças, testes farmacológicos e novas terapias para futura aplicação em humanos. Desta forma, estudamos o modelo canino como fonte de células tronco de anexos fetais, o líquido amniótico, alantóide e conteúdo vitelino. Uma vez que hoje, as células tronco apresentam uma esperança na cura de diversas doenças tanto nos cães, como no ser humano. Sendo assim, caracterizamos e estudamos o potencial de diferenciação dessas células, isoladas após a técnica de ovário salpingo histerectomia, de cadelas em campanhas de castração. Após o isolamento e a caracterização, somente foi estabelecida a cultura do líquido amniótico e alantóide. Para caracterizar as células, isoladas no intuito de comprovar que são células tronco verdadeiras, os seguintes Imunomarcadores foram usados, vimentina, nestina, citoqueratina-18 e oct-4, sendo os três primeiros positivos para células do líquido amniótico e alantóide. Induzimos a diferenciação dessas células para osso, cartilagem e gordura, utilizando protocolos previamente estabelecidos. As células tronco do líquido amniótico limitaram-se à diferenciação condrogênica e osteogênica enquanto que as células tronco do alantóide, limitaram-se a diferenciação condrogênica. Ao mesmo tempo, ambos os tipos celulares, não prosseguiram à diferenciação adipogênica. Surpreendentemente, o meio de diferenciação para gordura, induziu a mudança morfológica nestas células que passaram a apresentar a morfologia típica de células neuronais. Podemos concluir que provavelmente para diferenciação adipogênica, é preciso desenvolver outro meio de cultura, por outro lado, esse resultado sugere que devemos explorar o potencial neurogênico desses tipos celulares. The dog is an excellent preclinical model for the study of diseases, pharmacological tests and new therapies for future application in humans. Thus, we studied the canine model as a source of stem cells from fetal membranes, amniotic fluid, allantois and fluid yolk. Since today, stem cells have a hope in curing various diseases in both dogs and humans. Therefore, we characterize and study the differentiation potential of these cells, isolated after the technique of ovarian salpingo hysterectomy. After the isolation and characterization, was only established the culture of amniotic and allantois fluid. To characterize the cells isolated in order to demonstrate that they are true stem cells, the following were used antibodies, vimentin, nestin, cytokeratin-18 and oct-4. The cells were reactive positively to vimentin, nestin, cytokeratin. We induced the differentiation of these cells osteogenic, chondrogenic, adipogenic, using previously established protocols. Stem cells from amniotic fluid were restricted to chondrogenic and osteogenic differentiation while the stem cells of the allantois, limited to chondrogenic differentiation. At the same time, both cell types, were not able to adipogenic differentiation. Surprisingly, the means of adipogenic differentiation, induced the typical morphology of neuronal cells. We can conclude that probably for adipogenic differentiation, we must develop other culture media, on the other hand, this result suggests that we should explore the neurogenic potential these cell types.

As células provenientes do epitélio olfatório apresentam capacidade regenerativa durante toda a vida, embora este mecanismo ainda não esteja completamente elucidado. O potencial de diferenciação de células-tronco provenientes do epitélio olfatório de cães sem raça definida (Canis familiaris Linnaeus, 1758) foi avaliado utilizando-se 12 cães adultos e 12 cães com 60 dias de vida intra-uterina, oriundos do Hospital Veterinário da FMVZ-USP. Após coletado, o epitélio olfatório foi submetido a protocolo histológico padrão para hematoxilina-eosina, azul de toluidina e PAS. O material fixado em glutaraldeído 2,5% foi processado para observação sob microscopia eletrônica de transmissão. O índice de proliferação nuclear foi medido para detecção de PCNA e Ki67 nuclear. Células foram expandidas em cultura em meio D-MEM/F-12 acrescido de Soro Fetal Bovino hyclone (CO2-95% à 37ºC) para caracterização e diferenciação celular (osteogênica, adipogência e neurogênica). O cultivo das células provenientes do epitélio olfatório de cães com 60 dias de vida intra-uterina mostrou maior evolução em cultura quando comparados aos animais adultos, sendo as primeiras utilizadas para execução dos protocolos de caracterização e diferenciação. As células em cultivo apresentaram expressão CD29 positiva e marcação positiva para OCT-4, citoqueratina 18 (Ck18) e vimentina. A diferenciação osteogênica demonstrou, ao final de 21 dias, células com morfologia típica, caracterizadas pela coloração de Alizarin Red e Von Kossa. A diferenciação adipogênica mostrou pouco número de células, apresentando grânulos adipogênicos, corados por Oil Red, contudo sem morfologia típica. A diferenciação neurogênica demonstrou células que expressaram marcação para GFAP, Neurofilamentos, Oligodendrócitos e βtubulina III. As células isoladas a partir do epitélio olfatório de cães com 60 dias de vida intra-uterina evidenciaram populações de células-tronco, determinadas pela expressão de marcadores específicos e diferenciação em outros tipos de tecido, devendo-se considerar este epitélio como uma fonte potencial para aquisição de células, particularmente progenitores neuronais, que possam somar aos estudos e seu uso em terapia celular. Olfactory cells demonstrate regenerative capacity along life, although, its mechanism is still obscure. We evaluated the differentiation capacity of olfactory stem cell of mongrel dogs (Canis familiaris Linnaeus, 1758) in 12 adult dogs and 12 fetuses at term (60 days of pregnancy) from the Veterinary Hospital of FMVZ-USP. Following the sampling, the epithelia were submitted to standard histological process and stained with HE, toluidine blue and PAS. Samples fixed with 2.5% glutaraldehyde solution were processed for transmission electron microscopy. Proliferative index were obtained with the detection of PCNA and Ki67. Cells were kept in culture in D-MEM/F-12 medium supplemented with hyclone bovine fetal serum (CO2-95% at 37ºC) for characterization and cell differentiation (osteogenesis, adipogenesis, and neurogenesis). Cell culture of fetuses at term demonstrated higher evolution in comparison to adult animals, being submitted to the protocols of characterization and differentiation. Cell culture demonstrated positive reaction for CD29, OCT-4, Ck18 (citokeratin) and vimentin. Osteogenic differentiation demonstrated, 21 days, typical morphological cells characterized by Alizarin Red and Von Kossa staining. Adipogenic differentiation demonstrated less number of cells containing granules, stained with Oil Red, although being not typical shape. Neurogenic differentiation demonstrated positive staining for GFAP, Neurofilament, Oligodendrocyte and III β-tubulin. Cells isolated from epithelia of fetuses at term demonstrated population of stem cells determined by the expression of specific-staining and differentiation into other type of cells, which lead us to consider the olfactory epithelia as a source of potential stem cells particularly for neurogenic differentiation to be applied for further studies in cell therapy.

As fissuras lábio palatinas (FLP) são as malformações faciais mais comuns presentes ao nascimento e correspondem a cerca de 25% de todos os defeitos congênitos. Sua incidência é alta, de aproximadamente 1/700 nascimentos e varia entre os diferentes grupos étnicos. Elas representam um problema relevante de saúde, pois os portadores necessitam para sua reabilitação estética e funcional de uma equipe multidisciplinar, do nascimento e geralmente, até a vida adulta, o que exige um alto custo econômico. A etiologia das FLP não sindrômicas ainda é controversa na literatura, apesar de existirem esforços mundiais para identificar os fatores que causam esta patologia. Nosso trabalho consistiu do estabelecimento e caracterização de 23 linhagens de células tronco adultas (CTA) obtidas de polpa de dentes decíduos (11 indivíduos, sendo 5 controles, 5 portadores de FLP não sindrômica e 1 portador da síndrome de Van der Woude), do músculo orbicular do lábio (5 indivíduos portadores de FLP), do osso medular (2 indivíduos portadores de FLP) e de gordura de lipoaspiração (5 controles), com o objetivo de utilizá-las para ajudar a elucidar os mecanismos etiológicos de origem genética das fissuras lábio palatinas não sindrômicas; bem como para utilizá-las para bioengenharia dos tecidos alterados nesta patologia, especialmente o tecido ósseo. Demonstramos que os protocolos que utilizamos são facilmente reproduzidos e que as diferentes linhagens CTA obtidas tem plasticidade para diferenciação osteogênica “in vitro", e que as CTA obtidas de polpa de dente e de músculo orbicular do lábio têm plasticidade para se diferenciar “in vitro" em tecido ósseo, muscular, condrogênico e adipogênico. Além disso, em nossos experimentos, demonstramos que estas CTA tem capacidade de regenerar grandes defeitos ósseos em ratos Wistar não imunossuprimidos, nos quais não observamos clinicamente nenhum tipo de rejeição destas células humanas. Utilizamos uma metodologia inédita para estudar a etiopatogenia das FLP, que consistiu da obtenção de RNA das CTA de indivíduos portadores de FLP e de controles para posterior hibridação em lâminas de “microarray" e comparação do perfil de expressão gênica das mesmas. Observamos neste estudo preliminar que 367 genes estão diferencialmente expressos nas amostras, sendo todos mais expressos nas amostras dos portadores de FLP e sugerimos que esta é uma estratégia promissora para estudo da etiopatogenia das FLP. Concluimos que a realização de estudos das CTA de afetados por FLP e de controles são importantes não só para utilização das mesmas em bioengenharia de tecidos, mas também para estudo da etiopatogenia das fissuras. Clefts involving the lip and palate (CLP) or palate only (CP) represent the most frequent facial malformation during birth and correspond to approximately 25% of all congenital defects. The incidence of this problem is high; corresponding to approximately 1:700 births, but is different among the ethnic groups. Clefts represent a major health problem due to the requirement of a mutidisciplinary team to deal with the esthetical and funcional reabilitation needs of these patients from birth to, in some cases, adult life, resulting in a high treatment cost. There still many controversies about the ethiology of non-syndomic CLP, even though there are researchers all over the world trying to identify the factors causing this pathology. Our work consisted to establish and characterize 23 adult stem cells (ASC) linages obtained from falling teeth dental pulp (5 controls, 5 non-syndomic CLP patients and 1 Van der Woude syndrome patient), orbicular oris muscle (5 non-syndomic CLP patients), bone marrow (2 non-syndomic CLP patients) and adipose tissue (5 controls). The objectives were to use these lineages to help elucidate the genetic mechanisms involved in the development of non-syndomic CLP, as well as, to bioengineer tissues affected by this pathology, mainly bone tissue. The protocols we used are easily reproductible and we demonstrate that our different ASC linages have in vitro plasticity to osteogenic differentiation, as well as, the lineages obtained from dental pulp and orbicular oris muscle have osteogenic, muscular, condrogenic and adipogenic plasticity. Further more our experiments demonstrate that these ASC lineages have the capacity to regenerate major bone defects in non-immunocompromised Wistar rats, which did not develop any kind of rejection against these human cells. We have used a new methodology to study the molecular mechanisms involved in CLP, which consisted in comparing the mRNA expression profile of ASC from non-syndomic CLP patients and controls, using microarrays. We observed that 367 genes were differently expressed between the two groups and all these genes have a higher expression in samples from nonsyndomic CLP patients, thus suggesting that this is a promising strategy to study the molecular mechanisms involved in CLP. In conclusion, studies involving ASC from non-syndomic CLP patients and controls are important not only to tissue bioengineering, but also to elucidate the molecular mechanisms involved in CLP.

A domesticação dos cães produziu-se simultaneamente em várias partes do globo o que ocasionou, o aparecimento por seleção de várias raças. Desde então o cão passou a ser utilizado para várias e diferentes tarefas, dentre elas acompanhar o homem, que usufruiu da sua conveniência, descobrindo que muitas vezes ambos podem sofrer dos mesmos males. Cães da raça Golden Retriever apresentam uma doença geneticamente degenerativa, homóloga a distrofia muscular de Duchenne (DMD) no homem; ambas doenças afetam o gene que produz a distrofina; uma proteína citoesquelética múscular. Uma possível forma de fornecer uma cópia normal do gene para os grupos musculares afetados de um indivíduo consiste no transplante de células tronco os quais podem ser obtidas de células embrionárias, células germinativas, células do sangue de cordão umbilical, células de medula óssea e células de sangue periférico. Estudos com modelos animais tem mostrado que transplante de células tronco fetais ou células tronco pluripotentes podem ter sucesso no tratamento de muitas doenças crônicas, sendo assim, objetivamos delinear uma linha de tratamento para distrofia muscular em cães da raça Golden Retriever, mediante caracterização e uso das células germinativas embrionárias para terapia celular. Foram utilizados 16 fêmeas sem raça definida (SRD), e as cadelas foram selecionadas a partir do exame citológico; as fêmeas foram inseminadas artificialmente, e após 30 dias de gestação os animais foram castrados pela técnica de ovário-salpingohisterectomia. Os embriões coletados possibilitaram a obtenção e estabelecimento de células tronco germinativas embrionárias, de fibroblastos fetais, de células musculares, os quais analisamos através de citometria de fluxo, interação no co-cultivo de células musculares caninas e células germinativas embrionárias e a imunopositividade das células na detecção de Oct-4. Os resultados nos possibilitam afirmar que em embriões com 22 dias de idade gestacional a região paramesonéfrica apresenta-se indiferenciada, diferentemente do que encontramos com 24 dias de idade, no qual o rim primitivo apresenta-se visível diferenciado. As células tronco germinativas embrionárias apresentaram colônias compactas e com alta proliferação de células mononucleares indiferenciadas e que as células tronco germinativas embrionárias apresentaram como principal problema a manutenção das culturas por períodos significativos. The canine domesticity generated simultaneously in different parts of the World, that created, the begin of selection of many breeds. Since that time, dogs become to be used for different works, since follow men, that usufructed their convinience discovering most of the time that both are soffering the same ill. Dogs from the Golden Retriever breed presented a degenerative and genetically disease, homologous to Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) in human, the dystrophin gene affection; a muscle citosckeletical protein. A possibility way to supply a correct gene shape for the affected muscle could be from the stem cell therapy from embrionic stem cell, germ cells, umbilical cord blood cells, bone marrow and perific blood. Researches with animal models are showing sucess on the treatment with fetal stem cells or pluripotents ones in different types of cronic illness, then, we aimed a treatment of the Golden Retriever Muscular Dystrophy using embrionic germ cells meantime characterization and their use on cell therapy. Were uses 16 females crossbreed (SRD), bitches were selected by the vaginal cytology exams; females were artificially inseminated and after 30 days of pregancy, the animals were histectomized. Embryos were collected to stabilish embrionic germ cells, canine fibroblasts, muscle cells, which were analysed by flow cytometre, co culture and OCT-4 detection. The results showed the paramesonephic region of embryos with 22 days of pregnancy presents undifferentiate cells(germ cells), what differs from embryos with 24 days, which primitive kidneys presented differentianted types of cells. Under culture conditions, these cells formed compact colonies with high proliferative potential, but without capacity of maintenance after 30 days.