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Obiettivo di questo lavoro di tesi è stato lo studio delle comunità batteriche presenti nelle acque delle Saline di Tarquinia, Viterbo (Italia) attraverso metodi colturali e coltura indipendenti ed il monitoraggio del cambiamento nella composizione di tali comunità in seguito a variazioni nutrizionali, climatiche, stagionali,… Nelle Saline di Tarquinia sono stati eseguiti vari studi relativi agli organismi eucarioti che popolano tale ambiente, ma non sono mai state studiate finora le comunità batteriche presenti. Allo scopo di ottenere informazioni sia a livello ecologico, sia per possibili future applicazioni in ambito biotecnologico, lo studio è stato eseguito sia su batteri coltivabili, isolati con i metodi tradizionali, sia sulle comunità batteriche totali, utilizzando metodi molecolari (PCR-DGGE). Gli ecosistemi iperalini sono considerati ambienti estremi e le saline ne sono un esempio. Esse sono caratterizzate da una serie di vasche interconnesse nelle quali la concentrazione salina aumenta progressivamente fin oltre la saturazione e sono caratterizzate da una elevata variabilità dei parametri chimico-fisici, i quali sono soggetti a forti fluttuazioni. Le Saline di Tarquinia sono state utilizzate per la produzione industriale di sale fino al 1997 e dal 1980 sono state istituite Riserva Naturale. Sono caratterizzate da oltre 100 vasche. Allo scopo di poter eseguire una comparazione con una salina ancora attiva nella produzione di sale, è stato condotto uno studio preliminare presso “Salina Chiusicella” all’interno delle saline di Trapani e Paceco. Presso le saline di Tarquinia è stata eseguita una campagna di campionamento triennale, che ha previsto il prelievo mensile di campioni di acqua per i primi due anni, a partire dal mese di maggio 2012 e settimanale per tre mesi significativi a livello stagionale (maggio 2014, settembre 2014 e febbraio 2015) durante il terzo anno. La campagna di campionamento ha previsto il prelievo di campioni di acqua da 14 vasche scelte secondo un gradiente di salinità e dal mare limitrofo per un totale di 15 campioni. Ciascun campione rappresenta la media di tre sottocampioni prelevati da tre punti significativi in ciascun sito. Presso Salina Chiusicella sono stati invece eseguiti due campionamenti (settembre 2013 e settembre 2014) da 10 vasche scelte secondo un gradiente di salinità. Isolamento dei batteri coltivabili e test preliminari I campioni di acqua sono stati filtrati su membrane di nitrocellulosa allo scopo di ottenere colture batteriche pure incubando il filtro su piastre di PCA (Plate Count Agar) a differenti concentrazioni saline scelte in un range compreso tra 0 e 250‰ con step di 50‰. Si è proceduto quindi ad una caratterizzazione morfologica e biochimica ed alla colorazione di Gram, che hanno permesso di ottenere 39 diversi isolati. Identificazione degli isolati Il DNA genomico batterico è stato estratto dalle colture pure ad utilizzato per l’amplificazione del 16S rDNA per permettere l’identificazione degli isolati. 29 ceppi su 39 sono stati identificati a livello di specie (77% ca.). 26 di questi hanno mostrato, dal confronto in banca dati GenBank, valori elevati di identità (99-100%). Tutti gli altri isolati sono stati identificati a livello di genere. 29 ceppi appartenevano alla classe γ-Proteobacteria e 14 di questi all’ordine Oceanospirillales. Tra questi, i generi Halomonas e Salinivibrio erano la maggioranza (11 e 7 isolati rispettivamente). In particolare, all’interno del genere Halomonas sono state identificate 7 differenti specie. Sono stati isolati inoltre ceppi appartenenti agli ordini Enterobacteriales (generi Yersinia e Erwinia), Pseudomonadales (generi Pseudomonas e Psychrobacter), Alteromonadales (genere Idiomarina), Vibrionales (genere Salinivibrio), Rhodobacterales (genere Ruegeria), Actinomycetales (generi Rhodococcus, Nesterenkonia, Arthrobacter e Microbacterium) Bacillales (generi Bacillus, Marinococcus e Planococcus) e Aeromonadales (genere Aeromonas). Le sequenze 16S rDNA dei ceppi isolati sono state allineate tra loro e con quelle che dal confronto in banca dati GenBank hanno mostrato la maggior percentuale di similarità con esse, allo scopo di eseguire analisi filogenetiche. Sono stati ottenuti tre alberi filogenetici utilizzando il metodo della massima verosimiglianza: uno comprendente tutti i ceppi isolati, il secondo relativo all’ordine Oceanospirillales e il terzo relativo agli altri ordini. Sulla base dei risultati ottenuti, alcuni dei ceppi sono stati identificati con certezza a livello di specie mentre altri, a causa della lunghezza dei rami o della posizione esterna nei raggruppamenti, probabilmente appartengono a specie nuove. Per tutti gli altri ceppi, l’identificazione è stata possibile solo a livello di genere. In molti casi questo potrebbe essere dovuto allo scarso potere informativo del gene target utilizzato per discernere la relazioni al di sotto del livello di genere. Determinazione dei profili di crescita a differenti temperature La crescita dei ceppi batterici è stata testata nel range 0-45°C, con step di 5°C, su piastre di PCA con concentrazione salina pari all’optimum per ogni ceppo. La maggior parte di essi (54% ca.) mostrava l’optimum a 30°C. L’optimum più basso è stato registrato per due ceppi (S8 e S34) ed era pari a 20°C. Nessun ceppo mostrava un optimum superiore ai 35°C. La maggior parte degli isolati (64% ca.) mostrava l’optimum nel range mesofilo, ma era in grado di crescere anche a 0-5°C. Questi organismi potrebbero essere definiti come mesofili-psicrotolleranti. Solo il 3% ca. dei ceppi mostrava un optimum a 20°C e cresceva nel range 5-35°C. Questi ceppi possono essere definiti psicrotrofi. Il resto degli isolati (ca. 33%) cresceva a partire da temperature pari o superiori ai 10°C e mostrava un optimum intorno ai 30-35°C. Per questa ragione possono essere definiti mesofili. Quasi tutti i ceppi studiati potrebbero essere considerati euritermi, indicando l’adattamento ad ampie variazioni di temperatura tipiche di un ambiente come quello delle saline. Se comparati con le stesse specie descritte in letteratura, i ceppi testati mostravano un range di crescita spostato verso temperature più basse, ma gli optimum non erano molto differenti. Determinazione dei profili di crescita a differenti concentrazioni di cloruro di sodio La crescita dei ceppi è stata testata nel range 0-320‰, con step di 40‰ su piastre di PCA. Il 46% ca. dei ceppi mostrava un optimum di crescita pari a 40‰ di NaCl e ca. il 23% mostrava l’optimum ad 80‰. La maggior parte di questi ceppi (ca. 81%) non era in grado di crescere in assenza di NaCl ed il 22% cresceva in presenza di concentrazioni saline uguali o superiori a 240‰. Tra i ceppi che mostravano l’optimum a 40‰ di NaCl, alcuni (BS34, S1, S39, S46 e S48) erano in grado di crescere bene anche in assenza di sale. Potrebbero quindi essere definiti come alofili moderati normotolleranti. Circa il 31% dei ceppi mostrava un optimum pari a 0‰, ma era in grado di tollerare concentrazioni saline relativamente alte. Questi microrganismi possono essere definiti quindi alotolleranti. La maggior parte dei ceppi potrebbe essere considerata eurialina, poiché in grado di crescere in un range piuttosto ampio di salinità. Questo fa sì che l’organismo sia in grado di adattarsi all’elevata variabilità tipica di un ambiente come quello delle saline, in cui la salinità è soggetta a forti fluttuazioni. Se comparati con le stesse specie descritte in letteratura, i ceppi testati manifestano un range di crescita meno ampio. Per quanto riguarda gli optima sembrerebbe esserci invece una buona corrispondenza con i pochi dati disponibili in bibliografia. Citometria di flusso Informazioni più dettagliate concernenti l’omeostasi e lo stato fisiologico delle cellule batteriche sottoposte a differenti concentrazioni saline, sono state ottenute da studi di citometria di flusso nel range 0-280‰ con step di 40‰, per quattro ceppi di interesse (BS6, S17, S19 e S28). Per i ceppi BS6 e S28, i risultati ottenuti dalla citometria di flusso confermano quelli ottenuti con la prova di crescita su piastra. Per i ceppi S17 e S19, i risultati ottenuti dalla prova di crescita su piastra, durante la quale era stata evidenziata crescita fino a 280‰ seppur limitata a partire dai 200‰, non sono stati confermati. Per il ceppo S19 infatti, la crescita era manifestata fino a 200‰, ma con il graduale aumento della salinità era possibile notare un aumento proporzionale della sofferenza cellulare. Per il ceppo S17 invece, la crescita si arrestava repentinamente a 120‰, mostrando segni di sofferenza già dalle prime ore di incubazione. È importante sottolineare che la richiesta e la tolleranza di sale per molte specie, varia al variare delle condizioni di crescita, come ad esempio la temperatura o la composizione del terreno. Inoltre la prova di citometria di flusso è stata condotta in terreno liquido, quindi ci possono essere differenze che influiscono sulla crescita del microrganismo. Una delle più rilevanti è la diversa disponibilità di ossigeno a cui il batterio è sottoposto rispetto ad una crescita su terreno solido in piastra. Studio delle comunità batteriche La diversità batterica è stata studiata inoltre utilizzando la tecnica di fingerprinting PCR-DGGE ed i patterns di bande ottenuti sono stati comparati tra loro e sottoposti ad analisi di clusterizzazione attraverso l’utilizzo dei programmi Quantity-One e Phoretix 1D. Una singola specie è rappresentata da una singola banda e la sua abbondanza relativa è determinata dall’intensità della banda. L’analisi di clusterizzazione è stata eseguita utilizzando il metodo UPGMA ed i coefficienti di Dice e Pearson. Dall’ analisi dei gel eseguiti è stata riscontrata una notevole variabilità nei profili di fingerprinting, che non sono risultati omogenei né nel numero di bande rilevate né nella loro distribuzione all’interno del gel. Inoltre, nel corso dei diversi mesi di campionamento, i raggruppamenti all’interno dei dendrogrammi non risultavano correlati alla salinità delle vasche campionate. Questo risultato è stato confermato anche per i mesi estivi, in cui sono state rilevate le differenze più marcate tra i valori di salinità delle varie vasche. Infine, dalle analisi di clusterizzazione è emerso che le vasche in cui si sono registrati sempre i valori di salinità più elevati, non presentavano nella maggior parte dei casi un numero di bande inferiore rispetto agli altri siti nel corso dei campionamenti effettuati. Allo scopo di rappresentare graficamente l’uniformità delle comunità batteriche studiate, sono state calcolate le curve di Pareto-Lorenz basate sull’intensità delle bande presenti nei profili. Ogni profilo di DGGE è descritto da una curva che viene disegnata in un grafico in cui in ascissa è riportato il numero cumulativo normalizzato di bande e in ordinata le rispettive intensità cumulative normalizzate. Per interpretare numericamente la curva si fa riferimento alla proiezione del valore dell’asse y nel punto in cui le intensità corrispondono alla verticale del 20% sull’asse x (indice di organizzazione funzionale - Fo). Le curve di Pareto-Lorenz sono state eseguite per tutti i siti di campionamento e per i mesi di agosto 2012, marzo 2013 e maggio 2012, caratterizzati rispettivamente da salinità massima, minima e intermedia rispetto all’intero periodo di campionamento. I valori medi di Fo calcolati per i mesi di agosto e maggio 2012 (35% e 32% rispettivamente), descrivevano comunità con una medio-bassa organizzazione funzionale e con elevata uniformità, in grado quindi di reagire al mutare delle condizioni ambientali, preservando la loro funzionalità. Questi risultati sembrerebbero adattarsi all’ambiente delle saline, caratterizzato da elevata instabilità dei parametri ambientali, a cui solo una comunità con queste caratteristiche sarebbe in grado di far fronte. Per quanto riguarda il mese di marzo 2013 invece, il valore medio di Fo sale al 43%. Si tratta del mese in cui sono stati registrati i valori di salinità più bassi rispetto ai due anni di campionamento. In questo caso quindi, grazie ad un aumento delle potenzialità fisico-chimiche dei siti campionati, si è rilevato anche un aumento dell’organizzazione funzionale della comunità. Le curve di Pareto-Lorenz sono state calcolate anche per i primi due anni di campionamento per il sito vascone. L’organizzazione funzionale è risultata essere molto differente tra i vari mesi, evidenziando quindi una elevata variabilità nella struttura della comunità batterica nel tempo. Infine è stata eseguita la Moving Windows Analysis per valutare i cambiamenti nella struttura della comunità batterica presente in ciascun sito campionato, a partire dalla matrice di similarità delle curve densiometriche dei profili DGGE. Per tutte le vasche è stata rilevata una elevata dinamicità nel tempo nella composizione delle comunità batteriche presenti. NMDS (No metric multidimensional scaling) Il metodo NMDS è stato eseguito per ogni sito campionato e per tutti i mesi di campionamento, per la ricerca dei rapporti tra il set di dati biologici (conte totali e vitali, matrice delle bande DGGE e Richness) e i dati ambientali rilevati (salinità, temperatura, ossigeno disciolto, pH, clorofeopigmenti e BOD5). I diagrammi di ordinamento sono stati generati utilizzando il coefficiente di similarità Bray-Curtis. Osservando i diagrammi ottenuti è stato possibile notare che essi descrivono uno schema di ordinamento caratteristico per ciascuna delle vasche campionate e questo risultato è stato confermato anche dall’NMDS eseguita per la ricerca dei rapporti tra gli indici di biodiversità calcolati (Richness, indici di Simpson e Shannon-Wiener ed Evenness) e i dati ambientali utilizzati anche per la precedente analisi. Studio delle variazioni mensili Al termine dei due anni di campionamento a cadenza mensile, sono stati eseguiti campionamenti a cadenza settimanale per tre mesi significativi a livello stagionale (maggio 2014, settembre 2014 e febbraio 2015). In questo modo è stato possibile ottenere un confronto su un ulteriore anno di campionamento, almeno per alcuni mesi, ed è stato possibile rilevare anche le variazioni mensili per questo ambiente. I dati relativi al mese di febbraio 2015 sono ancora in fase di elaborazione. I risultati confermano quelli ottenuti con la campagna di campionamento a cadenza mensile: è stata riscontrata una elevata variabilità nella composizione delle comunità batteriche tra i vari siti e i raggruppamenti all’interno dei dendrogrammi, anche in questo caso, non risultano correlati alla salinità delle vasche campionate. Al fine di comprendere le relazioni esistenti tra le comunità batteriche di uno stesso mese nel corso dei vari campionamenti, è stata eseguita un’analisi combinata dei gel sia per il mese di maggio sia per quello di settembre. Per questi è stato possibile eseguire un raffronto per tutti e tre gli anni di campionamento. L’analisi combinata è stata eseguita utilizzando il software Phoretix 1D. I dendrogrammi relativi alla similarità dei patterns di bande sono stati calcolati utilizzando il coefficiente di Dice e l’algoritmo UPGMA. Dai dendrogrammi è stato possibile osservare che, salvo alcune eccezioni, le vasche clusterizzano tra di loro in funzione della data di campionamento. Quindi i profili per le varie vasche, prelevate allo stesso tempo, risultano più simili tra loro di quanto non lo siano i profili ottenuti per la stessa vasca nel corso dei tre anni. Studio preliminare sulle Saline di Trapani e Paceco Al fine di poter eseguire un confronto della diversità batterica tra saline attive nella produzione di sale e non, si è proceduto ad uno studio preliminare presso “Salina Chiusicella” all’interno delle Saline di Trapani e Paceco. Le analisi di clusterizzazione rilevano una differenza sostanziale con i risultati ottenuti per le saline di Tarquinia. È stato possibile infatti rilevare, in questo caso, una suddivisione netta in diversi raggruppamenti, in relazione ai valori di salinità delle vasche campionate. Inoltre, durante il mese di settembre 2014, sebbene nella maggior parte dei casi siano stati rilevati valori di salinità più elevati, è stata evidenziata una maggior diversità batterica. In entrambe le saline quindi non è stato possibile trarre una qualsiasi conclusione netta relativa all’andamento del numero di OTU al variare della salinità in questi ambienti. Questo conferma la complessità nella variazione della struttura delle comunità batteriche lungo un gradiente di salinità e suggerisce di rivalutare il ruolo del dominio batteri negli ambienti “estremi”. In this work we have studied the bacterial communities present in the water environments of “Saline di Tarquinia” Viterbo (Italy) through culture dependent and independent methods and the changes in the communities composition as a function of seasonal, climatic and nutritional variations recorded. Various studies were performed in the “Saline in Tarquinia” on the eukaryotic organisms that inhabit that environment, but the bacterial communities present have never been studied so far. In order to obtain information both at the ecological level and for possible future applications in biotechnology, the study has been carried out both on cultivable strains, isolated by traditional methods, and on the total bacterial communities by molecular methods (PCR-DGGE). Hyperaline ecosystems are considered as extreme environments and the solar salterns are typical examples. They are characterized by a series of interconnected ponds in which salt concentration increases progressively up to saturation. They also show a high variability of physical-chemical parameters such as temperature and salinity and dissolved oxygen, which are subject to strong fluctuations. “Saline di Tarquinia” were used for industrial salt production until 1997 and since 1980 they had been transformed into a natural reserve. They have more than 100 ponds. In order to do a comparison with a solar saltern still active in the salt production, we have carried out a preliminary study in the “Salina Chiusicella” of “Saline di Trapani e Paceco” solar saltern. In “Saline di Tarquinia” the sampling campaign was planned for three years starting from May 2012. From May 2012 to April 2014 we carried out monthly sampling and in the third year we performed weekly sampling for three months: May 2014, September 2014 and February 2015. Sampling campaign consisted in the collection of water from 14 ponds with a salinity gradient. The nearby sea water was also collected as a reference. These samples represented the average of three sub-samples taken from three separate points in each site. In “saline di Trapani e Paceco” we carried out two samplings in September 2013 and September 2014 from 10 ponds with a salinity gradient. Strain isolation and preliminary tests Water samples were filtered through membranes in order to obtain both bacteria pure cultures and DNA for molecular studies. Pure cultures of isolates were obtained by plate streak method on PCA (Plate Count Agar) with different salt concentration from 0 to 250‰ with steps of 50‰. Preliminary tests were carried out considering strain morphological characteristics (shape, color and dimensions), Gram reaction and simple biochemical tests (catalase and oxidase production). This preliminary selection permitted to remove the majority of replicates and to keep 39 isolates. Taxonomical identification of isolates Bacterial genomic DNA was extracted from pure cultures and used for amplification of 16S rDNA, to allow taxonomical identification of each isolate. 29 strains out of 39 (ca. 77%), were identified at species level. 26 strains of these showing high identity (99-100%). All other isolates were identified at the genus level. 29 strains out of 39, belonged to the γ-Proteobacteria class and 14 of these belonged to the Oceanospirillales order. Among these strains, the genera Halomonas and Salinivibrio were the mayority (11 and 7 isolates respectively). In particular, 7 different species have been identified in the Halomonas genus. We have also isolated strains of Enterobacteriales (genera Yersinia and Erwinia), Pseudomonadales (genera Pseudomonas and Psychrobacter), Alteromonadales (genus Idiomarina), Vibrionales (genus Salinivibrio), Rhodobacterales (genus Ruegeria), Actinomycetales (genera Rhodococcus, Nesterenkonia, Arthrobacter and Microbacterium) Bacillales (genera Bacillus, Marinococcus and Planococcus) and Aeromonadales (genus Aeromonas) orders. In addition, the 16S rDNA sequences of the studied strains were aligned between them and with highly similar 16S in the GenBank and phylogenetic analysis was performed. To get a confident branch-length, three different trees were inferred: the first for all studied strains, the second for Oceanospirillales order and the third for the other orders. Based on the results, some of the strains were identified with certainty at species level while some others, due to the branch length or the external position, probably belonged to new species. For all other strains identification was possible at genus level only. In many cases this could be due to the scarce informative power of the gene target used to discern the relations below the genus level. Temperature growth profiles The optimal temperatures for growth of the various strains were tested in the range 0-45°C on PCA plates (steps of 5 °C) with optimal NaCl concentration for each strain. Most of the strains (54% ca.) showed the optimum at 30°C. The lowest optimum was recorded at 20°C for two strain only (S8 e S34). None of them showed an optimum above 35°C. The majority of the isolates (64% ca.) showed the optimum in the mesophilic range, but they were also able to grow to 0-5°C. These organisms can be defined as mesophilic-psychrotolerant. Only 3% ca. of the strains showed the optimum at 20°C and growing in the range 5-35°C. These can be defined psychrotrophics. The rest of the isolates (ca. 33%) grew from or above 10°C and showed an optimum amount to 30-35°C. For this reason they can be defined mesophilics. Almost all the strains could be considered as eurythermics, indicating adaptation to wide temperature variations such as those of the water environments of “Saline di Tarquinia”. If compared with the same species described in the literature, the tested strains showed a growth range shifted to lower temperatures, but optima weren’t very different. Salinity growth profiles The optimal salinity for growth of the strains were tested in the range 0-320‰ on PCA plates (steps of 40‰) at 25°C. Approximately 46% of the strains showed an optimum of growth at 40‰ of NaCl and about 23% showed the optimum at 80‰. Most of these strains (ca. 81%) was not able to grow in the absence of NaCl and 22% ca. grew in the presence of salt concentrations equal or greater than 240‰. Among the strains that showed the optimum growth at 40‰ of NaCl, there were some (BS34, S1, S39, S46 and S48) that were able to grow well even in the absence of salt. They could be defined as moderate halophilics normotolerant. Approximately 31% of all strains showed the optimum to 0‰, but were able to tolerate relatively high salt concentrations. These microorganisms can be define halotolerants. Almost all the strains could be considered as euryhaline, indicating adaptation to wide salinity variations such as those of Saline di Tarquinia. If, compared with the same species described in the literature, the strains tested showed a less wide growth range. With regard to the optimum, it would seem to be a good match with the limited data available in the literature. Flow cytometry More detailed information concerning homeostasis and physiological state of each bacterial cell, submitted to different conditions of salinity, was obtained by flow cytometry in the range 0-280‰, with steps of 40‰, for four strains of interest (BS6, S17, S19 and S28). For BS6 and S28 strains, the results obtained by flow cytometry confirmed those obtained with the test of growth on plate. For S17 and S19 strains, the results obtained from the test plate, in which was highlighted growth up to 280‰, although limited from 200‰, were not confirmed. In fact, for S19 strain the growth was manifested up to 200‰ but at the gradual increase in salinity it is possible to notice a proportional increase in the cellular suffering. For S17 strain, the growth stopped at 120‰, showing signs of suffering from the first hours of incubation. This is because the request and the tolerance of salt for many species, varies with growth conditions, such as temperature or composition of medium. The flow cytometry was performed in liquid medium (LB), so there may be differences that affect the growth of the organism. One of the most important is the varying availability of oxygen to which the bacterium is subjected compared to growth on solid medium in the plate. Study on the bacterial communities The bacteria biodiversity was studied by PCR-DGGE fingerprinting of partial 16S-rRNA gene amplicons. DGGE band patterns, representing the various species present in the communities, were compared and clustered using Quantity-One and Phoretix 1D software. A single species is identified by a single band and the relative abundance of a single species is determined by the band intensity. The cluster analysis was performed using the method UPGMA and Dice and Pearson coefficients. From the analysis of the gel it was possible to find a considerable variability in the profiles of fingerprinting, which were not homogeneous neither in the number of bands nor in the distribution of these within the gel. In addition, in the course of several months of sampling, the clusters within the dendrograms were not related to the salinity of the ponds sampled and this has been confirmed also for the summer months, when the largest differences between the values of salinity of the ponds were found. Moreover, it emerged by the clustering analysis that the ponds with high salinity didn’t not present in most of the cases a number of bands less than the other sites during the sampling conducted. To render a graphic representation of the bacterial communities evenness, Pareto-Lorenz distribution curves were drawn based on the intensities of bands in the profiles for three months: August 2012, March 2013 and May 2012, respectively characterized by salinity maximum, minimum and intermediate compared to the whole sample period. The functional community redundancy (response to perturbing environmental conditions) is evaluated by the Functional organization index (Fo) considering curves slope. Results for the months of August and May 2012 (35% and 32% respectively) showed communities with medium-low Fo and a high evenness. In other words, due to the elevated concentration of some species and the availability of many others, the community can potentially deal with environmental conditions changes thus preserving its functionality. These results would seem to adapt to the environment of the solar salterns, characterized by high instability of the environmental parameters that only a community with these features would be able to face. In March 2013 the value was of 43%, therefore due to an increase of the potential physical and chemical properties of the sampled sites, there is also an increase of the functional organization of the community. Pareto-Lorenz distribution curves were drawn also for the first two sampling years for the bacterial community of the vascone pond. The functional organization was very different during the years, therefore there was a high variability in the structure of the community in the time. The Moving Window Analysis was performed to evaluate the changes in the structure of the bacterial community in a single ponds between one month and the next. The variability in the composition of community for the various ponds was very high as highlighted also by the analysis of DGGE gel. Statistical analyses NMDS (No metric multidimensional scaling) NMDS method was performed to search for patterns in the set of biological data (viable and total count, DGGE band matrix and Richness) and to assess their relationship with the environmental data (water salinity and temperature, BOD5, pH, dissolved oxygen and chlorophyll pigments). Looking at the diagrams obtained it was possible to observe that they described a sorting scheme characteristic for each sampled site and this result was confirmed also by NMDS to search for patterns in the set of Biodiversity index (richness, Shannon-Wiener index, Simpson index and evenness) and to assess their relationship with the same environmental data of the previous analysis. Weekly sampling At the end of the monthly sampling, we performed weekly ones for three months in different seasons (May 2014, September 2014 and February 2015). In this way it was possible to obtain a comparison of an additional year of sampling at least for a few months and it was possible to detect even the monthly changes for this environment. The data for the month of February 2015 are still being processed. Weekly sampling have confirmed the results obtained with the monthly sampling. It was highlighted a high variability in the composition of bacterial community among the ponds and, the clusters within the dendrograms do not seem related to the salinity of the sampled ponds. In order to understand the relationships between the bacterial communities of a month over the years of sampling, a combined analysis of the gels was performed for the months of May and September. For these it was possible to perform a comparison for all three years of sampling. The dendrograms related to the similarity of the patterns of bands were calculated using the Dice coefficient and UPGMA algorithm with Phoretix 1D software. Observing both dendrograms it can be seen that, with some exceptions, the ponds group between them according to the date of sampling. Therefore the profiles for the various ponds, taken at the same time, are more similar to each other than the profiles obtained for the same pond in the course of three years. Preliminary study on “Saline di Trapani e Paceco” solar saltern In order to make a comparison with a solar saltern still active in the salt production, we have carried out a preliminary study in the “Salina Chiusicella” of “Saline di Trapani e Paceco” solar saltern. Clustering analysis revealed a substantial difference with the results obtained for the “Saline di Tarquinia”. Looking at the dendrograms in fact, it was possible to detect a clear division into different groupings, in relation to salinity values of the sampled ponds. In addition, during the month of September 2014, although in most cases higher salinities were detected than in the month of September 2013, we could observe a greater number of bands in the fingerprinting profiles and therefore a greater bacterial biodiversity. In both sites, it was not possible to draw any conclusion concerning the trend of the number of OTU varying the salinity in these environments. This confirms the complexity of the change in structure of bacterial communities along the salinity gradient and suggests to revalue the role of the domain bacteria in "extreme" environments. Dottorato di ricerca in Ecologia e gestione delle risorse biologiche

Floodplains are among the most valuable and the most degraded ecosystems in Europe. The Kopački rit Nature Park is situated in northeastern Croatia, between courses of the Danube and the Drava Rivers. The appearance of the whole area and rich biodiversity depends on the flooding regime of the Danube River, while the Drava River has much less importance. This area is protected since 1967, and proclaimed as nature park in 1999 on the surface of 231 km2. In 1993 it is listed among wetlands of international importance(Ramsar area). Tradition of hunting the particular wild animal species: red deer (Cervus elaphus), roe deer (Capreolus capreolus) and wild boar (Sus scrofa) in this part of Croatia dates back more than 300 years. Wildlife management with a purpose of breeding, protection and hunting the game animals is carried out since 1781, when this area was part of the large Belje Estate. Through active management over hundred of years a significant growth in population size of game animals has been achieved, and this area became a hunting resort known all over Europe and the world. Nowadays, wildlife management and hunting activities within the boundaries of the Kopački rit Nature Park are implemented according to Croatian nature protection legislation. Main threats to wildlife management are anthropogenic impact, habitat loss or degradation, more frequent occurrence of extreme weather and hydrological events, and water-borne diseases.

Parasitic diseases are permanently present in wild animals living in natural habitats. The giant liver fluke (Fascioloides magna)is one of the most pathogenic helminths parasitizing a number of mammalian species (primarily ruminants), causing a severe health problems, often leading to death. Specific distribution route of this endoparasite from Central towards Southeast Europe mainly follows the inundation area of the Danube River, where the seasonal migration of red deer (Cervus elaphus) is possible, and intermediate host, a freshwater snail (Lymnaea truncatula) is present. The giant liver fluke was firstly discovered in Croatia in January 2000, during liver examination of red deer hunt in the hunting ground located in the floodplain of the Danube River. It can be confirmed that developmental stages of the giant liver fluke were introduced in Croatia by migration of invaded red deer, and by freshwater snails deposited with floods during the high water-level episodes. Appropriate treatment of parasitic disease has been tried but with limited success. The risk of infection is still present, which was confirmed by dissection of the red deer hind found dead in April 2015, when about 60 liver flukes were taken from the liver. Proper application of zoo-hygienic measures in hunting grounds, combined with antiparasitic treatment of free ranging red deer population and captive deer is important to restrain the further spread of fascioloidosis in Croatia.

In this work we studied the bacterial community obtained from water samples collected in Kandalaksha Bay (White Sea), Russia in order to obtain information both at the ecological level and for possible future application in biotechnology. The study has been carried out both on cultivable strains, isolated by traditional methods, and on the total bacterial (Eubacteria) community by molecular methods. The isolates were preliminary investigated in order to understand their temperature preferences then their metabolic competences, including the production of extracellular enzyme activities, were tested for possible further biotechnological applications. Furthermore, a detailed taxonomical study was carried out both on cultivable and total bacterial population Strain isolation and preliminary tests Sea water was sampled in various areas of Kandalaksha Bay. The majority of samples were collected, at minimum tide level using sterile containers, in an intertidal zone pool and from the adjacent water surface. Others, from different offshore locations and depths (0.5, 2.5, 15, 70 m), were taken by scuba divers or boats using Niskin bottles. Water was filtered on membranes in order to obtain both bacteria pure cultures and DNA for molecular to studies. Pure cultures of isolates (ca. 500) were obtained by plate streak method. To discharge evident replicates of same isolates, preliminary tests were carried out considering strain morphological characteristics (shape, color and dimensions), Gram reaction and simple biochemical tests (catalase and oxidase production). This preliminary selection permitted to remove the majority of replicates and to keep 52 isolates. Taxonomical identification of isolates by 16S rDNA 2 Bacterial genomic DNA was extracted from pure cultures and used for amplification of 16S rDNA, to allows taxonomical identification of each isolate. Only 20 strains out of 52 (ca. 38%), showing high identity (99-100%) with a single known microorganism, were identified at species level. All other isolates were identified at the genus level only: for most of them, affiliation was not possible because 98-99% of identity was recorded with various species of the same genus. Moreover 3 strains showed a very low percentage of identity (96-97%). The majority of sequences were phylogenetically related to the genera Pseudomonas and Serratia that are well worldwide distributed. However, only a typical bacteria of cold marine environment Shewanella baltica (KB30) have been revealed. When Blastn analyses supplied uncertain identification, sequences were aligned with highly similar 16S in the Genbank and phylogenetic analysis was performed. To get a confident branch-length, three different trees, Pseudomonas, Serratia and a group containing all the other genera, were inferred. Basing on the results some of the strains were identified with certainty at species level while some others, due to the branch length or the external position, probably belonged to new species. For all other strains identification was possible at genus level only. In many cases this could be due to the scarce informative power of the gene target used to discern the relations below the genus level. Temperature growth profiles The optimal temperatures for growth of the various strains were tested in the range 0-45°C on PCA plates (steps of 5 °C). Most of the strains (42% ca.) showed the optimum at 30°C. The lowest optimum was recorded at 15°C for one strain only (KB75), while the highest was at 40°C (KB22 and KB49). Most of the strains (56%) were able to growth at 0°C while only 25% grew at 45°C.In addition, the majority were able to grow in a rather broad range of temperature. The majority of the isolates (42%) seems to be psychrotrophics while no psychrophiles were detected. Almost all the strains could be considered as eurythermics, 3 indicating adaptation to frequent and wide temperature variations such as those of Kandalaksha Bay. Moreover, it was evident that many KB strains had wider ranges of growth if compared with same species described in literature; optima were also different. Extracellular enzyme activity The strains where submitted to plate screening for the production of various extracellular enzyme activities (amylase, cellulase, chitinase, pectinase, phosphatase, protease, urease, lipases), at their optimal temperature, in order to obtain metabolic information and to find new microorganisms for possible applications. Lipases, phosphatase and protease were common (ca. 54% and 44% of the isolates, respectively). Pectinase and amylase were present in about 32 % of the strains, while chitinase and urease were detected in a limited number of isolates (17% both); cellulase was not detected. Organisms producing large halos of activity were considered as possible high producers and could be further investigated for biotechnological application. However, none of the isolates produced all the tested activities and a rather large number of strains (17%) produced no activity at all. The results of the screening could be useful also at ecological level. In fact, the isolates producing a limited number of enzymes could be considered as specialized, while those with more diversified enzymatic competence, showing a higher eco-nutritional versatility, are probably advantaged in the harsh White Sea environment. Metabolic competences by BIOLOG system The BIOLOG system was used to test the metabolic competences of the strains by their ability to use different compounds as carbon sources. The system is able to detect the oxidation of 95 compounds (including sugars, fatty, organic amino and acids), used by microorganisms as sole carbon sources.In our case, amino acids were generally the preferred compounds: the most utilized carbon sources were L-Glutamic Acid and L-asparagine (96% of strains). Also use of sugars was, as expected, rather common, being α-D-Glucose oxidized by ca. 92%of strains. The information obtained by BIOLOG could be considered as an index 4 regarding the strain metabolic complexity. A small number of strain apparently showed a rather simple metabolism being using a limited number of carbon sources and only few showed a very diversified metabolic competence. However, the majority of the bacteria tested used about 30-50 compounds showing medium-high competence. In general, the strains able to use a wide array of carbon sources were also able to produce diversified extracellular enzyme patterns confirming their high eco-nutritional versatility. Study on the total bacterial (Eubacteria) community In order to have a complete overview of the bacterial community structure, by a cultivation-independent approach, total DNA was extracted from the filter-membranes. The bacteria biodiversity was studied by PCR-TGGE fingerprinting of partial 16S-rRNA gene amplicons. TGGE band patterns were normalized, compared and clustered. showed The community structure was revealed by the cluster analysis of the fingerprints. Samples collected both from the intertidal zone and the nearby sea surface, grouped together (80% similarity). Samples from open sea clearly clustered away. This was particularly evident for the sample collected at -70 m, which branched away at only 40% similarity. TGGE gel images allow the analysis of band patterns generated from the environmental samples representing the various species present in the community. A single species is identified by a single band and the relative abundance of a single species is determined by the band intensity. Among the KB samples, a total of 70 different banding positions (band classes) were detected. The average number of bands per sample was 26 with a maximum of 30 in the samples from open sea. Simpson's Diversity Index calculated for all the samples showed very high level of diversity. Based on the total number of bands in each TGGE pattern and the relative temperature gradient, range-weighted richness indexes (Rr) were calculated and indicated a very high community biodiversity. Relative bands intensities were also calculated and expressed as percentages of the total band intensity in each TGGE lane. To render a graphic representation of the bacterial communities evenness, Pareto-Lorenz distribution curves were drawn based on the intensities. 5 The functional community redundancy (response to perturbing environmental conditions) is evaluated by the Functional organization index (Fo) considering curves slope. Results showed a balanced community with medium Fo and a medium evenness. In other words, due to the elevated concentration of some species and the availability of many others, the community can potentially deal with environmental conditions changes thus preserving its functionality. Prominent TGGE bands were excised from the gel, re-amplified and sequenced, to obtain the identities of the community predominant populations. Sequences phylogenetic analysis, showed a great presence of α-proteobacteria (16 sequences out of 27) with some γ-proteobacteria and some actinobacteria too. Some cyanobacteria were revealed also. Among α -proteobacteria strains can be affiliated mainly to the genus Roseobacter and one sequence was related to Ruegeria. All γ-proteobacteria showed highly similarity with the species of Cobetia marina, while all the cyanobacteria were unknown. Taxonomic results obtained by the total community study were quite different from those gained by the pure cultures: the pure culture strains were completely different (genera and species) from those by 16S rDNA analysis. This could be explained by the limits of TGGE technique. In fact, due to the bias introduced by the PCR reaction, this methodology can only detect bacteria representing at least 1% of the total community. It is possible that some species, even if present in a very low percentage, had prevailed due to favorable culture conditions of the isolation procedures. However, it is known that a large number of marine bacteria are uncultivable. Another important information was that some bands showed very low sequence identity if compared with sequences present in the database, suggesting the possible presence of unknown bacteria. Study on Pseudomonas species present in the community In the TGGE gel relative to the total bacterial community, no Pseudomonas species were revealed. By contrast, the majority (ca. 45%) of the cultivable KB strains were affiliated to 6 this genus. In order to find possible explications to this apparent incongruity, further TGGE analyses have been carried out focusing on Pseudomonas. Thus, total DNA was used for PCR-TGGE fingerprinting of partial 16S-rRNA gene amplicons using specific primers for the amplification of this Genus and different temperature gradients. Again, prominent TGGE bands, excised from the gel, were re-amplified and sequenced. The phylogenetic analysis showed that only 6 sequences out of 22 can be affiliated to Pseudomonas. Although the primers used were specific for this genus, possible amplification of other similar 16S rDNA (in particular γ-proteobacteria) could occur. In fact, a big cluster, comprising the majority of the sequences, showed very low similarity with Pseudomonas but high similarity with clones of marine invertebrates symbiotic γ-proteobacteria. It is possible that some new genera and/or species were present in our samples. TGGE patterns were normalized, compared and clustered as reported for the total bacteria community. Cluster analysis of the fingerprints was similar to that obtained for total community. However, in this case sample collected at -70 m, was even more clearly separated from all the others samples: similarity was only 20%. Analysis of bands number allowed to detect a total of 26 different banding positions All the statistical indexes, discussed for total bacteria and related to community diversity and organization, in this case are meaningless because they would refer only to a limited portion of the entire population. To the best of our knowledge, this work represents the first and extensive study carried out on Kandalaksha Bay bacterial community. In questo lavoro di tesi è stata studiata la comunità batterica di campioni di acqua marina prelevati nella Baia di Kandalaksha (Mar Bianco), Russia. Lo studio è stato condotto con lo scopo di ottenere informazioni a livello ecologico ma anche per possibili applicazioni biotecnologiche. Per queste ragioni sono stati analizzati sia i ceppi isolati con metodi di microbiologia tradizionale sia la comunità batterica totale con metodi di biologia molecolare. Sui ceppi isolati sono stati condotti studi sulle preferenze di temperatura per la crescita e sulle competenze metaboliche, quali produzioni di enzimi extracellulari, per possibili applicazioni. Inoltre una dettagliata analisi tassonomica è stata condotta sia sui ceppi coltivabili che sulla comunità totale. Isolamento dei campioni e test preliminari I campioni di acqua marina sono stati prelevati in varie zone diella Baia di Kandalaksha. La maggior parte di essi sono stati ottenuti da una pozza di acqua formatasi dal ritirarsi delle acque nella zona intertidale e dalla superficie del mare ad essa adiacente. Altri campioni, da differenti punti a largo sono stati prelevati con bottiglie Niskin a varie profondità (0.5, 2.5, 15, 70 m). L’acqua è stata poi filtrate e i filtri sono stati utilizzati per l’isolamento di colture pure e per studi di biologia molecolare. Gli isolati ottenuti in coltura pura per strisciamento (ca. 500) sono stati sottoposti a scrematura. Per scartare eventuali doppi ceppi sono state osservati forma, colore e aspetto delle colonie e vari test, tra cui colorazione di Gram e test per catalasi e ossidasi, sono stati effettuati. Questa selezione ha permesso di ottenere 52 ceppi finali che sono stati mantenuti per i successivi studi. 2 Identificazione tassonomica dei ceppi tramite il gene del 16S rRNA Il DNA genomico delle colture pure è stato estratto ed utilizzato per l’ amplificazione del gene del 16S rRNA in modo da permettere l’identificazione tassonomica dei ceppi. Solo 20 ceppi su 52 (ca. 38%) sono stati identificati a livello di specie: infatti mostravano un’alta percentuale di identità con un solo microrganismo. Tutti gli altri ceppi avevano un’identità di circa 98-99% con varie specie dello stesso genere, per questo sono stati identificati solo a livello di genere. Infine 3 ceppi avevano identità molto basse (96-97%). La maggior parte delle sequenze sono state identificate come ceppi dei generi Pseudomonas and Serratia, generi piuttosto ubiquitari, mentre è stato trovato un solo ceppo tipicamente marino Shewanella baltica (KB30). Per i ceppi per cui l’analisi in banca dati non ha permesso un’identificazione certa, è stata effettuata un’analisi filogenetica basata sull’allineamento delle sequenze del 16S con le sequenze più simili presenti in banca dati. Per ottenere una migliore risoluzione sono stati costruiti differenti alberi filogenetici per i generi Pseudomonas e Serratia ed uno per tutti gli altri generi. Sulla base dei risultati alcuni ceppi sono stati identificati a livello di specie mentre altri potrebbero appartenere a nuove specie. Comunque per molti ceppi l’identificazione è stata possibile solo a livello di genere probabilmente a causa di una scarso livello di specie-specificità del gene utilizzato. Temperature ottimali e range di crescita Le temperature di crescita dei vari ceppi sono state testate nel range 0-45°C su piastre di PCA (steps di 5 °C). La maggior parte (42% ca.) mostrava un optimum a 30°C. L’ optimum più basso è stato registrato per il ceppo KB75 (15°C), mentre KB22 e KB49 avevano quello più alto (40°C). Molti ceppi (56%) erano in grado di crescere a 0°C mentre solo il 25% cresceva a 45°C. La maggior parte di essi poteva essere considerato psicrotrofo e quasi tutti erano euritermi, indicando capacità di adattamento alle frequenti e repentine variazioni di temperatura di Kandalaksha Bay. 3 Enzimi extracellulari Con lo scopo di ottenere informazioni metaboliche ed individuare ceppi di interesse biotecnologico, è stato effettuato uno screening in piastra per varie attività enzimatiche extracellulari (amilasi, cellulasi, chitinasi, pectinasi, fosfatasi, proteasi, ureasi, lipasi). Lipasi, fosfatasi e proteasi erano abbastanza comuni (ca. 54% e 44% dei ceppi, rispettivamente). Pectinasi e amilasi erano presenti in circa il 32 % dei ceppi mentre chitinasi e ureasi sono state rilevate in un numero limitato (17%); la cellulasi non era prodotta da nessun ceppo. Alcuni ceppi che hanno prodotto aloni di attività particolarmente grandi possono essere considerati alto-produttori e verranno studiati ulteriormente per eventuali applicazioni biotecnologiche. Dal punto di vista ecologico lo screening ha mostrato la presenza di ceppi che possono essere considerati altamente specializzati perché in grado di produrre un numero limitato di attività, mentre altri, presentando una competenza enzimatica più elevata potrebbero essere ecologicamente avvantaggiati nelle estreme condizioni ambientali presenti nel Mar Bianco. Competenze metaboliche tramite il sistema BIOLOG Il sistema BIOLOG è stato utilizzato per saggiare le competenze metaboliche dei ceppi attraverso la capacità di ossidare differenti composti come fonte di carbonio. Il sistema è in grado di stabilire l’ossidazione di 95 composti, tra cui zuccheri, acidi organici e amino acidi come unica fonte di carbonio. In generale gli amminoacidi erano la fonte preferita: l’acido L-Glutammico e l’Asparagina erano i composti più utilizzati (96% dei ceppi). Anche gli zuccheri, in particolare l’ α-D-Glucosio (92% dei ceppi) erano abbastanza comuni. Sono state inoltre ottenute informazioni sulla complessità metabolica: la maggior parte dei ceppi hanno dimostrato una capacità metabolica elevata in quanto erano in grado di ossidare circa 30-50 fonti. Confrontando i dati con quelli ottenuti per le attività enzimatiche è stato possibile confermare la loro elevata capacità eco-nutrizionale. 4 Studio della comunità batterica(eubatteri) totale La biodiversità della comunità totale è stata studiata con metodi non-colturali tramite la tecnica di PCR-TGGE fingerprinting basata sull’analisi del gene 16S-rRNA. Il DNA totale è stato estratto dalle membrane e frammenti amplificati del 16S sono stati separati tramite elettroforesi su gel di polyacrilammide sottoposto a differente gradiente termico. I profili di banda ottenuti dai vari campioni sono stati analizzati tramite analisi di cluster. I campioni relativi alla pozza d’acqua della zona intertidale e della superficie marina ad essa adiacente sono risultati piuttosto simili mentre i campioni presi a varie profondità raggruppavano in clusters separati, in particolare il campione preso a -70m che presentava un similarità minore al 40% rispetto a tutti gli altri. I profili sono stati poi analizzati per lo studio delle bande che rappresentano le varie specie di batteri presenti nei campione. Sono state individuate un totale di 70 classi di bande in tutti campioni, con una media di 26 nei campioni di zona intertidale ed un massimo di 30 nei campioni di profondità. In tutti i campioni la biodiversità è stata calcolata con l’indice di diversità di Simpson e con l’indice di ricchezza ponderata. In entrambi i casi i valori di biodiversità erano molto alti per tutti i campioni analizzati. La rappresentazione grafica delle intensità relative delle bande in ogni area di campionamento è stata effettuata tramite le curve di Pareto-Lorenz. Tramite queste curve è stato possibile anche calcolare l’organizzazione funzionale della comunità (risposta a perturbazioni ambientali): la struttura della comunità è risultata piuttosto equilibrata e con un valore medio-alto di organizzazione funzionale. Le bande preminenti presenti dei vari profili sono state escisse, riamplificate e sequenziale per ottenere l’affiliazione tassonomica delle specie tramite costruzione di alberi filogenetici. L’analisi ha permesso di individuare una grande presenza di α-proteobatteri (16 sequenze su 27) tra cui principalmente batteri appartenenti al genere Roseobacter. Erano presenti anche specie di γ-proteobatteri tutte riconducubili alla specie Cobetia marina. E’ stata rilevata anche una sequenza relativa agli attinobatteri e alcune relative a vari ciano batteri non coltivabili. In 5 generale alcune bande avevano una similarità bassa con le specie presenti nell’albero. E’ dunque possible ipotizzare la presenza di nuove specie. Studio delle specie di Pseudomonas presenti nella comunità Vista la grande presenza tra i ceppi coltivabili di specie di Pseudomonas, un ulteriore analisi della comunità tramite PCR-TGGE è stata effettuata utilizzando primers specifici per questo genere. Le bande preminenti sono state amplificate, sequenziate e utilizzate per l’analisi filogenetica. Solo 6 sequenze su 22 sono state affiliate a Pseudomonas: nonostante i primers fossero specifici per questo genere tuttavia possono portare all’amplificazione di 16S simili come quelli di altri γ-proteobatteri. L’analisi di cluster dei profili di banda anche in questo caso ha evidenziato similarità tra i profili dei campioni presi nella zona intertidale, mentre i campioni di mare profondo erano in gruppi esterni. L’analisi di biodiversità in questo caso non è stata effettuata in quanto si sarebbe riferita solo ad una porzione limitata della comunità totale e dunque non rilevante. Sulla base delle nostre conoscenze, è possibile affermare che questo lavoro rappresenta il primo studio dettagliato della comunità batterica della Baia di Kandalaksha. Dottorato di ricerca in Scienze ambientali