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A exemplo do que ocorre em animais, peptídeos hormonais em plantas desempenham papéis importantes no crescimento, desenvolvimento e defesa. RALF é um peptídeo hormonal ubíquo em plantas que foi primeiramente isolado de folhas de tabaco. Embora não se saiba exatamente sua função, as informações até agora existentes apontam para um envolvimento com aspectos básicos da biologia celular, provavelmente alongamento celular. Peptídeos RALF em Arabidopsis são encontrados em uma família multigênica de 37 membros. Plantas transgênicas superexpressando o AtRALF1 sob o controle do forte promotor constitutivo 35S, mostram um fenótipo semi-anão e inibição do crescimento das raízes. Um fenótipo semelhante também foi observado quando o AtRALF23 foi superexpresso. O AtRALF23, ao contrário do AtRALF1, tem sua expressão inibida por brassinosteróides. Esses fatos sugerem que diferentes peptídeos hormonais RALF, apesar de convergirem para a mesma função, apresentam uma relação individualizada com outros hormônios. O objetivo desse trabalho foi contribuir para a determinação da função dos peptídeos RALF em plantas e para o esclarecimento da inter-relação existente entre eles e os demais hormônios vegetais. Para tal, selecionou-se as isoformas AtRALF1 e AtRALF34 com base em semelhança/dessemelhança estrutural e padrão de expressão. Plantas silenciadas e com altos níveis de expressão para ambos os genes foram obtidas e avaliadas. A construção gênica AtRALF1-GFP foi inserida em Arabidopsis sob o controle do promotor 35S e foi observada fluorescência no retículo endoplasmático, complexo de Golgi e apoplasto. Genes anteriormente reportados como induzidos em plantas 35S:AtRALF1 foram validados e utilizados em experimentos com o AtRALF1 e o brassinolide. O conjunto dos resultados sugere um efeito antagônico do peptídeo AtRALF1 com relação ao efeito do brassinolide no alongamento de hipocótilos e raízes. Plantas com altos níveis de AtRALF1 são resistentes a aplicação exógena de brassinolide, não exibindo as respostas características do hormônio esteróide. O antagonismo entre os dois hormônios também foi sugerido pela análise da expressão de genes que são induzidos por AtRALF1 e brassinolide. Like in animals, plant peptide hormones play important roles in growth, development and defense. RALF is a peptide hormone ubiquitous in plants that was first isolated from tobacco leaves. Although its function has not been established, the information gathered so far suggest its involvement with basic aspects of cellular biology, probably cellular elongation. RALF peptides in Arabidopsis are found in a multigene family of 37 members. Transgenic plants overexpressing AtRALF1 under the control of the strong constitutive promoter 35S, show a semi-dwarf phenotype and root growth inhibition. A similar phenotype was also observed when AtRALF23 was overexpressed. AtRALF23, as opposed to AtRALF1, is inhibited by brassinosteroids. These facts suggest that different RALF peptide hormones, despite the convergence to the same function, show a unique relationship with other hormones. The goal of this work was to contribute to the determination of the function of RALF peptides in plants and to clarify the inter-relationship between RALF and the other plant hormones. With that in mind, the isoforms AtRALF1 and AtRALF34 were selected based on primary structure similarity/dissimilarity and pattern of gene expression. Plants with high levels of expression or silenced for both genes were obtained and evaluated. The gene construct AtRALF1-GFP was introduced in Arabidopsis under the control of the 35S promoter and fluorescence was observed in the endoplasmic reticulum, Golgi apparatus and apoplast. Genes previously reported as induced in 35S:AtRALF1 plants were validated and used in AtRALF1 peptide and brassinolide experiments. Taken together our results suggest an antagonistic effect of the peptide AtRALF1 regarding the elongation effect of brassinolide in hypocotyls and roots. Plants with high levels of AtRALF1 are resistant to exogenously applied brassinolide, and do not show typical responses to the steroid hormone. The antagonism between the two hormones was also suggested by the gene expression analysis of the AtRALF1 and brassinolide inducible genes.

As plantas desenvolveram diferentes mecanismos para reduzir o ataque de insetos, incluindo compostos protéicos de defesa, como os inibidores de proteinases (IPs). Os insetos, ao longo da evolução, desenvolveram estratégias para superar as barreiras defensivas das plantas, permitindo a sua alimentação e desenvolvimento, como a super expressão de genes de enzimas digestivas sensíveis e insensíveis aos IPs de plantas. Uma das abordagens desse trabalho foi identificar novas serinoproteinases no intestino de lagartas de Spodoptera frugiperda. Duas novas quimotripsinas e trê novas tripsinas foram identificadas e juntamente com mais 10 genes já conhecidos que codificam estas enzimas foram submetidos à análise de expressão gênica por PCR em tempo real. Entre essas duas famílias de serinoproteinases (SPs) os genes que codificam as quimotripsinas apresentam uma regulação positiva mais ampla do que aqueles que codificam as tripsinas. Estudos de modelagem molecular das quimotripsinas também foram realizados. Foram construídos modelos tridimensionais à partir de modelagem por homologia além de análises de dinâmica molecular e docagem com oito diferentes IPs do tipo Bowman- Birk. Os resultados mostram quais quimotripsinas apresentam as maiores afinidades aos inibidores testados de maneira geral e individual, inferidos à partir da estimativa de energia livre do sistema. Também foi encontrada uma serina extra próxima ao sítio catalítico de três quimotrispsinas modeladas que pode interferir na afinidade dessas enzimas já que este aminoácido apresenta perda de área acessível ao solvente quando complexada ao IP de soja testado. Os resultados de expressão gênica e grau de sensibilidade foram comparados e não se observou qualquer relação entre esses parâmentros. Isso sugere que as lagartas da espécie S. frugiperda combinam diferentes estratégias adaptativas como o aumento de expressão de todas as suas quimotripsinas independentemente do grau de sensibilidade das enzimas. Plants have developed different mechanisms to reduce insect attack, including defence proteins such as proteinase inhibitors (PIs). In turn, insects have evolved strategies to overcome these plant defence mechanisms, such as the hyperexpression of PI-sensitive and insensitive digestive enzymes, allowing the insect to thrive. One of the aims of this work was to identify new serine proteinases (SPs) in the gut of the fall armyworm larvae, Spodoptera frugiperda. Two new chymotrypsins and three new trypsins were identified, and together with 10 previously identified genes, the genes that encode these enzymes were subjected to real-time PCR and gene expression analysis. Between these two families of serine-proteinases the genes that encode chymotrypsins show a greater positive regulation then those encoding the trypsins. Molecular modelling studies of the chymotrypsins were carried out, and 3D models were generated using homology modelling, which were then further refined by dynamic molecular and docking analyses with 8 different Bowman-Birk type PIs. The results demonstrate which chymotrypsins possess the highest affinities to the tested inhibitors in a general and individual manner, inferred from the estimated free energies. A serine residue in very close proximity to the catalytic site was present in three of chymotrypsins investigated, which may be affecting the enzymes affinity since the residue has a reduced accessible area to the solvent when complexed to the soya PI tested. The genetic expression patterns and the degree of PI-sensitivity were also compared and no relation between the parameters was found. This suggests that the larvae of the species S. frugiperda combine different adaptive strategies like the increase in expression of its entire chymotrypsin arsenal regardless of the degree of PI-sensitivity of the enzymes.

Nos organismos eucariotos, aproximadamente 50% das proteínas traduzidas no citoplasma são transportadas para as organelas, onde irão desempenhar suas funções. Com isso, surgiu um intricado sistema de transporte intracelular de proteínas. Nas plantas, a presença de uma segunda organela endossimbionte, o plastídio, tornou este sistema mais complexo e gerou demanda adicional por transporte. Ainda, grande maioria das proteínas mitocondriais e plastidiais são codificadas por genes nucleares e importadas do citosol. O dogma uma proteína-uma localização foi associado ao conceito de um gene-uma proteína na biologia celular. Entretanto, proteínas individuais podem ter mais de uma função, e mais recentemente, proteínas codificadas por um único gene foram identificadas em mais de um compartimento subcelular, o que deu origem ao conceito de duplo direcionamento (DD). Um exemplo bem estudado de DD vem das proteínas da família das aminoacil-tRNA sintetases (aaRS), que participam da síntese protéica ao acoplar o aminoácido ao seu tRNA cognato. Dentre as aaRSs, a glutamil-tRNA sintetase citosólica (GluRS), através de sua extensão N-terminal, parece estar envolvida com outras funções além da tradução. Em Arabidopsis thaliana, há dois genes nucleares que codificam a GluRS, um para uma proteína de duplo direcionamento (DD) e outro para uma proteína citosólica. Resultados recentes em nosso laboratório mostraram que a GluRS citosólica pode estar relacionada ao controle da localização subcelular de proteínas organelares em Arabidopsis. Para verificar um eventual papel desta proteína na localização subcelular de outras proteínas, foram realizados ensaios de duplo-híbrido em levedura, os quais mostraram interação entre a GluRS e a glutamina sintetase (GS) de Arabidopsis thaliana, proteína de DD para mitocôndrias e cloroplastos Esta interação foi confirmada in planta, sendo a sequência da GluRS responsável pela interação localizada na região N-terminal, do resíduo 207 ao 316. Análises filogenéticas apontam que esta região encontra-se ausente nas bactérias e que originou-se provavelmente em Archea, entre 2,6 e 1,8 bilhões de anos. Além disso, observa-se que esta sequência é conservada em fungos, musgos e plantas vaculares, tendo originado-se em Arabidopsis há cerca de 2 bilhões de anos. In eukaryotic organisms, about 50% of cytoplasmic translated proteins are transported to the organelles, where they can play their roles. Thus, a complex system for intracellular transport was established. In plants, the presence of a second endosymbiont organelle, the plastid, turned this system still more intricated and required an additional transport mechanism. Besides, most of organellar proteins are coded by nuclear genes and imported from the cytosol. The one protein-one localization was associated to the idea of one gene-one protein, which has long been established in molecular biology. However, individual proteins can show more than one function, and recently, proteins coded by one single gene were identified in more than one subcellular compartment, which has originated the concept of dual targeting. One of the most studied example of dual targeted proteins is the aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) family, which are related to protein synthesis by attaching the correct amino acid onto the cognate tRNA molecule. Among the aaRSs, cytosolic glutamyl-tRNA synthetase (GluRS), through its N-terminal extension, seems to be involved in other cellular role beyond translation. In Arabidopsis thaliana, there are two genes encoding GluRS, one for a dual-targeted protein and other for a cytosolic protein. Recent results in our laboratory showed that GluRS interacts with proteins destinated to other organelles, which suggest that this protein might have a role in interfering on protein localization in Arabidopsis. In order to gain some information on the role of this protein in subcellular localization, yeast two-hybrid assays were performed. These studies showed the interaction between GluRS and glutamine synthetase (GS), a mitochondrial and chloroplastic dual-targeted protein. This interaction was confirmed in planta. In addition, the GluRS sequence associated to protein interaction was localized at its N-terminal portion, between the residues 207 316. Phylogenetic analysis revealed that this region is absent in bacteria and it probably arose from Archea between 2.6 and 1.8 billion years ago. Also, this sequence is conserved in fungi, moss and all the green plants investigated. Finally, datation analysis showed that this sequence arose in Arabidopsis between 2 and 1.7 billion years ago.

Rapid Alkalinization Factor (RALF) pertence a uma crescente família de peptídeos com características hormonais em plantas. Inicialmente isolado de folhas de plantas de tabaco, peptídeos RALF podem ser encontrados em todo reino vegetal e são expressos em plantas ubiquamente. Plantas de cana-de-açúcar apresentam quatro isoformas dos genes SacRALF e foi identificado que o gene SacRALF1 é expresso predominantemente. Transcritos de SacRALF1 são abundantes nas zonas de elongação de pontas de raízes, e todos os quatro genes SacRALF são mais expressos em folhas jovens e em expansão do que em folhas expandidas. Nos limbos foliares, transcritos dos genes SacRALF foram encontrados em alta concentração na parte basal da folha e baixa concentração na porção apical. O conjunto das análises de expressão gênica neste estudo sugerem que a expressam dos genes SacRALF está localizada nas zonas de elongação de raízes e folhas. Folhas maduras, que são desprovidas de células em elongação, não mostraram expressão considerável dos genes SacRALF. Culturas de suspensão celular embriogênica de cana-de-açúcar mostraram um nível constitutivo de transcritos de genes SacRALF. O peptídeo SacRALF1 foi adicionado ao meio de cultura e inibiu o crescimento de microcalli derivado de culturas de suspensão celular em concentrações tão baixas quanto 0,1 µM. Microcalli expostos ao SacRALF1 exógeno mostraram um número reduzido de células elongadas. Os resultados obtidos sugerem que os peptídeos RALF possuem uma função no desenvolvimento de plantas, particularmente na elongação celular. Rapid Alkalinization Factor (RALF) is part of a growing family of peptides with hormone characteristics in plants. Initially isolated from leaves of tobacco plants, RALF peptides can be found throughout the plant kingdom and they are expressed in plants ubiquitously. Sugarcane plants have four isoforms of SacRALF genes and SacRALF1 isoform is expressed predominantly. SacRALF1 transcripts are abundant in the elongation zone of root tips and all four SacRALF genes are more expressed in young and expanding leaves than in expanded leaves. In leaf blades, SacRALF gene transcripts were found at high levels at the basal portion of the leaf and at low levels at the apical portion. The whole set of gene expression analyses showed in this study, suggest that SacRALF genes expression is localized in elongation zones of roots and leaves. Mature leaves that are devoid of elongating cells do not show considerable expression of SacRALF genes. Sugarcane embryogenic cell suspension cultures showed a nearly constitutive level of SacRALF gene transcripts. SacRALF1 peptide was added to culture media and inhibited the growth of microcalli derived from cell suspension cultures at concentrations as low as 0.1 µM. Microcalli exposed to exogenous SacRALF1 showed a reduced number of elongated cells. The findings suggest that RALF peptides have a role in plant development, particularly in cell elongation.

RALFs são peptídeos hormonais de aproximadamente 5kD que regulam negativamente o alongamento celular. Dentre suas atividades biológicas, a alcalinização do meio extracelular e a inibição do alongamento celular são tidas como associadas, pois a acidificação do meio extracelular é necessária para a expansão celular. A atividade de alcalinização e a de inibição do crescimento são medidas em dois ensaios distintos: o ensaio de alcalinização do meio extracelular de células em suspensão e o ensaio do crescimento de raiz primária de plantas jovens. Buscando-se fazer ambas as avaliações da inibição da expansão celular e da alcalinização em um único modelo de estudo, tomou-se como medida da expansão celular o volume das células decantadas (VCD). Quando o tampão MES ou o pré-tratamento com \"Fusicoccin\" foi utilizado para se atenuar o efeito de alcalinização do AtRALF1, verificou-se que o efeito de inibição do alongamento celular não sofreu alteração. Em arabidopsis são encontrados nove peptídeos RALF, que apresentam alta similaridade com o RALF original de tabaco. Com exceção do AtRALF4, todos são capazes de alcalinizar o meio extracelular e inibir raízes. A comparação da estrutura primária do AtRALF4 com os demais RALFs mostra que poucos resíduos são distintos entre eles, sugerindo que estes possam ser os determinantes das atividades de inibição e alcalinização. A alteração de um destes resíduos, AtRALF4(N92A), é capaz de restaurar a capacidade do AtRALF4 de inibir as raízes sem, no entanto, recuperar a atividade de alcalinização. Quando três outros resíduos exclusivos do AtRALF4 foram substituídos pelos seus correspondentes do AtRALF1, observa-se uma restauração parcial da alcalinização, desta vez, sem alterar a capacidade de inibir as raízes. Recentemente, foi mostrado pelo nosso grupo que o peptídeo AtRALF1 induz a expressão de genes relacionados ao rearranjo da parede celular. Quando verificado por PCR quantitativa, contatou-se que somente os peptídeos mutantes que apresentam atividade de inibição do crescimento são capazes de promover uma indução semelhante. Ainda, utilizando gel indicador de pH, verificou-se que plantas transgênicas super-expressando AtRALF1 (35S:AtRALF1) acidificam o meio durante seu crescimento de maneira semelhante a plantas selvagens. O peptídeo de defesa AtPEP1, a exemplo dos peptídeos RALF, também promove a alcalinização do meio extracelular. A utilização de drogas para reproduzir ou atenuar o efeito de alcalinização promovido por este peptídeo sugere que a expressão dos genes responsivos a AtPEP1 também não está relacionada à alteração na atividade das próton-ATPases. Finalmente, quando mutantes para ambos os receptores de AtPEPs foram utilizados (atpepr1/r2) em gel indicador de pH, verificou-se que estes alcalinizam o pH da rizosfera na presença do peptídeo. Nossos dados somados sugerem uma dissociação das atividades biológicas de alcalinização do meio extracelular e de inibição da expansão celular. A alteração na atividade das próton-ATPases pode não ser apenas uma mensagem secundária do efeito biológico, mas sim outra fonte de informação independente e ainda pouco explorada como tal. RALFs are 5kD peptide hormones that negatively regulates cell expansion. Among the biological activities of the RALF peptide, the extracellular alkalinization and cellular expansion inhibition were previously suggested to be associated, once the extracellular acidification is required to cell expansion. Usually, the alkalinization and cell expansion inhibition activities are evaluated in two different assays, the cell suspension medium alkalinization and the plantlet root growth inhibition. We manage to set an assay in which both cell expansion inhibition and extracellular alkalinization activities could be evaluated. Using the package suspension cell volume through decantation as a value of cell expansion, we evaluated the relation between alkalinization and cell expansion inhibition in different conditions. When the MES buffer or the pre-treatment with Fusicoccin was used to arrest the AtRALF1 extracellular alkalinization, the package cell volume inhibition activity was not affected. There are 9 RALF peptides encoded in arabidopsis plants that are closely related with the first isoform isolated from tobacco. With exception of the AtRALF4, all those isoforms are able to alkalinize the extracellular medium and arrest root growth. Comparing the AtRALF4 with other eight isoforms, we verified that are few different amino acids between them, suggesting that those amino acids could be essential for the biological activities. The rescue of one of those amino acids, AtRALF4(N92A), was able to regain the root growth inhibition activity of the AtRALF4 peptide, although the extracellular alkalinization activity was not restored. When three other AtRALF4 amino acids were substituted by their AtRALF1 correspondent, there is a partial rescue of the extracellular alkalinization activity, but no alterations in the root growth inhibition. We had recently shown that the AtRALF1 peptide induces the expression of genes related to cell wall rearrangement. The quantitative PCR analyses demonstrates that only the mutant peptides that are able to arrest root growth are also able to induce the gene expression. When submitted to a pH indicator, it was verified that AtRALF1 overexpressing plants acidifies it during its growth, as much as wild type plants.The defense peptide AtPEP1, similarly of AtRALF1, also triggers extracellular alkalinization. The use of proton-pump chemical modulators to simulate or arrests AtPEP1 extracellular alkalinization activity suggests that the gene expression of the AtPEP1-responsive genes is not related to changes in plasma membrane proton pump activity. Finally, when double mutants for both the AtPEP1 receptors (atpepr1/r2) were submitted to a pH gel indicator, it was seen that they alkalinize the rhizosphere pH in the presence of the AtPEP1 peptide. Our data suggests that the extracellular alkalinization and arrest of cell expansion activities are dissociated. The proton pump modulation activity may not be only a secondary messenger, but another source of information independent and yet to be explored.

Os peptídeos hormonais vegetais, que vêm sendo caracterizados em plantas desde a década de 90, podem estar relacionados com defesa, reprodução, crescimento e desenvolvimento de plantas. O peptídeo RALF (Rapid Alkalinization Factor), ubíquo no reino vegetal, está envolvido com o desenvolvimento de plantas. Em arabidopsis há 37 genes que codificam peptídeos RALF (AtRALFs). A isoforma mais estudada é a AtRALF1, a qual regula de maneira negativa a expansão celular, inibindo o crescimento de raiz primária e o alongamento de hipocótilo quando aplicado exogenamente. Recentemente, demonstrou-se a existência de uma relação antagônica entre AtRALF1 e a via de brassinosteróides (BRs) no desenvolvimento de raízes. Quando mutantes da via de sinalização do BR foram avaliados quanto a sua resposta ao peptídeo AtRALF1, descobriu-se que mutantes para o receptor quinase1 associado ao BRI1 (bak1) são insensíveis a AtRALF1. Experimentos utilizando o sistema de duplo híbrido em levedura, a co-imunoprecipitação e a indução de genes marcadores em mutantes bak1 foram realizados e confirmaram o envolvimento da proteína BAK1 na percepção do peptídeo. Plantas transgênicas que superexpressam AtRALF1 apresentam um fenótipo semi-anão, no entanto, quando as mesmas foram cruzadas com o mutante bak1, suas progênies apresentaram um fenótipo similar ao de plantas selvagens. Ainda, quando plantas deste cruzamento foram novamente cruzadas com plantas selvagens, plantas com fenótipo semi-anão foram observadas na prole. Ensaios de ligação usando o peptídeo AtRALF1 marcado com éster de acridínio foram realizados e mostraram que em mutantes bak1, a ligação do AtRALF1 é menor em aproximadamente 30% quando comparada com plantas selvagens. Os dados obtidos mostram que a proteína BAK1 interage fisicamente com o AtRALF1, está envolvida na percepção do peptídeo, é essencial para a inibição do crescimento da raiz primária causada pelo AtRALF1 e é necessária para a indução dos genes responsivos ao AtRALF1. The plant peptides, which have been characterized in plants since the 90\'s, can be related to defense, reproduction, growth and development of plants. The RALF (Rapid Alkalinization Factor) peptide, ubiquitous in the plant kingdom, is related to the development of plants. In arabidopsis plants, there are 37 genes encoding RALF peptides (AtRALFs). AtRALF1 is the most studied isoform, which negatively regulate cell expansion, inhibiting primary root growth and hypocotyl elongation when it is applied exogenously. Recently, an antagonistic relationship between AtRALF1 and the brassinosteroids (BRs) to control root development had been demonstrated. When the response of mutants related to the BR signaling pathway to AtRALF1 peptide was investigated, it was found that mutants lacking the BRI1-associated receptor kinase1 (bak1) are insensitive to AtRALF1. Experiments using the two-hybrid system in yeast, co-immunoprecipitation, and the induction of marker genes in bak1 mutants were carried out, and confirmed the involvement of the BAK1 protein in the perception of AtRALF1 peptide. Transgenic plants overexpressing AtRALF1 are semi-dwarf. However, when those transgenic plants were crossed with bak1 mutant, their progeny showed a wild-type phenotype. Besides, when plants from this progeny were crossed again with wild-type plants, semi-dwarf phenotype plants were obtained in the offspring. Binding assays using AtRALF1 labeled with acridinium-ester were performed, and showed that in bak1 mutants, the AtRALF1 binding was reduced approximately 30% when compared to wild-type plants. All data indicate that BAK1 protein interacts physically with AtRALF1, it\'s involved with the peptide perception, essential for the primary root growth inhibition caused by AtRALF1, and required to the induction of genes responsive to AtRALF1.

Plantas de Citrus regeneradas de tecidos juvenis demandam um longo período para a análise do fenótipo resultante em flores ou frutos. Este trabalho apresenta o mutante espontâneo de florescimento precoce de laranja doce, denominado \'x11\', como modelo para estudos de genômica funcional de Citrus. As frutas cítricas são ricas em carotenoides, pigmentos que possuem grande valor nutricional, como pró-vitamina A (?- ou ?-caroteno). Estudos de genômica funcional envolvendo genes da via biossintética dos carotenoides terão resultados rapidamente obtidos utilizando-se variedades com florescimento e frutificação precoce, como a laranjeira doce mutante \'x11\'. A laranjeira doce \'Sanguínea-de-Mombuca\' (SM) é uma variedade de polpa vermelha que acumula licopeno na polpa dos frutos, podendo ser considerada uma importante ferramenta no estudo da acumulação de carotenoides nos frutos de laranjeiras. Desta maneira, o objetivo deste estudo foi estabelecer a laranjeira \'x11\' como planta-modelo em experimentos de transformação genética visando estudos de genômica funcional dos genes PSY (fitoeno sintase), PDS (fitoeno desaturase), CRTISO (carotenoide isomerase), LCY-b (licpeno ?-ciclase) e ?-caroteno hidroxilase (HYb), envolvidos na biossíntese de carotenoides e utilizar a laranjeira SM como ferramenta no entendimento da acumulação dos carotenoides nos frutos de Citrus. Plantas de laranjeira \'x11\' foram transformadas com promotor de expressão preferencial para órgãos reprodutivos de Citrus controlando a expressão de gene repórter (gusA) para a análise da tecido especificidade. Foi realizada a otimização do protocolo de transformação genética de segmentos de epicótilo de laranjeira \'x11\' via Agrobacterium. A eficiência de transformação média foi de 18,6%, mas atingiu 29,6% no protocolo otimizado. Das 270 brotações positivas, cinco foram microenxertadas e aclimatizadas. Quatro dessas plantas exibiram as primeiras flores em três meses após o estabelecimento ex vitro, e a outra, dois meses mais tarde, independentemente da época do ano. A coloração histoquímica da atividade do gene gusA foi realizada em segmentos de caule, flores e frutos de plantas transgênicas aclimatizadas, com 5-7 meses de idade, confirmando a expressão constitutiva do gene gusA nesses órgãos. As plantas transformadas com a construção para o teste do promotor de expressão preferencial para órgãos reprodutivos de Citrus continuam em fase de desenvolvimento. Em seguida foi realizada a transformação genética de laranjeira \'x11\' para a superexpressão dos genes PDS e LCY-b1 e para a superexpressão do gene LCY-b1 e HYb em laranjeira SM. Também foi realizada a transformação genética de \'x11\' para o silenciamento do gene CRTISO e HYb e também para o silenciamento do gene CRTISO, em SM. A quantificação da expressão do gene-alvo em tecido foliar foi correlacionada ao número de cópias do cisgene inseridos em cada planta, revelando que o nível de expressão gênica não foi diretamente ligado ao número de cópias inseridas no genoma. Uma planta de laranjeira \'x11\' superexpressando o gene LCY-b1 frutificou e foi realizada a análise do perfil de carotenoides totais em relação ao fruto de uma planta não transformada. Neste evento houve aumento no teor de carotenoides totais e xantofilas, indicando o potencial da manipulação dos genes codificadores de enzimas da via biossíntese de carotenoides para alterações quantitativas e qualitativas destes pigmentos Considering the perennial developmental phase of Citrus, plants regenerated from juvenile tissues require long period for analysis of the resulting phenotype in flowers or fruits. Herein, we present the spontaneous sweet orange mutant named \'x11\', as a model plant for functional genomics studies in Citrus due to the remarkable feature of early-flowering. Citrus fleshy fruits are rich in carotenoids which are pigments that have great nutritional value, such as pro-vitamin A (?- or ?-carotene). Functional genomics studies involving genes related to carotenoids biosynthesis pathway can be rapid generated by using the early flowering mutant, \'x11\' in sweet orange background. The fleshy fruit from the sweet orange \'Sanguínea-de-Mombuca\' (SM) has a red pulp due to accumulation lycopene that may be considered an important tool to investigate the accumulation of carotenoids in sweet orange fruits. Therefore, the aim of this study was to establish the orange mutant \'x11\'as model plants for genetic transformation and functional genomics analysis of key regulatory genes PSY (phytoene synthase), PDS (phytoene desaturase), CRTISO (carotenoid isomerase), LCY-b1 (licopene ?-cyclase) and ?-carotene hydroxylase (HYb) involved in the biosynthesis of carotenoids and to use the sweet orange SM as a tool in understanding the accumulation of carotenoids in sweet orange fruits. The mutant plants \'x11\' were transformed with gene reporter (gusA) under control of specific promoter for reproductive organs in Citrus for the tissue specificity analysis. We report a procedure for efficient regeneration and transformation using epicotyl segment explants of \'x11\' and Agrobacterium tumefaciens as a proof-of-concept. The average transformation efficiency was 18.6%, but reached 29.6% in the best protocol tested. Among 270 positive shoots, five were micrografted and acclimatized. Four of these plants exhibited the first flowers within three months after ex vitro establishment, and the other, two months later, regardless the period of the year. Transgenic plants harboring specific promoter for reproductive organs in Citrus are still under development. We transformed \'x11\' for overexpression of PDS or LCY-b1 genes, and to overexpress LCY-b1 or HYb in SM sweet orange. \'x11\' was transformed to silence CRTISO or HYb , and CRTISO gene in SM sweet orange. Then, quantification of target gene expression in leaf tissue was performed by correlating this information with the number of copies of cisgene inserted into each plant. According to the results, it is suggested that the level of gene expression is not directly linked to the number of copies inserted into the genome.One transgenic plant of \'x11\' overexpressing LCY-b1 produced flowers and fruits and the carotenoid profile analysis indicated an increased in content of total carotenoids and, especially, xanthophylls, clearly indicating the potential to manipulate expression of genes encoding enzymes of the carotenoid biosynthetic pathway to obtain qualitatively and quantitatively changes of these pigments

Orientador: Michel Georges Albert Vincentz Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O fator de transcrição do tipo basic leucine leucine zipper (bZIP) de Arabidopsis thaliana AtbZIP63 faz parte da via de resposta a carência energética coordenada pelas quinases KIN10/11, integradoras centrais dos sinais relacionados ao estado de privação de energia. O mutante de inserção de T-DNA atbzip63-2 apresenta uma redução do crescimento e desenvolvimento das folhas assim como um atraso do florescimento em comparação ao tipo selvagem (TS, acesso Ws) quando cultivado em fotoperíodo de dia curto (10 h/14 h). Condições de fotoperíodo de dia longo ou luz contínua promoveram uma reversão parcial ou completa, respectivamente, do fenótipo mutante para o tipo selvagem, levantando a possibilidade de que este fenótipo seja o resultado de uma carência energética. Plantas silenciadas para expressão de AtbZIP63 por RNAi apresentaram características similares a do mutante atbzip63-2 confirmando o envolvimento deste fator de transcrição no crescimento. O perfil de expressão gênica e os níveis de alguns metabólitos do mutante atbzip63-2 indicaram que AtbZIP63 participa do controle da degradação do amido, pois a expressão de alguns genes centrais na degradação deste carboidrato de reserva está desregulada neste mutante. Mostramos que as oscilações no nível do transcrito AtbZIP63 são reguladas pelo relógio circadiano e a fase da oscilação do AtbZIP63 é aparentemente influenciada pela disponibilidade de carboidratos na célula. Além de estar sob o controle do relógio, AtbZIP63 também atua como um ativador direto da expressão de PRR7, que codifica um dos componentes chave do oscilador central do relógio. Portanto, evidenciamos uma interação recíproca entre o relógio e AtbZIP63 que possivelmente está impactando o processo de degradação do amido à noite. Este conjunto de evidências revela novos aspectos do ajuste do relógio circadiano pelo status de açúcar na célula que estão de acordo com trabalhos recentes mostrando que os açúcares afetam diretamente o funcionamento do relógio. Nossa hipótese é que o AtbZIP63 está agindo como um mediador entre a disponibilidade de viii açúcar e o mecanismo oscilatório do relógio circadiano de A. thaliana. Adicionalmente, verificamos que o perfil de transcritos no final do dia no mutante atbzip63-2 é diferente do observado no final da noite, sugerindo a participação do AtbZIP63 na regulação de genes envolvidos em redes regulatórias distintas em função do período do dia. Dentre os genes desregulados no atbzip63-2 no final do dia, observamos um enriquecimento para genes relacionados com metabolismo secundário e síntese de trealose, o que sugere a participação do AtbZIP63 na regulação da síntese destes compostos durante o dia, e possivelmente reflete a ocorrência de stress no mutante Abstract: he Arabidopsis thaliana basic leucine zipper domain (bZIP) AtbZIP63 transcription factor is part of the response pathway to energy shortage coordinated by kinases KIN10/11. The T-DNA insertion mutant atbzip63-2 shows a reduction in the growth and development of leaves, as well as a delay in flowering compared to wild type (WT; ecotype Ws), when grown in short-day conditions. Long day or continuous light conditions promoted a partial or complete reversion, respectively, of the mutant to wild-type phenotype, raising the possibility that this phenotype is the result of an energy shortage. Plants silenced for AtbZIP63 showed similar characteristics to the atbzip63-2 mutant, confirming the involvement of this transcription factor in the growth. The gene expression profile and the levels of some metabolites of the atbzip63-2 indicated that AtbZIP63 takes part in the control of starch degradation, regulating the expression of some key genes in starch degradation. Diurnal AtbZIP63 mRNA level fluctuation is regulated by the circadian clock, and the phase oscillation is influenced by the availability of carbohydrates. In addition, to be controlled by the circadian clock, AtbZIP63 directly regulates the expression of PRR7 which encodes one of the key regulators of the core clock. We have therefore identified a reciprocal interaction between the clock and AtbZIP63 which is probably affecting the starch degradation process. This set of evidence reveals new aspects of the entrainment of the circadian clock by sugars, and is consistent with recent studies showing that sugars directly regulate the circadian clock. Our hypothesis is that AtbZIP63 is acting as a mediator between the energy status (availability of sugar) and the oscillatory mechanism of the A. thaliana circadian clock. Additionally, we found that the profile of transcripts at the end of the day in atbzip63-2 mutant is different from that observed in the end of the night, suggesting the involvement of AtbZIP63 in the regulation of genes involved in distinct regulatory networks according to the period of day. Among the genes deregulated in atbzip63-2 at the end of the x day, an enrichment for genes related to secondary metabolism and trehalose biosynthesis was observed. Suggesting the involvement of AtbZIP63 in regulating the synthesis of these compounds during the day, and probably reflects the occurrence of stress in the mutant Doutorado Genética Vegetal e Melhoramento Doutor em Genética e Biologia Molecular

O fator de alcalinização rápida ou RALF (do inglês, Rapid ALkalinization Factor) é um peptídeo hormonal ubíquo que induz a atividade de uma MAP quinase, bem como um aumento rápido do pH extracelular do meio de cultura de células em suspensão. O AtRALF1, uma das 37 isoformas de RALF presentes em Arabidopsis thaliana, é um peptídeo secretado de 5 kDa, que inibe o crescimento radicular e causa uma rápida mobilização de Ca2+ extra e intracelular. Em células eucarióticas, calmodulinas são proteínas bem caracterizadas por mediar a transdução de sinais de Ca2+ intracelular. Entretanto, em várias espécies vegetais incluindo Arabidopsis, também existem relatos de calmodulinas secretadas com funções ainda desconhecidas. Neste trabalho, foi caracterizada a AtCML38, uma proteína de Arabidopsis semelhante a calmodulina e que interage com o peptídeo AtRALF1. Análises in silico e por RT-PCR semi-quantitativo mostram a co-expressão de ambos os genes AtRALF1 e AtCML38 em raízes de plântulas de Arabidopsis. Apesar da ausência de um peptídeo sinal típico na proteína AtCML38, a localização sub-celular demonstra que esta é secretada através da via secretória RE-Golgi. O uso de uma versão truncada da AtCML38, cujos 87 primeiros aminoácidos foram retirados, indicou que o N-terminal é essencial para o seu direcionamento. Por meio de ensaios de complementação fluorescente bimolecular, foi demonstrado que AtCML38 interage com AtRALF1 no apoplasto de folhas de tabaco. Ensaios de pulldown indicam que esta interação é específica e dependente de Ca2+ e do pH. Um mutante por inserção de T-DNA, que não produz a proteína AtCML38 (cml38), mostrou-se insensível ao peptídeo AtRALF1 aplicado exogenamente, e suas raízes cresceram normalmente. Plantas transgênicas de Arabidopsis super-expressando o gene AtRALF1 (35S:AtRALF1) têm um fenótipo semi-anão com pronunciada redução do crescimento radicular. Contudo, quando plantas 35S:AtRALF1 foram cruzadas com o mutante cml38, suas progênies exibiram fenótipo e crescimento radicular normais, apesar do acúmulo do peptídeo AtRALF1. Juntos, os resultados mostram que AtCML38 interage com o peptídeo hormonal AtRALF1, e que a proteína AtCML38 é essencial para inibição do crescimento radicular causado pelo peptídeo. Rapid alkalinization factor (RALF) is a ubiquitous peptide hormone that induces a MAP kinase and a rapid increase in the pH of the extracellular media of cell suspension cultures. AtRALF1, one of the 37 RALF isoforms of Arabidopsis thaliana, is a secreted peptide of 5 kDa that inhibits root growth and causes a rapid mobilization of extra and intracellular Ca2+. In eukaryotic cells, calmodulin proteins are well-characterized to mediate intracellular Ca2+ signal transduction. Nevertheless, in several plant species including Arabidopsis, there are also reports of calmodulins being secreted with still unknown function. In this work, we characterized the AtCML38, a calmodulin-like protein from Arabidopsis as an AtRALF1-interacting protein. Analyses in silico and semiquantitative RT-PCR show co-expression of both AtCML38 and AtRALF1 genes in roots of Arabidopsis seedlings. Despite the fact that AtCML38 lacks a typical signal peptide, subcellular localization demonstrates that AtCML38 is secreted via the ER-Golgi secretory pathway. A truncated AtCML38, without the first 87 amino acids indicates that the N-terminal is essential for targeting. Through bimolecular fluorescence complementation assays, we showed that AtCML38 protein interacts with AtRALF1 in the apoplast of epidermal cells from tobacco leaves. Pull down assays indicate that this interaction is specific, Ca2+- and pH-dependent. A T-DNA insertion mutant defective in the AtCML38 protein (cml38) was insensitive to exogenously applied AtRALF1 peptide and their roots grow just as the wild type plants. Transgenic Arabidopsis plants overexpressing the AtRALF1 gene (35S:AtRALF1) have a semi-dwarf phenotype with a pronounced reduction in the root growth. However, when 35S:AtRALF1 plants are crossed with the mutant cml38, their progenies are normal looking and exhibit normal root growth in spite of the high accumulation of AtRALF1 peptide. Taken together, the results show that AtCML38 interacts with the peptide hormone AtRALF1 and that the protein AtCML38 is essential for the root growth inhibition caused by the peptide.

Proteínas FtsH são metaloproteases pertencentes à família AAA (ATPases Associadas a Diversas Atividades Celulares), e estão presentes em todos os reinos dos seres vivos. Estas proteases utilizam a energia liberada da hidrólise do ATP para desempenhar suas diversas atividades celulares. Em Escherichia coli, as proteases FtsH se organizam em um homohexamero na membrana plasmática, sendo que este complexo atua na degradação de proteínas mal dobradas. Em Arabidopsis, o hetero-complexo FtsH localizado na membrana dos tilacóides é formados por isômeros do tipo A (FtsH1/FtsH5) e do tipo B (FtsH2/FtsH8). Sua atividade proteolítica está relacionada ao controle de qualidade organelar, degradando proteínas mal dobradas e de vida curta. O complexo está envolvido também na degradação da proteína D1 do PSII, danificada por danos foto-oxidativo. Embora as FtsH cloroplastidiais sejam bem caracterizadas em termos genéticos e moleculares, o mecanismo de regulação do complexo ainda não foi esclarecido, o que torna interessante a busca por fatores proteicos adicionais. Em investigações anteriores nosso grupo de pesquisa encontrou um candidato potencial, denominado FIP (FtsH5 Interacting Protein), que pode modular a atividade ATPásica e/ou proteásica do complexo. Fip está presente na membrana dos tilacóides e mostrou interação com FtsH5 in vivo e in vitro. Neste trabalho foram realizados ensaios de duplo híbrido de leveduras, utilizando deleções da proteína FIP, bem como substituições de resíduos de cisteína por alanina. Os resultados revelaram que a interação entre FIP e FtsH5 é mantida somente quando duas regiões ricas em cisteína estão presentes na sequência de FIP. Essa região compreende 46 aminoácidos, com 4 resíduos de cisteína conservados, e ensaios com 7 diferentes substituições desses resíduos por alanina não mostraram interação com FtsH5, o que corrobora a hipótese de que os resíduos de cisteína são necessários para a interação. Experimentos de análise de expressão utilizando PCR em tempo real, sob condições de estresse salino e estresse a frio, revelaram que os genes que codificam FIP e FtsH5 têm sua expressão regulada de modo antagônico, o que sugere que FIP possa atuar como modulador negativo da atividade proteásica do complexo FtsH. Metalloprotease FtsH proteins are members of the AAA family (ATPases Associated with Diverse Cellular Activities), and are present in all kingdoms of living organisms. These proteases use energy of ATP hydrolysis to perform its various cellular activities. In Escherichia coli, FtsH proteases are organized in a homo-hexamer in the cytoplasmic membrane, and this complex acts in the degradation of misfolded proteins. In Arabidopsis, the FtsH hetero-complex located in the thylakoid membrane is formed by type A (FtsH1/FtsH5) and type B (FtsH2/FtsH8) isomers. Its proteolytic activity is involved in organellar quality control by degrading misfolded and short-lived proteins. The complex is also involved in the degradation of the D1 protein of PSII, damaged by photo-oxidative damage. Although the chloroplast FtsH are well characterized genetically and molecularly, the regulatory mechanism of the complex remains unclear, which makes it interesting to search for additional protein factors. In earlier studies our research group has found a potential candidate called FIP (FtsH5 Interacting Protein), which can modulate the ATPase and/or protease activity of the complex. FIP is present in the membrane of the thylakoids and showed interaction with FtsH5 in vivo and in vitro. In this study yeast two-hybrid assays were performed using FIP protein deletions, and substitutions of cysteine to alanine residues. The results showed that the interaction between FIP and FtsH5 is maintained only when two cysteine rich regions are present in the sequence of FIP. This region contains 46 amino acids with four conserved cysteine residues and 7 different assays with alanine replacements of these residues showed no interaction with FtsH5, which corroborates the hypothesis that the cysteine residues are required for the interaction. Expression experiments analysis using realtime PCR, under conditions of salt stress and cold stress, revealed that the genes encoding FtsH5 and FIP have its expression regulated in an antagonistic way, suggesting that FIP can act as a negative modulator of the activity FtsH protease of the complex.

Muitas plantas apresentam crescimento indeterminado e são capazes de produzir novos órgãos e tecidos ao longo de todo seu ciclo de vida. Essa capacidade é devida parcialmente à expressão altamente regulada de genes específicos, tais como os genes SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like (SPLs). SPLs codificam fatores de transcrição específicos de plantas que desempenham papéis importantes em diferentes aspectos do desenvolvimento, tais como mudança de fase juvenil-adulto, definição da arquitetura da planta e amadurecimento do fruto. A maioria dos genes SPLs são pós-transcricionalmente regulados pelo microRNA (miRNA) miR156. Apesar de alguns aspectos regulados pelas SPLs serem bem estudados, suas funções moleculares durante o desenvolvimento do fruto são pouco compreendidas. Neste trabalho, nós geramos 22 eventos transgênicos de Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom (MT) superexpressando o precursor AtMIR156b. Plantas transgênicas exibiram morfologia foliar e floral anormal além de alteração na arquitetura vegetal. Interessantemente, a maioria dos eventos apresentou frutos de crescimento indeterminado, os quais não apresentam sementes sendo caracterizados pelo crescimento de frutos secundários além da presença de estruturas vegetativas e meristemas florais ectópicos. Fazendo uso da técnica de RT-qPCR, nós encontramos uma robusta correlação entre expressão do miR156 e o fenótipo dos frutos, sugerindo que esta rota regula o desenvolvimento e determinação do fruto de tomateiro. O mutante de tomateiro Mouse ears (Me) apresenta um fraco nível de indeterminação no fruto, sendo que os níveis do transcrito miR156 maduro são maiores no fruto mutante quando comparado aos controles MT, mas significativamente menores que nos frutos transgênicos. Oito SPLs de tomateiro foram silenciadas em diferentes níveis em frutos de diferentes eventos transgênicos e no mutante Me. O fator de transcrição do tipo MADS-box MACROCALYX (MC), o qual é ortólogo ao gene APETALA1 (AP1) de arabidopsis (alvo direto in vivo da proteína SPL3), afeta a determinação da inflorescência e o desenvolvimento das sépalas. A expressão de MC foi severamente reduzida nos frutos dos eventos transgênicos, mas não no mutante Me. Este dado sugere que a desregulação da expressão de MC deve ser responsável pelo forte fenótipo de indeterminação do fruto observados nos eventos transgênicos. Tomados em conjunto, nossos dados sugerem uma nova função para a via genética mir156/SPL na regulação do desenvolvimento e determinação de frutos carnosos, provavelmente através da regulação da expressão de MC. Many plants have indeterminate growth and are capable of producing new organs and tissues throughout their life. This capability is partially due to the highly regulated expression of specific genes such as SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like (SPL) genes. SPLs encode plant-specific transcription factors that play important roles in development, such as phase transition, plant architecture, and fruit ripening. Most SPL genes are post-transcriptionally regulated by the microRNA (miRNA) miR156. Although some developmental aspects regulated by SPLs have been well studied, their molecular roles during fruit development are poorly understood. In this work, we generated 22 transgenic events of Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom (MT) overexpressing AtMIR156b precursor. Transgenic plants exhibit abnormal leaf and flower morphology and altered vegetative architecture. Interestingly, most events display navel-like fruits that are seedless and characterized by the growth of secondary fruits and present leaf-like structures as well as ectopic flowering meristems. By using RT-qPCR, we found a robust correlation between miR156/SPL expression and the fruit phenotype, suggesting that this pathway regulates tomato fruit development and determinacy. The tomato mutant Mouse ears (Me) displays a weak level of fruit indeterminacy. Levels of mature miR156 transcripts are higher in fruits from the mutant as comparing to MT fruits, but significantly lower than in transgenic fruits. Eight tomato SPLs were downregulated at variable levels in fruits from distinct transgenic events and Me plants. The MADS-type of transcription factor Macrocalyx (MC) gene is an orthologue of Arabidopsis AP1 (a direct in vivo target of SPL3) and affects tomato inflorescence determinacy and sepal development. MC was severely downregulated in fruits from transgenics but not in fruits from Me mutant. This data suggests that the MC misregulation may lead to the strong fruit indeterminacy phenotype observed in the transgenic events. Taken together, our data suggest a new function for miR156/SPL pathway in regulating fruit development and determinacy likely through the regulation of MC expression.

Desde a década de 90, uma nova família de moléculas de origem protéica e com características hormonais vem sendo estudada em plantas. Esse grupo de novas moléculas, coletivamente chamado de peptídeos hormonais, está envolvido com defesa, reprodução, crescimento e desenvolvimento. RALF, que é um desses novos peptídeos, é ubíquo em plantas e está envolvido com desenvolvimento vegetal. Em Arabidopsis existem 34 genes semelhantes ao RALF (AtRALFs). Nosso grupo mostrou que AtRALF1 é processado de um precursor maior por uma subtilase. Arabidopsis possui 56 subtilases, o objetivo deste trabalho é identificar a subtilase responsável pelo processamento do AtRALF1. Predição da localização subcelular e análise da expressão in silico, ambas confirmadas por análise da expressão por RT-PCR e fusões proteicas com a proteína verde fluorescente, permitiram reduzir para sete o número de subtilases candidatas. Cruzamentos entre mutantes nocaute ou plantas de baixa expressão por RNAi dessas sete subtilases com plantas superexpressoras do AtRALF1 identificaram as subtilases AtSBT6.1 (At5g19660) e AtSBT5.3 (At2g04160) como prováveis envolvidas no processamento do prepropeptídeo AtRALF1. Since the 90s, a new family of molecules of protein origin and with hormone characteristics has been studied in plants. This group of new molecules, collectively named peptide hormones, is involved in defense, reproduction, growth and development. RALF, one of these peptides, is ubiquitous in plants and is involved in plant development. In Arabidopsis there are 34 RALF-like genes (AtRALFs). Our group has shown that AtRALF1 is processed from a larger precursor by a subtilase. Arabidopsis has 56 subtilases, our goal is the identification of the specific subtilase that is responsible for the AtRALF1 processing. Prediction of subcelular localization and in silico gene expression analysis, both confirmed by RT-PCR expression analysis and chimeric proteins with green-fluorescent protein, allowed the reduction of the initial 56 candidates to only 7 subtilases. Crosses between knockout mutants or RNAi plants expressing low levels of subtilases with overexpressors of AtRALF1 identified the subtilases AtSBT6.1 (At5g19660) and AtSBT5.3 (At2g04160) as potentialy involved in the prepropeptide AtRALF1 processing.

A maioria das proteínas organelares são codificadas pelo núcleo, sintetizadas no citosol e direcionadas especificamente ao seu destino final. O direcionamento aos diferentes subcompartimentos subcelulares é feito por uma complexa e ampla maquinaria que envolve sequências de direcionamento, proteínas citossólicas e receptores organelares específicos. Entretanto, relativamente pouco se conhece sobre o processo na qual uma proteína recém sintetizada é transportada ao seu destino final. Parte significativa das proteínas destinadas às organelas possui a informação necessária ao seu transporte localizada na extremidade N-terminal. Vários estudos têm buscado caracterizar as etapas que envolvem a localização de uma proteína, desde os estágios iniciais após a sua síntese até os fatores que regulam o seu correto endereçamento. Modificações pós-traducionais, regiões 5-UTR, região C-terminal, transporte por vias alternativas e interações proteína-proteína podem agir na localização subcelular de proteínas. O estudo de redes biomoleculares se tornou um dos focos de estudo da biologia de sistemas e demonstra um enorme potencial na descoberta de diversos processos biológicos, como as interações proteína-proteína. As proteínas que possuem duplo direcionamento (DD) em Arabidopsis thaliana foram analisadas em redes de interação proteína-proteína (PPI) e proteínas que interagem com proteínas de DD foram escolhidas quanto a função e localização para a verificação de um eventual papel dessas proteínas na localização subcelular de outras proteínas. Para tanto, foram realizadas varreduras em ensaios de duplo-híbrido em levedura para os genes de GRF9 (14-3-3) e ATH7 (tiorredoxina tipo h). Os resultados para GRF9 incluem as proteínas peroxidase PRXR1 e dihidrolipoamida acetiltransferase. Já os resultados para ATH7 mostram a interação com glutamina sintetase (AT5G35630.3). A combinação dos estudos in silico com a varredura via duplo-híbrido de levedura abrem novas perspectivas no entendimento do controle da localização subcelular de proteínas. Most organellar proteins are nuclear encoded, synthesized in the cytosol and then targeted to their destination. Specific subcellular targeting is conducted by a complex machinery for the specific localization of the proteins, which includes targeting sequences, cytosolic proteins and specific organelar receptors. However, little is known about the process that happens from the synthesis of a protein and the transport to its final destination. Most organellar proteins contain the information for their localization in the N-terminal sequence. Many studies have searched to characterize the steps involved in protein targeting, from the early stages after its synthesis to the cytosolic factors regulating its correct localization. Post-translational modifications, 5-UTR regions, the C-terminal extension on the protein, alternative transport pathways and proteinprotein interactions may influence the subcellular location of some proteins. The use of biomolecular netwoks has become one of the main focus of systems biology studies and possess a major potential in the discovery of several biological processes, such as protein-protein interactions (PPI). Dual-targeted (DT) proteins in Arabidopsis thaliana were analyzed through a PPI network, and the proteins displaying interactions with DT proteins were selected by their funtion and location. The selected proteins were analyzed for their eventual role in the subcellular targeting of other proteins. Screenings in yeast two-hibrid assays were performed for the genes GRF9 (14-3-3) and ATH7 (h-type thioredoxin). The results for GRF9 include a peroxidase (PRXR1) and dihydrolipamide acetyltransferase. The results for ATH7 include glutamine synthetase (AT5G35630.3). Combination of in silico analysis with yeast two-hibrid screenings provide new perspectives for understanding the control of subcellular localization.

Em resposta aos danos ocasionados por insetos, as plantas emitem voláteis que atraem os inimigos naturais desses herbívoros. Embora essa relação tritrófica venha sendo intensamente estudada, muitos mecanismos envolvidos nesta interação ainda permanecem inexplorados. Dentre os compostos voláteis induzidos por herbivoria e emitidos pelas plantas, os terpenos são os mais expressivos e abundantes. Em resposta ao dano ocasionado por um inseto, cascatas bioquímicas são iniciadas na planta, as quais podem alterar a expressão de genes envolvidos na resposta a tal dano. Este trabalho analisou as mudanças na expressão gênica e produção de compostos voláteis em plantas de milho, Zea mays (Poaceae)promovidas por lagartas Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) ao longo do tempo. Utilizando a técnica de PCR em tempo real (qRTPCR) foram verificadas respostas no nível da expressão gênica das plantas submetidas à indução por herbivoria. Foram analisados os genes de uma lipoxigenase e de três terpeno sintases, enzimas envolvidas na produção de compostos voláteis que atraem parasitóides de S. frugiperda. As plantas submetidas à herbivoria apresentaram níveis de expressão gênica e emissão de voláteis maiores do que as plantas sadias. Os resultados fornecem bases para o entendimento dos mecanismos endógenos responsáveis pela liberação de voláteis nas plantas visando o estabelecimento de novos fundamentos para o controle biológico de pragas. In response to insect damage, plants emit volatiles that attract natural enemies of herbivores. Although this tritrophic interaction has been intensively studied, many mechanisms involved in this interaction remain unexplored. Among the herbivore-induced volatile compounds, terpenes are the most abundant and significant ones. In response to insect damage, biochemical pathways are activated, which can alter the expression of genes involved in the response to that damage. This study examined changes in gene expression and volatile compounds production in maize plants, Zea mays (Poaceae) promoted by Spodoptera frugiperda (Lep.: Noctuidae) caterpillars through time. Using the real-time PCR technique (qRT-PCR) we verified responses on the level of gene expression of plants subjected to herbivores feeding. We analyzed genes of lipoxygenase and three terpene synthases, enzymes involved in the synthesis of volatile compounds that attract parasitoids of S. frugiperda. Plants subjected to herbivory had higher levels of gene expression and volatile emission when compared to healthy plants. Results provide basis for better understanding of plant volatile emission endogenous mechanisms in order to set new foundations for biological control of pests.

As pesquisas com os peptídeos hormonais de plantas se iniciaram na década de noventa com a descoberta da sistemina. Hoje existem diversos peptídeos identificados, e alguns deles já em avançado estágio de caracterização. O envolvimento desta classe de moléculas em diversas funções básicas e específicas da biologia dos vegetais despertou o interesse da comunidade científica. Dentre os peptídeos em fase de caracterização, destacam-se os representantes da família RALF. Os peptídeos RALF estão presentes em basicamente todo o reino vegetal, desde o musgo Physcomitrela pattens até as plantas superiores mono e dicotiledôneas. A conservação destes peptídeos no reino vegetal sugere um importante papel na fisiologia vegetal, e evidências recentes indicam a participação de RALF em processos básicos do desenvolvimento das plantas. O mecanismo pelo qual o peptídeo RALF atua e é percebido pela célula constitui etapa fundamental para sua caracterização funcional. Para tanto, no presente trabalho foram empregadas técnicas para identificação de proteínas de interação com RALF. Os resultados indicam que este peptídeo possivelmente tem sua atividade regulada pelo íon cálcio, através da interação com uma proteína de ligação a cálcio que, assim como o RALF, é secretada para o apoplasto. Estes dados colocam RALF em um cenário até o momento inédito no mecanismo de ação hormonal em plantas. A exemplo de animais e leveduras, observou-se também que o processamento de RALF ocorre em um sítio dibásico. A mutação de um dos aminoácidos deste sítio foi suficiente para impedir processamento do peptídeo in vivo e in vitro. A utilização de extratos protéicos da fração microsomal de Arabidopsis no ensaio in vitro indica que esta atividade é desempenhada por uma protease presente no sistema de endomembranas celular, provavelmente da classe das convertases. Os resultados publicados marcam o início dos estudos de caracterização do processamento de prohormônios em plantas. The peptide hormone research has begun during the 90s decade with the systemin discovery. Nowadays several peptides have already been identified, and some of them are further characterized. The involvement of these molecules with a range of basic and specific biological functions has raised the scientific communitys interest. Among the peptides being studied, the RALF family is particularly intriguing. The RALF peptides can be found throughout the plant kingdom, from the moss Physcomitrella patens to the mono and dicot plant groups. The conserved occurrence of these peptides along the plant kingdom suggests an important role in the plant physiology field. Recent evidences indicate that RALF plays a role in basic mechanisms of plant development. The RALF mechanism of action and its perception by the cell are fundamental information in order to characterize this peptide function. In the present work experiments to identify RALF interacting proteins were employed. The results indicate that RALF peptides activity is possibly regulated by the calcium ion. This regulation is mediated by the interaction with a calcium binding protein. This calcium binding protein was found to be secreted to the apoplast. Presented data suggests that RALF is regulated by a mechanism never described before in the plant hormone research field. As previously described in animals and yeast the RALF propeptide processing takes place in a dibasic site. A single amino acid site specific mutation disrupted peptide processing in vivo and in vitro. The correct processing is mediated by proteases of the Arabidopsis microsomal fraction. This processing seems to occur at the endomembrane system, possibly catalized by a convertase class enzyme. The published results points the beginning of the peptide processing studies in plants.

Com o intuito de gerar subsídios para melhoria do processo de produção de Metarhizium anisopliae, o presente estudo teve como principais objetivos, determinar os efeitos de inibidores de proteinases de soja no crescimento vegetativo, esporulação e virulência do fungo e comparar a produção, viabilidade e virulência dos conídios produzidos em diferentes tipos de arroz e aditivos. A adição de 5 g.L-1 de inibidores de proteinases semi-purificados de soja ou 0,5 g.L-1 de inibidor purificado do tipo Kunitz no meio de cultura ME resultou em grande aumento na esporulação (de duas a 75 vezes) sem afetar a viabilidade dos conídios de quatro isolados (ESALQ-1037, IBCB348, E9, F20) de M. anisopliae. A presença destes inibidores de proteinases também alterou a morfologia dos conídios produzidos em ME. Os mecanismos responsáveis por estas alterações fisiológicas não foram determinados, mas provavelmente estejam associados à ação anti-nutricional, diminuindo a absorção protéica e estimulando a esporulação. Os conídios produzidos no meio com adição de 0,5 g.L-1 de inibidor de proteinase do tipo Kunitz ou com 2,5 g.L-1 de albumina de soro bovino e no meio BDA apresentaram virulência superior aos conídios produzido no meio ME sem inibidores. Quando o inibidor de proteinase do tipo Kunitz foi adicionado à suspensão de conídios do fungo antes da pulverização de lagartas de Diatraea saccharalis, a eficiência de controle foi 35,1%, inferior ao apresentado pelos demais tratamentos sem a presença deste inibidor. Nos estudos para determinação dos melhores tipos de arroz para produção de M. anisopliae, tentou-se correlacionar à produção de conídios com características destes substratos como valor nutricional, teor de resíduos de agrotóxicos e densidade de microorganismos. O arroz parboilizado foi responsável pela maior produção de conídios (4,38 x 109 conídios.g-1). Este tipo de arroz apresentou teor de proteína bruta menor do que a maioria dos arrozes e o maior teor de umidade (41,3% após a autoclavagem). Além disto, os grãos após autoclavagem ficaram menos gelatinosos e mais soltos, o que facilita o processo de produção do fungo. Enquanto que os arrozes dos tipos brancos polidos, canjicão e integral ficaram pegajosos e formaram grumos, o que provavelmente deve acarretar em menor superfície de desenvolvimento para o fungo. O segundo melhor arroz, o canjicão, com produção de 3,42 x 109 conídios.g-1, teve a maior quantidade de fungos contaminantes nos grãos crus. Quantidades intermediárias de conídios foram produzidas pelos arrozes branco polido irrigado, de terras altas e orgânico. O integral foi o que resultou na menor quantidade de conídios (1,53 x 109 conídios.g-1), sendo o mais rico em minerais, proteína bruta e extrato etéreo. Nenhum dos aditivos (farelo de soja, grãos de soja partidos, extrato de soja, peptona de soja, inibidores de proteinases de soja semipurificados e purificado do tipo Kunitz, polpa cítrica e levedura) resultou em aumento na produção de conídios em comparação com o arroz parboilizado sem aditivos. Os conídios produzidos em todos os arrozes e aditivos apresentam viabilidade superior a 99%. As vantagens da utilização do arroz parboilizado levando-se em consideração custo, facilidade de manuseio e produtividade são discutidas. In order to optimize the production process of Metarhizium anisopliae, the present study aimed to determine the effects of soybean proteinase inhibitors on growth, sporulation and virulence of the fungus and to compare yield, viability and virulence of M. anisopliae conidia produced in different types of rice and additives. The addition of 5 g.L-1 of semi-purified soybean proteinase inhibitor or 0.5 g.L-1 of Kunitz-type inhibitor purified on the culture medium ME resulted in large increases in sporulation (two to 75 times) without affecting the viability of conidia of four M. anisopliae isolates (ESALQ-1037, IBCB348, E9, F20). The presence of proteinase inhibitors altered morphology of conidia produced in ME. Mechanisms responsible for these physiological changes in the fungus have not been determined, but it is probably associated to an anti-nutritional action, reducing the absorption of protein and stimulating sporulation. Spores produced in the medium with the addition of 0.5 g.L-1 Kunitz-type inhibitor purified or 2.5 g.L-1 of bovine serum albumin (BSA) and PDA medium showed higher virulence of conidia produced in ME without inhibitors. When the Kunitz-type inhibitor was added to conidial suspension of the fungus before spraying larvae of Diatraea saccharalis, control efficiency was 35.1% lower than that presented in other inhibitor-free treatments. In the studies aiming to determine the best types of rice for production of M. anisopliae, we tried to correlate production of conidia with characteristics of these substrates such as nutritional content, pesticide residues and density of microorganisms. The parboiled rice was responsible for greater production of conidia (4.38 x 109 conidia.g-1). This type of rice showed crude protein content lower than most rice and the highest moisture content (41.3% after autoclaving). Besides that, grains became less gelatinous and loose after autoclaving, and these feature favored fungus production. While types of polished white, brown rice and course (broken) rice grain were sticky and formed clumps, providing a smaller area for fungus development. The second best rice, course rice grain, with production of 3.42 x 109 conidia.g-1, had the highest amount of fungal contaminants in raw grains. Intermediate amounts of conidia were produced by white irrigated polished rice, upland rice and organic rice. The brown rice was the kind that resulted in fewer conidia (1.53 x 109 conidia.g-1), being the richest in minerals, protein and lipids. None of the additives (soybean meal, soybean parties, soy extract, soy peptone, semi-purified soybean proteinase inhibitor, Kunitz-type inhibitor purified, citrus pulp and yeast) resulted in increased production of conidia compared to parboiled rice without additives. Conidia produced in all types of rice and additives presented viability greater than 99%. The advantages of the use of parboiled rice taking into consideration the cost, easy handling and productivity are discussed.

Apesar de sua elevada importância econômica mundial, o cultivo do tomateiro é classificado como de alto risco devido à infestação da cultura por um grande número de pragas e doenças. Esse problema leva tal cultura a depender amplamente da aplicação de agroquímicos que, além de elevaram o custo de produção, são potenciais causadores de danos ambientais e do aparecimento de outras pragas e doenças. Observando o problema mais detalhadamente, pode-se perceber que uma grande parcela das perdas advém dos danos causados por artrópodes herbívoros, os quais são capazes de se alimentar de diversas partes da planta, causando, geralmente, perda de produtividade. Apesar disso, o tomateiro apresenta mecanismos de defesa naturais contra tais pragas, como tricomas e aleloquímicos, que agem intoxicando os artrópodes, dificultando sua movimentação e/ou alterando varias fases de seu desenvolvimento. A busca por genótipos de tomateiro com maior densidade de tricomas e elevado teor de aleloquímicos é hoje considerado um hot spot de pesquisa, devido ao benefício que trariam como redução do custo de produção e maior produtividade. Sabese que vários hormônios vegetais estão ligados a geração de caracteres anti-herbivoria, mas, atualmente, um grande foco vem sendo dado somente ao ácido jasmônico, devido ao seu claro papel na formação de tricomas, aleloquímicos, inibidores de proteases, dentre outros. Visando mostrar a importância de uma abordagem multi-hormonal nesse tipo de estudo, o presente trabalho teve como objetivo avaliar quais hormônios vegetais estão envolvidos com a formação de vários caracteres anti-herbivoria em tomateiro, como densidade de tricomas e teor de aleloquímicos e inibidores de protease. Para tal, fez-se uso da um grande número de mutantes hormonais introgredidos na cultivar Micro-Tom (a qual apresenta diversas facilidades de trabalho como porte reduzido e rápido ciclo de vida). Demonstrou-se que, apesar do ácido jasmônico ser extremamente importante na formação de tais caracteres, outros hormônios também atuam fortemente em tal papel. Etileno, giberelinas e auxina alteram de forma indireta a densidade de tricomas em tomateiro, através de alteração na área de células epidérmicas. O ácido jasmônico é um forte regulador positivo da formação de tricomas, do aleloquímico zingibereno e da formação de inibidores de protease. De forma antagônica, brassinosteróides parecem controlar negativamente a densidade de tricomas, a produção de zingibereno e inibidores de protease. Interessantemente, observou-se que esse controle negativo efetuado por brassinosteróides acontece através de um controle na via do ácido jasmônico, o qual foi comprovado pela produção de duplos mutantes. Resultados obtidos em testes com o herbívoro polífago Spodoptera frugiperda e com a praga de tomate Tuta absoluta (traça-do-tomateiro), bem como de análise de expressão gênica comprovaram a importância do ácido jasmônico, brassinosteróides e sua interação na defesa a herbivoria. Os resultados aqui apresentados sugerem que o foco para futuros estudos da formação de mecanismos anti-herbivoria em tomateiro deve ser voltado não só para o ácido jasmônico como para brassinosteroides e para suas ações antagônicas. Even though the cultivation of tomato has a high economical importance, this culture is classified as being of elevated risk because of it common infestation by pests and diseases. This problem makes this culture greatly dependent of the application of several agrochemicals, which leads to increase in cost of production, environmental damages and also facilitating the appearance of new pests and diseases. Looking carefully to the problem, it is possible to conclude that a great part of tomato losses are caused by herbivory-arthropods, which are capable of feeding of several parts of the plant, causing, generally, losses in the productivity. However, tomato has natural defense mechanisms against those pests, for example trichomes and allelochemicals, which act poisoning the arthropods, hindering their movement through the plant and/or altering steps of their development. The search for tomato genotypes with great density of trichomes and elevated levels of allelochemicals is nowadays being considered as a hot spot of research, because of the benefits it would provide (for example: a decrease in the cost of production and also a higher productivity). Although it is believed that many plant hormones are involved in the generation of anti-herbivory traits, a great focus has been given only to jasmonic acid because of it clear action in the formation of those traits, such as trichomes, allelochemicals, proteinase inhibitors and many others. The present work objective was to evaluate which hormones are involved in the formation of anti-herbivory traits such as trichome density and allelochemicals and proteinase inhibitors content. For this reason, we made use of several hormonal mutants already introgressed in the Micro-Tom cultivar (which presents benefits as small size and fast life cycle). It was showed that jasmonic acid is an important hormone in the formation of these traits, but other phytohormones also play important roles. Ethylene, gibberellins and auxin alters trichome density indirectly, by altering the area of epidermal cells and thus cell number. Jasmonic acid is a positive regulator of trichome formation, the allelochemicals zingiberene content and also in the formation of proteinase inhibitors. However, brassinosteroids acts by negatively controlling all of those. Interestingly, we observed that this negative control happens through the control of jasmonic acid pathway, a hormonal interaction that was proved by double-mutant analysis. Results obtained in tests with the polyphagous insect Spodoptera frugiperda and the tomato specific pest Tuta absoluta (tomato pinworm) and also with qPCR showed the importance of jasmonic acid, brassinosteroid and their interaction in herbivory defense. Our data suggest that future studies about the formation of antiherbivory traits should be analyzed by focusing the functions not only of jasmonic acid but also brassinosteroid and their antagonist functions.

Genes de plantas que codificam inibidores de enzimas digestivas de insetos têm sido introduzidos em plantas cultivadas visando o controle de pragas. Os inibidores de proteinases estão presentes nos tecidos vegetais, principalmente nas sementes, e atuam em resposta a ataques por herbívoros e patógenos. Inibidores de serino-proteinases (IPs) dos tipos Bowman-Birk e Kunitz isolados de sementes de soja foram inseridos em variedades de cana-de-açúcar para aumentar a resistência à broca Diatraea saccharalis (Fabr.), principal praga desta cultura. Para utilização de plantas geneticamente modificadas contendo inibidores de proteinases é necessário um conhecimento profundo de sua sustentabilidade e segurança ambiental, determinando a estabilidade da característica inserida e os seus efeitos nos organismos não-alvo. O objetivo desta pesquisa foi avaliar os efeitos diretos e indiretos de inibidores de proteinases de soja em organismos não-alvos: um parasitóide larval, Cotesia flavipes (Cam.) (Hymenoptera: Braconidae); um patógeno, Metarhizium anisopliae (Mestch.) Sorokin (Deuteromycotina: Hyphomycetes); um polinizador, Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae) e um decompositor, Scheloribates praeincisus (Berlese) (Acari: Oribatida: Scheloribatidae); associados à cultura da cana-de-açúcar. O consumo de Kunitz e BBI não afetou a sobrevivência de S. praeincisus. Por outro lado, a ingestão dos inibidores semi-purificados e purificados do tipo Kunitz diminuiu a duração das fases imaturas de S. praeincisus. A ingestão de folhas de cana GM expressando inibidores de proteinases (Kunitz e BBI) não afetou o tempo de desenvolvimento e a sobrevivência dos imaturos deste oribatídeo quando comparada à ingestão de suas isolinhas. Os inibidores de proteinases semi-purificados e purificados não afetaram a duração dos períodos larval e pupal, o peso e número de pupas e percentual de emergência do parasitóide C. flavipes em D. saccharalis. Por outro lado, a proporção de fêmeas em relação a machos de C. flavipes foi maior no tratamento onde as lagartas foram alimentadas com dieta contendo 0,5% de inibidores semi-purificados comparado-se à testemunha. A proporção fêmea:macho foi significativamente maior também quando os parasitóides foram alimentados com o inibidor do tipo Kunitz em relação ao controle e aos parasitóides alimentados com BBI. A adição de 0,5% (p/v) de inibidores de proteinases semi-purificados e 0,05% (p/v) de inibidores purificados do tipo Kunitz nos meios de cultura MC e BDA resultaram em maiores crescimento vegetativo e produção de conídios de M. anisopliae. Os inibidores purificados do tipo BBI não alteraram a esporulação do fungo. Os resultados dos estudos com A. mellifera não foram conclusivos e novas investigações precisam ser conduzidas para esclarecer os potenciais efeitos de inibidores de proteinases em abelhas. De uma forma geral, observou-se que os inibidores de proteinases (Kunitz e BBI) não afetaram negativamente os organismos não-alvo testados. Por outro lado, a ingestão de inibidor do tipo Kunitz alterou positivamente alguns parâmetros biológicos de C. flavipes, M. anisopliae e S. praeincisus. Genes of plants expressing insect proteinase inhibitors have been introduced into plants for pest control. Proteases inhibitors are present in plant tissues, mainly in seeds, and act in response to predators and pathogens. The Bowman-Birk type and Kunitz type of serine proteases inhibitors (PI) from soybean seeds are been used to increase resistance of sugarcane to Diatraea saccharalis (Fabr.), the most important pest of this crop. The sustainability and environmental safety of PI crops is still unknown. For these reasons, it is necessary to understand the stability and the non-target effects of this new trait. The objective of this study was to evaluate the direct and indirect effects of soybean PI on the following non-target organisms associated to sugarcane: the larval parasitoid, Cotesia flavipes (Cam.) (Hymenoptera: Braconidae); the entomopathogen, Metarhizium anisopliae (Mestch.) Sorokin (Deuteromycotina: Hyphomycetes); the pollinator Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae) and the soil mite involved in the process of recycling organic matter, Scheloribates praeincisus (Berlese) (Acari: Oribatida: Scheloribatidae). Kunitz and BBI did not affect S. praeincisus survival. On the other hand, Kunitz semi-purified and purified inhibitor ingestion reduced duration of the immature stages of S. praeincisus. Ingestion of GM senescent leaves did not have an effect on mite immatures development time and survival compared to ingestion of its isolines leaves. The semi-purified and purified proteinases inhibitors did not alter either the duration of larval and pupal stages of C. flavipes on D. saccharalis, or weight and number of pupae and parasitoid emergence. In other hand, the parasitism and proportion of female was higher on the treatment where caterpillars were fed with diet containing 0.5% of semi-purified inhibitors, comparing to control. The ratio female:male was significantly higher also when parasitoids were fed to the Kunitz type inhibitor compared to the control and BBI. The addition of 0.5 % (w/v) of semi- purified proteinase inhibitors and 0.05% (w/v) of Kunitz type purified inhibitors on two culture media (CM and PDA), resulted in increase of vegetative growth and production of conidia. BBI type purified inhibitors did not change the fungus sporulation. The results from the studies with A. mellifera were not conclusive and investigations are needed to clarify the potential impact of proteinase inhibitors on A. mellifera. Overall, proteinase inhibitors (Kunitz and BBI) did not negatively affect the non-target organisms tested. Conversely, ingestion of the Kunitz type of proteinase inhibitors altered positively some biological parameters of C. flavipes, M. anisopliae and S. praeincisus.

O seqüenciamento em larga-escala e a aplicação da tecnologia de seqüências expressas (ESTs) permitiram a identificação de milhares de seqüências genômicas de vários organismos. Através de projetos como o de obtenção de ESTs de cana-de-açúcar (SUCEST - Sugarcane EST Project), a tecnologia de macro e microarranjos de DNA pôde ser aplicada para o monitoramento da expressão gênica. O primeiro passo deste trabalho foi otimizar a técnica de macroarranjos utilizando-se colônias bacterianas. Os arranjos foram construídos com o auxílio do robô Q-Bot. Células bacterianas contendo clones de cDNA de cana-de-açúcar foram arranjadas em duplicata em membranas de náilon e crescidas por 6 e 12 horas. Como resultado, concluiu-se que é possível estudar a expressão gênica em larga-escala usando macroarranjos de colônias bacterianas crescidas por 6 horas. Na segunda parte, o objetivo foi identificar genes de defesa em duas variedades de cana-de-açúcar (Saccharum sp.), em resposta ao herbívoro Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). A cana-de-açúcar é de grande importância para a agricultura brasileira e para a economia geral de muitos países em desenvolvimento. Estas plantas são atacadas por D. saccharalis, a mais importante praga desta cultura, causando significativas perdas econômicas. Como é sabido, as plantas desenvolveram complexas estratégias para se protegerem do ataque de insetos-praga. As variedades SP80-3280 (susceptível) e SP81-3250 (tolerante) de cana-de-açúcar foram expostas à D. saccharalis. Plantas submetidas à lagarta e plantas controle foram coletadas em 0.5, 6, 12 e 24 horas de experimento. As análises permitiram a identificação de genes diferencialmente expressos em resposta à lagarta nas duas variedades. Foram analisados o tempo, dinâmica e regulação da expressão de 3.840 clones do SUCEST, os quais foram crescidos na membrana de náilon por 6 horas. Estes ESTs foram agrupados em dezesseis classes: metabolismo de aminoácidos, crescimento/desenvolvimento, metabolismo de proteínas, metabolismo de RNA, metabolismo secundário, resposta à diferentes condições de estresse, transporte, bioenergética, transdução de sinal, dinâmica celular, metabolismo de DNA, metabolismo de lipídios, elementos móveis, metabolismo de nitrogênio, sulfato e fosfato, metabolismo de nucleotídeos e função não determinada (ND). Estes resultados ajudam elucidar as estratégias de defesa desenvolvidas pela cana-de-açúcar para evitar os danos causados por esta praga. Neste estudo, os dados do macroarray revelaram 580 ESTs com expressão aumentada, oriundos das duas variedades. Estes resultados são importantes não somente porque este é o primeiro estudo em larga-escala da expressão gênica de uma monocotiledônea em resposta ao ataque de herbívoros, mas também porque permite a comparação dos perfis de expressão entre genótipos susceptível e tolerante de cana-de-açúcar. Este estudo abre possibilidades para a engenharia genética de plantas de cana-de-açúcar inseto-resistentes e também para o uso destes genes como marcadores moleculares em programas de melhoramento assistido. Large-scale sequencing and the application of expressed sequence tag (EST) technology has led to the identification of hundreds of thousands of genomic sequences from various organisms. Through projects like the Sugarcane Expressed Sequence Tag (SUCEST), DNA arrays technology could be applied in monitoring gene expression. The first step of this work was to optimize the macroarray technique with bacterial colonies. Arrays were robotically constructed (Q-Bot). Bacterial cells carrying sugarcane cDNA clones were arrayed in duplicate onto nylon membrane and grown for 6 and 12 hours. As a result, we conclude that is possible to study the gene expression in large-scale using macroarray through bacterial colony that grown for 6 hours. The second part of this work was to study how different two sugarcane varieties (Saccharum sp.) are in response resistance against Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). Sugarcane is of great importance for Brazilian’s agriculture and for the general economy of many tropical developing countries. These plants are attacked by D. saccharalis, the most important insect pest of sugarcane, causing significant economic losses. As it is well known, plants have evolved complex defense strategies to protect them in opposition to attack by insects. The varieties SP80-3280 (susceptible) and SP81-3250 (tolerant) were exposed to D. saccharalis. Plants materials from plants with the borer and control plants (without the borer) were collected at 0.5, 6, 12 and 24 hours time points. The analysis revealed genes differentially expressed in response to sugarcane borer in both varieties. We analyzed the timing, dynamics, and regulation of the expression of 3,840 SUCEST clones, which were grown on a nylon membrane for 6 h. These ESTs was grouped into 16 broad categories: amino-acid metabolism, plant grow and development, protein metabolism, RNA metabolism, secondary metabolism, stress response, transport, bioenergetics, signal transduction, cellular dynamics, DNA metabolism, lipid, fatty-acid metabolism, mobile genetic elements, nitrogen, sulphur and phosphate metabolism, nucleotide metabolism, and the group matched to unable to classify, which no indication of the function of the gene product are known. These results help to elucidate the defense strategies developed by sugarcane in order to prevent against insect damage. In this study, macroarray analyses revealed 580 ESTs with increased expression, from both varieties. These results are important not only because this is the first large-scale gene expression study of a monocot in response to insect attack, but also because it allows the comparison of the gene expression pattern between susceptible and tolerant genotypes. This study opens possibilities for genetically-engineering of insect-resistant sugarcane and for using these genes as molecular markers in conventional breeding programs.