Search

The Mitochondrial Carrier Family (MCF) groups integral membrane proteins that transport various metabolites across the inner mitochondrial membrane. This transport is needed in major metabolic pathways occurring in mitochondria and is essential in eukaryotic metabolism. The mis-function of several identified human mitochondrial carriers has been associated with severe diseases. In order to achieve a better understanding of mitochondrial carriers two different families of mitochondrial carriers where chosen to be studied: the AACs (ADP/ATP Carriers) and the UCPs (UnCoupling Proteins). Two heterologous expression systems of these carriers were developed: the cell free and the expression in E. coli as fusion proteins. The cell free system allowed the production and purification of about 0,6 mg of protein per milliliter of reaction mixture and the expression in E.coli proved to be very efficient for the functional characterization of ADP/ATP carriers. A functional test was developed for the uncoupling protein also. This test, based on the measure of electrical currents generated by the transport activity of UCP, allowed the functional characterization of native UCP1., Le passage sélectif d'ions et de métabolites à travers les membranes biologiques est essentiel à de nombreux processus cellulaires fondamentaux. Au niveau de la membrane interne de la mitochondrie, la communication cellulaire et les processus d'échanges sont principalement assurés par les transporteurs mitochondriaux. Ces protéines membranaires jouent un rôle clef dans les fonctions métaboliques des cellules eucaryotes et leur dysfonctionnement est à l'origine d'un certain nombre de maladies graves chez l'homme Parmi les transporteurs mitochondriaux, deux familles ont été étudiées au cours de ce travail : les AACs (ADP/ATP Carriers) et les UCPs (UnCoupling Proteins). Deux systèmes de production hétérologue de ces transporteurs ont été mis en place : la synthèse in vitro et l'expression chez E. coli de protéines de fusion. Le premier a permis la production et la purification d'environ 0,6 mg de protéine par mL de réaction et le deuxième a été exploité afin de réaliser des caractérisations fonctionnelles des transporteurs ADP/ATP. Un test fonctionnel pour la protéine découplante a également été mis au point. Ce test, basé sur la mesure directe des courants électriques associés à l'activité de transport de l'UCP, à permis la caractérisation fonctionnelle de la protéine UCP1 native.

L’étude des assemblages biomoléculaires de grande taille a été initiée au cours de la thèse de R. Sounier (bourse ministère de la recherche) dont j’ai assuré la formation et la co-direction depuis octobre 2004 avec Dr. Jean-Pierre Simorre (IBS, Grenoble). Deux premiers articles issusde ce travail ont déjà été publiés (Sounier et al. 2007; Schanda et al. 2007) et deux autres, avec R. Sounier en premier auteur, sont actuellement en préparation. Ces travaux ont débouché sur l’étude RMN hors d’équilibre de NanoMachines hyperthermophiles de plusieurs centaines de kDa. Ce dernier projet a été confié au Dr. C Amero qui a rejoint l’équipe en juin 2008, pour être formé sous ma direction à la RMN des assemblages supramoléculaires.J’ai également encadré, plusieurs étudiants en Master de Biologie de l’UJF. Ils ont été impliqués dans la mise au point de protocoles de protonation spécifique des méthyles des isoleucines pour K. Treche (2005) et des alanines pour N. Usé (2007). Deux étudiants en Masters de Physique ont été impliqués dans les développements pour l’attribution des ponts disulfures pour A. Sollier (1999) et M Falges (2006) pour la mesure rapide de RDC 1H-1H. Plus récemment, j’ai également formé J. Retel, un étudiant hollandais effectuant son stage de Master Life Science & Technology (programme commun des universités de Leiden et de Delft, NL 2007). Son travail de stage consiste à généraliser les outils développés lors de la thèse de Remy Sounier. Cette implication dans la formation des étudiants de Master a été validée par quatre articles dans lesquels les étudiants de Master sont co-auteurs (Boisbouvier et al. 2000; Scanda et al. 2007; Ayala et al., in press; Sounier et al., en préparation) et vient compléter l’expérienced’enseignement en Licence et Agrégation que j’ai acquise pendant deux ans de monitorat.

During phagocytose of a micro-organism, the NADPH Oxidase complex of neutrophiles is activated. Reactive oxygen species are then produced and contribute to pathogen destruction. This complex comprises cytosolic factors (p67phox, p40phox, p47phox), a small G protein Rac and a flavocytochrome b558 composed of p22phox and gp91phox. Mutations within the genes encoding some of these proteins lead to a rare but serious disease termed chronic granulomatous disease (CGD). The formation of the ternary complex constituted by the cytosolic factors implies several SH3 domain/polyproline interactions and also an interaction PB1 domain interaction. We structurally characterized by Nuclear Magnetic Resonance the interaction between PB1 domains of p67phox and p40phox. We also studied the consequences of activation on the interactions involving p47phox C-terminal polyproline motif and its SH3 domain partners. Thus, we combined the analysis of the structures of p40phox SH3 domain and p67phox C-terminal SH3 domain, in complex with p47phox C-terminal polyproline, with our affinity measures between these partners at various stages of activation. These data were obtained by intrinsic fluorescence of tryptophan present within SH3 domains., Lors de la phagocytose d'un micro-organisme, le complexe de la NADPH Oxydase des neutrophiles est activé. Il permet alors la production d'espèces réactives de l'oxygène qui contribuent à la destruction du pathogène. Ce complexe est constitué de facteurs cytosoliques (p67phox, p40phox, p47phox), d'une petite protéine G Rac et du flavocytochrome b558 membranaire, lui-même composé de p22phox et gp91phox. Des mutations dans les gènes codant pour certaines de ces protéines conduisent à une maladie génétique rare mais grave!: la granulomatose septique chronique (CGD). Au sein du complexe ternaire formé par les facteurs cytosoliques, il existe des interactions de type domaine SH3/motif polyproline et une interaction entre domaines PB1. Par Résonance Magnétique Nucléaire, nous avons caractérisé d'un point de vue structural l'interaction entre les domaines PB1 de p67phox et p40phox. Nous avons également étudié les conséquences de l'activation sur les interactions entre le motif polyproline C-terminal de p47phox et ses domaines SH3 partenaires. Ainsi, nous avons combiné l'analyse des structures des domaines SH3 de p40phox et SH3 C-terminal de p67phox, en complexe avec le polyproline C-terminal de p47phox, avec nos mesures d'affinité entre ces partenaires à différents stades de l'activation. Ces données ont été obtenues par fluorescence intrinsèque du tryptophane présent au sein des domaines SH3.