Search

A new activity-based probe able to covalently modify the active site of proteases belonging to the matrix metalloprotease family (MMPs) has been developed in this thesis project. The probe was shown to behave as potent inhibitor of several MMPs, with nanomolar Ki values. This probe was also able to modify specifically only the free active site of MMPs, with particular high yields of cross-linking varying from 50 % to 11 %, depending of the MMPs tested. Using radioactivity as means of detection, this probe was able to detect active form of MMPs with a threshold of 1 femtomole. Applied to the study of bronchoalvelolar fluids (BAL) from mice exposed to nanoparticles by a lung aspiration protocol, this probe revealed the presence of the catalytic domain of MMP-12 under its active form, but not in control animals. When used to detect active form of MMPs from extracts obtained from human arteries of patient suffering from atherosclerosis, the probe was not able to detect such MMP active forms. Despite this negative result, the detection of active form of MMP in pathological fluid like BAL has never been reported before this work. Having validated this novel MMP activity-based probe, it will be possible to use it now for detecting MMPs from other pathological fluids or tissues extracts in which MMPs can be good markers of the pathology.; Le développement d’une nouvelle sonde dite « activity-based probe » pour réaliser la détection de formes actives de protéases appartenant à la famille des protéases à zinc de la matrice (MMP) a été réalisé dans ce travail, en partant d’un inhibiteur phosphinique puissant des MMP dans lequel a été introduit un groupement photoactivable de type diazérine. Ce composé se révèle un inhibiteur puissant de plusieurs MMP avec des affinités nanomolaires. Ce composé incubé avec différentes MMP est par ailleurs capables de modifier de façon covalente un grand nombre de MMP au niveau de leur site actif, avec des rendements de modification variant de plus de 50% à 11%, selon la nature des MMP. En ayant choisi comme moyen de détection la radioactivité, nous démontrons qu’avec cette nouvelle sonde qu’il est possible de détecter des formes actives de MMP avec des sensibilités de l’ordre de la femtomole dans des systèmes modèles de protéomes complexes. Appliquée à l’analyse de lavages broncho alvéolaires de souris traitées par voie pulmonaire avec des nanoparticules pour induire une réponse inflammatoire, cette nouvelle sonde permet de mettre en évidence la présence de formes actives du domaine catalytique de la MMP-12, une métalloprotéase à zinc exprimée par les macrophages, mais pas dans les animaux contrôles. En revanche l’analyse de carotides humaines de patients souffrant d’athérosclérose ne nous pas conduit avec cette sonde à la détection de formes actives de MMP. Malgré ce résultat, il est à noter que la détection de forme active de MMP dans un fluide pathologique est une première dans ce domaine. Cette sonde étant validée pour sa capacité à détecter des formes actives de MMP, elle permettra dans l’avenir de tester d’autres fluides pathologiques d’origine humaine ou bien des extraits de tissu comme des tumeurs pour lesquels les MMP pourraient être des marqueurs de ces pathologies.

Metalloproteases (ADAMs, MMPs) are multidomain proteins that play key roles in extracellular matrix remodelling and degradation, in cell-cell and cell-matrix interactions and in the proteolytic liberation of membrane-anchored proforms of cytokines and growth factors, the so-called ectodomain shedding. In this work we describe the development of photoactivatable activity-based probes with which active metalloproteases can be visualised. Our probes are based on the succinyl hydroxamate motif and differ in the positioning of the trifluoromethylphenyldiazirine photoreactive group. We demonstrate that directing the photoactivatable group towards the S1' pocket yields activity-based probes more effective than the corresponding probe with the photoactivatable group directed towards the S2' pocket.

The Matrix Metalloproteinases (MMP) represent a family of Zinc dependent extracellular proteinases able to cleave collectively all the proteins constituting the extracellular matrix. Currently, 23 human MMP have been identified and are characterized by their sequence in aminoacids and their highly conserved 3D structure. These enzymes are expressed constitutively during the tissue remodelling process. Their over-expression in various diseases tightly related to inflammatory processes (arthritis, emphysema, cancer) described MMP as choice therapeutic targets. However, as the tissue remodelling implicates modification of cellular contacts, MMP appear currently as proteins involved in signalling pathways. Recent works demonstrating that MMP are able to cleave substrates, which are different than proteins constituting the extracellular matrix, reinforce this vision. In order to identify the individual role and the protein expression level of MMP in pathological context, we developed a new technique of functional proteomics dedicated to the detection of active forms of MMP in tumour samples. This technique relied on the development of a new photoaffinity probe, based on the structure of a potent phosphinic inhibitor of MMP, allowing targeting and isolating active forms of MMP by photoaffinity labelling. Furthermore, as the new developed probe incorporated a radioactive element, photoaffinity labelling permitted to radiolabel the targeted proteins. This probe demonstrated in vitro its remarkable ability to covalently modify the hMMP-12, with a singular cross-linking yield, determined at 42 %, displaying an extremely sensitive detection (2.5 fmoles of hMMP-12). When added to complex proteome, the photoaffinity probe presents the same sensibility of detection for the hMMP-12 (5 fmoles); importantly, in this case, hMMP-12 represents only 0.001 % of the totality of the proteins present in the sample. Moreover, this technique allows us to identify active forms of gelatinases (MMP-2 & -9) in an indirect manner by comparing the results of tumour samples treated with the photoaffinity probe and the results of tumour samples analysed in zymography. These studies indicate that the protein expression levels of active forms of MMP are extremely low (fmoles) and do not permit any characterisation of those forms of MMP by mass spectrometry, constituting a genuine challenge which can be approached by the development of new photoaffinity probes incorporating a biotin-group. The example of this class of proteins expressed in very low abundance under active form implicates to grant efforts to develop new strategies allowing the capture of the targeted proteins. Key-words: matrix metalloproteinases; functional proteomics; photoaffinity probe; zymography, Les Métalloprotéases matricielles (MMPs) constituent une famille des métalloprotéases à zinc capables conjointement de dégrader l'ensemble des protéines de la matrice extracellulaire. Aujourd'hui, vingt-trois MMPs humaines ont été identifiées et sont caractérisées par leur séquence en aminoacides et leur structure 3D fortement conservées. Ces enzymes sont exprimées de manière constitutive au cours des processus de remodelage tissulaire. Leur surexpression dans un certain nombre de pathologies étroitement liée au phénomène d'inflammation (arthrite, emphysème, cancer) fait des MMPs des cibles thérapeutiques de choix. Cependant, le remodelage entraînant des modifications des contacts cellulaires, les MMPs apparaissent aujourd'hui comme des protéines des voies de signalisation à part entière. Les récentes découvertes de substrats des MMPs ne faisant pas partie des constituants de la matrice extracellulaire renforcent cette vision. Dans le but d'identifier le rôle particulier et le taux d'expression protéique des MMPs dans un contexte pathologique, nous avons développé une technique de protéomique fonctionnelle dédiée à la détection des formes actives des MMPs dans des échantillons tumoraux. Cette technique repose sur le développement d'une nouvelle sonde de photoaffinité, basée sur la structure d'un puissant inhibiteur des MMPs de type phosphinique, permettant de cibler les MMPs sous forme active et de les isoler par marquage par photoaffinité. Le marquage par photoaffinité nous permet ainsi grâce à un élément radioactif incorporé à la sonde de radiomarquer les protéines ciblées. Cette sonde a montré in vitro sa capacité remarquable à modifier de manière covalente la hMMP-12 avec un rendement de 42 %, affichant une sensibilité extrême de détection (2.5 fmoles de hMMP-12). En présence de protéome complexe, la sensibilité de détection de la sonde pour la hMMP-12 est tout à fait comparable (5 fmoles) ; la hMMP-12 représente une fraction de 0.001 % de la quantité totale des protéines. Cette méthode nous a permis également d'identifier de manière indirecte les formes actives des gélatinases en comparant les extraits tumoraux traités par la sonde et les extraits tumoraux analysés en zymographie. Ces études indiquent que les niveaux d'expression des formes actives de MMPs sont très faibles (fmoles) ne permettant pas une caractérisation de celles-ci par spectrométrie de masse, ce qui constitue un véritable défi pouvant être abordé avec de nouvelles sondes incorporant une biotine. Cet exemple de protéines exprimées sous forme active en très faible abondance, implique une orientation des efforts à consentir vers le développement de nouvelles stratégies de capture.

The Matrix Metalloproteinases (MMP) represent a family of Zinc dependent extracellular proteinases able to cleave collectively all the proteins constituting the extracellular matrix. Currently, 23 human MMP have been identified and are characterized by their sequence in aminoacids and their highly conserved 3D structure. These enzymes are expressed constitutively during the tissue remodelling process. Their over-expression in various diseases tightly related to inflammatory processes (arthritis, emphysema, cancer) described MMP as choice therapeutic targets. However, as the tissue remodelling implicates modification of cellular contacts, MMP appear currently as proteins involved in signalling pathways. Recent works demonstrating that MMP are able to cleave substrates, which are different than proteins constituting the extracellular matrix, reinforce this vision. In order to identify the individual role and the protein expression level of MMP in pathological context, we developed a new technique of functional proteomics dedicated to the detection of active forms of MMP in tumour samples. This technique relied on the development of a new photoaffinity probe, based on the structure of a potent phosphinic inhibitor of MMP, allowing targeting and isolating active forms of MMP by photoaffinity labelling. Furthermore, as the new developed probe incorporated a radioactive element, photoaffinity labelling permitted to radiolabel the targeted proteins. This probe demonstrated in vitro its remarkable ability to covalently modify the hMMP-12, with a singular cross-linking yield, determined at 42 %, displaying an extremely sensitive detection (2.5 fmoles of hMMP-12). When added to complex proteome, the photoaffinity probe presents the same sensibility of detection for the hMMP-12 (5 fmoles); importantly, in this case, hMMP-12 represents only 0.001 % of the totality of the proteins present in the sample. Moreover, this technique allows us to identify active forms of gelatinases (MMP-2 & -9) in an indirect manner by comparing the results of tumour samples treated with the photoaffinity probe and the results of tumour samples analysed in zymography. These studies indicate that the protein expression levels of active forms of MMP are extremely low (fmoles) and do not permit any characterisation of those forms of MMP by mass spectrometry, constituting a genuine challenge which can be approached by the development of new photoaffinity probes incorporating a biotin-group. The example of this class of proteins expressed in very low abundance under active form implicates to grant efforts to develop new strategies allowing the capture of the targeted proteins. Key-words: matrix metalloproteinases; functional proteomics; photoaffinity probe; zymography., Les Métalloprotéases matricielles (MMPs) constituent une famille des métalloprotéases à zinc capables conjointement de dégrader l'ensemble des protéines de la matrice extracellulaire. Aujourd'hui, vingt-trois MMPs humaines ont été identifiées et sont caractérisées par leur séquence en aminoacides et leur structure 3D fortement conservées. Ces enzymes sont exprimées de manière constitutive au cours des processus de remodelage tissulaire. Leur surexpression dans un certain nombre de pathologies étroitement liée au phénomène d'inflammation (arthrite, emphysème, cancer) fait des MMPs des cibles thérapeutiques de choix. Cependant, le remodelage entraînant des modifications des contacts cellulaires, les MMPs apparaissent aujourd'hui comme des protéines des voies de signalisation à part entière. Les récentes découvertes de substrats des MMPs ne faisant pas partie des constituants de la matrice extracellulaire renforcent cette vision. Dans le but d'identifier le rôle particulier et le taux d'expression protéique des MMPs dans un contexte pathologique, nous avons développé une technique de protéomique fonctionnelle dédiée à la détection des formes actives des MMPs dans des échantillons tumoraux. Cette technique repose sur le développement d'une nouvelle sonde de photoaffinité, basée sur la structure d'un puissant inhibiteur des MMPs de type phosphinique, permettant de cibler les MMPs sous forme active et de les isoler par marquage par photoaffinité. Le marquage par photoaffinité nous permet ainsi grâce à un élément radioactif incorporé à la sonde de radiomarquer les protéines ciblées. Cette sonde a montré in vitro sa capacité remarquable à modifier de manière covalente la hMMP-12 avec un rendement de 42 %, affichant une sensibilité extrême de détection (2.5 fmoles de hMMP-12). En présence de protéome complexe, la sensibilité de détection de la sonde pour la hMMP-12 est tout à fait comparable (5 fmoles) ; la hMMP-12 représente une fraction de 0.001 % de la quantité totale des protéines. Cette méthode nous a permis également d'identifier de manière indirecte les formes actives des gélatinases en comparant les extraits tumoraux traités par la sonde et les extraits tumoraux analysés en zymographie. Ces études indiquent que les niveaux d'expression des formes actives de MMPs sont très faibles (fmoles) ne permettant pas une caractérisation de celles-ci par spectrométrie de masse, ce qui constitue un véritable défi pouvant être abordé avec de nouvelles sondes incorporant une biotine. Cet exemple de protéines exprimées sous forme active en très faible abondance, implique une orientation des efforts à consentir vers le développement de nouvelles stratégies de capture.

The synthesis of the photoaffinity label 8-N3-[2'-32P]NADP+ is described. The synthesis consists of the following steps: first 8-N3-AMP is synthesized from AMP or ATP and then the 8-N3-AMP is coupled with NMN, using DCCD as coupling reagent. Finally, the formed 8-N3-NAD+ is phosphorylated with [γ-32P]ATP, using NAD-kinase. The formed product is purified and analysed and is shown to react well with NADP-specific enzymes and not to react with NAD-specific enzymes. Additionally, it is proposed that in the NAD-kinase reaction 2 mol ATP are used for the formation of 1 mol NADP: one molecule of ATP is hydrolyzed to ADP and phosphate while the other delivers the phosphate for the phosphorylation of NAD+.