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Introdução: apesar dos grandes avanços alcançados até o momento com a prevenção, diagnóstico e tratamento, a isoimunização pelo fator Rhesus (Rh) é ainda a principal causa de anemia grave em fetos, gerando importante morbimortalidade. Os critérios diagnósticos da anemia fetal são fundamentais para a indicação da melhor abordagem no seguimento e tratamento das gestações complicadas pela isoimunização Rh. Atualmente, o Centro de Medicina Fetal do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais (CEMEFE-HC-UFMG) utiliza a medida do pico da velocidade sistólica da artéria cerebral média associada ao índice cardiofemoral (ICF) para a avaliação dos fetos de gestantes acometidas e necessidade de realização de cordocentese para hematimetria. O conhecimento do comportamento desses índices em fetos com risco de desenvolver anemia já é bem conhecido, porém não se sabe ainda se esses exames se comportam da mesma forma em fetos politransfundidos e se o nível de hemoglobina de adulto na circulação fetal interfere no resultado dos mesmos. Objetivos: o estudo se propõe à avaliação crítica da acurácia do índice cardiofemoral e do pico da velocidade sistólica na artéria cerebral média em fetos submetidos a transfusões intrauterinas subsequentes e a identificar o parâmetro mais fidedigno para o diagnóstico da anemia grave. Pacientes e métodos: foram analisadas 23 gestantes submetidas a pelo menos três transfusões intrauterinas (TIU). Os dados das três primeiras TIUs foram alocados em três grupos referentes a: primeira, segunda e terceira TIU. As pacientes foram acompanhadas durante a gestação e submetidas a exames não invasivos com medida do ICF e pico da velocidade sistólica da artéria cerebral média (PVS-ACM) para a detecção de anemia fetal grave a partir de 22 semanas de gestação. Caso houvesse sinais de hidropisia fetal ou alteração de um dos métodos não invasivos, a paciente era submetida a cordocentese e estudo da hematimetria fetal. Os dados referentes ao ICF e PVS-ACM foram comparados aos resultados de hemoglobina prétransfusional obtidos por meio da cordocentese e alocados em seus grupos respectivos. Resultados: a sensibilidade do ICF na primeira, segunda e terceira TIU foi, respectivamente, 80%, 75% e 90%. Os resultados de valor preditivo negativo (VPN) foram de 90%, 85% e 89%, respectivamente. A sensibilidade do PVS-ACM na primeira, segunda e terceira TIU foi, respectivamente, de 80%, 75% e 45%. Os resultados de VPN foram de 88,8%, 80% e 60%, respectivamente. As curvas receiver operating characteristic (ROC) referentes ao ICF na primeira, segunda e terceira TIU apresentaram áreas sob as curvas de, respectivamente, 0,683 (95% IC, 0,384-0,983), 0,746 (95% IC, 0,510-0,982) e 0,913 (95% IC, 0,792-1,0). A acurácia do ICF e PVS-ACM foi testada em associação nos três grupos, apresentando sensibilidade de 64%, 57% e 40% quando testados em série, respectivamente; e 96%, 93% e 95% quando testados em paralelo, respectivamente. Conclusões: o índice cardiofemoral apresenta-se como método diagnóstico para anemia fetal grave de boa acurácia, mantendo sua efetividade mesmo em fetos politransfundidos. O PVS-ACM perde valor após transfusões intrauterinas repetidas. O uso do PVS-ACM em associação com o ICF aumenta a sensibilidade do screening da anemia fetal grave. Introduction: Despite the great progress achieved to date with the prevention, diagnosis and treatment, isoimmunization Rhesus (Rh) is still the leading cause of severe anemia in fetuses, generating significant morbidity and mortality. The diagnostic criteria for fetal anemia are key for indicating the best approach in the monitoring and treatment of pregnancies complicated by Rh isoimmunization. Currently, the Center for Fetal Medicine, Hospital das Clinicas, Federal University of Minas Gerais (CEMEFE-HC-UFMG) uses the measurement of peak systolic velocity of the middle cerebral artery associated with cardiofemoral index (ICF) for the evaluation of fetuses of pregnant women affected and need to perform cordocentesis for hematimetria. The knowledge of the behavior of these indices in fetuses at risk for anemia is already well known, but not yet known whether these tests behave similarly in fetuses multitransfused and if the hemoglobin level in the fetal circulation of adult prejudice the outcome of these . Objectives: The study aims to assess the accuracy of critical cardiofemoral index and peak systolic velocity in the middle cerebral artery in fetuses undergoing intrauterine transfusions and subsequent identify the most reliable parameter for the diagnosis of severe anemia. Patients and methods: We analyzed 23 pregnant women undergoing intrauterine transfusions at least three (TIU). The data of the first three TIUs were divided into three groups regarding: first, second and third TIU. Patients were followed during pregnancy and undergo noninvasive tests to measure the ICF and peak systolic velocity of the middle cerebral artery (MCA-PSV) for the detection of severe fetal anemia from 22 weeks of gestation. If there were signs of fetal hydrops or alteration of a non-invasive, the patient was subjected to cordocentesis and study of fetal red blood cells. The data relating to ICF and PVS-ACM were compared to the results of pre-transfusion hemoglobin obtained by cordocentesis and assigned to their respective groups. Results: The sensitivity of ICF in the first, second and third TIU was respectively 80%, 75% and 90%. Results from negative predictive value (NPV) were 90%, 85% and 89%, respectively. The sensitivity of the PVS-ACM in the first, second and third TIU was respectively 80%, 75% and 45%. The results VPN were 88.8%, 80% and 60%, respectively. The receiver operating characteristic curves (ROC) for the ICF in the first, second and third TIU showed areas under the curves, respectively, 0.683 (95% CI, 0.384 to 0.983), 0.746 (95% CI, 0.510 to 0.982) and 0.913 (95% CI, 0.792 to 1.0). The accuracy of the ICF and PVS-MA was tested in combination in the three groups, with a sensitivity of 64%, 57% and 40% when tested in series, respectively, and 96%, 93% and 95% when tested in parallel, respectively. Conclusions: The index cardiofemoral presents itself as a diagnostic tool for severe fetal anemia good accuracy while maintaining its effectiveness even in fetuses multitransfused. The PVS-ACM loses value after repeated intrauterine transfusions. The use of PVSACM in association with the ICF increases the sensitivity of the screening of severe fetal anemia.

Introdução: As células F(CF) são eritrócitos contendo hemoglobina (Hb) F e outros tipos de hemoglobina. São encontradas em indivíduos de todas as idades, ao contrário dos eritrócitos fetais, só encontrados em fetos e recém-nascidos. Nestes eritrócitos fetais, a Hb F é o tipo dominante de Hb. Estudos publicados indicam que a gravidez pode levar a um aumento progressivo de células com Hb F no sangue materno, devido à presença de CF e/ou de células fetais, estas últimas frequentemente associadas a hemorragia feto–materna (HFM). Objetivo: (1) Determinação da percentagem (%) de células com Hb F em sangue materno, usando um anticorpo Anti-Hb F num analisador hematológico. (2) Quantificação de CF e/ou células fetais na gravidez e pós o parto. (3) Elaboração de algoritmo para a triagem de HFM. Material e Métodos: Estudadas 168 amostras de sangue materno: 29 no 1º trimestre da gravidez (1ºT); 43 no segundo (2º T); 82 no terceiro (3ºT), 14 pós-parto (PP) (amostras entre dia 0 e dia 7, após parto); 32 controlos negativos (Ctl N) com homens adultos saudáveis e 30 controlos positivos (Ctl P), obtidos por mistura de sangue do cordão com sangue do adulto, AB0 compatíveis. Amostras processadas no analisador hematológico Cell-Dyn Sapphire tm, em modo RBC Flow, após ajuste de parâmetros IAS, FL1 e FL3, utilizando um reagente com iodeto de propídio e 2,5 uL de anticorpo monoclonal anti-Hb F FITC. Imagens analisadas pelo software FCS Express V3. Análise estatística com Kruskal-Wallis e teste t-Student (significância estatística p 0,53%): 66% no grupo 1ºT, 83 % no 2º T e 91% no 3º T. Valor cut-off para suspeita de HFM de 1,70% de células com Hb F. Teste preciso (CV+- 4%) para baixas % de células com Hb F. Discussão/Conclusão: Há um aumento células com Hb F durante a gravidez e esse aumento permanece no período PP. Em duas amostras do 3ºT obteve-se % células com Hb F elevada, superior ao cut-off (≥1,70%), sendo detetada uma população de prováveis células fetais. A presença células fetais nestas amostras foi confirmada por citometria de fluxo com Anti-Hb F/ Anti-CA, com subsequente diagnóstico de HFM. Esta metodologia é simples, rápida e não dispendiosa, quando aplicada a um analisador hematológico, representa uma mais-valia no rastreio da HFM. No futuro, pode integrar o protocolo de análises de rotina das grávidas, permitindo detetar as HFM silenciosas, que são a origem de muitas anemias de causa desconhecida em recém-nascidos.

Orientador: Fernando Ferreira Costa, Anderson Ferreira da Cunha Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Durante o desenvolvimento ontogenético, ocorrem alterações na expressão dos genes das globinas, caracterizando o switching de hemoglobina. Após o nascimento há o silenciamento do gene da globina ? concomitante à ativação do gene da globina ?. Todavia, algumas deleções gênicas no grupamento dos genes das globinas e algumas mutações de ponto no promotor do gene da globina ? são responsáveis pela expressão continuada do gene da globina , resultando em níveis elevados de hemoglobina fetal (HbF) na vida adulta, caracterizando, respectivamente, a Persistência Hereditária de Hemoglobina Fetal delecional e a não delecional (ndPHHF). A mutação de ponto C?G na posição -195 do promotor do gene da globina ?A caracteriza a ndPHHF tipo Brasileira (ndPHHF-B), com aumento nos níveis de HbF entre 6% e 16%. Todavia, o mecanismo molecular responsável pela reativação do gene da globina ?A na ndPHHF-B não está elucidado. Estudos anteriores demonstraram que na ndPHHF tipo Brasileira (-195) a elevação nos níveis de HbF não é mediada pelo aumento na afinidade com o fator de transcrição SP1, como ocorre na ndPHHF-B tipo Inglesa (-198). Na tentativa de compreender o mecanismo responsável pelo fenótipo de ndPHHF-B, buscamos identificar outros fatores de transcrição envolvidos na reativação do gene da globina ?A nessa ndPHHF-B. Os resultados obtidos através de ensaios de Array DNA-proteína, EMSA e ChIP mostraram uma alteração na interação de dois fatores de transcrição: NF-E1/YY1 e PAX1. A mutação -195 C?G abole o sítio de ligação para o NF-E1/YY1 e aumenta a interação do PAX1, um ativador da transcrição, com o promotor do gene da globina ?A , possivelmente levando à reativação desse gene. Também investigamos o possível envolvimento de outros genes que poderiam estar relacionados à manutenção dos níveis elevados de HbF, construindo Bibliotecas Subtrativas Supressivas para identificar transcritos diferencialmente expressos em reticulócitos de portadores de ndPHHF-B. Os resultados apontam para uma possível participação do gene MIER1 no switching da hemoglobina fetal para a adulta, uma vez que esse gene, responsável pelo remodelamento de cromatina e consequente silenciamento gênico, apresentou expressão diminuída em portadores de ndPHHF-B. Identificamos ainda outro gene, o KLF1, com expressão diminuída nesses indivíduos, o que pode favorecer a interação entre o gene da globina ?A e o LCR. Nossos resultados fornecem a primeira evidência in vitro do provável mecanismo molecular envolvido na reativação do gene da globina ?A na ndPHHF tipo Brasileira Abstract: Hemoglobin switching occurs after birth resulting in a decrease in gamma globin gene expression. Although, some single point mutation in this gene are able to maintain its expression during adult life, leading to increased production of fetal hemoglobin (HbF) which characterize the non deletion Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin (ndHPFH). Among these, the Brazilian type of ndHPFH corresponds to the C?G substitution at the -195 position of the A gamma globin gene. However, the molecular mechanism responsible for this phenotype still unclear. In contrast to the British ndHPFH type (-198), where the mechanism responsible for the increase of HbF levels is mediated by the raising in the affinity for the SP1 transcription factor, the Brazilian ndHPFH mutation does not affect Sp1 binding. In order to elucidate this mechanism, we tried to identify others transcription factors involved in the reactivation of the A gamma globin gene in the Brazilian ndHPFH. Alterations in the binding of two transcription factors were identified by DNA-protein Array, EMSA and ChIP: NF-E1/YY1 and PAX-1. Our results suggest that the -195C?G in the A gamma globin promoter may abrogate NF-E1/YY1 binding and increase PAX-1 binding in this DNA region, probably resulting in the reactivation of this gene. We also investigate others genes that may be involved in hemoglobin switching and/or maintenance of elevated HbF levels in Brazilian ndHPHF using Suppression Subtractive Hybridization Library to identify transcripts that are differentially expressed in reticulocytes of ndHPFH Brazilian subjects. MIER1 expression was found to be decreased in Brazilian ndHPFH reticulocytes, compared to controls. The MIER1 gene is able to chromatin-remodeling leading to the formation of heterochromatin and, consequently, silencing genes. This MIER1 may be an important gene in gamma to beta globin gene switching, where it could help in the maintenance of a closed chromatin structure in the gamma globin gene in individuals with low HbF levels. Another gene identified was KLF1 which expression was decreased in Brazilian HPFH and favors the interaction between the A gamma globin gene and the LCR. These results provide the first in vitro evidence for the possibly molecular mechanism of reactivation of the A gamma globin gene in Brazilian nHPFH. Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica

Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente apresentada à Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa. Dissertação orientada pela Doutora Paula Faustino (Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge) e pela Professora Deodália Dias, Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa A hemoglobina é uma proteína essencial, constituinte maioritário dos eritrócitos, cuja principal função é o transporte de oxigénio no organismo. Esta é constituída por quatro cadeias globínicas, cada uma ligada a um grupo heme, que contém um ião Fe2+ ao qual se liga uma molécula de O2. As patologias associadas à hemoglobina (Hb) têm o nome genérico de hemoglobinopatias. Estas poderão ser do tipo quantitativo (as talassémias) ou qualitativo (as variantes da hemoglobina). De entre estas últimas salienta-se a mais comum, denominada Drepanocitose ou Anemia das células falciformes. A Drepanocitose é uma doença autossómica recessiva, que se caracteriza pela presença em homozigotia de uma mutação de A > T no codão 6 de gene da beta-globina (HBB). Os doentes drepanocíticos são incapazes de sintetizar a hemoglobina predominante no adulto normal, a HbA. Pelo contrário, é sintetizada uma variante de hemoglobina, a HbS, que tem propriedades de falciformização no eritrócito e origina, consequentemente, eventos de vaso-oclusão e anemia hemolítica crónica. Embora a Drepanocitose seja uma doença monogénica, os seus fenótipos (hematológico e clínico) têm gravidade variável pois são modificados por vários factores ambientais e genéticos. Este trabalho tinha como objectivos caracterizar uma população de 108 indivíduos para a presença da mutação drepanocítica, da deleção α-talassémica de 3,7 kb, quanto ao haplótipo no agrupamento génico β-globina e para uma série de polimorfismos em BCL11A e HBS1L-MYB. Seguidamente, pretendeu-se verificar se os genótipos caracterizados nestes loci seriam moduladores do nível de Hb Fetal (HbF; um parâmetro já aceite como sendo benéfico nesta patologia) e/ou do curso clínico da doença (medido através do número de crises de dor aguda que levaram a internamento dos doentes devidas, na sua maioria, à vaso-oclusão). Verificou-se que a população drepanocítica analisada apresenta 29% de frequência alélica para a deleção α-talassémia de 3,7 kb. Observou-se que os indivíduos drepanocíticos que co-herdaram α-talassémia apresentam microcitose, hipocromia e níveis baixos de Hb total. Não foi encontrada associação entre presença da deleção de 3,7kb e o nível de HbF. No entanto, relativamente à relação entre a presença desta deleção e a gravidade da doença, observaram-se melhorias significativas nos heterozigóticos. Observou-se que os heterozigóticos para esta deleção tinham 29% menos risco de terem crises com internamento do que os homozigóticos e os que não co-herdaram α-talassémia apresentam apenas menos 12% de risco. Concluimos, portanto, que a co-herança da delecção α-talassémica de 3,7 kb confere um efeito benéfico quando em heterozigotia e um efeito nefasto quando em homozigotia. Concluiu-se que a maior parte dos indivíduos apresentava o haplótipo Bantu no agrupamento génico da β-globina, seguido do Benim. Embora não se tendo observado associação entre o haplótipo e o nível de HbF, observou-se que, tendencialmente, a homozigotia para o haplótipo Bantu corresponde a níveis mais baixos de HbF e a homozigotia para o haplótipo Senegal encontra-se, tendencialmente, associado a níveis elevados de HbF. Não se verificou associação entre os polimorfismos globínicos, estudados na região promotora do gene Gγ-globina (rs112215533, rs112075505 e rs112479156) e o nível de HbF. No que diz respeito aos polimorfismos em BCL11A (rs11886868, rs4671393, rs10189857 e rs45506594) verificaram-se associações estatisticamente significativas entre a presença dos alelos menos frequentes para os dois primeiros polimorfismos e o nível de HbF (respectivamente, p = 0,001 e p < 0,001). Observaram-se também melhorias do curso clínico da doença aquando da presença destes alelos. Relativamente ao SNP rs11886868, concluiu-se que os indivíduos heterozigóticos para o alelo mais raro (TC) tinham 36% menos risco de terem crises com internamento que os TT, enquanto que nos homozigóticos para esse alelo (CC) a melhoria ascendia a 62% menos de risco que os TT. Relativamente ao polimorfismo rs4671393 pôde constatar-se que a presença do alelo menos frequente em heterozigotia (AG) conferia a esses doentes 38% menos risco de terem crises com internamento que os GG, e que esse valor era de menos 60% para os AA, também relativamente aos GG. No que se refere ao outro polimorfismo não globínico estudado, SNP rs9402686 em HBS1L-MYB, não se verificou associação com o nível de HbF. Em conclusão, com este estudo conseguiram-se identificar dois polimorfismos (em BCL11A, SNP rs11886868 e rs4671393) associados a níveis de HbF mais elevados e a um curso clínico mais suave da drepanocitose, podendo assim ser utilizados como preditores precoces da gravidade da doença e para adequar a terapêutica às necessidades de cada doente. Hemoglobin is an essential protein, and a major constituent of red blood cells, with its’ main function being to transport oxygen in the organism. It is composed of four globin chains, each of which is linked to a heme group, which contains a Fe2+ ion that binds to a molecule of O2. Hemoglobin associated pathologies are generically called hemoglobinopathies which can be of either a quantitative or qualitative type. One of the latter is Sickle Cell Anemia (SCA), a recessive autosomic disorder, characterized by the presence of a homozygous mutation A > T in codon 6 of the beta-globin gene (HBB). Individuals with SCA are unable to synthesize the predominant hemoglobin present in normal adults, HbA. Instead it is synthesized the variant HbS which leads to the sickling of red blood cells and therefore to vaso-occlusion events and chronic hemolytic anemia. Although Sickle Cell Anemia is a monogenic disease its hematological and clinical phenotypes have variable severity as they are modified by various environmental and genetic factors. The objectives of this study were to characterize a population of 108 individuals, with sickle cell anemia, for the presence of the α-thalassemia deletion of 3.7 kb, the haplotype in the β-globin gene cluster and for a number of polymorphisms in the BCL11A and HBS1L-MYB. Next, the study sought to determine whether the genotypes at these loci were modulators of fetal Hb level (HbF; a parameter already accepted as being beneficial in this condition) and / or the clinical course of disease (measured by the number of crisis of acute pain which led to hospitalization of patients mostly as a consequence of vascular occlusion). The analyzed population was found to have had an allelic frequency of 29% for α-thalassemia deletion of 3.7 kb. It was observed that those individuals with sickle cell Anemia who co-inherited α-thalassemia had microcytosis, hypochromia and low levels of total Hb. No association was found between the presence of the deletion of 3.7 kb and the level of HbF. However, on the relationship between the presence of this deletion and the severity of the disease, significant improvements were observed in the heterozygotes. It was observed that the heterozygotes for this deletion had 29% less likelihood of a crisis resulting in hospitalization than homozygotes, and those individuals who did not co-inherit α-thalassemia had only a 12% less risk. It was concluded, therefore, that the co-inheritance of α-thalassemia deletion of 3.7 kb confers a beneficial effect when heterozygous and an adverse effect when in homozygosity. It was also concluded that most individuals had the Bantu haplotype in the of β-globin gene cluster, followed by the Benin haplotype. Whilst not having observed association between the haplotype and HbF level, a tendency was observed for the Bantu haplotype in homozygosity for lower levels of HbF and the Senegal haplotype in homozygosity, usually associated with high levels HbF. There was no association between polymorphisms studied in the promoter region of the Gγ-globin gene (rs112215533, and rs112075505 rs112479156) and the level of HbF. In regards to the polymorphisms in BCL11A (rs11886868, rs4671393, rs10189857 and rs45506594) there were significant associations between the presence of less common alleles for the first two polymorphisms and the level of HbF (respectively, p = 0.001 and p < 0.001). There were also improvements in the clinical course of disease when these alleles were present. For the SNP rs11886868, it was concluded that heterozygous individuals for the rarest allele (CT) were 36% less likely to have crises with hospitalization than individuals with the TT genotype, whereas in homozygosity for this allele (CC) the improvement amounted to a 62% less risk. For the rs4671393 polymorphism it was seen that the presence of the less frequent allele in heterozygotes (AG) gave 38% of these patients less risk of seizures which required hospitalization than those individuals with the GG haplotype; the value was less than 60% for AA compared with the GG haplotype. As for the other non-globin polymorphism studied, SNP rs9402686 in HBS1L-MYB, no association with the level of HbF was found. In conclusion, this study identified two polymorphisms (in BCL11A, rs11886868 and rs4671393 SNP) associated with higher levels of HbF and a milder clinical course of sickle cell disease, which can be used as early predictors of disease severity and to adjust the therapy to individual patient needs. parcialmente financiado por projecto da FCT: PIC/IC/83084/2007 e Programa de financiamento plurianual do CIGMH

Orientador: Fernando Ferreira Costa Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A anemia falciforme (AF) é um distúrbio genético da hemoglobina causado por uma mutação de ponto no gene da beta-globina com consequente produção de hemoglobina S (HbS). A polimerização de HbS causa a deformação, enrijecimento e diminuição da flexibilidade das hemácias, resultando em uma série de eventos que levam a redução da sua vida média. Os principais fatores que influenciam a polimerização são: concentração de oxigênio e concentração de hemoglobina fetal (HbF). Pacientes com AF apresentam aumento dos níveis circulantes de citocinas, incluindo fator de necrose tumoral-'alfa' (TNF-'alfa') que possui efeitos pró-inflamatórios resultando no aumento das propriedades quimiotáxicas e a aderência de neutrófilos ao endotélio vascular. Muitos estudos têm sido realizados com o intuito de buscar novas estratégias terapêuticas que contribuam para o aumento dos níveis de HbF e diminuam os níveis de citocinas inflamatórias. Com este objetivo, novos compostos que agregam funções anti-inflamatórias e são moléculas doadoras de óxido nítrico, foram desenvolvidas. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos dos compostos derivados da hidroxiureia e da talidomida na produção de HbF, na atividade quimiotática e na produção de espécies reativas de oxigênio em células de pacientes com anemia falciforme e indivíduos controles, tratadas com o composto denominado Lapdesf 1, assim como a concentração de citocinas inflamatórias, em culturas de células mononucleares de camundongos falciforme. Os resultados obtidos demonstram que o composto Lapdesf 1 foi capaz de aumentar os níveis de HbF em cultura de células CD34+ e em linhagem celular K562. Os neutrófilos de indivíduos controles e pacientes com AF, tratados com este composto apresentaram a capacidade quimiotática induzida por Il-8 significativamente reduzida em relação ao controle, e o tratamento com Lapdesf 1 não alterou a geração de espécies reativas de oxigênio em plaquetas, neutrófilos, eritrócitos e células mononucleares. O tratamento de camundongos transgênicos para a AF demonstrou a capacidade desse composto em aumentar os níveis de HbF, além de diminuir a quantidade de citocinas inflamatórias no sobrenadante de culturas de células mononucleares de camundongos. Em resumo nossos resultados sugerem que o composto Lapdesf 1, apresenta-se como uma nova alternativa terapêutica, pela capacidade de aumentar a síntese de HbF e diminuir os níveis de citocinas inflamatórias e seus efeitos, que merece ser testada como possível tratamento da anemia falciforme Abstract: Sickle cell anemia is a genetic hemoglobin disorder caused by a point mutation that produces hemoglobin S (HbS). Polymerization of HbS causes deformation, stiffness and decreased flexibility of red blood cells, resulting in different events. The main factors influencing polymerization are: oxygen concentration and intracellular concentration of fetal hemoglobin (HbF). It has been reported that patients with sickle cell disease have increased circulating levels of cytokines, including tumor necrosis factor-'alfa' (TNF-'alfa') which has pro-inflammatory effects, resulting in increased chemotactic properties and adhesion of neutrophils to vascular endothelium. Many studies have been conducted in order to pursue new therapeutic strategies that increase fetal hemoglobin levels and lower levels of inflammatory cytokines. New compounds have been developed for the treatment of some sickle cell anemia symptoms. These compounds have several functions: they act as antiinflammatory agents, and donate nitric oxide. Thus the objectives of this study were to evaluate effects of compounds derived from hydroxyurea and thalidomide in the production of HbF, chemotactic activity and production of reactive oxygen species in cells from patients with sickle cell anemia and controls treated with the compound called Lapdesf1, and also the concentration of inflammatory cytokines in cultures of mononuclear cells from sickle cell mice. Our results demonstrate that the compound, Lapdesf 1, was able to increase levels of fetal hemoglobin in CD34+ cultured cells and K562 lineage cells. Neutrophils from control subjects and patients with sickle cell anemia had their chemotactic capacity significantly reduced following treatment with this compound; furthermore, the compound did not alter the generation of reactive oxygen species in platelets, neutrophils, red cells and mononuclear cells. Treatment of transgenic sickle cell anemia mice demonstrated the ability of the compound to increase fetal hemoglobin in vivo and reduce the amount of inflammatory cytokines such as TNF-'alfa', IL-8, IL-6 and IL- 1ß in the supernatant of cultures of mononuclear cells from sickle mice. In summary, our results suggest that the compound Lapdesf 1 has the ability to increase HbF synthesis and decrease the levels of inflammatory cytokines and their effects. So this compound may present promise as a new drug for the treatment of sickle cell disease, minimizing the clinical complications associated with this disease Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica

A anemia falciforme está entre as doenças genéticas mais comuns e mais estudadas em todo o mundo. Ela é causada por mutação no gene β, produzindo alteração estrutural na molécula da hemoglobina. As moléculas de HbS, decorrentes da mutação, sofrem processo de polimerização fisiologicamente provocado pela baixa tensão de oxigênio, acidose e desidratação. Com isso, os eritrócitos passam a apresentar a forma de foice, causando vaso-oclusão e outras conseqüências. O objetivo desse estudo foi revisar a importância da hemoglobina fetal na clínica de pacientes portadores de anemia falciforme. O significado clínico da associação da elevação da hemoglobina fetal na anemia falciforme mostra-se favorável em termos hematológicos, pois, nessa interação, as células-F têm baixas concentrações de HbS e, com isso, inibem a polimerização da HbS e a alteração da morfologia dos eritrócitos. O tratamento com hidroxiuréia, em função do aumento na expressão da hemoglobina fetal que este fármaco proporciona, traz aos pacientes falcêmicos uma melhora significativa em sua clínica. Portanto, a hemoglobina fetal consiste no maior inibidor da polimerização da desoxi-HbS e, com isso, evita a falcização do eritrócito, a anemia hemolítica crônica, as crises dolorosas vaso-oclusivas, o infarto e a necrose em diversos órgãos, melhorando a clínica e a expectativa de vida dos pacientes. Sickle cell disease is one of the commonest and most studied genetic diseases in the world. Caused by a mutation of the β gene, it changes the molecular structure of hemoglobin. Abnormal Hb S molecules suffer polymerization physiologically provoked by a low oxygen tension, acidosis and dehydration. As a result, red blood cells take on a sickle cell form, which causes microvascular occlusion with varying consequences. The objective of this study was to review the importance of fetal hemoglobin in the clinical assessment of sickle cell disease patients. It has been shown that the association of high levels of fetal hemoglobin with sickle cell disease is favorable in hematological terms. In this interaction, F cells have low Hb S concentrations and thus inhibit Hb S polymerization and the morphological alteration of red blood cells. Treatment with hydroxyurea resulting in an increased fetal hemoglobin expression brings about a significant improvement in the patient's clinical state. Thus, fetal hemoglobin constitutes the greatest inhibitor of desoxi-Hb S polymerization and avoids the morphological alteration of red blood cells, chronic hemolytic anemia, painful microvascular occlusive crises, bone infarction and necrosis of several organs thereby improving the clinical outcome and the patients' life expectancy.

A anemia falciforme está entre as doenças genéticas mais comuns e mais estudadas em todo o mundo. Ela é causada por mutação no gene β, produzindo alteração estrutural na molécula da hemoglobina. As moléculas de HbS, decorrentes da mutação, sofrem processo de polimerização fisiologicamente provocado pela baixa tensão de oxigênio, acidose e desidratação. Com isso, os eritrócitos passam a apresentar a forma de foice, causando vaso-oclusão e outras conseqüências. O objetivo desse estudo foi revisar a importância da hemoglobina fetal na clínica de pacientes portadores de anemia falciforme. O significado clínico da associação da elevação da hemoglobina fetal na anemia falciforme mostra-se favorável em termos hematológicos, pois, nessa interação, as células-F têm baixas concentrações de HbS e, com isso, inibem a polimerização da HbS e a alteração da morfologia dos eritrócitos. O tratamento com hidroxiuréia, em função do aumento na expressão da hemoglobina fetal que este fármaco proporciona, traz aos pacientes falcêmicos uma melhora significativa em sua clínica. Portanto, a hemoglobina fetal consiste no maior inibidor da polimerização da desoxi-HbS e, com isso, evita a falcização do eritrócito, a anemia hemolítica crônica, as crises dolorosas vaso-oclusivas, o infarto e a necrose em diversos órgãos, melhorando a clínica e a expectativa de vida dos pacientes. Sickle cell disease is one of the commonest and most studied genetic diseases in the world. Caused by a mutation of the β gene, it changes the molecular structure of hemoglobin. Abnormal Hb S molecules suffer polymerization physiologically provoked by a low oxygen tension, acidosis and dehydration. As a result, red blood cells take on a sickle cell form, which causes microvascular occlusion with varying consequences. The objective of this study was to review the importance of fetal hemoglobin in the clinical assessment of sickle cell disease patients. It has been shown that the association of high levels of fetal hemoglobin with sickle cell disease is favorable in hematological terms. In this interaction, F cells have low Hb S concentrations and thus inhibit Hb S polymerization and the morphological alteration of red blood cells. Treatment with hydroxyurea resulting in an increased fetal hemoglobin expression brings about a significant improvement in the patient's clinical state. Thus, fetal hemoglobin constitutes the greatest inhibitor of desoxi-Hb S polymerization and avoids the morphological alteration of red blood cells, chronic hemolytic anemia, painful microvascular occlusive crises, bone infarction and necrosis of several organs thereby improving the clinical outcome and the patients' life expectancy.

Introdução: a anemia fetal decorrente da isoimunização materna por antígenos eritrocitários tem despertado grande interesse devido a sua morbimortalidade e da alta prevalência em nosso meio. Para o acompanhamento e tratamento adequados da doença hemolítica perinatal, é necessário o diagnóstico preciso do grau de anemia fetal. Apesar da eficácia da amniocentese e da cordocentese para o acompanhamento pré-natal na isoimunização maternofetal, as complicações associadas a esses procedimentos justificam a busca de métodos diagnósticos não invasivos que possam predizer com segurança a intensidade da anemia fetal. O índice cardiofemoral (medida ecográfica do diâmetro biventricular externo/comprimento dofêmur) tem sido utilizado como importante método não invasivo de avaliação da anemia fetal, porém necessita ainda de mais estudos para validação de seu valor científico. Objetivo: avaliar a correlação entre a medida ultra-sonográfica do índice cardiofemoral com o déficit dehemoglobina em fetos de gestantes isoimunizadas. Pacientes e métodos: realizou-se estudo transversal no qual foram acompanhados 125 fetos, com idade gestacional entre 20 e 35 semanas, de 124 gestantes portadoras de isoimunização por antígenos eritrocitários, nos quais foram realizadas 339 cordocenteses. Antes da coleta de sangue fetal, com a visão ultrasonográfica das quatro câmaras do coração fetal, em tempo real e com o modo-M, foi medido o diâmetro biventricular externo (DBVE), a seguir foi medido o comprimento do fêmur (CF) ao longo da diáfise, excluindo-se a epífise distal. Calculou-se o índice cardiofemoral (DBVE/CF). Utilizou-se o equipamento de ultra-som US SONOACE 8800 (MEDSOM) com sonda setorial de 3,5 Mhz. A concentração de hemoglobina foi determinada por meio de fotômetro no sistema HEMOCUE. O déficit de hemoglobina (Déf Hb) foi calculado baseado na curva de normalidade de Nicolaides (NICOLAIDES et al., 1988a). A ausência de anemia foi definida quando o Déf de Hb era < 2 g/dl; a anemia não grave quando o Déf Hb era = 2 g/dl e < 5 mg/dl e a anemia grave quando o Déf Hb era = 5 mg/dl. Resultados: no momentode sua inclusão no estudo 24% dos fetos não apresentavam anemia, a anemia foi classificada como não grave em 40,8% e grave em 35% dos fetos. Os valores do índice cardiofemoral foram, em média, significativamente menores no grupo sem anemia grave e maiores no grupo dos anêmicos graves (p

Orientador: Fernando Ferreira Costa Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A anemia falciforme (AF) é causada pela substituição de uma única base no códon 6 do gene da globina beta (GAG - GTG), levando à produção de hemoglobina S. Estudos recentes têm mostrado que a ativação de guanilato ciclase (GCs) em linhagens de células eritrocíticas e em cultura primária de precursores da série vermelha, causa um aumento na transcrição do gene gama globina e conseqüentemente aumento na produção de hemoglobina fetal (Hb F) (Ikuta et al., 2001). Os nucleotídeos cíclicos, AMPc e GMPc são segundos mensageiros responsáveis por vários sinais extracelulares, incluindo hormônios e neurotransmissores e provavelmente têm papel importante na anemia falciforme regulando a produção de HbF. Este trabalho teve como objetivo, primeiramente, estabelecer um sistema de cultura de células CD 34+ e posteriormente investigar a existência de uma via NO-GMPc/AMPc envolvida na produção de Hb F nos eritrócitos de pacientes com anemia falciforme e verificar se haveria aumento da expressão de GCs e de gama globina nestes mesmos pacientes. Amostras de sangue foram coletadas de voluntários sadios e pacientes com anemia falciforme. Foi utilizado cultura de células CD34+ hematopoéticas de sangue periférico, e ao longo da diferenciação eritróide (7°, 10° e 13° dia) foram coletadas células para citometria de fluxo, citospin, dosagem de GMPc e AMPc e avaliação da expressão gênica de gama globina, GCs alfa e beta subunidades, eNOS, PDE3B, CD36, CD29B e CD49. Observamos que gama globina encontra-se significativamente mais expressa nas culturas falciformes no 13° dia de diferenciação eritróide em relação ao mesmo ponto das culturas controle (2,945 ± 0,303 x 1,445 ± 0,165, respectivamente ,p=0,0095, n=6). A expressão de GCs alfa e beta subunidades, eNOS, PDE3B, CD36, CD29B e CD49 não apresentou diferenças significativas durante a diferenciação eritróide nas culturas falciformes e controles. Os níveis de GMPc nas culturas de pacientes com anemia falciforme estavam significativamente diminuídos ao longo da eritropoese in vitro em comparação com as culturas controles (dia 7: 0,2765 ± 0,0527 x 0,639 ± 0,1221 (p=0,0260); dia 10: 0,1166 ± 0,0219 x 0,268 ± 0,1181; dia 13: 0,037 ± 0,0061 x 0,093 ± 0,0236 (p=0,0152), respectivamente), enquanto o AMPc, encontrava-se elevado no dia 7 das culturas falciformes em relação às culturas controles (dia 7: 72,017 ± 14,849 x 24,987 ± 13,497 (p=0,048); dia 10: 36,3384 ± 16,708 x 8,663 ± 4,591; dia 13: 1,7138 ± 1,093 x 0,680 ± 0,370, respectivamente). O tratamento com BAY 41-2272 (ativador de GCs) em única cultura controle aumentou aproximadamente 3x os níveis de gama globina após 72 h de incubação. Nossos resultados sugerem que as células tronco hematopoéticas dos pacientes com AF são diferentes às dos controles, uma vez que ambas, sob as mesmas condições in vitro expressaram níveis significativamente diferentes de gama globina. Um cross talk entre o GMPc e o AMPc poderia regular a expressão de gama globina ao longo da diferenciação eritróide. Estes dados resultam no primeiro trabalho a demonstrar a expressão basal de gama globina ao longo da diferenciação eritróide de pacientes com anemia falciforme. Desta maneira, o esclarecimento desta via pode contribuir com entendimento da fisiopatologia da anemia falciforme e identificar novos alvos para a regulação farmacológica de hemoglobina fetal Abstract: Sickle cell disease (SCD) is caused by the substitution of a single base in codon 6 of the beta globin gene (GAG-GTG), causing the production of S hemoglobin. Recent studies have demonstrated that the activation of soluble guanylate cyclase (sGC) in erythrocytic cell lines and in primary erythroid precursor culture causes an increase in the transcription of the gamma globin gene and, consequently, an augmented production of fetal hemoglobin (HbF) (Ikuta et al., 2001). The cyclic nucleotides, cAMP and cGMP, are second messengers that are responsible for mediating the signaling of various extracellular signals, including those of hormones and neurotransmitters and, probably, have an important role in SCD by regulating the production of HbF. This study aimed to investigate the existence of a NO-cAMP/cAMP pathway involved in the production of HbF in the erythroid cells of patients with SCD and to determine whether there is an increase in the expression of sGC and of gamma globin in these same patients. Blood samples were collected from healthy volunteers and SCD patients. Peripheral blood hematopoietic CD34+ cell culture was used for the investigation; cells were differentiated into erythroid lineage and cells collected (7th, 10th and 13th day) for flow cytometry, citospin, measurement of cGMP/cAMP and evaluation of the gene expression of gamma globin, the sGC alpha and beta subunits, eNOS, PDE3B, CD36, CD29B and CD49. We demonstrate that gamma globin was significantly more expressed in the cultures of SCD cells on the 13th day of erythroid differentiation compared to the same time point in control cells (2.95 ± 0.30 vs. 1.45 ± 0.17, respectively, p=0.0095, n=6). The expression of sGC alpha and beta subunits, eNOS, PDE3B, CD36, CD29B and CD49 did not present significant differences during erythroid differentiation in control or SCD cell cultures. Levels of cGMP were significantly decreased during erythropoiesis in the SCD cultures compared to control cultures (day 7: 0.277 ± 0.053 vs. 0.639 ± 0.122 (p=0.026); day 10: 0.117 ± 0.022 vs. 0.268 ± 0,118; day 13: 0.037 ± 0.006 vs. 0.093 ± 0.024 (p=0.015), respectively). In contrast, levels of cAMP were significantly increased in the SCD cultures compared to the control cultures (day 7: 72.02 ± 14.85 vs. 24.99 ± 13.50 (p=0.048); day 10: 36.34 ± 16.71 vs. 8.66 ± 4.59; day 13: 1.74 ± 1.09 vs. 0.680 ± 0.370, respectively). Treatment with BAY 41-2272 (sGC inducer) in a single control cell culture increased the levels of gamma globin by approximately 3 times after 72h of incubation. Results suggest that the hematopoietic stem cells of SCD patients are significantly and constitutively different to those of controls, since under the same in vitro culture conditions, differentiation of the two cell types results in consistently significant different levels of gamma globin. A cross talk between cGMP and cAMP may regulate the expression of gamma globin during erythroid differentiation in patients with SCD. Thus, further investigation of this pathway may contribute to the understanding of the physiopathology of the disease and identify new targets for the pharmacological regulation of HbF production Doutorado Medicina Experimental Doutor em Fisiopatologia Médica

Objetivo: Foram dois os objetivos do estudo. O primeiro foi verificar se há possibilidade de calcular o volume sanguíneo que permita a correção da anemia fetal (Hb-pós = 14,0g%) baseando-se nos seguintes parâmetros fetais: idade gestacional e hemoglobina pré-transfusional. E o segundo foi verificar se o volume de sangue necessário para elevar a hemoglobina do feto em 1,0g% difere significativamente quando os fetos estão agrupados no segundo ou no terceiro trimestre de gestação. Pacientes e Método: Foram selecionadas pacientes do pré-natal do Centro de Medicina Fetal do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais (CEMEFE), no período de fevereiro de 2001 a dezembro de 2004, cujos fetos eram comprometidos pela anemia secundária à isoimunização materna pelo fator Rh. Realizou-se um total de 116 cordocenteses em 48 fetos decorrentes de gestação única. Na primeira etapa, para obter-se uma fórmula matemática de predição do volume a ser transfundido para correção da anemia fetal objetivando uma hemoglobina final de 14,0g%, realizou-se uma análise multivariada envolvendo os seguintes parâmetros: idade gestacional e hemoglobina pré-transfusional. Empregou-se o programa MINITAB Inc®, versão 1997 e considerou-se significativo um p

CONTEXT AND OBJECTIVE: Acquired fetal hemoglobin (HbF) elevation has been implicated as a prognostic factor in dyserythropoietic disorders. Our objectives were to examine acquired HbF increases in aplastic anemia (AA) and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) patients, and to evaluate whether there is an association between the presence of XmnI and 5' hypersensitive site locus control region (LCR-HS2) polymorphisms and the HbF levels. DESIGN AND SETTING: Cross-sectional study at the Hematology and Blood Transfusion Service of Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina. METHODS: We studied a group of 37 patients with AA and/or PNH. Polymerase chain reaction (PCR) and enzymatic digestion were utilized to analyze XmnI polymorphisms; and PCR, cloning and automated sequencing for the HS2 polymorphisms. RESULTS: The mean HbF level was 2.32%, but there was no significant difference in HbF level between the AA and PNH groups (p = 0.46). HbF levels of less than 1.0% showed a significant correlation with absence of the XmnI (+) polymorphism (p = 0.02). The presence of the XmnI allele was greater in the AA group (p = 0.007). CONCLUSIONS: XmnI polymorphism absence reduction is associated with acquired HbF elevation. Further studies are required to confirm these observations and make treatment, prognosis and survival comparisons. CONTEXTO E OBJETIVO: O aumento adquirido da hemoglobina fetal (HbF) já foi implicado como fator prognóstico em distúrbios diseritropoiéticos. Nossos objetivos foram de examinar elevações adquiridas na HbF em pacientes com anemia aplástica (AA) e hemoglobinúria paroxística noturna (PNH), e de avaliar se há associação entre a presença de polimorfismos XmnI e de região de controle de locus gênico 5' (LCR-HS2) e os níveis de HbF. TIPO DE ESTUDO E LOCAL: Estudo longitudinal no Serviço de Hematologia e Transfusão de Sangue da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina. MÉTODOS: Estudamos um grupo de 37 pacientes com AA e/ou PNH. Reação de polimerase em cadeia (PCR) e digestão enzimática foram usadas para analisar polimorfismos XmnI; e PCR para clonagem e sequenciamento automático dos polimorfismos HS2. RESULTADOS: O nível médio de HbF foi de 2,32%, mas não houve diferença significativa entre o nível de HbF dos pacientes AA e PNH (p = 0.46). Os níveis de HbF menores que 1,0% mostraram correlação estatisticamente significativa com ausência do polimorfismo XmnI (+) (p = 0.007). CONCLUSÕES: Ausência de polimorfismo XmnI está associado com diminuição de HbF. Mais estudos são necessários para confirmar estas observações e fazer comparações sobre tratamento, prognóstico e sobrevida.

142f. Submitted by Suelen Reis (suziy.ellen@gmail.com) on 2013-05-24T13:11:05Z No. of bitstreams: 1 Elisangela Adorno.pdf: 3379043 bytes, checksum: 972521d9aae8561da326946dd4da678a (MD5) Approved for entry into archive by Flávia Ferreira(flaviaccf@yahoo.com.br) on 2013-05-30T00:18:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Elisangela Adorno.pdf: 3379043 bytes, checksum: 972521d9aae8561da326946dd4da678a (MD5) Made available in DSpace on 2013-05-30T00:18:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elisangela Adorno.pdf: 3379043 bytes, checksum: 972521d9aae8561da326946dd4da678a (MD5) Previous issue date: 2005 Introdução. A hemoglobina S (HbS) resulta da troca de nucleotídeo (GAG GTG) no sexto codon do gene da globina beta, levando à substituição do ácido glutâmico por valina na cadeia da globina beta. A anemia falciforme ou a homozigose para a HbS, freqüentemente apresenta manifestações clínicas heterogêneas, fortemente relacionadas aos níveis de hemoglobina fetal (HbF). Objetivo. O presente estudo investigou as características fenopíticas e os marcadores moleculares presentes em portadores da anemia falciforme de Salvador-BA, identificando seqüências gênicas potencialmente importantes para a expressão dos genes gama. Métodos. O perfil de hemoglobinas e o nível de HbF foram determinados por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). Informações sobre o perfil clínico dos pacientes foram obtidas através da análise de prontuários. A talassemia α2 3.7Kb foi investigada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e os haplótipos ligados ao grupo de genes da globina berta S foram investigados por PCR e análise de sítios polimórficos utilizando endonucleases de restrição (RFLP). As regiões promotoras dos genes yG e γA e o HS2-LCR foram amplificados assimetricamente e seqüenciadas no ABI Prism 3100 prism DNA Sequencer. As análises estatísticas foram desenvolvidas no software EPI-INFO versão 6.04 e a significância foi estabelecida para p < 0.05. Resultados. Foram analisados 131 pacientes, dos quais 125 tiveram identificado o genótipo beta S, tendo sido encontrado 64 (51,2%) CAR/Ben; 36 (28,8%) Ben/Ben; 18 (14,4%) CAR/CAR; dois (1,6%) CAR/Aty;dois (1,6%) Ben/Cam; um (0,8%) CAR/Cam; um (0,8%) Car/Arabia-India e um (0,8%) Sen/Aty. A talassemia 2 3.7Kb foi estudada em 110 pacientes, onde 30 (27,3%) foram heterozigotos e dois (1,8%) homozigotos. O uso de transfusão sangüínea foi maior em pacientes com HbF menor que ou igual a 10,0% (p=0,009). Pacientes com genótipos α diferentes apresentaram diferenças para os valores de Hb (p=0,018); Ht (p=0,019); VCM (p=0,0004) e HCM (p=0,039). Os níveis de HbF foram maiores entre os pacientes Ben/Ben que entre os CAR/CAR (p=0,007) e CAR/Ben (p=0,013). A análise das seqüências do HS2-LCR de dez indivíduos demonstrou a substituição G A na posição ?10.677, presente apenas entre os portadores do haplótipo Ben com nível elevado de HbF, sugerindo uma possível associação entre este polimorfismo, a expressão dos genes γ e a síntese da HbF. A análise da região promotora do gene γG demonstrou a substituição T C na posição -157, que parece ser uma seqüência característica entre os pacientes estudados. Também foi encontrada a deleção de 4 pb na posição ?222 a ?225 no gene γG e relacionado ao haplótipo Cam. Conclusões. Os dados demonstraram um novo polimorfismo localizado no HS2-LCR e na região promotora do gene γG da globina, justificando a realização de estudos adicionais, associando os níveis de HbF, marcadores biológicos e mecanismos relacionados, visando esclarecer um possível papel no desenvolvimento do fenótipo da doença. Salvador

Orientador: Fernando Ferreira Costa Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A anemia falciforme (AF) é uma das mais freqüentes hemoglobinopatias ocorrentes no Brasil. Ela é causada por uma mutaçãode ponto (GAG- GTG) que leva à produção de uma valina ao invés de um ácido glutâmico no códon seis da 'beta' globina, originando uma hemoglobina estruturalmente anormal, a hemoglobina... Observação: O resumo na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: Sickling of red blood cells in sickle cell anaemia (SCA) is the consequence of a single amino acid substitution at codon 6 of the adult 'beta' globin gene, producing abnormal haemoglobin... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Doutorado Ciências Biomédicas Doutor em Ciências Médicas

142f. Submitted by Suelen Reis (suziy.ellen@gmail.com) on 2013-05-24T13:11:05Z No. of bitstreams: 1 Elisangela Adorno.pdf: 3379043 bytes, checksum: 972521d9aae8561da326946dd4da678a (MD5) Approved for entry into archive by Flávia Ferreira(flaviaccf@yahoo.com.br) on 2013-05-30T00:18:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Elisangela Adorno.pdf: 3379043 bytes, checksum: 972521d9aae8561da326946dd4da678a (MD5) Made available in DSpace on 2013-05-30T00:18:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elisangela Adorno.pdf: 3379043 bytes, checksum: 972521d9aae8561da326946dd4da678a (MD5) Previous issue date: 2005 Introdução. A hemoglobina S (HbS) resulta da troca de nucleotídeo (GAG GTG) no sexto codon do gene da globina beta, levando à substituição do ácido glutâmico por valina na cadeia da globina beta. A anemia falciforme ou a homozigose para a HbS, freqüentemente apresenta manifestações clínicas heterogêneas, fortemente relacionadas aos níveis de hemoglobina fetal (HbF). Objetivo. O presente estudo investigou as características fenopíticas e os marcadores moleculares presentes em portadores da anemia falciforme de Salvador-BA, identificando seqüências gênicas potencialmente importantes para a expressão dos genes gama. Métodos. O perfil de hemoglobinas e o nível de HbF foram determinados por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). Informações sobre o perfil clínico dos pacientes foram obtidas através da análise de prontuários. A talassemia α2 3.7Kb foi investigada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e os haplótipos ligados ao grupo de genes da globina berta S foram investigados por PCR e análise de sítios polimórficos utilizando endonucleases de restrição (RFLP). As regiões promotoras dos genes yG e γA e o HS2-LCR foram amplificados assimetricamente e seqüenciadas no ABI Prism 3100 prism DNA Sequencer. As análises estatísticas foram desenvolvidas no software EPI-INFO versão 6.04 e a significância foi estabelecida para p < 0.05. Resultados. Foram analisados 131 pacientes, dos quais 125 tiveram identificado o genótipo beta S, tendo sido encontrado 64 (51,2%) CAR/Ben; 36 (28,8%) Ben/Ben; 18 (14,4%) CAR/CAR; dois (1,6%) CAR/Aty;dois (1,6%) Ben/Cam; um (0,8%) CAR/Cam; um (0,8%) Car/Arabia-India e um (0,8%) Sen/Aty. A talassemia 2 3.7Kb foi estudada em 110 pacientes, onde 30 (27,3%) foram heterozigotos e dois (1,8%) homozigotos. O uso de transfusão sangüínea foi maior em pacientes com HbF menor que ou igual a 10,0% (p=0,009). Pacientes com genótipos α diferentes apresentaram diferenças para os valores de Hb (p=0,018); Ht (p=0,019); VCM (p=0,0004) e HCM (p=0,039). Os níveis de HbF foram maiores entre os pacientes Ben/Ben que entre os CAR/CAR (p=0,007) e CAR/Ben (p=0,013). A análise das seqüências do HS2-LCR de dez indivíduos demonstrou a substituição G A na posição ?10.677, presente apenas entre os portadores do haplótipo Ben com nível elevado de HbF, sugerindo uma possível associação entre este polimorfismo, a expressão dos genes γ e a síntese da HbF. A análise da região promotora do gene γG demonstrou a substituição T C na posição -157, que parece ser uma seqüência característica entre os pacientes estudados. Também foi encontrada a deleção de 4 pb na posição ?222 a ?225 no gene γG e relacionado ao haplótipo Cam. Conclusões. Os dados demonstraram um novo polimorfismo localizado no HS2-LCR e na região promotora do gene γG da globina, justificando a realização de estudos adicionais, associando os níveis de HbF, marcadores biológicos e mecanismos relacionados, visando esclarecer um possível papel no desenvolvimento do fenótipo da doença. Salvador

O uso de hidroxiuréia promove a elevação dos níveis de hemoglobina fetal (Hb F) em pacientes portadores de síndromes falciformes (SF) e o medicamento vem sendo estudado em vários grupos de pacientes, incluindo adultos e crianças. O presente trabalho analisou a eficácia e tolerabilidade do uso de hidroxiuréia em crianças na faixa etária entre 5 e 17 anos de idade e em adultos jovens acima de 18 anos, portadores de hemoglobinopatia SS ou Sbeta0 que foram acompanhados regularmente no ambulatório do Hospital Hemope. Os pacientes pediátricos foram tratados com dose inicial de hidroxiuréia de 10 mg/kg/dia, a qual era aumentada em 5 mg/kg por dia em intervalos de oito semanas, até a dose máxima de 25 mg/kg/dia. Para os adultos, o tratamento foi iniciado com 500 mg/dia de hidroxiuréia até a dose máxima de 1g/dia. Foi observada redução do número de crises álgicas assim como do número de internações hospitalares, elevação do nível de Hb F e do Volume Corpuscular Médio, no grupo pediátrico. Entre os pacientes maiores de 18 anos, também se observou melhora clínica e significância estatística com aumento dos valores da hemoglobina e redução dos valores de reticulócitos, leucócitos e plaquetas. Não foram observados sinais ou sintomas sugestivos de toxicidade medicamentosa em ambos os grupos. O uso de hidroxiuréia em todos os pacientes parece ser seguro e eficaz e assegura melhora da qualidade de vida e benefícios a seus familiares. Ademais, as doses preconizadas de hidroxiuréia aparentemente não foram mielotóxicas, não tendo sido necessária a suspensão do tratamento em nenhum dos pacientes. The use of hydroxyurea increases concentrations of fetal hemoglobin (Hb F) in sickle cell disease patients. It has been used in adults and in trials with children with the aim of preventing events such as episodes of pain or stokes. The objective of this study was to analyze the efficacy and side effects of Hydroxyurea in children with ages ranging from 5 to 17 years and also in young adults with SS or Sbeta0 hemoglobinopathies. The patients were treated in the outpatient clinic of the Hemope Hospital. Young patients were treated with hydroxyurea at 10 mg/kg/day which was increased by 5 mg/kg/day at 8-week intervals until reaching a maximum dose of 25 mg/kg/day. For adults, the treatment started at 500 mg/day and increased until a dose of 1000 mg/day was reached. Total Hb F levels and the Mean Corpuscular Volume rose with hydroxyurea therapy and there was a reduction of events involving pain as well as the necessity of hospitalization among the pediatric patients. With the over 18-year-old patients, a better clinical state was noticed together with a rise in hemoglobin levels and a reduction in the reticulocyte, leukocyte and platelet counts. No signs or symptoms in respect to drug toxicity were evidenced in either group. The use of hydroxyurea seems to be safe and effective in both children and young adults with sickle cell disease. The drug also improves the quality of life of these patients and their families. Additionally, the dosages of hydroxyurea used in this group of patients did not cause any bone marrow toxicity or other side effects.

Este trabalho buscou determinar a correlação entre a saturação de oxigênio fetal intraparto medida, indiretamente, através do oxímetro de pulso e a saturação de oxigênio medida por punção da veia umbilical. Outros parâmetros gasométricos (SpO2, BE, pH, PO2, Bicarbonato, PCO2) também foram correlacionados com a variável obtida no feto. Foi realizado um estudo transversal do qual participaram 50 parturientes acompanhadas no HCUFMG. Todas estavam com gestações acima de 32 semanas. O traçado da oximetria fetal de pulso foi obtida utilizando-se o aparelho Agilent Série 50 XMO (M I350C) e, para a determinação dos parâmetros gasométricos do sangue venoso umbilical, foi utilizado o aparelho Bayer Diagnostics 348. Empregamos o método da correlação univariada da SpO2 fetal medida pela OFP com os parâmetros gasométricos do sangue umbilical neonatal. Os resultados evidenciaram uma correlação estatisticamente significativa entre o menor valor do traçado da OFP com o pO2, bicarbonato, pCO2, e o SpO2medidos em sangue obtido da veia umbilical. Houve, também, umacorrelação estatisticamente significativa entre o último valor do traçado da OFP e o pH, pCO2, SpO2 e o pO2 da veia umbilical. Concluímos que o método da OFP oferece informações que evidenciam boa acuidade na determinação do estado de equilíbrio ácido/básico do feto durante o trabalho de parto.

Persistência Hereditária de Hemoglobina Fetal (PHHF) é uma condição clinicamente benigna, caracterizada pela síntese contínua da HbF na vida adulta, sem alterações hematológicas. A PHHF funciona como um modulador de gravidade em várias hemoglobinopatias, razão pela qual torna-se importante conhecer a sua freqüência em nosso meio. Desse modo, por intermédio da análise de 1.846 doadores voluntários de sangue da região de Bragança Paulista, São Paulo, procuramos contribuir para a estimativa dessa freqüência populacional. Realizou-se uma análise qualitativa das hemoglobinas pela eletroforese em gel de agarose. A análise qualitativa das cadeias gamaG e gamaA foi realizada pela eletroforese em gel de poliacrilamida-Triton-Uréia. Foram encontrados dois indivíduos com alto índice de hemoglobina fetal (0,1%). Em um dos indivíduos encontramos um percentual de HbF de 17% e no outro de 18%. Nos dois casos a eletroforese de cadeias mostrou uma ausência da cadeia gamaG. Os casos triados, pelas suas características laboratoriais, correspondem à forma pancelular de PHHF, por mutação de ponto. Tal resultado nos permitiu estimar a incidência da PHHF em 1/1.000 indivíduos na população estudada. Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin (HPFH) is a benign clinical condition characterized by the synthesis of HbF and which continues without hematological alterations during adult life. Since the function of HPFH in many hemoglobinopathies is that of a severity modulator, it is important to learn its frequency. To obtain this information, a study was conducted on 1,846 blood donors from Bragança Paulista, São Paulo State. Hemoglobin was qualitatively analyzed by hemolytic electrophoresis on agarose gel. Qualitative analysis of gammaG and gammaA chains was performed by electrophoresis in polyacrylamide-triton-urea. Two individuals were found to have a high fetal index (0.1%). The percentage of FHb in one individual was 17% and in the other 18%. The gamma G chain was missing in both electrophoretic chains. Cases screened according to laboratory characteristics were of the pancellular hereditary persistence type due to mutation. The frequency in this sample was thus 1/1,000 individuals.

Orientadores : Helena Zerlotti Wolf Grotto, Carmen Silvia Passos Lima Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A hemoglobina Fetal (HbF) é um inibidor eficaz da polimerização da HbS. A hidroxiuréia (HU) é usada para aumentar a síntese de HbF e melhorar a evolução clínica de pacientes com síndromes fa1ciformes. Foram estudados uma série de parâmetros laboratoriais relativos à produção de HbF e à resposta dos reticulócitos (RTC), e foram comparados os dados entre 2 grupos: 13 pacientes com síndromes falciformes tratados com HU e 33 pacientes com síndromes fa1ciformes sem tratamento. No grupo tratado com HU, os resultados mostraram uma maior concentração de Hb, no volume corpuscular médio (VCM), na hemoglobina corpuscular média (HCM), no volume corpuscular médio dos RTC (VCMr), na concentração de HbF, na porcentagem de células F e na quantidade de Hb F/célula F. O número de RTC, o índice médio de fluorescência (MFI) e o número de neutrófilos foram significativamente menores em pacientes usando HU. Houve uma correlação significativa entre o VCMr e os níveis de HbF e entre o VCMr e as células F em pacientes tomando HU. A concentração de HbF/célula F foi significativamente maior em pacientes tratados com HU, mas este aumento aparentemente é independente da produção de células F. Esses dados demonstram que os parâmetros reticulocitários fornecidos por analisadores hematológicos de última geração, podem ser úteis para acompanhar as mudanças eritropoiéticas em pacientes usando HU e, permitem uma melhor compreensão de como essa terapia induz o aumento da produção de HbF e celsF nos pacientes com síndromes falciformes Abstract: Haemoglobin F (HbF) is an effective inhibitor of HbS polymerisation. Hydroxyurea (HU) is used to increase HbF synthesis and to improve the clinical course of the sickle cell disease (SCD) patients. We studied a series of laboratorial parameters concerning to HbF production and reticulocyte response and compared the data between 2 groups: 13 SCD patients treated with HU and 33 SCD patients without treatment. Higher Hb concentration, mean cell volume (MCV), mean cell hemoglobin (MCH), mean reticulocyte volume (MRV), HbF concentration, percentage of Fce11 and proportion of HbF/Fcell were observed in the treated group ofpatients. There was no correlation between Hb and HbF increase. Reticulocyte count, immature reticulocyte count, mean fluorescence index (MFI) and neutrophil count were significantly lower in treated patients. These fmdings taken together suggest that a milder hemolytic process occurred in patients under HU treatment. There was significant correlation between MCV and HbF, MRV and HbF, and between MRV and Fce11 in patients taking HU. These data suggest that macroreticulocytes correspond to Freticulocytes, and that the increased MRV in SCD patients using HU may be an indirect evidence of F cell production. Concentration of HbF/Fcell was higher in patients treated with HU, but it is apparently independent Fcell production. RTC parameters provided by hematological analysers may be use fuI to follow erythropoietic changes in patients using HU and can, indirectly, indicate HbF and Fce11 production induced by HU therapy Mestrado Ciências Biomédicas Mestre em Ciências Médicas

Orientador : Fernando Ferreira Costa Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Doutorado Genética Médica Doutor em Ciências Biológicas

RESUMO: Objetivo: Descrever a prevalência das hemoglobinopatias da população adulta brasileira, segundo exames laboratoriais da Pesquisa Nacional de Saúde. Métodos: Estudo descritivo realizado com os dados laboratoriais da Pesquisa Nacional de Saúde coletados entre os anos de 2014 e 2015. A pesquisa de hemoglobinopatias foi feita pelo método da cromatografia líquida de alto desempenho. Os resultados dos exames individuais foram interpretados fornecendo os parâmetros normais, homozigotos ou heterozigotos para hemoglobina S, C e D, além de outras eventuais hemoglobinopatias. Foram estimadas prevalências das hemoglobinopatias segundo sexo, cor da pele, região, idade e escolaridade. Resultados: Houve presença de hemoglobinopatias em 3,7% da população. As principais foram o traço falciforme (2,49%), a talassemia menor (0,30%) e a suspeita de talassemia maior (0,80%). Em relação ao traço falciforme e à suspeita de talassemia maior, houve diferença estatisticamente significativa para a variável cor da pele (p < 0,05). As prevalências encontradas para traço falciforme segundo cor de pele foram: preta (4,1%), parda (3,6%), branca (1,2%) e outras (1,7%). Conclusão: As hemoglobinopatias mais prevalentes foram o traço falciforme e a talassemia menor, predominando entre pretos e pardos. O estudo ajuda na identificação das hemoglobinopatias e no aconselhamento genético na preconcepção. ABSTRACT: Objective: To describe the prevalence of hemoglobinopathies in the Brazilian adult population, according to laboratory tests from the National Health Survey. Methods: A descriptive study was carried out with National Health Survey laboratory data collected between 2014 and 2015. The hemoglobinopathies test was performed using the High Performance Liquid Chromatography method. The results of the individual tests were interpreted as providing normal, homozygous or heterozygous results for S, C and D hemoglobin, in addition to other possible hemoglobinopathies. Prevalence of hemoglobinopathies according to gender, skin color, region, age and schooling was estimated. Results: Hemoglobinopathies were present in 3.7% of the population. The main ones were the sickle cell trait (2.49%), thalassemia minor (0.30%) and suspected thalassemia major (0.80%). In relation to the sickle cell trait and suspected thalassemia major, there was a statistically significant difference for the skin color variable (p