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Introduction L’Aspergillose Broncho-Pulmonaire Allergique (ABPA) est une maladie bronchique inflammatoire qui resulte en partie de la sensibilisation IgE-dependante a Aspergillus fumigatus (Asp f). Le diagnostic repose sur des criteres cliniques, radiologi-ques, et biologiques. Notre objectif est de caracteriser la reponse lymphocytaire T CD4 + specifique d’Asp f chez des patients souffrant d’ABPA et chez des sujets sains. Methodes Neuf patients asthmatiques severes sensibilises a Asp f repondant aux criteres diagnostiques d’ABPA sont compares a 5 sujets sains. Les cellules mononuclees du sang peripherique sont marquees avec un marqueur de membrane fluorescent (PKH26) et stimulees par differentes concentrations d’Asp f ou par un antigene de rappel (toxine tetanique, TT). La proliferation T CD4 + a Asp f (5; 3,75; 2,5; 1,25 μg/ml) et a TT (10 μg/ml) est quantifiee par la mesure de la fluorescence membranaire en cytometrie de flux. Resultats L’index de stimulation rapporte la proliferation des cellules stimulees a celle des cellules non stimulees. L’index de stimulation par TT n’est pas different entre le groupe ABPA et le groupe controle. L’index de proliferation est significativement plus eleve pour Asp f 3,75 et 5 μg/ml. Aucune proliferation specifique n’a ete observee chez les sujets sains. Conclusion Nous avons mis en evidence une proliferation T CD4 + specifique d’Asp f chez les sujets ABPA. La concentration 3,75μg/ml d’Asp f nous permet de discriminer les patients sensibilises des sujets sains. Cette reponse T CD4+ specifique va nous permettre d’etudier d’autres marqueurs phenotypiques au cours de l’ABPA comme les concentrations de cytokines intracellulaires ou l’expression des recepteurs de chimiokines.

Introduction SDF-1 (CXCL12), puissant chimio-attractant des leucocytes et des mastocytes est produite de facon constitutive par la peau et les epitheliums respiratoires normaux. Le role essentiel de la chimiokine et de son recepteur CXCR4 dans les reactions allergiques a ete demontre dans un modele murin d’asthme allergique. Plusieurs equipes, dont la notre, ont montre que les effets de SDF-1 sont conditionnes par la presence d’un co-facteur specifique de la cellule consideree. Notre hypothese de travail a ete que l’histamine et le ligand de c-kit (stem cell factor, SCF) etaient des co-facteurs de SDF-1 pour les mastocytes humains. Methodes La migration de precurseurs de mastocytes (PrMC), de mastocytes matures et de lignees humaines de mastocytes a ete evaluee dans des chambres de Transwell vis-a-vis de SDF-1 seule ou en association avec l’histamine ou SCF. Le recepteur utilise par l’histamine et les voies de signalisation impliquees dans le processus de potentialisation ont ete etudies. Resultats Nos resultats montrent que SDF-1 induit la migration des PrMC, des cellules HMC1 5C6 et alpha 155 (assimilees a des mastocytes immatures). Par contre, les mastocytes totalement differencies et les cellules LAD-2 (proches de mastocytes matures) ne sont pas attires par SDF-1 et expriment faiblement CXCR4. L’histamine et SCF potentialisent le recrutement des PrMC et des cellules HMC1 5C6 induit par SDF-1. L’utilisation d’antagonistes a permis de demontrer que les effets de l’histamine sont medies par le recepteur H4. La migration des cellules induites par SDF-1 seule ou en association avec l’histamine ou SCF est inhibee a 100 % par la toxine pertussique et 80 % par un inhibiteur des PI 3-kinases. L’inhibition de l’expression de la p85α dans les cellules HMC1 5C6 a l’aide de siRNA s’accompagne d’une diminution de 50 % de leur reponse migratoire a SDF-1. De plus, l’histamine et SCF ne sont plus capables d’augmenter les effets de SDF-1 sur ces cellules deficientes en p85α. Conclusion Ces tests montrent que l’histamine et SCF potentialisent le recrutement des PrMC et des mastocytes immatures par SDF-1 et le role des PI 3-kinases de classe IA dans ce processus. Ce mecanisme pourrait etre implique dans l’augmentation du nombre de mastocytes dans les tissus sites d’une reaction allergique. Il expliquerait le role clef de SDF-1 dans les reactions allergiques malgre une expression non inductible.

Sepsis and septic shock, associated with a severe and uncontrolled systemic inflammation, are the main causes of death in intensive care units. Macrophages play a central role in these pathologies. They are involved in the initiation and regulation of inflammation. They recognize LPS from the bacterial cell wall via TLR4, which triggers the activation of MAPK signaling pathway and transcription factors such as NF-KB and AP1 and ultimately, the production of pro-inflammatory cytokines including TNF and IL6. The expression of the protein GILZ in macrophages limits in vitro the production of IL6 and TNF in response to LPS. This effect is attributed to inactivation of NF-kB. Moreover, GILZ expression decreases in human and mouse macrophages exposed to LPS.Given the regulatory effects of GILZ in macrophages, the objectives of our study were 1) to determine whether GILZ expression is down-regulated in monocytes / macrophages (M/M) in the sepsis, 2) to determine whether the modulation of GILZ expression in M/M is sufficient to influence systemic inflammation, and 3) to identify GILZ mechanism of action in human M/M.GILZ expression was measured in the M/M of patients with septic shock or acute respiratory distress syndrome, and in a murine model of endotoxemia. We observed a significant reduced expression of GILZ in these pathological contexts in human and mice. The impact of this alteration was explored in unique transgenic mouse model in which macrophages stably overexpress GILZ (CD68-GILZ).We confirmed that GILZ overexpression limits TNF production and promotes IL-10 production in in vitro LPS-stimulated macrophages. We further studied the inflammatory response and survival of these mice in models of endotoxemia and septic shock. We showed that GILZ overexpression restricted to macrophages, limits serum pro-inflammatory cytokines production, therefore decreases systemic inflammation and significantly improves mice survival. These results highlight the effects of macrophage polarization by GILZ at a systemic level.This result confirmed the need to characterize GILZ interactome in human macrophages. Two complementary approaches have been used. The first one consists of a pan-genomic double hybrid screening of human GILZ partners. The second method consists of a tandem affinity purification (TAP-TAG) of GILZ protein and its associated partners, followed by the identification of these partners by mass spectrometry. Analyses have been performed independently on nuclear and cytoplasmic extracts from human macrophage cells, genetically engineered to express GILZ protein with the two tags required for purification. This dual approach led us to identify new direct and indirect interactions between GILZ and other key proteins of TLR4 signaling pathway in human macrophages and highlight a likely role of GILZ as a transcription regulatory factor.These results confirm the anti-inflammatory role of GILZ on systemic inflammation and enhancement of lifetime in murine models of endotoxemia and septic shock. Furthermore, this work identifies for the first time the cytoplasmic and nuclear GILZ partners in human macrophages and would allow in the future, a better understanding of GILZ mechanism of action.; Le Sepsis et le choc septique, associés à une inflammation systémique sévère et incontrôlée, sont les principales causes de mortalité dans les unités de soins intensifs. Les macrophages jouent un rôle central dans ces pathologies. Ils participent à l'initiation et à la régulation de l'inflammation. Lors d'une infection bactérienne, ils reconnaissent le LPS de la paroi bactérienne par l’intermédiaire du TLR4 ce qui déclenche l’activation des MAPK, des facteurs de transcription NF-kB et AP1 et, in fine, la production des cytokines pro-inflammatoires dont le TNF et l'IL6. L’expression de la protéine GILZ dans les macrophages limite, in vitro, la production d'IL6 et de TNF en réponse au LPS. Cet effet est attribué à une inactivation de NF-kB. D’autre part, l'expression de GILZ décroît dans les macrophages humains et murins après une stimulation par du LPS.Compte tenu des effets régulateurs de GILZ dans les macrophages, les objectifs de notre étude sont 1) de déterminer si l’expression de GILZ est altérée dans les monocytes/macrophages (M/M) au cours du Sepsis, 2) de déterminer si une modulation de l’expression de GILZ dans les M/M est suffisante pour influencer l’inflammation systémique, et 3) d’identifier le mécanisme d'action de GILZ dans les M/M humains.Nous avons mesuré l’expression de GILZ dans les M/M de patients atteints de choc septique ou de syndrome de détresse respiratoire aiguë, et dans un modèle murin d’endotoxémie. Nous avons observé une diminution significative de GILZ dans ces contextes pathologiques chez l’homme et la souris. L'impact de cette altération a été exploré dans des souris transgéniques uniques dont les macrophages surexpriment GILZ de façon non régulable. Nous avons confirmé que la surexpression de GILZ limite la production de TNF et favorise celle de l'IL-10 dans les macrophages stimulés in vitro par du LPS. Nous avons ensuite étudié la réponse inflammatoire et la survie de ces souris dans un modèle d’endotoxémie et de choc septique, et montré que cette surexpression de GILZ restreinte aux macrophages limite la production sérique de cytokines pro-inflammatoires et, par conséquent, l'inflammation systémique en améliorant significativement la survie des souris. Ces résultats mettent en évidence les conséquences, au niveau systémique, de la régulation des macrophages par GILZ.Dans l’optique d’élucider les mécanismes impliqués dans la régulation des macrophages par GILZ, nous avons confirmé que GILZ inhibe NF-kB dans les macrophages humains sans toutefois retrouver l’interaction directe décrite entre GILZ murin et la sous-unité p65 de NF-kB.Ce résultat nous a conforté dans la nécessité de caractériser l’interactome de GILZ dans les macrophages humains. Deux approches complémentaires ont été utilisées. La première est un criblage pan-génomique des interactants de GILZ humain par la technique du double-hybride. La seconde méthode consiste en une purification d'affinité en tandem (TAP-TAG) de la protéine GILZ et de ses interactants, suivie d'une identification de ces protéines par spectrométrie de masse. Ce complexe a été isolé à partir d'extraits nucléaires ou cytoplasmiques de cellules humaines différenciées en macrophages et génétiquement modifiées afin d’exprimer la protéine GILZ flanquée des deux étiquettes nécessaires à sa purification. Ces deux approches ont mis en évidence des interactions nouvelles entre GILZ et des protéines clés de la signalisation du TLR4 dans les macrophages humains ainsi qu'un rôle probable de GILZ comme facteur régulateur de la transcription.Ces résultats montrent que la régulation de la réponse anti-inflammatoire des macrophages par GILZ a un impact sur l’inflammation systémique in vivo et améliore la survie dans un modèle de choc septique sévère. De plus, ces travaux identifient pour la première fois les partenaires cytoplasmiques et nucléaires de GILZ dans les macrophages humains et devraient permettre dans le futur, une meilleure compréhension de cette protéine.

We previously showed in vitro that DCs with a high level of GILZ activate regulatory T cells (Tregs) whereas DCs with low level of GILZ trigger effector T lymphocytes. Glucocorticoids (GCs), IL-10 and TGF- are potent inducers of GILZ expression. The aim of this thesis is to extend the above findings to induction of tolerance to allergens. Modulation of GILZ expression by DCs should induce allergen-specific Tregs able to inhibit the activation and proliferation of allergen specific T cell clones. In order to validate this concept we demonstrated that:- allergen-specific tolerance can be achieved in allergic patients treated with oral GC through the induction of GILZ expression in their antigen-presenting cells, and the role of allergen-specific Tregs in this effect,- mast cells play a role in the activation of DCs by inhibiting their expression of GILZ and thus their ability to stimulate Tregs against harmless environmental allergens,- GILZ-expressing DCs protect against allergic asthma in a model of transgenic mice over-expressing GILZ in their DCs.The present study supports the concept of an immune regulation of allergic responses through the modulation of GILZ expression by DCs and opens new perspectives in the development of innovative immunotherapies in the treatment of allergic diseases.; Une cellule dendritique (CD) qui exprime le facteur de transcription GILZ durant l’apprêtement de l’antigène et sa présentation aux cellules effectrices, génère des lymphocytes T régulateurs (LTregs) CD25high Foxp3+ sécréteurs d’IL-10. La production de GILZ est dépendante de l’action des glucocorticoïdes, de l’IL-10 et du TGF-.Nous avons mis en évidence chez l’homme qu’une corticothérapie orale de 48h induit l’expression de GILZ dans les cellules présentatrices de l’antigène circulantes (CPAs) de sujets allergiques. Les CPAs isolées après la corticothérapie génèrent des LTregs CD25high Foxp3+ IL-10+ spécifiques de l’allergène.Nous également constaté in vitro que les mastocytes participent à l’activation des CDs au cours des réactions allergiques en régulant l’expression de GILZ. Les médiateurs d’origine mastocytaire, dont l’histamine, diminuent l’expression de GILZ dans les CDs et altèrent ainsi leur capacité à activer des LTregs. Nous avons identifié le mécanisme par lequel l’histamine diminue l’expression de GILZ dans les CDs humaines. L’histamine inhibe l’activité transcriptionnelle de Foxo3, un facteur de transcription régulant l’expression de GILZ. Enfin, nous avons démontré que des souris transgéniques qui surexpriment GILZ constitutivement dans les CDs sont protégées contre le développement de l’asthme allergique. L’ensemble de ces résultats permet d’envisager de nouvelles stratégies d’immunomodulation dans l’allergie, centrée sur la régulation de l’expression de GILZ dans les CDs.