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Several lines of evidence suggest a role for laminin-5 in skin wound healing. We report here that transforming growth factor-beta (TGF-beta), which elicits various responses during cutaneous healing, stimulates transcription of the mouse laminin alpha3A (lama3A) gene. To identify the TGF-beta-responsive elements (TGFbeta-REs) on the lama3A promoter, we have generated a series of 5'-deletions of the promoter upstream of the beta-galactosidase reporter gene. Transient cell transfection assays using mouse PAM212 keratinocytes revealed that TGFbeta-REs lie between nucleotides -297 and -54 relative to the transcription start site. Insertion of the TGFbeta-RE in front of the unresponsive minimal SV40 promoter conferred TGF-beta inducibility. Computer analysis of the promoter sequence identified three canonical activator protein-1 (AP-1) sites located at nucleotides -277 (AP-1A), -125 (AP-1B), and -69 (AP-1C). Site-directed mutagenesis of either the AP-1A or AP-1C site did not drastically alter the basal activity of the lama3A promoter, but reduced TGF-beta responsiveness by 50%. Simultaneous mutation of these two AP-1 sites resulted in a 65% decline in the response to TGF-beta, suggesting a cooperative contribution of each site to the overall promoter activity. In contrast, mutation of the AP-1B site markedly reduced the basal activity of the lama3A promoter, indicating that this AP-1 site is essential for gene expression. Mobility shift assays demonstrated specific binding of Fra-2 and JunD to the AP-1 sites, suggesting for the first time a possible regulatory function for the Fra-2.JunD AP-1 complex in a basal keratinocyte-specific gene.

We already identified two distinct laminin alpha3A and alpha3B chain isoforms which differ in their amino-terminal ends and display different tissue-specific expression patterns. In this study we have investigated whether these two different isoforms are products of the same laminin alpha3 (lama3) gene and transcribed from one or two separate promoters. Genomic clones were isolated that encompass the sequences upstream to the 5' ends of both the alpha3A and the alpha3B cDNAs. Sequence analysis of the region upstream to the alpha3A open reading frame revealed the presence of a TATA box and potential binding sites for responsive elements. By primer extension analysis, the transcription start site of the alpha3B mRNA isoform was defined. The sequences upstream to the alpha3B mRNA transcription start site do not contain a TATA box near the transcription initiation sites, but AP-1, AP-2, and Sp1 consensus binding site sequences were identified. The genomic regions located immediately upstream of the alpha3A and alpha3B transcription start sites were shown to possess promoter activities in transfection experiments. In the promoter regions, response elements for the acute phase reactant signal and NF-interleukin 6 were found, and their possible relevance in the context of inflammation and wound healing is discussed. Our results demonstrate that the lama3 gene produces the two polypeptides by alternative splicing and contains two promoters, which regulate the production of the two isoforms alpha3A and alpha3B.

There is great interest but little understanding in how cancer stem cells arise. Here we show that tumor cells exhibiting stem-like properties and expression of stemness(CD133) and pluripotency markers (SOX2, NANOG, OCT4), can arise from differentiated tumor cells that are isolated from human glioblastomas. These cells could transit from a more differentiated state that cannot self-renew to a self-renewing stem-like state upon EGF/EGFR signaling. This dedifferentiation process induced expression of pluripotency markers, and restored clonal and tumorigenic properties as well as resistance to temozolomide, the chemotherapy of reference. EGF/EGFR signaling including ERK activation was crucial for this cellular reprogramming. Interestingly, expression of pluripotency markers occurred before the cells re-entered the cell cycle, demonstrating that the cells have the capacity to change and reprogram before the cell division starts. Our findings support a model of tumor homeostasis in which tumor cells driven by environmental cues such as EGF, can spontaneously acquire stem-like properties contributing thus to the enrichment in tumor propagating cells.; L’objectif de ce travail était de démontrer que les cellules de glioblastomes sont capables de se différencier et de se dédifférencier en fonction de leur environnement, d’explorer les mécanismes biologiques qui sous-tendent ces transitions, et d’évaluer in vivo les capacités de différenciation à distance des CIG par les CIG-miR-302-367 via la sécrétion de microvésicules. A partir de plusieurs glioblastomes fraichement réséqués, nous avons caractérisé les cellules tumorales sur le plan phénotypique et fonctionnel pour l’état souche et différencié. Nous avons extraits et analysés les microvésicules des milieux de culture de 2 lignées de CIG-miR-302-367. Selon les principes de la thérapie cellulaire, des co-injections de CIG+CIG-miR-302-367 ont été réalisées dans le cerveau des souris. La majorité des cellules tumorales avaient un phénotype et étaient fonctionnellement différenciées. Après 48 heures de culture en milieu EGF, elles acquéraient les propriétés souches phénotypiques et fonctionnelles. Ce processus de dédifférenciation était réversible en 4 jours de culture en milieu sérum et inhibé par l’adjonction dans le milieu EGF d’un anti-EGFR (cétuximab), suggérant un rôle primordial de la voie EGF/EGFR/ERK. Les microvésicules produites par les CIG-miR-302-367 ont permis une baisse significative de la tumorigénicité des CIG in vivo, et une augmentation de la survie des souris. Le concept de plasticité cellulaire remet en cause les dogmes établis sur la hiérarchie tumorale unidirectionnelle. La déplétion tumorale en CIG, en les forçant à se différencier, est une stratégie thérapeutique innovante, qui peut s’envisager par une approche de thérapie cellulaire.

There is great interest but little understanding in how cancer stem cells arise. Here we show that tumor cells exhibiting stem-like properties and expression of stemness(CD133) and pluripotency markers (SOX2, NANOG, OCT4), can arise from differentiated tumor cells that are isolated from human glioblastomas. These cells could transit from a more differentiated state that cannot self-renew to a self-renewing stem-like state upon EGF/EGFR signaling. This dedifferentiation process induced expression of pluripotency markers, and restored clonal and tumorigenic properties as well as resistance to temozolomide, the chemotherapy of reference. EGF/EGFR signaling including ERK activation was crucial for this cellular reprogramming. Interestingly, expression of pluripotency markers occurred before the cells re-entered the cell cycle, demonstrating that the cells have the capacity to change and reprogram before the cell division starts. Our findings support a model of tumor homeostasis in which tumor cells driven by environmental cues such as EGF, can spontaneously acquire stem-like properties contributing thus to the enrichment in tumor propagating cells.; L’objectif de ce travail était de démontrer que les cellules de glioblastomes sont capables de se différencier et de se dédifférencier en fonction de leur environnement, d’explorer les mécanismes biologiques qui sous-tendent ces transitions, et d’évaluer in vivo les capacités de différenciation à distance des CIG par les CIG-miR-302-367 via la sécrétion de microvésicules. A partir de plusieurs glioblastomes fraichement réséqués, nous avons caractérisé les cellules tumorales sur le plan phénotypique et fonctionnel pour l’état souche et différencié. Nous avons extraits et analysés les microvésicules des milieux de culture de 2 lignées de CIG-miR-302-367. Selon les principes de la thérapie cellulaire, des co-injections de CIG+CIG-miR-302-367 ont été réalisées dans le cerveau des souris. La majorité des cellules tumorales avaient un phénotype et étaient fonctionnellement différenciées. Après 48 heures de culture en milieu EGF, elles acquéraient les propriétés souches phénotypiques et fonctionnelles. Ce processus de dédifférenciation était réversible en 4 jours de culture en milieu sérum et inhibé par l’adjonction dans le milieu EGF d’un anti-EGFR (cétuximab), suggérant un rôle primordial de la voie EGF/EGFR/ERK. Les microvésicules produites par les CIG-miR-302-367 ont permis une baisse significative de la tumorigénicité des CIG in vivo, et une augmentation de la survie des souris. Le concept de plasticité cellulaire remet en cause les dogmes établis sur la hiérarchie tumorale unidirectionnelle. La déplétion tumorale en CIG, en les forçant à se différencier, est une stratégie thérapeutique innovante, qui peut s’envisager par une approche de thérapie cellulaire.